CN103173503A - 重组大肠杆菌表达酮还原酶生物制备 (s)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组大肠杆菌表达酮还原酶生物制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，及其在4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。以表达该酮还原酶(KRED)基因的重组大肠杆菌耦合葡萄糖脱氢酶(GDH)重组大肠杆菌细胞为催化剂，在添加或不添加辅酶NAD(P)H的条件下，在单一水相中均实现了4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原高效制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，摩尔转化率高于92%，产物的对映体过量值（e.e.）为100%。

Description

重组大肠杆菌表达酮还原酶生物制备 (S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种表达酮还原酶的重组大肠杆菌的应用，尤其是由导入全基因序列合成的酮还原酶酮还原酶的重组菌，以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物不对称还原制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法。

背景技术

4-氯-3-羟基丁酸乙酯（ethyl 4-chloro-3-hydroxyrate,CHBE）是一种重要的有机中间体，其最主要的用途是合成降胆固醇药物阿托伐他汀的前体化合物。其手性单一对映体S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯（(S)-CHBE）可用于很多活性药物的合成，如羟甲基戊二酰CoA (HMG-CoA)还原酶抑制剂和1，4-二氢吡啶类β-阻滞剂等。

潜手性物质4-氯乙酰乙酸乙酯（ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate, COBE）具有易于合成且价格低廉的优点，以其作为反应原料进行不对称制备手性CHBE是非常经济有效的途径。而且在反应过程中微生物不会利用反应的产物（S）-CHBE，因此可以利用微生物全细胞进行制备反应，反应进行更为简便。

目前，以COBE不对称还原制备手性CHBE的研究已经有很多的报道。主要制备方法有化学法和生物法。化学催化不对称还原主要是利用铑、钌等金属作为催化剂，在高温高压等条件下进行催化合成。化学催化法不仅耗费了昂贵的催化剂，且反应条件苛刻、耗能高、废弃的重金属催化剂对环境污染大，反应产物的光学纯度也不够高。生物催化法由于其反应迅速，反应条件温和，副产物较少，产物的处理简单等优点，越来越受到关注，其主要可分为酶催化和微生物催化。酶催化法是指利用从微生物细胞中分离纯化的酶（或商品酶）用为反应的催化剂来进行反应，其过程操作繁琐且酶容易失活，反应过程还需要额外添加辅酶（一般为NAD(P)H），成本较高。

微生物催化即利用完整的微生物细胞内专一酶系的立体选择性，在细胞体内选择性的催化底物转化成产物。但由于细胞中存在的酶体系复杂，往往催化产物的光学纯度也不高，需要筛选优良的微生物菌株或通过克隆重组基因来实现改良。同时也需要辅酶的加入来提供反应的还原力。

因此，在目前利用生物法不对称还原COBE来制备(S)-CHBE的技术中，底物转化率低，产物光学纯度低和辅酶循环再生(控制成本)等问题有待进一步研究解决。

发明内容

本发明要解决的技术问题是一种重组大肠杆菌表达酮还原酶在COBE不对称还原制备(S)-CHBE中的方法。

为解决上述技术问题，设计技术方案如下：

用于不对称制备(S)-CHBE的重组大肠杆菌，是导入了酮还原酶(酮还原酶)基因的大肠杆菌。用于提供还原力NAD(P)H的重组大肠杆菌为导入了葡萄糖脱氢酶GDH的大肠杆菌。

上述酮还原酶(酮还原酶)基因，是通过密码子优化全基因合成的，其含有852bp碱基，其在Genbank中的收录号KC426948，其基因序列如SEQ ID NO:1所示。由该基因编码的酮还原酶包含283个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

上述葡萄糖脱氢酶GDH基因含有786bp碱基，其在Genbank中的收录号为KC426949，其基因序列如SEQ ID NO:3所示。由该基因编码的酮还原酶包含261个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明即通过密码子优化全基因克隆了酮还原酶酮还原酶基因，将其构建在载体pET28a上并在大肠杆菌中表达。从Bacillus subtilis克隆葡萄糖脱氢酶(GDH)基因，将构建到载体pET28a上并在大肠杆菌中表达。表达所用的大肠杆菌菌株为BL21( DE3)，为本实验室保藏。

构建上述重组大肠杆菌的方法如下：全基因合成酮还原酶酮还原酶序列和克隆葡萄糖脱氢酶GDH基因，将其构建在pET28a上并分别在大肠杆菌中表达，获得不对称制备(S)-CHBE的重组大肠杆菌。

构建的表达酮还原酶酮还原酶的大肠杆菌能不对称的制备(S)-CHBE，而所构建的葡萄糖脱氢酶GDH又能够以葡萄糖为辅助底物，使得NADH再生循环，因而加入少量的NAD(P)+或者利用细胞中原有的辅因子就能现实反应中NAD(P)H的高效循环利用。

利用上述重组大肠杆菌不对称制备(S)-CHBE的方法如下：

以COBE为底物，以葡萄糖为辅助底物，以NAD(P)+为辅因子，由导入酮还原酶基因酮还原酶和葡萄糖脱氢酶GDH基因的重组大肠杆菌进行转化反应不对称制备(S)-CHBE。

其中，底物COBE的初始反应浓度为12.1 ~96.8g/L，葡萄糖初始反应浓度为10 ~100g/L、辅因子NAD(P)⁺ 的初始浓度为0~1.5mmol/L，重组大肠杆菌的用量以湿细胞计为10~100 g/L，双菌体质量比为0.25 ~4。

其中，所述的反应温度为15~40°C，反应转速为50~200rpm，反应时间2~16h。

其中，所述的转化水相转系统，所用是水相反应系统为湿重大肠杆菌细胞在pH4.0~10.的缓冲溶液中进行转化。

有益效果：本发明的不对称制备(S)-CHBE的重组大肠杆菌可以在不添加辅因子的情况下（即添加的NAD(P)+为0），高效的催化COBE生成(S)-CHBE，光学纯度e.e值达到100%，对底物转化率超过92%，降低了生产成本。对比其他水相中的催化反应，其产物的光学纯度高。

附图说明

图1 、图2分别为酮还原酶酮还原酶基因和葡萄糖脱氢酶GDH基因与载体pET28a的构件图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例 1 酮还原酶基因的获取

根据Candida magnoliae的酮还原酶氨基酸序列，利用E.coli密码子偏嗜性进行优化获得新的基因序列（Genbank：KC426948），送上海生工合成，基因两端分别添加NcoI、BamHI酶切位点。NcoI酶切位点：CCATGG，BamHI酶切位点：GGATCC。

实施例 2 葡萄糖脱氢酶基因的获取

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )LB液体培养基：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%,pH7.0。

将枯草芽孢杆菌接种于5mL LB液体培养基中37°C培养至对数生长期，使用基因组DNA提取试剂盒（TaKaRa公司产品）提取基因组。

构建表达载体所用的引物加设酶切位点，引物序列如下：

GDH-F1：5' -CGAATTCATGTATCCGGATTTAAAAGG-3' EcoRI酶切位点

GDH-R1：5' -GAAGCTTTTATGTTTAACCGCGGCCTG -3' HindIII酶切位点

引物由上海生物工程有限公司合成。

基因PCR（50ul 反应体系）条件如下:

94°C预变性5min ；94°C变性45s，52°C退火45s，68°C延伸1min，30个循环；再68°C延伸10min；冷却至16°C，结束反应。

实施例 3 酮还原酶基因的表达

用EcoRI及HindIII分别酶切pET-28a（pET-28a 购于Novagen(默克中国)）及所合成含有两个酶切位点的目的基因，分别胶回收已双酶切的目的片段和表达载体，将已双酶切的表达载体pET-28a 与目的基因用T4连接酶进行连接过夜，将10µL 的连接产物pET-28a-酮还原酶 加入100µL 的BL21(DE3) 感受态细胞中，冰上放置30min，42°C热激90 s。冰上放置2min。加入预热的0.45mL 培养基。200rpm 37°C培养 1h。将200µL 菌液加入分别含有50μg/mL 的卡那霉素和氯霉素的LB 平板上，37°C过夜培养12-16h。构建图谱见图1。

实施例 4 葡萄糖脱氢酶基因的表达

用EcoRI及HindIII分别酶切pET-28a(pET-22a 购于Novagen (默克中国)及所扩增到的含有两个酶切位点的目的基因，分别胶回收已双酶切的目的片段和表达载体，将已双酶切的表达载体pET-28a 与目的基因用T4 连接酶进行连接过夜，将10μL 的连接产物pET-28a-GDH 加入100μL 的BL21(DE3) 感受态细胞中，冰上放置30min，42°C热激90 s。冰上放置2min。加入预热的0.45mL 培养基。200rpm 37°C培养 1h。将200μL 菌液加入分别含有50μg/mL 的卡那霉素和氯霉素的LB 平板上，37°C过夜培养12-16h。构建图谱见图2。

实施例 5 酶活的测定

挑取重组菌BL21(DE3)-pET28a-酮还原酶和BL21(DE3)-pET28a-GDD及出发大肠杆菌BL21(DE3) 至含抗生素的LB 液体培养基中，37°C振荡培养过夜。然后按2%接种量分别接种到新鲜培养液中，37°C培养至OD600 约为0.8 时，加入IPTG 至终浓度1mmol·L^-1，于30°C，200rpm，诱导表达10h 后，离心(4°C，4000rpm，15min)，菌泥用100mM 磷酸钾缓冲(pH7.0) 重悬，超声破碎细胞( 功率300W，超声5s，间歇5s，共5min)，离心(4°C，12000rpm，10min)，测定上清中的酶活。

还原酶酮还原酶活性测定：反应体系为3mL 0.1M磷酸钾缓冲液 (pH7.0)中含有0.3mM NAD(P)H，5mM底物4-氯乙酰乙酸乙酯和适量粗酶液。加入酶液后立即开始扫描反应体系在340nm处吸光度的变化。

脱氢酶GDH活性测定体系：反应为3mL 0.1M磷酸钾缓冲液 (pH7.0)中含有0.3mM NAD(P)H， 0.2M底物葡萄糖和适量粗酶液。加入酶液后立即开始扫描反应体系在340nm处吸光度的变化。

酶活定义为每分钟内氧化1μmol NAD(P)H 所需要的酶量为一个酶活单位（U）。同时，采用Bradford 方法测定该无细胞粗酶液中蛋白质含量。

结果显示，出发大肠杆菌BL21(DE3) 的比酶活为0.0099 U/mg，而重组菌BL21(DE3)/pET28a-GDH的比酶活为8.2U/mg，重组菌BL21(DE3)/pET28a-酮还原酶比酶活为4.8U/mg。

实施例 6 重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-酮还原酶及BL21(DE3)/pET28a-GDH的发酵挑取重组菌至含抗生素的LB培养液，37°C振荡培养过夜。然后按2%接种量分别接种到新鲜培养液中，37°C培养至OD600 约为0.8 时，加入IPTG 至终浓度1mmol/L，于30°C，200rpm，诱导表达10h后，8000rpm，4°C离心10min，弃上清，收集菌体备用。

实施例 7 取实施例6的菌体用磷酸钾缓冲(100mmol/L，pH7.0) 洗涤两次，固定称取0.5g(湿重)的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-酮还原酶菌泥，分别加入0.25~4倍质量比的大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-GDH菌体，悬浮于10mL 的pH7.0 磷酸钾缓冲中。加入葡萄糖10g/L，COBE24.2g/L，NAD(P)+0.5mmol/L，30°C，150rpm下反应18h结束，测定其产物含量与对映体过量值，结果如表1。

表1 双菌质量比例对转化的影响

实施例 8 取实施例6的菌体用磷酸钾缓冲(100mmol/L，pH 7.0) 洗涤两次，以1:1比例各称取菌体0.5g(湿重)，悬浮于10mL的pH 7.0磷酸钾缓冲中，使细胞浓度为20g/L。加入24.2g/L的COBE，10~100g/L的葡萄糖和0.5mM的NAD(P)+，30°C振荡(150rpm)反应12h结束，测定其产物含量与对映体过量值，结果如表2。

表2 添加不同葡萄糖浓度对转化的影响

实施例 9 取实施例6的菌体用磷酸钾缓冲(100mmol/L，pH 7.0) 洗涤两次，以1:1比例各称取菌体0.1~1g(湿重)，悬浮于10mL 的pH 7.0磷酸钾缓冲中，使细胞浓度为10-100g/L。加入24.2g/L的COBE，50g/L的葡萄糖和0.5mM的NAD+，30°C振荡(150rpm)反应12h后结束，测定其产物含量与对映体过量值，结果如表3。

表3 不同的菌体量对转化的影响

实施例 10 取实施例6的菌体用磷酸钾缓冲(100mmol/L，pH 7.0) 洗涤两次，以1:1比例各称取菌体0.2g(湿重)，悬浮于10mL 的pH 7.0磷酸钾缓冲液中，使细胞浓度为20g/L。加入12.1~96.8g/L的COBE，50g/L的葡萄糖和0.5mM的NAD(P)+，30°C振荡(150rpm)反应12h后结束，测定其产物含量与对映体过量值，结果如表4。

表4 不同底物初始浓度对转化的影响

实施例 11 取实施例6的菌体用磷酸钾缓冲(100mmol/L，pH 7.0) 洗涤两次，以1:1比例各称取菌体0.2g(湿重)，悬浮于10mL 的pH 7.0磷酸钾缓冲中，使细胞浓度为20g/L。加入24.2g/L的COBE，50g/L的葡萄糖和0.5mM的NAD(P)+，15~40℃振荡(150rpm)反应12h后结束，测定其产物含量与对映体过量值，结果如表5。

表5 不同转化温度对转化的影响

实施例 12 取实施例6的菌体用磷酸钾缓冲(100mmol/L，pH 7.0) 洗涤两次，按照实施例11的方法，在25°C振荡(150rpm)反应0~18h后结束，测定其产物含量与对映体过量值，结果如表6。

表6 25°C下COBE转化CHBE过程

实施例 13 取实施例6的菌体用磷酸钾缓冲(100mmol/L，pH 7.0) 洗涤两次，按照实施例12的条件，比较添加与不添加NAD(P)H时COBE的摩尔转化率与S-CHBE的对映体过量值(ee)，结果如表7。

表7 添加与未添加NAD(P)H对COBE转化CHBE影响

实施例 14 产物的检测方法

水相反应中反应结束后，加入等体积乙酸乙酯，剧烈振荡10min放置分离有机层和水层。吸取上层乙酸乙酯相，加入适量无水硫酸镁除去残余水分，所得有机相过滤膜后，减压蒸干溶剂，保存样品。

采用OV-1色谱柱(30 m ×0.25 mm ×0.25 µm) ，检测器FID。分析条件为气化室温度250 °C，检测器温度280 °C，柱温80 °C保留3 min ，以15°C /min升温至200 °C维持10min ，载气为氮气，流量为1.2mL·min^-1，分流比1:50 。

用HPLC分析产物对映体过量值的测定：手性色谱柱CHIRALCEL^®OD-H (4.6 mm ×250mm；Daicel chemical Industries，Japan) ，室温，流动相为正己烷/异丙醇=95:5（V:V），流速0.8ml/mim，λ=220nm。其中S-CHBE、R-CHBE的保留时间分别为10.5mim、18.5mim。

核苷酸或氨基酸序列表

<110> 江西师范大学 江西苏克尔新材料有限公司

<120> 重组大肠杆菌表达酮还原酶生物制备 (S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法

<160> 4

<210> 1

<211> 852

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atggcaaaga attttagcaa tgtagagtat cccgcacccc cccccgcaca tacaaagaat 60

gagagcttac aagtattaga tttatttaag ttaaatggaa aagtagcaag cataacagga 120

agcagcagcg gaataggata tgcattagca gaggcttttg cacaagtcgg agcagatgta 180

gcaatatggt ataatagcca tgatgcaaca ggaaaagcag aggcattagc aaagaagtat 240

ggagtaaagg taaaggcata taaagcaaat gtaagcagca gcgatgcagt caagcaaaca 300

atagagcaac aaataaagga ttttggacat ttagatatag tagtagcaaa tgcaggaata 360

ccctggacaa agggagcata tatagatcaa gatgatgaca agcattttga ccaagtagta 420

gatgtagact taaagggagt aggatacgta gcaaagcatg caggaaggca ttttagggaa 480

aggtttgaga aagagggaaa aaagggagca ttagtattta cagcaagcat gagcggacat 540

atagtaaatg tcccccaatt ccaagcaaca tataatgcag caaaggcagg agtaaggcat 600

tttgcaaaga gcttagcagt cgagtttgca ccctttgcaa gggtaaatag cgtaagcccc 660

ggatatataa atacagaga aagcgatttc gtcccccaag agacacaaaa taagtggtgg 720

agcttagtcc ccttaggaag gggaggagag acagcagagt tagtaggagc atatttattc 780

ttagcaagcg atgcaggaag ctatgcaaca ggaacagata taatagtaga tggaggatat 840

acattaccct aa 852

<210> 2

<211> 283

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Met Ala Lys Asn Phe Ser Asn Val Glu Tyr

5 10

Pro Ala Pro Pro Pro Ala His Thr Lys Asn

15 20

Glu Ser Leu Gln Val Leu Asp Leu Phe Lys

25 30

Leu Asn Gly Lys Val Ala Ser Ile Thr Gly

35 40

Ser Ser Ser Gly Ile Gly Tyr Ala Leu Ala

45 50

Glu Ala Phe Ala Gln Val Gly Ala Asp Val

55 60

Ala Ile Trp Tyr Asn Ser His Asp Ala Thr

65 70

Gly Lys Ala Glu Ala Leu Ala Lys Lys Tyr

75 80

Gly Val Lys Val Lys Ala Tyr Lys Ala Asn

85 90

Val Ser Ser Ser Asp Ala Val Lys Gln Thr

95 100

Ile Glu Gln Gln Ile Lys Asp Phe Gly His

105 110

Leu Asp Ile Val Val Ala Asn Ala Gly Ile

115 120

Pro Trp Thr Lys Gly Ala Tyr Ile Asp Gln

125 130

Asp Asp Asp Lys His Phe Asp Gln Val Val

135 140

Asp Val Asp Leu Lys Gly Val Gly Tyr Val

145 150

Ala Lys His Ala Gly Arg His Phe Arg Glu

155 160

Arg Phe Glu Lys Glu Gly Lys Lys Gly Ala

165 170

Leu Val Phe Thr Ala Ser Met Ser Gly His

175 180

Ile Val Asn Val Pro Gln Phe Gln Ala Thr

185 190

Tyr Asn Ala Ala Lys Ala Gly Val Arg His

195 200

Phe Ala Lys Ser Leu Ala Val Glu Phe Ala

205 210

Pro Phe Ala Arg Val Asn Ser Val Ser Pro

215 220

Gly Tyr Ile Asn Thr Glu Ile Ser Asp Phe

225 230

Val Pro Gln Glu Thr Gln Asn Lys Trp Trp

235 240

Ser Leu Val Pro Leu Gly Arg Gly Gly Glu

245 250

Thr Ala Glu Leu Val Gly Ala Tyr Leu Phe

255 260

Leu Ala Ser Asp Ala Gly Ser Tyr Ala Thr

265 270

Gly Thr Asp Ile Ile Val Asp Gly Gly Tyr

275 280

Thr Leu Pro

<210> 3

<211> 786

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

<400> 3

atgtatccgg atttaaaagg aaaagtcgtc gctattacag gagctgcttc agggctcgga 60

aaggcgatgg ccattcgctt cggcaaggag caggcaaaag tggttatcaa ctattatagt 120

aataaacaag atccgaacga ggtaaaagaa gaggtcatca aggcgggcgg tgaagctgtt 180

gtcgtccaag gagatgtcac gaaagaggaa gatgtaaaaa atatcgtgca aacggcaatt 240

aaggagttcg gcacactcga tattatgatt aataatgccg gtcttgaaaa tcctgtgcca 300

tctcacgaaa tgccgctcaa ggattgggat aaagtcatcg gcacgaactt aacgggtgcc 360

tttttaggaa gccgtgaagc gattaaatat ttcgtagaaa acgatatcaa gggaaatgtc 420

attaacatgt ccagtgtgca cgaagtgatt ccttggccgt tatttgtcca ctatgcggca 480

agtaaaggcg ggataaagct gatgacagaa acattagcgt tggaatacgc gccgaagggc 540

attcgcgtca ataatattgg gccaggtgcg atcaacacgc caatcaatgc tgaaaaattc 600

gctgacccta aacagaaagc tgatgtagaa agcatgattc caatgggata tatcggcgaa 660

ccggaggaga tcgccgcagt agcagcctgg cttgcttcga aggaagccag ctacgtcaca 720

ggcatcacgt tattcgcgga cggcggtatg acacaatatc cttcattcca ggcaggccgc 780

ggttaa 786

<210> 4

<211> 261

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）

<400> 4

Met Tyr Pro Asp Leu Lys Gly Lys Val Val

5 10

Ala Ile Thr Gly Ala Ala Ser Gly Leu Gly

15 20

Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe Gly Lys Glu

25 30

Gln Ala Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Ser

35 40

Asn Lys Gln Asp Pro Asn Glu Val Lys Glu

45 50

Glu Val Ile Lys Ala Gly Gly Glu Ala Val

55 60

Val Val Gln Gly Asp Val Thr Lys Glu Glu

65 70

Asp Val Lys Asn Ile Val Gln Thr Ala Ile

75 80

Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Ile Met Ile

85 90

Asn Asn Ala Gly Leu Glu Asn Pro Val Pro

95 100

Ser His Glu Met Pro Leu Lys Asp Trp Asp

105 110

Lys Val Ile Gly Thr Asn Leu Thr Gly Ala

115 120

Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala Ile Lys Tyr

125 130

Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Asn Val

135 140

Ile Asn Met Ser Ser Val His Glu Val Ile

145 150

Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala

155 160

Ser Lys Gly Gly Ile Lys Leu Met Thr Glu

165 170

Thr Leu Ala Leu Glu Tyr Ala Pro Lys Gly

175 180

Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala

185 190

Ile Asn Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe

195 200

Ala Asp Pro Lys Gln Lys Ala Asp Val Glu

205 210

Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu

215 220

Pro Glu Glu Ile Ala Ala Val Ala Ala Trp

225 230

Leu Ala Ser Lys Glu Ala Ser Tyr Val Thr

235 240

Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met

245 250

Thr Gln Tyr Pro Ser Phe Gln Ala Gly Arg

255 260

Gly。

Claims (4)

1.一种重组大肠杆菌表达酮还原酶生物制备 (S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于底物4-氯乙酰乙酸乙酯的初始反应浓度为12.1~96.8g/L，葡萄糖初始反应浓度为10 ~100g/L、辅因子NA(P)D⁺ 的初始浓度为0~1.5mmol/L，重组大肠杆菌的用量以湿细胞计为10~100 g/L，反应温度为15~40 °C，反应转速为50~200rpm，所用水相反应系统为pH4.0~10.0的缓冲溶液中进行转化反应，反应时间为2~16h。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌表达酮还原酶生物制备 (S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于导入了酮还原酶基因的重组大肠杆菌不对称还原制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。

3.根据权利要求2重组大肠杆菌表达酮还原酶生物制备 (S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征是所述的不对称制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重组大肠杆菌，所述的酮还原酶的基因序列为：atggcaaaga attttagcaa tgtagagtat cccgcacccc cccccgcaca tacaaagaat

gagagcttac aagtattaga tttatttaag ttaaatggaa aagtagcaag cataacagga

agcagcagcg gaataggata tgcattagca gaggcttttg cacaagtcgg agcagatgta

gcaatatggt ataatagcca tgatgcaaca ggaaaagcag aggcattagc aaagaagtat

ggagtaaagg taaaggcata taaagcaaat gtaagcagca gcgatgcagt caagcaaaca

atagagcaac aaataaagga ttttggacat ttagatatag tagtagcaaa tgcaggaata

ccctggacaa agggagcata tatagatcaa gatgatgaca agcattttga ccaagtagta

gatgtagact taaagggagt aggatacgta gcaaagcatg caggaaggca ttttagggaa

aggtttgaga aagagggaaa aaagggagca ttagtattta cagcaagcat gagcggacat

atagtaaatg tcccccaatt ccaagcaaca tataatgcag caaaggcagg agtaaggcat

tttgcaaaga gcttagcagt cgagtttgca ccctttgcaa gggtaaatag cgtaagcccc

ggatatataa atacagaga aagcgatttc gtcccccaag agacacaaaa taagtggtgg

agcttagtcc ccttaggaag gggaggagag acagcagagt tagtaggagc atatttattc

ttagcaagcg atgcaggaag ctatgcaaca ggaacagata taatagtaga tggaggatat

acattaccct aa 。

4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌表达酮还原酶生物制备 (S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于以表达酮还原酶重组大肠杆菌为催化剂，以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，以葡萄糖作为辅助底物，以表达葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌提供还原力NAD(P)H，不对称还原制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。

Images