CN112175971A

CN112175971A - 密码子优化的krd基因和gdh基因及其应用

Info

Publication number: CN112175971A
Application number: CN201910597587.1A
Authority: CN
Inventors: 张贵民; 全艳彩; 黄文波
Original assignee: Lunan Pharmaceutical Group Corp
Current assignee: Lunan Pharmaceutical Group Corp
Priority date: 2019-07-04
Filing date: 2019-07-04
Publication date: 2021-01-05

Abstract

本发明属于酶催化领域，具体公开了一种密码子优化的KRD基因和GDH基因及其用于生物催化制备(S)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯的方法。本发明所提供的重组大肠杆菌能够同时表达酮还原酶和葡萄糖脱氢酶，并在细胞周质空间内表达，表达的酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的酶活性高，利用该构建的重组大肠杆菌全细胞催化制备(S)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯，无需添加辅酶或辅酶因子，解决了传统微生物法催化制备(S)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯成本高昂的问题，转化率高达99.9％，ee值高达100％。

Description

密码子优化的KRD基因和GDH基因及其应用

技术领域

本发明属于酶催化领域，具体涉及密码子优化的KRD基因和GDH基因及其用于生物催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法。

背景技术

瑞舒伐他汀钙最早是由日本野义公司开发，2007年4月阿斯利康制药公司瑞舒伐他汀获得国家食品药品监督管理局批准上市，标志着瑞舒伐他汀钙片正式进入中国市场。瑞舒伐他汀钙片在国内需求量大，仅2007年就在国内医院创造了200多万的销售额。2017年，国内瑞舒伐他汀钙片产品的市场规模突破60亿元。

瑞舒伐他汀钙是一种选择性HMG-CoA还原酶抑制剂，其主要的功能就是用于高血胆固醇症、单纯性高血脂甘油三酯症以及混合型血脂紊乱等三种病症的治疗，尤其是这种药物的使用对于降低胆固醇和油脂类指标存在较为突出的作用。光学纯的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(Ethyl 4-chloro-3-hydroxyrate，(S)-CHBE)是一种重要的有机中间体，其最主要的用途是作为合成降胆固醇药物阿托伐他汀的前体化合物。其手性单一对映体(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯((S)-CHBE)同样可用于其他很多活性药物的合成，如羟甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)还原酶抑制剂和1,4-二氢吡啶类β-阻滞剂等。

潜手性物质4-氯乙酰乙酸乙酯(Ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate，COBE)具有易于合成且价格低廉的优点，以其为反应底物进行不对称还原反应获取(S)-CHBE是非常经济有效的制备途径。

目前所知的从COBE还原为手性醇的方法主要有三条路径：

1、化学催化剂不对称还原法：用铑、钌等金属催化剂对COBE进行不对称还原；

2、酶催化不对称还原法，用提取纯化后的酶(商品酶)如乙醛还原酶等进行不对称还原；

3、微生物催化不对称还原法，即通过完整的微生物细胞(如面包酵母)的立体选择性生物催化来实现。

综合以上三种方法中，化学催化剂不对称还原法，采用的金属催化剂价格昂贵，另外产物立体选择性不够高，催化还原反应需要很高的氢气压，耗能高、废弃的重金属催化剂对环境污染大；酶催化不对称还原法存在过程操作繁琐和酶容易失活的缺陷，且需要添加价格昂贵的辅酶(一般为NADH或NADPH)，成本较高；微生物催化法有着反应条件温和，反应迅速，副产物产生少，产物的处理简单等优势，因此越来越受到关注。但要筛选获得高立体选择性的优良微生物菌株比较困难；同时也需要添加辅酶，并不断供给能量物质，另外还有底物对菌体的毒性及在水溶液中的不稳定性问题；由于微生物细胞内存在的酶系复杂，往往催化产物的光学纯度不高。

以重组的还原酶直接进行催化反应，需要按照化学剂量添加大量昂贵辅酶(NADH、NADPH)。因此，为了获得高产量、高纯度的(S)-CHBE，需要克隆脱氢酶基因实现辅酶的高效原位再生，以提供一种高效率的辅酶再生循环体系。

CN103173503A公开了一种用于不对称制备(S)-CHBE的重组大肠杆菌，是导入酮还原酶基因(KRED)的大肠杆菌。用于为表达葡萄糖脱氢酶(GDH)的大肠杆菌提供催化反应所必须的还原力NAD(P)H。该方法是将酮还原酶及葡萄糖脱氢酶分别导入不同的大肠杆菌，再选择这两种提供不同酶的大肠杆菌加入到反应体系，反应过程中需要加入少量的NAD(P)H，并且大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-KRED活较低，反应时间长达12h，并且反应与COBE底物浓度、双菌质量比，葡萄糖浓度、产物浓度等多因素的影响，产物转化率较低，反应12h后最高才达到92％。

CN104651292A公开了一种不对称转化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重组大肠杆菌及其应用，该重组大肠杆菌同时具有羰基还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因的大肠杆菌，能够同时表达羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶。但是，该重组大肠杆菌重组表达的羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶属于大肠杆菌胞内表达，所表达的酶多以包涵体形式存在，蛋白质不能够正确折叠，形成无活性或低活性的状态，需要将其破碎溶解、复性后重组蛋白才能发挥其正常的生物学功能，直接使用全细胞催化，容易导致蛋白酶活性很低或基本无活性。另外，其在(S)CHBE中的应用中，需要将冻干菌体作为催化剂，成本较高，且菌体冻干后成活率低。

综上所述，目前微生物催化不对称还原COBE存在着需要添加昂贵的辅酶NADH或NADPH，表达的酶活性低，或表达酶为细胞内产物，需要破壁复性后才能使得重组蛋白酶发挥正常的生物学功能、操作复杂、过程繁琐，生产成本高等问题。因此急需构建一种生物催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重组大肠杆菌。

发明内容

本发明的目的是提供一种密码子优化的鲁氏酵母的酮还原酶(KRD)基因和枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶(GDH)基因，以及利用该密码子优化的酮还原酶(KRD)和葡萄糖脱氢酶(GDH)基因在不对称转化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的应用，从而解决现有技术中的化学法催化产物的产率低，能耗高，污染大，微生物法催化产物的产率低，光学纯度不高，并且需要额外添加辅酶，表达的酶活性低，酮还原酶和葡萄糖脱氢酶不能同时在细胞周质空间共表达等问题。

本发明的第一个目的在于提供一种酮还原酶(KRD)和葡萄糖脱氢酶(GDH)基因以及该基因编码的氨基酸序列。

鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)的酮还原酶(ketoreductase，KRD)基因共1014bp碱基，其在GenBank中的收录号为AF178079.1，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。由该基因编码的酮还原酶，包含338个氨基酸，其在GenBank中的收录号为AAF22287.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase，GDH)基因含有783bp碱基，其在Genbank中的收录号为M12276.1，其基因序列如SEQ ID NO.6所示。由该基因编码的葡萄糖脱氢酶，包含260个氨基酸，其在Genbank中的收录号为AAA22463.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明所述鲁氏酵母的酮还原酶KRD基因的序列如SEQ ID NO.4所示；所述的枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶GDH基因的序列如SEQ ID NO.9所示。

本发明的第二个目的在于提供一种表达载体，包括本发明所提供的酮还原酶(KRD)和葡萄糖脱氢酶(GDH)基因。

在一个试验方案中，所述表达载体为pET-26b。

本发明的第三个目的在于提供一种宿主细胞，转化本发明所述的表达载体，所述的宿主细胞选自大肠杆菌。

在一个试验方案中，所述的宿主细胞为重组大肠杆菌，该重组大肠杆菌中共表达了鲁氏酵母的酮还原酶(KRD)和枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶(GDH)。

本发明所述的重组大肠杆菌能在细胞周质空间同时表达鲁氏酵母的酮还原酶KRD和枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶GDH。

本发明的第四个目的在于提供一种共表达上述两个基因的重组大肠杆菌的构建方法。首先将表达载体与酮还原酶KRD基因进行体外连接，验证正确后再与葡萄糖脱氢酶GDH基因连接，通过双酶切和测序验证载体连接的正确性，正确的表达载体通过化学法转化宿主菌即完成重组大肠杆菌的构建。

以下内容详述本发明所述重组大肠杆菌的构建方法：

(1)酮还原酶(KRD)基因和葡萄糖脱氢酶(GDH)基因的优化及合成

鲁氏酵母的酮还原酶(KRD)基因，其在GenBank中的收录号为AF178079.1，基因序列如SEQ ID NO.1所示，在该基因的5′端添加BamHⅠ和3′端添加SacⅠ酶切位点，设计好的基因委托上海生工生物工程(上海)股份有限公司进行全基因合成测序，其合成的基因序列如SEQ ID NO.3所示。

依据鲁氏酵母的酮还原酶(KRD)基因(SEQ ID NO.1所示)，将该序列设计、优化为大肠杆菌密码子偏好性序列，并在优化后的核苷酸序列的5′添加BamHⅠ和3′添加SacⅠ酶切位点，并通过化学合成该基因序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶(GDH)基因，其在Genbank中的收录号为M12276.1，基因序列如SEQ ID NO.6所示，在GDH基因5′端添加大肠杆菌SD序列及pelB leader信号肽序列，两端分别添加酶切位点SalⅠ和NotⅠ，命名为SGDH，设计好的基因委托上海生工生物工程(上海)股份有限公司进行全基因合成测序，其合成的基因序列如SEQ ID NO.8所示。

同样根据大肠杆菌密码子偏好性，将葡萄糖脱氢酶(GDH)基因(SEQ ID NO.6所示)进行优化，并在优化后的基因5′端添加大肠杆菌SD序列及pelB leader信号肽序列，两端分别添加酶切位点SalⅠ和NotⅠ，命名为SGDH，并通过化学合成该基因序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

(2)共表达载体的构建及宿主的转化

先将表达载体pET-26b与基因序列为SEQ ID NO.3的酮还原酶(KRD)基因进行体外连接，验证正确的pET-26b-KRD再通过同样的方法与基因序列为SEQ ID NO.8的SGDH基因连接，通过双酶切和测序验证pET-26b-KRD-SGDH的连接的正确性。正确的表达载体通过化学法转化宿主菌BL21(DE3)，摇瓶试验证实蛋白酮还原酶和葡萄糖脱氢酶均未表达。

将表达载体pET-26b与基因序列为SEQ ID NO.3的酮还原酶(KRD)基因进行体外连接，验证正确的pET-26b-KRD再通过同样的方法与基因序列为SEQ ID NO.9的SGDH基因连接，通过双酶切和测序验证pET-26b-KRD-SGDH的连接的正确性。正确的表达载体通过化学法转化宿主菌BL21(DE3)，摇瓶试验证实蛋白酮还原酶未表达，葡萄糖脱氢酶正确表达。

将表达载体pET-26b与基因序列为SEQ ID NO.3的酮还原酶(KRD)基因进行体外连接，验证正确的pET-26b-KRD再通过同样的方法与基因序列为SEQ ID NO.10的SGDH基因连接，通过双酶切和测序验证pET-26b-KRD-SGDH的连接的正确性。正确的表达载体通过化学法转化宿主菌BL21(DE3)，摇瓶试验证实蛋白酮还原酶未表达，葡萄糖脱氢酶正确表达，但是电泳条带不清晰。

将表达载体pET-26b与基因序列为SEQ ID NO.4的酮还原酶(KRD)基因进行体外连接，验证正确的pET-26b-KRD再通过同样的方法与基因序列为SEQ ID NO.8的SGDH基因连接，通过双酶切和测序验证pET-26b-KRD-SGDH的连接的正确性。正确的表达载体通过化学法转化宿主菌BL21(DE3)，摇瓶试验证实蛋白酮还原酶正确表达，葡萄糖脱氢酶未能表达。

将表达载体pET-26b与基因序列为SEQ ID NO.4的酮还原酶(KRD)基因进行体外连接，验证正确的pET-26b-KRD再通过同样的方法与基因序列为SEQ ID NO.9的SGDH基因连接，通过双酶切和测序验证pET-26b-KRD-SGDH的连接的正确性。正确的表达载体通过化学法转化宿主菌BL21(DE3)，摇瓶试验证实蛋白酮还原酶和葡萄糖脱氢酶能够正确表达，电泳结果显示有明显的蛋白表达带。

将表达载体pET-26b与基因序列为SEQ ID NO.4的酮还原酶(KRD)基因进行体外连接，验证正确的pET-26b-KRD再通过同样的方法与基因序列为SEQ ID NO.10的SGDH基因连接，通过双酶切和测序验证pET-26b-KRD-SGDH的连接的正确性。正确的表达载体通过化学法转化宿主菌BL21(DE3)，摇瓶试验证实蛋白酮还原酶和葡萄糖脱氢酶能够正确表达，但是电泳条带不清晰。

将表达载体pET-26b与基因序列为SEQ ID NO.5的酮还原酶(KRD)基因进行体外连接，验证正确的pET-26b-KRD再通过同样的方法与基因序列为SEQ ID NO.8的SGDH基因连接，通过双酶切和测序验证pET-26b-KRD-SGDH的连接的正确性。正确的表达载体通过化学法转化宿主菌BL21(DE3)，摇瓶试验证实蛋白酮还原酶正确表达，但是电泳条带不清晰，葡萄糖脱氢酶不表达。

将表达载体pET-26b与基因序列为SEQ ID NO.5的酮还原酶(KRD)基因进行体外连接，验证正确的pET-26b-KRD再通过同样的方法与基因序列为SEQ ID NO.9的SGDH基因连接，通过双酶切和测序验证pET-26b-KRD-SGDH的连接的正确性。正确的表达载体通过化学法转化宿主菌BL21(DE3)，摇瓶试验证实蛋白酮还原酶和葡萄糖脱氢酶正确表达，但是电泳条带不清晰。

将表达载体pET-26b与基因序列为SEQ ID NO.5的酮还原酶(KRD)基因进行体外连接，验证正确的pET-26b-KRD再通过同样的方法与基因序列为SEQ ID NO.10的SGDH基因连接，通过双酶切和测序验证pET-26b-KRD-SGDH的连接的正确性。正确的表达载体通过化学法转化宿主菌BL21(DE3)，摇瓶试验证实蛋白酮还原酶和葡萄糖脱氢酶正确表达，但是电泳条带不清晰。

因此，本发明酮还原酶(KRD)基因序列优选为SEQ ID NO.4，葡萄糖脱氢酶(GDH)基因序列优选为SEQ ID NO.9。

本发明的重组大肠杆菌BL21(DE3)(pET-26b-KRD-SGDH)共表达了酮还原酶(KRD)和葡萄糖脱氢酶(GDH)两种蛋白酶，两种酶在一个表达体系中，同时又有不同的SD序列和信号肽序列，互相表达并不干扰，可以在时空上达到两个酶体系的均一性。

大肠杆菌的细胞周质中含有一系列的酶，可以促进目的蛋白的正确折叠，使有活性的酶蛋白的产量提高。另外周质空间的杂蛋白含量低，可以避免重组蛋白的胞内的降解从而稳定的存在，有利于目标产物的浓缩。周质空间位于两层细胞膜之间，更容易将目的蛋白从胞内释放到胞外而不影响细胞的完整性。

本发明的第五个目的在于提供重组大肠杆菌在4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。

所述不对称还原反应采用水相系统转化法。现有技术中两相法和单水相催化都比较普遍，相比较而言，单水相催化避免了大量有机试剂对催化剂的毒害作用，有助于提高反应效率。

本发明重组大肠杆菌BL21(DE3)(pET-26b-KRD-SGDH)在不额外添加辅酶的情况下在水相体系中催化COBE完全转化为(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的制备方法。

一种生产(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，在水相反应体系中，以4-氯乙酰乙酸乙酯为原料，异丙醇为氢供体，加入本发明所述重组大肠杆菌进行转化反应制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。

所述制备方法包括如下步骤：培养重组大肠杆菌BL21(DE3)(pET-26b-KRD-SGDH)，将其全细胞加入反应体系，以4-氯乙酰乙酸乙酯为原料，异丙醇为氢供体，利用细胞本身的辅酶系统，在不添加外源性辅酶的条件下高对映选择性合成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。所述反应体系中含水相缓冲液，控制反应温度25～35℃。

具体的为，反应体系中加入水相缓冲液，异丙醇，4-氯乙酰乙酸乙酯和重组大肠杆菌菌体，控制反应温度25～35℃，搅拌反应，GC检测，底物转化完全，停止搅拌，静置分液。有机相加无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。

优选地，所述水相缓冲液为磷酸盐缓冲液，所述水相缓冲液浓度为50～200mM，pH为6.0～7.0；水相缓冲液和底物4-氯乙酰乙酸乙酯的投料质量体积比为3～7:1，ml/g。

优选地，重组大肠杆菌菌体的质量为底物4-氯乙酰乙酸乙酯质量的0.5～1.5％。

优选地，异丙醇与底物4-氯乙酰乙酸乙酯的质量比为0.3～0.8:1。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：

(1)本发明所提供的酮还原酶(KRD)基因和葡萄糖脱氢酶(GDH)基因，二者在大肠杆菌中同时表达，二者在一个体系中保持了时空的一致性，更有利于其催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。

(2)酮还原酶(KRD)和葡萄糖脱氢酶(GDH)都表达于大肠杆菌周质空间中，周质空间的杂蛋白含量低，杂蛋白酶活性要比胞质中低，使所表达的蛋白酶能避免胞内降解而稳定的存在，有利于目标蛋白的表达。

(3)本发明构建的重组大肠杆菌，表达的酮还原酶(KRD)活性高，且无需纯化制备过程，直接将重组大肠杆菌全细胞加入反应体系即可用于催化4-氯乙酰乙酸乙酯。

(4)利用本发明构建的重组大肠杆菌BL21(DE3)(pET-26b-KRD-SGDH)全细胞催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，无需添加辅酶或辅酶因子，解决了传统微生物法催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯成本高昂的问题，转化率高达99.9％，ee值高达100％。

附图说明

图1是本发明的重组共表达载体pET-26b-KRD-GDH的物理图谱；

图2是SDS-PAGE电泳图谱，M：低分子量蛋白质marker，1：阴性对照条带，2：酮还原酶KRD和葡萄糖还原酶GDH在细胞周质空间共表达电泳条带。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明做进一步阐述说明。应当理解为以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。本发明中所用的材料原料等无特殊说明均可通过商业途径获得。

实施例1：重组质粒pET-26b-KRD-SGDH的构建

一、基因设计

鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)的酮还原酶(KRD)基因共1014bp碱基，其在GenBank中的收录号为AF178079.1，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。该基因编码的酮还原酶，包含338个氨基酸，其在GenBank中的收录号为AAF22287.1，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

根据GenBank的序列，在KRD基因的5′添加BamHⅠ和3′添加SacⅠ酶切位点，设计好的基因委托上海生工生物工程(上海)股份有限公司进行全基因合成测序，其合成的基因序列如SEQ ID NO.3所示。

结合大肠杆菌偏爱密码子，在不改变氨基酸的前提下，根据密码子的简并性对序列SEQ ID NO.1进行优化，并在优化后的基因的5′端添加BamHⅠ和3′端添加SacⅠ酶切位点，委托上海生工生物工程(上海)股份有限公司进行全基因合成测序，其合成的基因序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的葡萄糖脱氢酶(GDH)基因含有783bp碱基，其在GenBank中的收录号为M12276.1，其基因序列如SEQ ID NO.6所示。由该基因编码的葡萄糖脱氢酶，包含260个氨基酸，其在GenBank中的收录号为AAA22463.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

根据GenBank的序列，在GDH基因5′端添加大肠杆菌SD序列及pelB leader信号肽序列，两端分别添加酶切位点SalⅠ和NotⅠ，命名为SGDH，设计好的基因委托上海生工生物工程(上海)股份有限公司进行全基因合成测序，其合成的基因序列如SEQ ID NO.8所示。

同样结合大肠杆菌密码子偏好性，在不改变氨基酸的前提下，根据密码子的简并性对序列SEQ ID NO.6进行优化，并在优化后的基因5′端添加大肠杆菌SD序列及pelBleader信号肽序列，两端分别添加酶切位点SalⅠ和NotⅠ，委托上海生工生物工程(上海)股份有限公司进行全基因合成测序，其合成的基因序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

二、提取质粒

分别将带有KRD基因的pUC57-KRD-DH5α委托上海生工生物工程(上海)股份有限公司合成鉴定，甘油菌划线，37℃培养过夜，从平板上挑取单菌落接种至含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基，37℃150rpm培养过夜，取4ml菌液离心收集菌体，提取质粒，加60μL灭菌水洗脱，-20℃保存。

分别将带有GDH基因的pUC57-GDH-DH5α委托上海生工生物工程(上海)股份有限公司合成鉴定，甘油菌划线，37℃培养过夜，从平板上挑取单菌落接种至含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基，37℃150rpm培养过夜，取4ml菌液离心收集菌体，提取质粒，加60μL灭菌水洗脱，-20℃保存。

三、载体pET-26b-KRD-GDH的构建

将上述提取的质粒中的pET-26b、pUCk57-KRD用BamHⅠ和SacⅠ进行双酶切，酶切体系为：pET-26b或pUC57-KRD 30.0μL、10×K buffer 2.0μL、酶BamHⅠ0.5μL、酶SacⅠ3.5μL、ddH₂O 4μL。1％琼脂糖电泳，回收载体和基因的双酶切片段，灭菌水洗脱，pET-26b载体回收大片段为5.35kb，pUC57-KRD回收小片段为1032bp。胶回收后将两者在T4连接酶存在的体系中连接成环。将连接后的产物转化克隆宿主DH5α，挑取转化子酶切、测序，验证后的质粒pET-26b-KRD进行下一步实验。

正确连接的质粒pET-26b-KRD和pUC57-GDH用SalⅠ和NotⅠ进行双酶切，酶切体系为：pUC57-GDH或pET-26b-KRD 30.0μL、10×H buffer 4.0μL、酶SalⅠ1.5μL、酶NotⅠ0.5μL、ddH₂O 4μL。回收双酶切片段，pET-26b-KRD载体回收大片段为6.38kb，pUC57-GDH回收小片段为955bp。体外连接后转化克隆宿主DH5α，双酶切验证、基因测序进行验证，验证正确的即为pET-26b-KRD-GDH质粒。

实施例2重组大肠杆菌的构建

一、大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备：

1、从LB平板上挑取大肠杆菌BL21(DE3)的单克隆至LB培养液中，37℃过夜培养(约16h)。

2、将该菌液按照1:50的比例，转接于新鲜的50ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2.5～3h，当OD₆₀₀为0.3～0.6时停止培养。

3、将菌液转移到冰上预冷的离心管中，冰浴30min，在4℃条件下，4000r/min离心10min。

4、弃掉上清液，用预冷的0.1MCaCl₂溶液轻轻悬浮细胞，4℃条件下，4000r/min离心10min。

5、重复步骤4一次。

6、弃去上清液，加入100μl预冷的CaCl₂溶液，小心悬浮细胞，即制成了感受态细胞悬液。

二、质粒pET-26b-KRD-GDH转化大肠杆菌BL21(DE3)

1、分别将重组质粒3μl pET-26b-KRD-GDH和100μl BL21(DE3)感受态细胞轻轻混匀，冰浴30min。

2、42℃热激90S，迅速置于冰上冰浴5min。

3、分别加入800μlSOC培养液，37℃培养45min。

4、分别取100μl菌液涂布于含50μg/ml卡那霉素的抗性平板上，37℃倒置培养。

三、重组菌BL21(DE3)(pET-26b-KRD-SGDH)表达验证

将上述实验获得的转化子分别接种至含有50μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃培养至菌体浓度OD600约0.6-1.0时，加入终浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，25℃诱导培养20h后，分别在6000rpm离心收集菌体，即为含有胞内表达重组质粒(pET-26b-KRD-SGDH)重组大肠杆菌BL21(DE3)(pET-26b-KRD-SGDH)湿菌体。分别取湿菌体1g，用10ml含20％蔗糖的10mmol/L的Tris-HCl溶液(pH8.0)充分悬浮，4℃维持30min，离心收集菌体，再用10ml、10mmol/L的Tris-HCl溶液(pH8.0)悬浮，4℃维持30min，12000rpm离心后分别取上清进行SDS-PAGE检测，结果见表1。

表1酮还原酶和葡萄糖还原酶目的蛋白表达情况

从表1结果可以看出，当质粒所含目的基因序列为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.9时，酮还原酶和葡萄糖脱氢酶能够正确表达在大肠杆菌细胞周质空间内，其重组质粒构建图谱见图1，SDS-PAGE电泳图谱见图2。

实施例3酶活的测定

挑取表达最好的含有酮还原酶基因SEQ ID NO.4序列和葡萄糖脱氢酶基因SEQ IDNO.9的重组大肠杆菌BL21(DE3)(pET-26b-KRD-SGDH)至含卡那抗性的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜。然后按2％接种量分别接种到新鲜培养液中，37℃培养至OD600约为0.8时，加入IPTG至终浓度0.2mmol/L，于25℃，200rpm，诱导表达20h后，离心(4℃，4000rpm，30min)，菌泥用50mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)重悬，超声破碎细胞(功率300W，超声5s，间歇5s，共5min)，离心(4℃，12000rpm，10min)，采用Bradford方法测定该无细胞粗酶液中蛋白质含量。

还原酶酮还原酶(KRD)活性测定：反应体系为50mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)中含有0.3mMNADH，5mM底物4-氯乙酰乙酸乙酯和适量酶粗液。加入酶活后立即开始扫描反应体系在340nm处吸光度的变化。

葡萄糖脱氢酶(GDH)活性测定体系：采用Sadoff法测定活性。测定体系中包含200mM底物葡萄糖，4uM NAD+，20nM的MnSO₄，适量粗酶液溶于50mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)至终体积2.0mL。加入酶活后立即开始扫描反应体系在340nm处吸光度的变化。

结果显示，重组大肠杆菌BL21(DE3)(pET-26b-KRD-SGDH)的酮还原酶比酶活为51.3U/mg，重组大肠杆菌BL21(DE3)(pET-26b-KRD-SGDH)的葡萄糖脱氢酶比酶活为56.4U/mg。

实施例4重组大肠杆菌BL21(DE3)(pET-26b-KRD-SGDH)全细胞制备

从卡那抗性平板挑取实施例2得到的重组大肠杆菌BL21(DE3)(pET-26b-KRD-SGDH)单菌落，接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于37℃下，200rpm振荡培养，至OD600值达到0.6-1.0时，加入IPTG至浓度为0.2mM，于25℃下继续培养20小时，4℃下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体两遍，再次离心收集菌体即得含有重组酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌BL21(DE3)(pET-26b-KRD-SGDH)全细胞。

实施例5重组大肠杆菌在催化COBE制备(S)-CHBE中的应用

以实施例4制备的重组菌体全细胞作为催化剂。在反应瓶中加入pH为6.0的磷酸盐缓冲溶液(200mM)150ml、异丙醇9g、4-氯乙酰乙酸乙酯30g和0.15g重组大肠杆菌湿菌体。控制温度25℃，搅拌反应1h。GC检测，底物转化率达99.9％，停止搅拌，静置、分液。有机相加无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，收率98.1％，光学纯度100％。

GC检测分析条件为：色谱柱为0.3mm毛细管柱30m(DIKMA)，FID检测器。色谱柱温度208℃，气化和检测温度均为230℃，载气流量20-30ml/min，进样量0.3～0.5μL，载气为N₂。

产物光学纯度检测条件为：色谱柱为CP-Chirasil-DEX CB手性毛细管柱，其余条件同上。

实施例6重组大肠杆菌在催化COBE制备(S)-CHBE中的应用

以实施例4制备的重组菌体全细胞作为催化剂。在反应瓶中加入pH为6.5的磷酸盐缓冲溶液(100mM)150ml、异丙醇40g、4-氯乙酰乙酸乙酯50g和0.5g重组大肠杆菌湿菌体。控制温度30℃，搅拌反应0.5h。GC检测，底物转化率达99.9％，停止搅拌，静置、分液。有机相加无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，收率98.7％，光学纯度100％。

实施例7重组大肠杆菌在催化COBE制备(S)-CHBE中的应用

以实施例4制备的重组菌体全细胞作为催化剂。在反应瓶中加入pH为7.5的Tris-HCl缓冲溶液(50mM)150ml、异丙醇11g、4-氯乙酰乙酸乙酯21.5g和0.32g重组大肠杆菌湿菌体。控制温度35℃，搅拌反应0.5h。GC检测，底物转化率达99.2％，停止搅拌，静置、分液。有机相加无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，收率97.2％，光学纯度100％。

实施例8重组大肠杆菌在催化COBE制备(S)-CHBE中的应用

以实施例4制备的重组菌体全细胞作为催化剂。在反应瓶中加入pH为6.5的磷酸盐缓冲溶液(100mM)150ml、异丙醇15g、4-氯乙酰乙酸乙酯30g和0.3g重组大肠杆菌湿菌体。控制温度30℃，搅拌反应10min。GC检测，底物转化率达99.9％，停止搅拌，静置、分液。有机相加无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，收率98.8％，光学纯度100％。

实施例9重组大肠杆菌在催化COBE制备(S)-CHBE中的应用

以实施例4制备的重组菌体全细胞作为催化剂。在反应瓶中加入pH为6.5的磷酸盐缓冲溶液(100mM)150ml、异丙醇40g、4-氯乙酰乙酸乙酯50g和0.2g重组大肠杆菌湿菌体。控制温度30℃，搅拌反应1h。GC检测，底物转化率达99.9％，停止搅拌，静置、分液。有机相加无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，收率99.4％，光学纯度100％。

序列表

<110> 鲁南制药集团股份有限公司

<120> 密码子优化的KRD基因和GDH基因及其应用

<130> 2019

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1017

<212> DNA

<213> 鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)

<400> 1

atgacaaaag tcttcgtaac aggtgccaac ggattcgttg ctcaacacgt cgttcatcaa 60

ctattagaaa agaactatac agtggttgga tctgtccgtt caactgagaa aggtgataaa 120

ttagctaaat tgctaaacaa tccaaaattt tcatatgaga ttattaaaga tatggtcaat 180

tcgagagatg aattcgataa ggctttacaa aaacattcag atgttgaaat tgtcttacat 240

actgcttcac cagtcttccc aggtggtatt aaagatgttg aaaaagaaat gatccaacca 300

gctgttaatg gtactagaaa tgtcttgtta tcaatcaagg ataacttacc aaatgtcaag 360

agatttgttt acacttcttc attagctgct gtccgtactg aaggtgctgg ttatagtgca 420

gacgaagttg tcaccgaaga ttcttggaac aatattgcat tgaaagatgc caccaaggat 480

gaaggtacag cttatgaggc ttccaagaca tatggtgaaa aagaagtttg gaatttcttc 540

gaaaaaacta aaaatgttaa tttcgatttt gccatcatca acccagttta tgtctttggt 600

cctcaattat ttgaagaata cgttactgat aaattgaact tttccagtga aatcattaat 660

agtataataa aaggtgaaaa gaaggaaatt gaaggttatg aaattgatgt tagagatatt 720

gcaagagctc atatctctgc tgttgaaaat ccagcaacta cacgtcaaag attaattcca 780

gcagttgcac catacaatca acaaactatc ttggatgttt tgaatgaaaa cttcccagaa 840

ttgaaaggta aaatcgatgt tgggaaacca ggttctcaaa atgaatttat taaaaaatat 900

tataaattag ataactcaaa gaccaaaaaa gttttaggtt ttgaattcat ttcccaagag 960

caaacaatca aagatgctgc tgctcaaatc ttgtccgtta aaaatggaaa aaaataa 1017

<210> 2

<211> 338

<212> PRT

<213> 鲁氏酵母酮还原酶(Zygosaccharomyces rouxii Ketoreductase)

<400> 2

Met Thr Lys Val Phe Val Thr Gly Ala Asn Gly Phe Val Ala Gln His

1 5 10 15

Val Val His Gln Leu Leu Glu Lys Asn Tyr Thr Val Val Gly Ser Val

20 25 30

Arg Ser Thr Glu Lys Gly Asp Lys Leu Ala Lys Leu Leu Asn Asn Pro

35 40 45

Lys Phe Ser Tyr Glu Ile Ile Lys Asp Met Val Asn Ser Arg Asp Glu

50 55 60

Phe Asp Lys Ala Leu Gln Lys His Ser Asp Val Glu Ile Val Leu His

65 70 75 80

Thr Ala Ser Pro Val Phe Pro Gly Gly Ile Lys Asp Val Glu Lys Glu

85 90 95

Met Ile Gln Pro Ala Val Asn Gly Thr Arg Asn Val Leu Leu Ser Ile

100 105 110

Lys Asp Asn Leu Pro Asn Val Lys Arg Phe Val Tyr Thr Ser Ser Leu

115 120 125

Ala Ala Val Arg Thr Glu Gly Ala Gly Tyr Ser Ala Asp Glu Val Val

130 135 140

Thr Glu Asp Ser Trp Asn Asn Ile Ala Leu Lys Asp Ala Thr Lys Asp

145 150 155 160

Glu Gly Thr Ala Tyr Glu Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Glu Lys Glu Val

165 170 175

Trp Asn Phe Phe Glu Lys Thr Lys Asn Val Asn Phe Asp Phe Ala Ile

180 185 190

Ile Asn Pro Val Tyr Val Phe Gly Pro Gln Leu Phe Glu Glu Tyr Val

195 200 205

Thr Asp Lys Leu Asn Phe Ser Ser Glu Ile Ile Asn Ser Ile Ile Lys

210 215 220

Gly Glu Lys Lys Glu Ile Glu Gly Tyr Glu Ile Asp Val Arg Asp Ile

225 230 235 240

Ala Arg Ala His Ile Ser Ala Val Glu Asn Pro Ala Thr Thr Arg Gln

245 250 255

Arg Leu Ile Pro Ala Val Ala Pro Tyr Asn Gln Gln Thr Ile Leu Asp

260 265 270

Val Leu Asn Asn Phe Pro Glu Leu Lys Gly Lys Ile Asp Val Gly Lys

275 280 285

Pro Gly Ser Gln Asn Glu Phe Ile Lys Lys Tyr Tyr Lys Leu Asp Asn

290 295 300

Ser Lys Thr Lys Lys Val Leu Gly Phe Glu Phe Ile Ser Gln Glu Gln

305 310 315 320

Thr Ile Lys Asp Ala Ala Glu Ala Gln Ile Leu Ser Val Lys Asn Gly

325 330 335

Lys Lys

<210> 3

<211> 1032

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggatccatga caaaagtctt cgtaacaggt gccaacggat tcgttgctca acacgtcgtt 60

catcaactat tagaaaagaa ctatacagtg gttggatctg tccgttcaac tgagaaaggt 120

gataaattag ctaaattgct aaacaatcca aaattttcat atgagattat taaagatatg 180

gtcaattcga gagatgaatt cgataaggct ttacaaaaac attcagatgt tgaaattgtc 240

ttacatactg cttcaccagt cttcccaggt ggtattaaag atgttgaaaa agaaatgatc 300

caaccagctg ttaatggtac tagaaatgtc ttgttatcaa tcaaggataa cttaccaaat 360

gtcaagagat ttgtttacac ttcttcatta gctgctgtcc gtactgaagg tgctggttat 420

agtgcagacg aagttgtcac cgaagattct tggaacaata ttgcattgaa agatgccacc 480

aaggatgaag gtacagctta tgaggcttcc aagacatatg gtgaaaaaga agtttggaat 540

ttcttcgaaa aaactaaaaa tgttaatttc gattttgcca tcatcaaccc agtttatgtc 600

tttggtcctc aattatttga agaatacgtt actgataaat tgaacttttc cagtgaaatc 660

attaatagta taataaaagg tgaaaagaag gaaattgaag gttatgaaat tgatgttaga 720

gatattgcaa gagctcatat ctctgctgtt gaaaatccag caactacacg tcaaagatta 780

attccagcag ttgcaccata caatcaacaa actatcttgg atgttttgaa tgaaaacttc 840

ccagaattga aaggtaaaat cgatgttggg aaaccaggtt ctcaaaatga atttattaaa 900

aaatattata aattagataa ctcaaagacc aaaaaagttt taggttttga attcatttcc 960

caagagcaaa caatcaaaga tgctgctgct caaatcttgt ccgttaaaaa tggaaaaaaa 1020

taataagagc tc 1032

<210> 4

<211> 1032

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggatccatga cgaaagtctt cgtgactggt gcaaacggtt tcgtagcgca gcatgtagtg 60

caccaactgc tggaaaaaaa ttacactgta gtaggctctg ttcgtagcac cgaaaaaggt 120

gataaactgg ccaaactgct gaacaaccca aaattttctt acgaaatcat caaggatatg 180

gtcaacagcc gtgacgaatt cgacaaagcg ctgcaaaaac attccgacgt agagatcgtg 240

ctgcataccg ccagcccggt attcccaggc ggcatcaaag acgtggagaa ggaaatgatc 300

cagccggcag ttaacggtac ccgtaacgtt ctgctgtcca tcaaagacaa tctgccgaac 360

gtgaaacgtt tcgtctacac ttcttctctg gcggcagttc gcaccgaagg tgcgggttac 420

tctgctgatg aagtggtaac cgaagactct tggaataata tcgcgctgaa ggatgcaacc 480

aaagatgaag gtactgccta cgaagcgtct aaaacttatg gtgaaaaaga agtttggaac 540

ttcttcgaaa aaactaaaaa cgtgaacttt gattttgcca tcatcaaccc ggtttacgta 600

ttcggtccgc agctgttcga agagtacgtt accgacaaac tgaacttctc ttctgagatt 660

atcaacagca tcatcaaggg cgagaaaaaa gagatcgaag gctacgagat cgatgttcgc 720

gacatcgctc gcgcacacat cagcgcagtt gaaaatccgg ccaccacccg ccagcgtctg 780

atcccggcgg tggctccgta taaccagcag accatcctgg atgtcctgaa caactttccg 840

gagctgaaag gcaaaatcga tgtgggtaaa ccgggttccc agaacgaatt catcaaaaaa 900

tactacaagc tggacaactc taagaccaaa aaagttctgg gctttgaatt tatctcccag 960

gaacagacta tcaaagacgc tgcagaagcg cagatcctga gcgttaaaaa cggtaaaaaa 1020

taataagagc tc 1032

<210> 5

<211> 1032

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggatccatga ccaaagtctt cgtaacaggc gcaaacggtt tcgtggcgca gcacgtagtg 60

caccagctgt tagagaagaa ttatactgtt gtaggcagtg tccgctcgac cgagaaaggg 120

gacaaattgg caaagctgtt aaataaccca aagtttagct acgagattat taaagatatg 180

gtaaactcgc gcgatgagtt tgacaaggct ctgcagaagc actcagatgt cgagatcgta 240

ttgcacaccg ctagtcccgt gtttcccgga gggatcaagg acgtggaaaa agaaatgatt 300

caaccagcgg tcaatggaac tcgcaacgtt cttttgagta ttaaggacaa cttacccaac 360

gtcaaacgtt ttgtatatac gtcttcctta gccgccgtgc gcaccgaggg ggccggttac 420

tcggctgatg aagtagttac ggaagactcg tggaataaca tcgccttaaa ggatgcaact 480

aaagacgaag ggaccgccta tgaagcgtcc aaaacatatg gcgaaaagga agtttggaat 540

ttctttgaga agactaagaa cgttaacttc gatttcgcta tcatcaatcc agtgtatgtt 600

ttcggccctc aactgttcga ggaatacgtc accgataagc tgaatttttc ttctgaaatt 660

attaactcga ttatcaaagg cgaaaaaaag gaaattgaag ggtacgagat cgacgttcgt 720

gatatcgcac gcgcacacat ctctgcagtt gagaacccgg ctaccacacg tcagcgcctt 780

atcccggctg tggcaccgta taatcaacag acgatcttag atgttttaaa cgagaatttc 840

cctgaattga aaggaaagat cgatgtagga aagccaggat cacagaatga atttatcaag 900

aagtattata aactggacaa ttccaaaact aagaaagttt taggatttga gttcattagt 960

caggaacaaa caatcaagga tgctgctgca cagatcctgt ccgttaaaaa cggtaagaag 1020

taataagagc tc 1032

<210> 6

<211> 783

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 6

atgtatccgg atttaaaagg aaaagtcgtc gctattacag gagctgcttc agggctcgga 60

aaggcgatgg ccattcgctt cggcaaggag caggcaaaag tggttatcaa ctattatagt 120

aataaacaag atccgaacga ggtaaaagaa gaggtcatca aggcgggcgg tgaagctgtt 180

gtcgtccaag gagatgtcac gaaagaggaa gatgtaaaaa atatcgtgca aacggcaatt 240

aaggagttcg gcacactcga tattatgatt aataatgccg gtcttgaaaa tcctgtgcca 300

tctcacgaaa tgccgctcaa ggattgggat aaagtcatcg gcacgaactt aacgggtgcc 360

tttttaggaa gccgtgaagc gattaaatat ttcgtagaaa acgatatcaa gggaaatgtc 420

attaacatgt ccagtgtgca cgcgtttcct tggccgttat ttgtccacta tgcggcaagt 480

aaaggcggga taaagctgat gacagaaaca ttagcgttgg aatacgcgcc gaagggcatt 540

cgcgtcaata atattgggcc aggtgcgatc aacacgccaa tcaatgctga aaaattcgct 600

gaccctaaac agaaagctga tgtagaaagc atgattccaa tgggatatat cggcgaaccg 660

gaggagatcg ccgcagtagc agcctggctt gcttcgaagg aagccagcta cgtcacaggc 720

atcacgttat tcgcggacgg cggtatgaca caatatcctt cattccaggc aggccgcggt 780

taa 783

<210> 7

<211> 260

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶(Bacillus subtilis glucose dehydrogenase)

<400> 7

Met Tyr Pro Asp Leu Lys Gly Lys Val Val Ala Ile Thr Gly Ala Ala

1 5 10 15

Ser Gly Leu Gly Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe Gly Lys Glu Gln Ala

20 25 30

Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Ser Asn Lys Gln Asp Pro Asn Glu Val

35 40 45

Lys Glu Glu Val Ile Lys Ala Gly Gly Glu Ala Val Val Val Gln Gly

50 55 60

Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Lys Asn Ile Val Gln Thr Ala Ile

65 70 75 80

Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Ile Met Ile Asn Asn Ala Gly Leu Glu

85 90 95

Asn Pro Val Pro Ser His Glu Met Pro Leu Lys Asp Trp Asp Lys Val

100 105 110

Ile Gly Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala Ile

115 120 125

Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Asn Val Ile Asn Met Ser

130 135 140

Ser Val His Ala Phe Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala Ser

145 150 155 160

Lys Gly Gly Ile Lys Leu Met Thr Glu Thr Leu Ala Leu Glu Tyr Ala

165 170 175

Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile Asn Thr

180 185 190

Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Lys Gln Lys Ala Asp Val

195 200 205

Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu Ile Ala

210 215 220

Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Lys Glu Ala Ser Tyr Val Thr Gly

225 230 235 240

Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Gln Tyr Pro Ser Phe Gln

245 250 255

Ala Gly Arg Gly

260

<210> 8

<211> 955

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtcgacttaa tacgactcac tataggggaa ttgtgagcgg ataacaattc ccctctagaa 60

ataattttgt ttaactttaa gaaggagata tacatatgaa atacctgctg ccgaccgctg 120

ctgctggtct gctgctcctc gctgcccagc cggcgatggc catgtatccg gatttaaaag 180

gaaaagtcgt cgctattaca ggagctgctt cagggctcgg aaaggcgatg gccattcgct 240

tcggcaagga gcaggcaaaa gtggttatca actattatag taataaacaa gatccgaacg 300

aggtaaaaga agaggtcatc aaggcgggcg gtgaagctgt tgtcgtccaa ggagatgtca 360

cgaaagagga agatgtaaaa aatatcgtgc aaacggcaat taaggagttc ggcacactcg 420

atattatgat taataatgcc ggtcttgaaa atcctgtgcc atctcacgaa atgccgctca 480

aggattggga taaagtcatc ggcacgaact taacgggtgc ctttttagga agccgtgaag 540

cgattaaata tttcgtagaa aacgatatca agggaaatgt cattaacatg tccagtgtgc 600

acgcgtttcc ttggccgtta tttgtccact atgcggcaag taaaggcggg ataaagctga 660

tgacagaaac attagcgttg gaatacgcgc cgaagggcat tcgcgtcaat aatattgggc 720

caggtgcgat caacacgcca atcaatgctg aaaaattcgc tgaccctaaa cagaaagctg 780

atgtagaaag catgattcca atgggatata tcggcgaacc ggaggagatc gccgcagtag 840

cagcctggct tgcttcgaag gaagccagct acgtcacagg catcacgtta ttcgcggacg 900

gcggtatgac acaatatcct tcattccagg caggccgcgg ttaataagcg gccgc 955

<210> 9

<211> 955

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtcgacttaa tacgactcac tataggggaa ttgtgagcgg ataacaattc ccctctagaa 60

ataattttgt ttaactttaa gaaggagata tacatatgaa atacctgctg ccgaccgctg 120

ctgctggtct gctgctcctc gctgcccagc cggcgatggc catgtacccg gacctgaaag 180

gtaaagtggt tgctatcact ggcgcagctt ccggcctggg taaagcgatg gctatccgtt 240

ttggcaaaga acaggctaag gtagttatca actactattc taataaacag gacccaaacg 300

aggtaaaaga agaggtgatc aaagccggcg gtgaagcggt cgttgtacaa ggtgacgtaa 360

ccaaagaaga ggatgtaaag aacatcgttc agaccgcgat taaggaattc ggtaccctgg 420

acatcatgat taacaacgcg ggtctggaaa acccggtgcc tagccacgag atgcctctga 480

aagattggga caaggttatc ggtaccaacc tgactggtgc attcctgggt tcccgtgaag 540

ctatcaagta tttcgtggag aacgacatta aaggtaacgt aatcaacatg tcctctgttc 600

atgcctttcc ttggccgctg ttcgttcatt atgcggcgtc taaaggcggt atcaaactga 660

tgaccgagac tctggcactg gagtatgcac cgaaaggtat ccgtgtgaac aacatcggcc 720

cgggcgcgat taacactcca atcaacgccg aaaaatttgc ggacccgaaa cagaaagcag 780

acgtcgaatc catgatccca atgggttaca tcggtgaacc ggaagaaatc gctgcagttg 840

cagcctggct ggcctctaaa gaagcttctt atgttactgg tatcacgctg ttcgctgacg 900

gcggcatgac gcagtacccg tctttccagg caggccgtgg ctaataagcg gccgc 955

<210> 10

<211> 955

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtcgacttaa tacgactcac tataggggaa ttgtgagcgg ataacaattc ccctctagaa 60

ataattttgt ttaactttaa gaaggagata tacatatgaa atacctgctg ccgaccgctg 120

ctgctggtct gctgctcctc gctgcccagc cggcgatggc catgtacccg gacctgaaag 180

gtaaagttgt tgctatcacc ggtgctgctt ctggtctggg taaagctatg gctatccgtt 240

tcggtaaaga acaggctaaa gttgttatca actactactc taacaaacag gacccgaacg 300

aagttaaaga agaagttatc aaagctggtg gtgaagctgt tgttgttcag ggtgacgtta 360

ccaaagaaga agacgttaaa aacatcgttc agaccgctat caaagaattc ggtaccctgg 420

acatcatgat caacaacgct ggtctggaaa acccggttcc gtctcacgaa atgccgctga 480

aagactggga caaagttatc ggtaccaacc tgaccggtgc tttcctgggt tctcgtgaag 540

ctatcaaata cttcgttgaa aacgacatca aaggtaacgt tatcaacatg tcttctgttc 600

acgctttccc gtggccgctg ttcgttcact acgctgcttc taaaggtggt atcaaactga 660

tgaccgaaac cctggctctg gaatacgctc cgaaaggtat ccgtgttaac aacatcggtc 720

cgggtgctat caacaccccg atcaacgctg aaaaattcgc tgacccgaaa cagaaagctg 780

acgttgaatc tatgatcccg atgggttaca tcggtgaacc ggaagaaatc gctgctgttg 840

ctgcttggct ggcttctaaa gaagcttctt acgttaccgg tatcaccctg ttcgctgacg 900

gtggtatgac ccagtacccg tctttccagg ctggtcgtgg ttaataagcg gccgc 955

Claims

1.一种核苷酸序列，编码鲁氏酵母的酮还原酶，其特征在于，核苷酸序列为SEQ ID NO：4。

2.一种核苷酸序列，编码枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶，其特征在于，核苷酸序列为SEQ ID NO：9。

3.一种重组表达载体，其特征在于，其含有权利要求1和2所述的核苷酸序列。

4.一种宿主细胞，其特征在于，其含有权利要求3所述的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述的细胞是大肠杆菌。

6.一种提高鲁氏酵母的酮还原酶和枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶蛋白表达量的方法，该方法包括培养权利要求4或5所述的宿主细胞并获得鲁氏酵母的酮还原酶和枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶。

7.权利要求1或2所述的核苷酸序列在生产(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。

8.权利要求3所述重组表达载体在生产(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。

9.权利要求4或5所述宿主细胞在生产(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。

10.权利要求6所述方法获得的鲁氏酵母的酮还原酶和枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶在生产(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。