CN114107355A - 一种高效表达葡萄糖脱氢酶的工程菌的发酵方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开的是一种高效表达葡萄糖脱氢酶的工程菌的发酵方法及其应用，通过将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta，获得了一株能高效表达葡萄糖脱氢酶的工程菌，使用甘油替代葡萄糖作为碳源有效减少乙酸的积累，通过调整补料速度并将转速与溶氧相关联的方法有效的将溶氧控制在30％左右，从而使得葡萄糖脱氢酶的酶活达到了7211.5U/g，湿重达到了0.2g/mL，且发酵液室温放置24h之后，酶活依然保持在86.7％以上，稳定性较好，适合葡萄糖脱氢酶大规模工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种工程菌的发酵方法，更具体一点说，涉及一种高效表达葡萄糖脱氢酶的工程菌的发酵方法及其应用，属于基因工程发酵优化领域。
背景技术
葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase,GDH)是一种可以将葡萄糖氧化得到葡萄糖酸的氧化还原酶。根据其不同的辅酶结合类型，分为吡咯喹啉醌依赖型(pyrroloquinoline quineone-dependent,PQQ-GDH)、黄素腺嘌呤双核苷酸依赖型(FAD-dependent,FAQ-GDH)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖型(NAD(P)+-dependent,NAD(P)+-GDH)三种。本发明涉及的是NAD(P)依赖型葡萄糖脱氢酶。葡萄糖脱氢酶在生物催化方面有广泛的应用。几乎所有的氧化还原反应都需要NAD(P)H的参与，但是辅酶价格昂贵，稳定性差，严格限制了氧化还原酶的工业应用，需引入一个辅酶再生系统。NAD(P)依赖型葡萄糖脱氢酶能催化葡萄糖脱氢，氧化型辅酶NAD+或NADP+作用，生成还原型辅酶NADH或NADPH。因此，葡萄糖脱氢酶可以利用廉价的葡萄糖构建一个酶催化循环系统。此外，葡萄糖脱氢酶还可以与酮基还原酶、辅酶共同作用于特定型羰基类化合物生成光学纯度高的手性醇。在血糖检测以及生物燃料电池方面葡萄糖脱氢酶也有重要的应用价值。
葡萄糖脱氢酶来源较少，主要来源于动物肝脏和芽孢杆菌发酵。芽孢杆菌来源的天然葡萄糖脱氢酶稳定性较差，其在脱离了芽孢的保护后，若不添加任何保护剂则会在40℃开始失活。目前葡萄糖脱氢酶的生产主要存在着发酵液酶活低，发酵时间长且效率低的问题，导致生产成本较高，严重限制了大规模工业化生产及应用。
发明内容
为了解决上述现有技术问题，本发明提供具有工艺简单，发酵液酶活高，效率高等技术特点的一种高效表达葡萄糖脱氢酶的工程菌的发酵方法。
本发明还提供了一种高效表达葡萄糖脱氢酶的工程菌的发酵方法在制备葡萄糖脱氢酶产品中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明一种高效表达葡萄糖脱氢酶的工程菌的发酵方法，该方法包括如下步骤：
步骤1)获得原始基因GDH；
步骤2)根据氨基酸序列设计优化其编码核苷酸序列，全基因合成质粒PET-14b-GDH，所述质粒的序列如SEQ ID NO1所示；
步骤3)将构建好的质粒PET-14b-GDH热激转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，转化pET1-4b-GDH后，培养基培养，获得高效表达GDH的工程菌；
步骤4)诱导表达工程菌后获得菌液，再进行蛋白表达检测；
步骤5)蛋白纯化：将菌液离心集菌后，超声破碎，收集破碎后上清；上清利用镍柱亲和层析；超滤脱盐，冻干保存。
优选的，步骤3)具体为：将大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞冰浴10min后，加入质粒PET-14b-GDH，冰浴20min；
在42℃条件下水浴热激90s，迅速冰浴5min，然后加入LB液体培养基1mL，在37℃条件下培养1h后，5000rpm离心5min，弃900μL上清液，重悬后涂布到Amp抗性的LB固体培养基上；
在37℃条件下培养过夜后挑取单菌落，并PCR鉴定正确。
优选的，诱导表达工程菌具体为：吸取50μL菌种转接到5mL的LB培养基，在37℃，220rpm条件下培养12h以活化菌种，将活化的菌种按照1％的接种量转接到300mL的LB培养基，在37℃，220rpm条件下培养12h得到种子液；向10L发酵罐中加入2.76L微量盐，121℃灭菌20min，向发酵罐中加入240mL补料培养基，调节培养pH值为7，罐温为37℃，接入一级种子液并加入消泡剂，控制通气量为600L/h，罐压为0.1-0.12MPa，转速与溶氧关联，开始培养；设置溶氧大于30％并延时监测2h后开始补料，当培养至OD>60时，加入终浓度为0.5mM的IPTG开始诱导，分别在诱导后1h、2h、9h、12h取样称量湿重，诱导23h后下罐，取样称量湿重。
优选的，蛋白表达检测具体为：分别在诱导后1h、5h及下罐后取样，在各样品中分别取0.1g菌体，用1mL PBS重悬，200W，持续3s，间隔3s，超声至溶液澄清；在12000rpm，4℃离心2min取上清，稀释10倍后进行SDS-PAGE凝胶电泳检测。
优选的，还包括葡萄糖脱氢酶的酶活测定：
分别在诱导后1h、2h、9h、12h、下罐及下罐后24h取样品；在各样品中分别取0.1g菌体，用1mL PBS重悬，200W，持续3s，间隔3s，超声至溶液澄清；
在12000rpm，4℃条件下，离心2min，取上清，并用PBS稀释100倍，获得葡萄糖脱氢酶的粗酶液；
在比色皿中分别加入2.7ml PBS、100μL NAD+、100μL葡萄糖和100μL粗酶液，混匀后迅速放入紫外分光光度计，按空白后读数。
优选的，微量盐包括：Na3C6H5O7·2H2O 74g/L，FeCl3·6H2O 27g/L，CoCl2·6H2O2g/L，Na2MoO4·2H2O 2g/L，ZnSO4·7H2O 3g/L，MnSO4·H2O 2g/L，CuCl2·2H2O 1.3g/L，CaCl2·2H2O 1g/L，H3BO3 0.5g/L。
优选的，补料培养基包括：甘油353g/L，蛋白胨67.2g/L，酵母提取物67.2g/L，MgSO4·2H2O 5.4g/L。
本发明一种高效表达葡萄糖脱氢酶的工程菌的发酵方法在制备葡萄糖脱氢酶产品中的应用。
有益效果：发酵液酶活高，发酵时间短、效率高，降低了生产成本，适合工业化生产，应用场景广阔；能够高效表达GDH，酶活是每克菌体比活高等技术特点，具体一点，GDH发酵湿重重在200g/L以上，最高可以达到330g/L，表达量可以到70％以上，酶活是每克菌体比活高达7211.5U/g，稳定性较好，适合葡萄糖脱氢酶大规模工业化生产。
附图说明
图1为诱导9h超声破碎上清稀释100倍后酶活测定结果图之一；
图2为诱导9h超声破碎上清稀释100倍后酶活测定结果图之二；
图3为诱导11h超声破碎上清稀释100倍后酶活测定结果图之一；
图4为诱导11h超声破碎上清稀释100倍后酶活测定结果图之二；
图5为诱导23h超声破碎上清稀释1000倍后酶活测定结果图之一；
图6为诱导23h超声破碎上清稀释1000倍后酶活测定结果图之二；
图7为下罐24h超声破碎上清稀释1000倍后后酶活测定结果图之一；
图8为下罐24h超声破碎上清稀释1000倍后后酶活测定结果图之二；
图9为不同取样时间蛋白诱导表达情况结果图。
图9中：M：预染蛋白Marker 26616，1：未诱导，2：诱导1h全菌，3：诱导5h全菌，4：诱导5h破碎后上清，5：诱导5h破碎后沉淀，6：下罐时诱导全菌，7：下罐时破碎后上清，8：下罐时破碎后沉淀。
具体实施方式
以下结合说明书附图，对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。
1.基础盐：Na2HPO4 4.1g/L，KH2PO4 3.4g/L，NH4Cl 4.0g/L。
2.微量盐：Na3C6H5O7·2H2O 74g/L，FeCl3·6H2O 27g/L，CoCl2·6H2O 2g/L，Na2MoO4·2H2O 2g/L，ZnSO4·7H2O 3g/L，MnSO4·H2O 2g/L，CuCl2·2H2O 1.3g/L，CaCl2·2H2O 1g/L，H3BO3 0.5g/L，121℃灭菌20min，室温保存。
3.补料培养基：甘油353g/L，蛋白胨67.2g/L，酵母提取物67.2g/L，MgSO4·2H2O5.4g/L，121℃灭菌20min后超净台补加微量盐7mL/L。
实施例1构建高效表达GDH的工程菌株
1)全基因合成pET-14b-GDH重组质粒，所述质粒的序列如SEQ ID NO1所示；
2)将大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞冰浴10min后，加入pET-14b-GDH重组质粒。冰浴20min，42℃热击90s，冰浴5min，然后加入LB液体培养基1mL，37℃培养1h后，5000rpm离心5min，弃900μL上清液，重悬后涂布到Amp抗性的LB固体培养基上；
3.)37℃培养过夜后挑取单菌落，PCR鉴定正确。
实施例2发酵培养
1)吸取50μL菌种转接到5mL的LB培养基，37℃，220rpm培养12h活化菌种，将活化的菌种按照1％的接种量转接到300mL的LB培养基，37℃，220rpm培养12h得到种子液；
2)向10L发酵罐中加入2.76L微量盐，121℃灭菌20min，向发酵罐中加入240mL补料培养基，调节培养pH＝7，罐温为37℃，接入一级种子液并加入消泡剂。控制通气量为600L/h，罐压为0.1-0.12MPa，转速与溶氧关联，开始培养；
3)设置溶氧大于30％并延时监测2h后开始补料。补料工艺参数见表1。
表1不同时间段的补料速度
4)当培养至OD>60时加入终浓度为0.5mM的IPTG开始诱导。诱导时参数见表2。分别在诱导后1h、2h、9h、12h取样称量湿重。
表2诱导表达时参数
5)诱导23h后下罐，取样称量湿重。不同取样时间的湿重见表3。随着培养时间的增加，湿重不断上升。
表3不同取样时间的湿重
实施例3葡萄糖脱氢酶的酶活测定
1)分别在诱导后1h、2h、9h、12h、下罐及下罐后24h取样测酶活；
2)提前30min打开紫外分光光度计预热，使用340nm；
3)取0.1g菌体，用1mL PBS(0.2M,pH＝7)重悬，200W，持续3s，间隔3s，超声至溶液澄清；
4)12000rpm，4℃离心2min取上清，并用PBS(0.2M,pH＝7)稀释100倍即得葡萄糖脱氢酶的粗酶液；
5)比色皿中分别加入PBS(0.2M,pH＝7)2.7ml、NAD+(100g/L)100μL、葡萄糖(1M,pH＝7)100μL和粗酶液100μL，混匀后迅速放入紫外分光光度计，按空白后读数。计算公式：酶活(U/g)＝斜率/6.24*稀释倍数。不同取样时间的酶活见表4和图1-8。诱导23h后，测得酶活较高，能够达到7211.5U/g。并且下罐后室温放置24h再次测量，酶活下降较少，较为稳定。
表4不同取样时间的酶活
实施例4诱导表达情况
1)分别在诱导后1h、5h、及下罐后取样。取0.1g菌体，用1mL PBS(0.2M，pH＝7)重悬，200W，持续3s，间隔3s，超声至溶液澄清。
2)在12000rpm，4℃条件下离心2min取上清，稀释10倍后进行SDS-PAGE凝胶电泳检测结果。结果见图9，诱导后上清中表达量较高。
因此，通过将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta，获得了能高效表达葡萄糖脱氢酶的工程菌，使用甘油替代葡萄糖作为碳源有效减少乙酸的积累，通过调整补料速度并将转速与溶氧相关联的方法有效的将溶氧控制在30％左右，从而使得葡萄糖脱氢酶的酶活达到了7211.5U/g(现有技术中一般菌体比活是174.4U/g)，湿重达到了0.2g/mL，且发酵液室温放置24h之后，酶活依然保持在86.7％以上，稳定性较好，适合葡萄糖脱氢酶大规模工业化生产。
SEQ ID NO1：
ttcttgaagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtgttgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgcagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgcctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtctggcttctgataaagcgggccatgttaagggcggttttttcctgtttggtcactgatgcctccgtgtaagggggatttctgttcatgggggtaatgataccgatgaaacgagagaggatgctcacgatacgggttactgatgatgaacatgcccggttactggaacgttgtgagggtaaacaactggcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaatcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggtgttccacagggtagccagcagcatcctgcgatgcagatccggaacataatggtgcagggcgctgacttccgcgtttccagactttacgaaacacggaaaccgaagaccattcatgttgttgctcaggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgcttcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattctgctaaccagtaaggcaaccccgccagcctagccgggtcctcaacgacaggagcacgatcatgcgcacccgtggccaggacccaacgctgcccgagatgcgccgcgtgcggctgctggagatggcggacgcgatggatatgttctgccaagggttggtttgcgcattcacagttctccgcaagaattgattggctccaattcttggagtggtgaatccgttagcgaggtgccgccggcttccattcaggtcgaggtggcccggctccatgcaccgcgacgcaacgcggggaggcagacaaggtatagggcggcgcctacaatccatgccaacccgttccatgtgctcgccgaggcggcataaatcgccgtgacgatcagcggtccagtgatcgaagttaggctggtaagagccgcgagcgatccttgaagctgtccctgatggtcgtcatctacctgcctggacagcatggcctgcaacgcgggcatcccgatgccgccggaagcgagaagaatcataatggggaaggccatccagcctcgcgtcgcgaacgccagcaagacgtagcccagcgcgtcggccgccatgccggcgataatggcctgcttctcgccgaaacgtttggtggcgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggcgtgcaagattccgaataccgcaagcgacaggccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggtcctcgccgaaaatgacccagagcgctgccggcacctgtcctacgagttgcatgataaagaagacagtcataagtgcggcgacgatagtcatgccccgcgcccaccggaaggagctgactgggttgaaggctctcaagggcatcggtcgacgctctcccttatgcgactcctgcattaggaagcagcccagtagtaggttgaggccgttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaaggagatggcgcccaacagtcccccggccacggggcctgccaccatacccacgccgaaacaagcgctcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttccccatcggtgatgtcggcgatataggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccggccacgatgcgtccggcgtagaggatcgagatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccatgggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcctggtgccgcgcggcagccatatgATGTATCCCGACCTCAAGGGCAAGGTGGTCGCCATCACTGGGGCCGCCTCAGGGTTAGGAAAAGCAATGGCAATTCGCTTCGGCAAAGAACAGGCAAAAGTGGTGATAAATTATTACTCCAACAAACAAGATCCGAATGAAGTTAAGGAGGAGGTGATTAAGGCCGGCGGGGAGGCTGTCGTTGTTCAAGGTGATGTTACCAAAGAGGAAGATGTGAAAAACATTGTTCAAACGGCTATAAAGGAATTTGGTACATTAGACATTATGATTAACAATGCTGGCTTGGAGAATCCGGTTCCGAGCCATGAAATGCCGCTTAAAGATTGGGATAAAGTTATAGGCACCAATCTGACCGGTGCATTTCTGGGTAGCCGTGAAGCAATTAAATACTTCGTGGAGAATGATATCAAGGGTAATGTTATTAATATGAGCAGCGTGCACGAGGTGATTCCGTGGCCTCTCTTCGTACATTACGCGGCCTCGAAGGGGGGCATCAAACTGATGACAGAAACCTTAGCCCTGGAATATGCACCGAAAGGGATAAGAGTAAACAACATCGGTCCCGGGGCTATCAACACACCAATTAATGCAGAAAAATTTGCCGACCCTAAGCAGAAAGCCGACGTTGAAAGCATGATTCCGATGGGTTATATCGGGGAACCGGAAGAAATTGCAGCCGTTGCAGCATGGCTGGCATCTAAGGAGGCGTCGTACGTCACCGGAATAACTCTATTCGCGGATGGTGGTATGACCCAGTACCCAAGCTTTCAAGCTGGACGGGGATAAggatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaata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最后，需要注意的是，本发明不限于以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
发明名称：一种高效表达葡萄糖脱氢酶的工程菌的发酵方法及其应用
第一申请人：浙江清肽生物科技有限公司
第二申请人：浙江理工大学绍兴生物医药研究院有限公司
SEQ ID NO1：
ttcttgaagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtgttgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgcagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgcctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtctggcttctgataaagcgggccatgttaagggcggttttttcctgtttggtcactgatgcctccgtgtaagggggatttctgttcatgggggtaatgataccgatgaaacgagagaggatgctcacgatacgggttactgatgatgaacatgcccggttactggaacgttgtgagggtaaacaactggcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaatcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggtgttccacagggtagccagcagcatcctgcgatgcagatccggaacataatggtgcagggcgctgacttccgcgtttccagactttacgaaacacggaaaccgaagaccattcatgttgttgctcaggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgcttcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattctgctaaccagtaaggcaaccccgccagcctagccgggtcctcaacgacaggagcacgatcatgcgcacccgtggccaggacccaacgctgcccgagatgcgccgcgtgcggctgctggagatggcggacgcgatggatatgttctgccaagggttggtttgcgcattcacagttctccgcaagaattgattggctccaattcttggagtggtgaatccgttagcgaggtgccgccggcttccattcaggtcgaggtggcccggctccatgcaccgcgacgcaacgcggggaggcagacaaggtatagggcggcgcctacaatccatgccaacccgttccatgtgctcgccgaggcggcataaatcgccgtgacgatcagcggtccagtgatcgaagttaggctggtaagagccgcgagcgatccttgaagctgtccctgatggtcgtcatctacctgcctggacagcatggcctgcaacgcgggcatcccgatgccgccggaagcgagaagaatcataatggggaaggccatccagcctcgcgtcgcgaacgccagcaagacgtagcccagcgcgtcggccgccatgccggcgataatggcctgcttctcgccgaaacgtttggtggcgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggcgtgcaagattccgaataccgcaagcgacaggccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggtcctcgccgaaaatgacccagagcgctgccggcacctgtcctacgagttgcatgataaagaagacagtcataagtgcggcgacgatagtcatgccccgcgcccaccggaaggagctgactgggttgaaggctctcaagggcatcggtcgacgctctcccttatgcgactcctgcattaggaagcagcccagtagtaggttgaggccgttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaaggagatggcgcccaacagtcccccggccacggggcctgccaccatacccacgccgaaacaagcgctcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttccccatcggtgatgtcggcgatataggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccggccacgatgcgtccggcgtagaggatcgagatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccatgggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcctggtgccgcgcggcagccatatgATGTATCCCGACCTCAAGGGCAAGGTGGTCGCCATCACTGGGGCCGCCTCAGGGTTAGGAAAAGCAATGGCAATTCGCTTCGGCAAAGAACAGGCAAAAGTGGTGATAAATTATTACTCCAACAAACAAGATCCGAATGAAGTTAAGGAGGAGGTGATTAAGGCCGGCGGGGAGGCTGTCGTTGTTCAAGGTGATGTTACCAAAGAGGAAGATGTGAAAAACATTGTTCAAACGGCTATAAAGGAATTTGGTACATTAGACATTATGATTAACAATGCTGGCTTGGAGAATCCGGTTCCGAGCCATGAAATGCCGCTTAAAGATTGGGATAAAGTTATAGGCACCAATCTGACCGGTGCATTTCTGGGTAGCCGTGAAGCAATTAAATACTTCGTGGAGAATGATATCAAGGGTAATGTTATTAATATGAGCAGCGTGCACGAGGTGATTCCGTGGCCTCTCTTCGTACATTACGCGGCCTCGAAGGGGGGCATCAAACTGATGACAGAAACCTTAGCCCTGGAATATGCACCGAAAGGGATAAGAGTAAACAACATCGGTCCCGGGGCTATCAACACACCAATTAATGCAGAAAAATTTGCCGACCCTAAGCAGAAAGCCGACGTTGAAAGCATGATTCCGATGGGTTATATCGGGGAACCGGAAGAAATTGCAGCCGTTGCAGCATGGCTGGCATCTAAGGAGGCGTCGTACGTCACCGGAATAACTCTATTCGCGGATGGTGGTATGACCCAGTACCCAAGCTTTCAAGCTGGACGGGGATAAggatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaata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Claims (8)
1.一种高效表达葡萄糖脱氢酶的工程菌的发酵方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
步骤1)获得原始基因GDH；
步骤2)根据氨基酸序列设计优化其编码核苷酸序列，全基因合成质粒PET-14b-GDH，所述质粒的序列如SEQ ID NO1所示；
步骤3)将构建好的质粒PET-14b-GDH热激转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，转化pET1-4b-GDH后，培养基培养，获得高效表达GDH的工程菌；
步骤4)诱导表达工程菌后获得菌液，再进行蛋白表达检测；
步骤5)蛋白纯化：将菌液离心集菌后，超声破碎，收集破碎后上清；上清利用镍柱亲和层析；超滤脱盐，冻干保存。
2.根据权利要求1所述的一种高效表达葡萄糖脱氢酶的工程菌的发酵方法，其特征在于：步骤3)具体为：将大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞冰浴10min后，加入质粒PET-14b-GDH，冰浴20min；
在42℃条件下水浴热激90s，迅速冰浴5min，然后加入LB液体培养基1mL，在37℃条件下培养1h后，5000rpm离心5min，弃900μL上清液，重悬后涂布到Amp抗性的LB固体培养基上；
在37℃条件下培养过夜后挑取单菌落，并PCR鉴定正确。
3.根据权利要求1或2所述的一种高效表达葡萄糖脱氢酶的工程菌的发酵方法，其特征在于：诱导表达工程菌具体为：吸取50μL菌种转接到5mL的LB培养基，在37℃，220rpm条件下培养12h以活化菌种，将活化的菌种按照1％的接种量转接到300mL的LB培养基，在37℃，220rpm条件下培养12h得到种子液；向10L发酵罐中加入2.76L微量盐，121℃灭菌20min，向发酵罐中加入240mL补料培养基，调节培养pH值为7，罐温为37℃，接入一级种子液并加入消泡剂，控制通气量为600L/h，罐压为0.1-0.12MPa，转速与溶氧关联，开始培养；设置溶氧大于30％并延时监测2h后开始补料，当培养至OD>60时，加入终浓度为0.5mM的IPTG开始诱导，多次取样称量湿重，诱导后下罐，再次取样称量湿重。
4.根据权利要求1或2所述的一种高效表达葡萄糖脱氢酶的工程菌的发酵方法，其特征在于：蛋白表达检测具体为：分别在诱导后1h、5h及下罐后取样，在各样品中分别取0.1g菌体，用1mL PBS重悬，200W，持续3s，间隔3s，超声至溶液澄清；在12000rpm，4℃离心2min取上清，稀释10倍后进行SDS-PAGE凝胶电泳检测。
5.根据权利要求1所述的一种高效表达葡萄糖脱氢酶的工程菌的发酵方法，其特征在于：还包括葡萄糖脱氢酶的酶活测定：
分别在诱导后多个时间段，以及下罐和下罐取样品；在各样品中分别取0.1g菌体，用1mL PBS重悬，200W，持续3s，间隔3s，超声至溶液澄清；
在12000rpm，4℃条件下，离心2min，取上清，并用PBS稀释100倍，获得葡萄糖脱氢酶的粗酶液；
在比色皿中分别加入2.7ml PBS、100μL NAD+、100μL葡萄糖和100μL粗酶液，混匀后迅速放入紫外分光光度计，按空白后读数。
6.根据权利要求3所述的一种高效表达葡萄糖脱氢酶的工程菌的发酵方法，其特征在于：微量盐包括：Na3C6H5O7·2H2O 74g/L，FeCl3·6H2O 27g/L，CoCl2·6H2O 2g/L，Na2MoO4·2H2O 2g/L，ZnSO4·7H2O 3g/L，MnSO4·H2O 2g/L，CuCl2·2H2O 1.3g/L，CaCl2·2H2O 1g/L，H3BO3 0.5g/L。
7.根据权利要求3或6所述的一种高效表达葡萄糖脱氢酶的工程菌的发酵方法，其特征在于：补料培养基包括：甘油353g/L，蛋白胨67.2g/L，酵母提取物67.2g/L，MgSO4·2H2O5.4g/L。
8.一种高效表达葡萄糖脱氢酶的工程菌的发酵方法在制备葡萄糖脱氢酶产品中的应用。
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