CN108893439A

CN108893439A - 一种可高效表达葡萄糖脱氢酶的枯草芽胞杆菌工程菌

Info

Publication number: CN108893439A
Application number: CN201810695022.2A
Authority: CN
Inventors: 张玲; 杨海麟; 林荣; 王男
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-06-29
Filing date: 2018-06-29
Publication date: 2018-11-27
Anticipated expiration: 2038-06-29
Also published as: CN108893439B

Abstract

本发明涉及一种可高效表达葡萄糖脱氢酶的枯草芽胞杆菌工程菌，属于生物工程及基因工程技术领域。本发明以以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶(FAD‑GDH)基因作为目的基因，以pMA5质粒或插入了启动子的pMA5质粒作为表达载体，以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为表达宿主，构建了一种可高效表达以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶的基因工程菌；采用此菌摇瓶发酵生产以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶，可使胞内酶活高达3626U/L。

Description

一种可高效表达葡萄糖脱氢酶的枯草芽胞杆菌工程菌

技术领域

本发明涉及一种可高效表达葡萄糖脱氢酶的枯草芽胞杆菌工程菌，属于生物工程及基因工程技术领域。

背景技术

葡萄糖氧化还原酶是一类催化葡萄糖氧化还原反应的酶，常被用于开发传感器或检测试剂盒。它根据电子受体的差异，可分为葡萄糖氧化酶(GOD)和葡萄糖脱氢酶(GDH)，其中，葡萄糖氧化酶是葡萄糖检测试剂盒或葡萄糖传感器中应用最广泛的原料用酶，但其催化活性易受溶解氧的限制，会造成测量误差。

近些年，研究发现葡萄糖脱氢酶不以氧气为电子受体不受溶解氧的限制，用于检测葡萄糖检测结果误差更小，具有替代葡萄糖氧化酶的应用潜力。

葡萄糖脱氢酶按照辅基或辅酶类型可分为四类：以NADP+为辅酶的葡萄糖六磷酸脱氢酶(EC1.1.1.49简称G6PDH)；以NAD+为辅酶的葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.47简称NAD-GDH)；以PQQ为辅基的葡萄糖脱氢酶(EC1.1.5.2简称PQQ-GDH)以及以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶(EC1.1.99.10简称FAD-GDH)。

其中，G6PDH和NAD-GDH的辅因子结合不紧密，催化过程中需要不断添加辅酶；PQQ-GDH热稳定性差，底物谱较广，除葡萄糖外还能以多种单糖和二糖为底物，上述缺陷均大大限制了G6PDH、NAD-GDH以及PQQ-GDH在检测血糖方面的应用；而FAD-GDH具有热稳定性好，催化效率高，辅基结合紧密等优势，是替代目前诊断用葡萄糖氧化酶的首选。然而，FAD-GDH在菌中分泌极少，因此，想达到FAD-GDH的工业生产仍存在很多问题。

目前，已经有研究试图通过构建基因工程菌以提高FAD-GDH在菌中的分泌量，如：杨愈峰等人将来源于土曲霉的FAD-GDH基因在Pichia pastoris中进行表达，通过表达筛选及15L发酵罐发酵，上清酶活达2.6×10⁵U/L，但在酵母菌中表达的异源葡萄糖脱氢酶存在糖基化修饰，会干扰血糖检测电极的灵敏度，实际生产应用中需进行酶的去糖基化步骤；周立伟等人筛选克隆出来源于青霉的FAD-GDH基因在E.coli BL21中表达，但表达出的蛋白大部分为包涵体；周立伟等人也尝试将筛选克隆出来源于青霉的FAD-GDH基因在毕赤酵母中表达，但表达量较低，仅为1×10^-4U/L，上述工程菌分泌得到的蛋白在纯化和放大生产中均存在较大的缺陷。

因此，如何找到一种既能够提高FAD-GDH在菌中的分泌量，又不影响分泌得到的蛋白质量的方法仍需进一步试验。

发明内容

为解决上述问题，本发明以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)基因作为目的基因，以pMA5质粒或插入了启动子的pMA5质粒作为表达载体，以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)作为表达宿主，构建了一种可高效表达以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶的基因工程菌；采用此菌摇瓶发酵生产以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶，可使胞内酶活高达3626U/L。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种可高效表达葡萄糖脱氢酶的枯草芽胞杆菌工程菌，所述工程菌包含重组质粒和表达宿主；所述重组质粒包含目的基因以及表达载体；所述目的基因为以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)基因；所述表达载体为pMA5质粒或插入了启动子的pMA5质粒；所述表达宿主为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；

在本发明的一种实施方式中，所述工程菌包含重组质粒和表达宿主；所述重组质粒包含目的基因以及表达载体；所述目的基因为以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)基因；所述表达载体为pMA5质粒或插入了P_amyQ’启动子的pMA5质粒或插入了P₄₃启动子的pMA5质粒或插入了P_gsiB启动子的pMA5质粒或插入了P_opuaa启动子的pMA5质粒或插入了移除cre位点的P_amyQ’启动子的pMA5质粒；所述表达宿主为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；所述cre位点是指启动子上游的一段具有回文结构的保守序列。

在本发明的一种实施方式中，所述启动子的插入位点在pMA5质粒自带的P_HpaⅡ启动子的下游。

在本发明的一种实施方式中，所述以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)基因来源于洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)。

在本发明的一种实施方式中，所述以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

在本发明的一种实施方式中，所述P_amyQ’启动子来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。

在本发明的一种实施方式中，所述P_amyQ’启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

在本发明的一种实施方式中，所述P₄₃启动子来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。

在本发明的一种实施方式中，所述P₄₃启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。

在本发明的一种实施方式中，所述P_gsiB启动子来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。

在本发明的一种实施方式中，所述P_gsiB启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.4。

在本发明的一种实施方式中，所述P_opuaa启动子来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。

在本发明的一种实施方式中，所述P_opuaa启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.5。

在本发明的一种实施方式中，所述cre位点的核苷酸序列为SEQ ID NO.6：TGWAARCGYTWNCW，其中，W为碱基A或T，R为碱基A或G，N为任意碱基。

在本发明的一种实施方式中，所述移除cre位点的P_amyQ’启动子的核苷酸序列为SEQID NO.7。

在本发明的一种实施方式中，所述以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)基因的上游引物序列为SEQ ID NO.8，下游引物序列为SEQ ID NO.9。

在本发明的一种实施方式中，所述P_amyQ’启动子的上游引物序列为SEQ ID NO.10，下游引物序列为SEQ ID NO.11。

在本发明的一种实施方式中，所述P₄₃启动子的上游引物序列为SEQ ID NO.12，下游引物序列为SEQ ID NO.13。

在本发明的一种实施方式中，所述P_gsiB启动子的上游引物序列为SEQ ID NO.14，下游引物序列为SEQ ID NO.15。

在本发明的一种实施方式中，所述P_opuaa启动子的上游引物序列为SEQ ID NO.16，下游引物序列为SEQ ID NO.17。

在本发明的一种实施方式中，所述表达宿主为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WB600。

本发明提供了一种生产葡萄糖脱氢酶的方法，所述方法为使用上述一种可高效表达葡萄糖脱氢酶的枯草芽胞杆菌工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为将上述一种可高效表达葡萄糖脱氢酶的枯草芽胞杆菌工程菌现在种子培养基中进行培养，得到种子液；再将种子液接种至发酵培养基进行培养，得到含葡萄糖脱氢酶的发酵培养液。

本发明提供了上述一种可高效表达葡萄糖脱氢酶的枯草芽胞杆菌工程菌或上述一种生产葡萄糖脱氢酶的方法在生产葡萄糖脱氢酶、制备葡萄糖传感器、制备葡萄糖检测试剂盒以及检测葡萄糖方面的应用。

有益效果：

(1)本发明以以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)基因作为目的基因，以pMA5质粒或插入了P_amyQ’启动子的pMA5质粒或插入了P₄₃启动子的pMA5质粒或插入了P_gsiB启动子的pMA5质粒或插入了P_opuaa启动子的pMA5质粒或插入了除去cre位点的P_amyQ’启动子的pMA5质粒作为表达载体，以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600作为表达宿主，构建了一种可高效表达以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶的基因工程菌；

(2)本发明的工程菌进行了基因改造，除去了cre位点，减少了碳代谢产物对启动子转录的抑制，进一步提高了以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶的产量；

(3)采用本发明的工程菌摇瓶发酵生产以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶，发酵48h，可使胞内酶活高达3626U/L。

附图说明

图1为重组质粒pMA5/gdh的构建流程；

图2pMA5/gdh双酶切验证图谱

图3为重组菌B.subtilis/pMA5/gdh表达的FAD-GDH的SDS-PAGE鉴定结果；

图4为重组菌B.subtilis/pMA5/gdh表达的FAD-GDH的飞行质谱鉴定结果；

图5为重组质粒pMA5-P_amyQ’/gdh、pMA5-P₄₃/gdh、pMA5-P_gsiB/gdh、pMA5-P_opuaa/gdh的构建流程；

图6载体pMA5-P_amyQ’/gdh、pMA5-P₄₃/gdh、pMA5-P_gsiB/gdh、pMA5-P_opuaa/gdh双酶切验证图谱；

图7为不同重组菌表达FAD-GDH的结果；

图8为不同重组菌表达FAD-GDH的SDS-PAGE鉴定结果；

图9为不同浓度的葡萄糖对改造前重组菌B.subtilis/pMA5-P_amyQ/gdh及改造后重组菌B.subtilis/pMA5-P_{amyQ’.del.14nt}/gdh产FAD-GDH及菌体生长的影响；

图10为不同浓度的甘油对改造前重组菌B.subtilis/pMA5-P_amyQ/gdh及改造后重组菌B.subtilis/pMA5-P_{amyQ’.del.14nt}/gdh产FAD-GDH及菌体生长的影响。

具体实施方式

以下实施例用于非限制性地解释本发明的技术方案，各实施例中所用的葡萄糖脱氢酶基因(gdh)由南京金斯瑞合成并构建与载体pUC57，各实施例中所用E.coli JM109菌株、B.subtilis 168菌株以及B.subtilis WB600菌株均由江南大学微生物实验室保存。

下述实施例中所涉及的试剂为：

购自大连宝生物有限公司的限制性内切酶、T4DNA连接酶、rTaq DNA聚合酶、蛋白质Low Marker、DNA Marker；购自上海生工股份有限公司的DNA凝胶回收试剂盒；购自国药集团药业股份有限公司的PCR产物回收试剂盒。

下述实施例中所涉及的培养基及缓冲液为：

LB培养基(g/L)：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，氯化钠5.0，加入2％的琼脂即为LB固体培养基。

TB培养基(g/L)：甘油4.0，酵母粉24.0，蛋白胨12.0，溶解在800mL去离子水中，高压灭菌后冷却至40℃加入200mL灭菌的缓冲液(缓冲液：磷酸氢二钾16.4g，磷酸二氢钾2.32g，溶解于去离子水中，定容至200mL，0.22μm的滤膜过滤除菌或高压灭菌)。

抗生素溶液：先将抗生素配置成浓度为100mg/mL的母液，然后用0.22μm的滤膜过滤除菌，用小的EP管分装，置于﹣20℃保存。

磷酸钾缓冲液(PB，50mmol/L，pH为7.0)：取86mL的0.1mol/L的K₂HPO₄，加入14mL的0.1mol/L的KH₂PO₄，再加入100mL的水，调节pH至7.0。

下述实施例中所涉及的培养方法为：

种子液的制备：从卡纳抗性的固体培养基上，挑取重组菌B.subtilis单菌落，接种到LB液体培养基，37℃，200r/min摇床培养8h。

摇瓶发酵培养：以体积分数4％转接种子液于发酵培养基中，30℃，220r/min，培养48h。

下述实施例中所涉及的检测方法为：

菌体生物量测定：取20mL不同浓度的菌液，8000r/min离心10min，用pH为7.0、50mmol/L的PB缓冲液清洗两次，测定湿重，105℃烘干至恒定值，称取干重。

菌体湿重约是干重的3.8倍。

葡萄糖脱氢酶酶活测定：取100μL适当稀释的酶液，加入3mL显色液(50mmol/L、pH为7.0的PB缓冲液，0.03mmol/L的DCPIP，1.6mmol/L的PMS，100mmol/L的葡萄糖溶液)轻轻混匀，用重蒸水调零，37℃每隔1min记录600nm处吸光值的变化，共记录2-3min。

用酶的缓冲液代替酶液作为对照。

酶活定义：在一定条件下，每分钟还原1μmol DCPIP所需的酶量定义为一个酶活单位。

葡萄糖脱氢酶SDS-PAGE分析：采用5％的浓缩胶与15％的分离胶，pH为8.3的Tris-Gly电泳缓冲液，90V恒压，将剥离电泳后的胶，染色，脱色。

下述实施例中所用的引物如表1：

表1引物

注：下划线部分为酶切位点。

实施例1：重组质粒的构建

将pUC57/gdh上的来源于洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)的以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)基因进行PCR扩增(引物见表1)，扩增产物回收，并通过BamH Ⅰ和Mlu Ⅰ进行双酶切，插入同样双酶切的质粒pMA5自带的启动子P_HpaⅡ的下游，构建重组质粒pMA5/gdh(构建过程如图1)。

将得到的重组质粒分别转化E.coli JM109，经过氨苄抗性平板筛选，从阳性转化子中提取质粒，分别利用BamH Ⅰ和Mlu Ⅰ双酶切电泳验证(验证结果如图2)，凝胶电泳条带与目的基因大小一致，并将验证正确的基因测序，与目的序列比对，结果表明构建成功。

实施例2：重组菌的构建

将实施例1得到的重组质粒pMA5/gdh转入B.subtilis感受态WB600，从含有卡纳抗性的平板上挑选阳性克隆，获得重组菌株B.subtilis/pMA5/gdh将获得的重组菌摇瓶发酵培养48h，得到发酵液，离心收集菌体，将菌体进行细胞破碎，离心得上清，上清即酶液。

将得到酶液进行酶活检测，检测结果为：重组菌株B.subtilis/pMA5/gdh的胞内酶活为962U/L。取30μL由B.subtilis/pMA5/gdh所得的酶液，加入10μL 4×的上样缓冲液，煮沸10min，进行SDS-PAGE检测，结果见图3，由于空白对照处也存在一条60kDa的条带，所以将破壁上清SDS-PAGE图谱中60kDa处的条带切胶回收，进行飞行质谱分析，结果见图4，比对结果显示与目的条带匹配度最高的为来源于Burkholderia cepacia的葡萄糖脱氢酶，分子量60kDa，进一步表明FAD-GDH在B.subtilis WB600中表达成功。

实施例3：含双启动子的重组质粒的构建

以B.subtilis 168基因组为模板进行PCR扩增P_amyQ’、P₄₃、P_gsiB、P_opuaa启动子的序列(引物见表1)，扩增产物回收双酶切插入pMA5自带的启动子P_HpaII的下游以及目的基因的上游，分别获得重组质粒pMA5-P_amyQ’/gdh、pMA5-P₄₃/gdh、pMA5-P_gsiB/gdh、pMA5-P_opuaa/gdh(构建过程见图5)。

分别利用NdeⅠ和MluⅠ双酶切电泳验证(验证结果如图6)，并将验证正确的基因测序，与目的序列比对，比对结果表明构建成功。

实施例4：含双启动子的重组菌的构建

将实施例3得到的重组质粒pMA5-P_amyQ’/gdh、pMA5-P₄₃/gdh、pMA5-P_gsiB/gdh、pMA5-P_opuaa/gdh转化感受态B.subtilis WB600，从含有卡纳抗性的平板上挑选阳性克隆，获得重组菌株B.subtilis/pMA5-P_amyQ’/gdh、B.subtilis/pMA5-P₄₃/gdh、B.subtilis/pMA5-P_gsiB/gdh、B.subtilis/pMA5-P_opuaa/gdh，将获得的重组菌摇瓶发酵培养48h，得到发酵液，离心收集菌体，将菌体进行细胞破碎，离心得上清，上清即酶液。

将得到酶液进行酶活检测，检测结果为：重组菌株B.subtilis/pMA5-P_amyQ’/gdh的胞内酶活为2497U/L、B.subtilis/pMA5-P₄₃/gdh的胞内酶活为578U/L、B.subtilis/P_gsiB/gdh的胞内酶活为740U/L、B.subtilis/-P_opuaa/gdh的胞内酶活为878U/L，重组菌株B.subtilis/pMA5-P_amyQ’/gdh的胞内酶活最高。

取30μL上述所得的酶液，加入10μL 4×的上样缓冲液，煮沸10min，进行SDS-PAGE检测，结果见图8。

由上述结果可知：重组菌株B.subtilis/pMA5-P_amyQ’/gdh的胞内酶活最高。

实施例5：cre位点对重组菌FAD-GDH产量及菌体生物量的影响

通过将启动子P_amyQ’的核苷酸序列与cre位点的核苷酸序列进行对比，确定启动子P_amyQ’中的cre位点序列为SEQ ID NO.20：TGTAAGCGTTAACA。

利用引物对P_{amyQ’.del.14nt}-F/P_{amyQ’.del.14nt}-R(见表1)对启动子P_amyQ’进行PCR扩增，移除P_amyQ’启动子中14个核苷酸的cre位点，得到P_{amyQ’.del.14nt}，并按照实施例3、4的方法构建重组菌B.subtilis/pMA5-P_{amyQ’.del.14nt}/gdh。

将获得的重组菌分别在添加了3％的葡萄糖、2％的甘油的发酵培养基中进行摇瓶发酵培养48h，得到发酵液，离心收集菌体，将菌体进行细胞破碎，离心得上清，上清即酶液。

将得到酶液进行酶活检测，检测结果为：在添加了3％葡萄糖的培养基中培养的重组菌株的B.subtilis/pMA5-P_{amyQ’.del.14nt}/gdh的胞外酶活为3626U/L、在添加了2％甘油的培养基中培养的重组菌株的B.subtilis/pMA5-P_{amyQ’.del.14nt}/gdh的胞外酶活为3119U/L(检测结果如图9、10)。

由上述结果可知：培养基添加3％-4％的葡萄糖，一定程度上促进菌体生长及酶的表达，删去启动子P_amyQ’的cre位点可减少碳源代谢产物对基因转录的抑制，促进外源基因表达。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种可高效表达葡萄糖脱氢酶的枯草芽胞杆菌工程菌

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1638

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggcggaca ccgataccca aaaggcggac gtggttgtgg ttggtagcgg cgtggcgggt 60

gcgatcgttg cgcaccagct ggcgatggcg ggtaaagcgg tgattctgct ggaagcgggt 120

ccgcgtatgc cgcgttggga aatcgttgag cgtttccgta accaaccgga caagatggat 180

tttatggcgc cgtacccgag cagcccgtgg gcgccgcacc cggaatacgg tccgccgaac 240

gattatctga tcctgaaggg cgagcacaaa ttcaacagcc agtatattcg tgcggtgggt 300

ggcaccacct ggcactgggc ggcgagcgcg tggcgtttca ttccgaacga ctttaagatg 360

aaaagcgtgt acggtgttgg ccgtgattgg ccgatccagt atgacgatct ggagccgtac 420

tatcaacgtg cggaggaaga gctgggtgtg tggggtccgg gtccggaaga ggacctgtac 480

agcccgcgta aacaaccgta tccgatgccg ccgctgccgc tgagcttcaa cgaacagacc 540

attaagaccg cgctgaacaa ctacgacccg aaatttcacg tggttaccga gccggttgcg 600

cgtaacagcc gtccgtatga tggtcgtccg acctgctgcg gcaacaacaa ctgcatgccg 660

atctgcccga ttggtgcgat gtacaacggc attgtgcacg ttgaaaaggc ggagcgtgcg 720

ggtgcgaaac tgatcgaaaa cgcggtggtt tataagctgg agaccggtcc ggacaaacgt 780

atcgtggcgg cgctgtacaa ggataaaacc ggtgcggaac accgtgtgga gggcaagtat 840

ttcgttctgg cggcgaacgg tatcgaaacc ccgaaaattc tgctgatgag cgcgaaccgt 900

gactttccga acggtgtggc gaacagcagc gacatggttg gccgtaacct gatggatcac 960

ccgggcaccg gtgtgagctt ctacgcgagc gaaaagctgt ggccgggtcg tggtccgcaa 1020

gagatgacca gcctgattgg tttccgtgac ggcccgtttc gtgcgaccga ggcggcgaag 1080

aaaatccacc tgagcaacct gagccgtatc gaccaggaaa cccaaaagat ttttaaagcg 1140

ggcaagctga tgaaaccgga cgagctggat gcgcagatcc gtgaccgtag cgcgcgttac 1200

gtgcaattcg attgctttca cgaaatcctg ccgcagccgg agaaccgtat tgttccgagc 1260

aagaccgcga ccgatgcgat cggtattccg cgtccggaaa tcacctacgc gattgacgat 1320

tatgttaagc gtggtgcggc gcacacccgt gaggtgtatg cgaccgcggc gaaagttctg 1380

ggtggcaccg acgtggtttt caacgatgaa tttgcgccga acaaccacat caccggtagc 1440

accattatgg gcgcggacgc gcgtgatagc gtggttgaca aagattgccg taccttcgac 1500

cacccgaacc tgtttatcag cagcagcgcg accatgccga ccgtgggcac cgtgaacgtt 1560

accctgacca tcgcggcgct ggcgctgcgt atgagcgata ccctgaagaa ggaagttcat 1620

catcaccatc accactaa 1638

<210> 2

<211> 367

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggcggcgttc tgtttctgct tcggtatgtg attgtgaagc tggcttacag aagagcggta 60

aaagaagaaa taaaaaagaa atcatctttt ttgtttggaa agcgagggaa gcgttcacag 120

tttcgggcag ctttttttat aggaacattg atttgtattc actctgccaa gttgttttga 180

tagagtgatt gtgataattt taaatgtaag cgttaacaaa attctccagt cttcacatcg 240

gtttgaaagg aggaagcgga agaatgaagt aagagggatt tttgactccg aagtaagtct 300

tcaaaaaatc aaataaggag tgtcaagaat gtttgcaaaa cgattcaaaa cctctttact 360

gccttat 367

<210> 3

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacagc cattgaacat acggttgatt 60

taataactga caaacatcac cctcttgcta aagcggccaa ggacgctgcc gccggggctg 120

tttgcgtttt tgccgtgatt tcgtgtatca ttggtttact tatttttttg ccaaagctgt 180

aatggctgaa aattcttaca tttattttac atttttagaa atgggcgtga aaaaaagcgc 240

gcgattatgt aaaatataaa gtgatagcgg taccattata ggtaagagag gaatgtacac 300

<210> 4

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctatcgagac acgtttggct ggaaaaaact tttccagata gtgccggttg ccggaatggt 60

ttttggcgcc gctgccaatc gctcaacatt aaacgacatt accgagacag gcatgatgct 120

gtacaaaaag aggcgcattc ttgaacgact gaaagaaaca gaacgagaga tggaatagca 180

gaaagcagac ggacaccgcg atccgcctgc tttttttagt ggaaacatac ccaatgtgtt 240

ttgtttgttt aaaagaattg tgagcgggaa tacaacaacc aacaccaatt aaaggaggaa 300

<210> 5

<211> 195

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aggtaggaga aaaatcaccc gtaaaataca atcatatagg aggattacag agcatttaga 60

agcataaata agatcatgtg gtcacatgga tgtttataaa gaaatggtac agaataaaag 120

agaatatgct gtttgtgtgg gaagttacat aaatgttacg gtaataaaga ttgcttaata 180

tggagggaaa atatg 195

<210> 6

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 6

tgwaarcgyt wncw 14

<210> 7

<211> 353

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggcggcgttc tgtttctgct tcggtatgtg attgtgaagc tggcttacag aagagcggta 60

aaagaagaaa taaaaaagaa atcatctttt ttgtttggaa agcgagggaa gcgttcacag 120

tttcgggcag ctttttttat aggaacattg atttgtattc actctgccaa gttgttttga 180

tagagtgatt gtgataattt taaaaaattc tccagtcttc acatcggttt gaaaggagga 240

agcggaagaa tgaagtaaga gggatttttg actccgaagt aagtcttcaa aaaatcaaat 300

aaggagtgtc aagaatgttt gcaaaacgat tcaaaacctc tttactgcct tat 353

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aattccggat ccatgcacaa cgacaacacc 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aataacgcgt ggttagtggt gatggtgatg 30

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

actacatatg ggcggcgttc tgtttctgct tcggtat 37

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

aattggatcc ttcctccttt aattggtgtt ggttgt 36

<210> 12

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

attacatatg tgataggtgg tatgttttcg cttgaac 37

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

acggatccgt gtacattcct ctcttaccta taa 33

<210> 14

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

acctcatatg ctatcgagac acgtttggct ggaaaaa 37

<210> 15

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ccaggatcct tcctccttta attggtgttg gttgt 35

<210> 16

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

atacatatga ggtaggagaa aaatcacccg taaaa 35

<210> 17

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

attggatccc atattttccc tccatattaa gcaatc 36

<210> 18

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gtgattgtga taattttaaa aaattctcca gtct 34

<210> 19

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

agactggaga attttttaaa attatcacaa tcac 34

<210> 20

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tgtaagcgtt aaca 14

Claims

1.一种可高效表达葡萄糖脱氢酶的枯草芽胞杆菌工程菌，其特征在于，所述工程菌包含重组质粒和表达宿主；所述重组质粒包含目的基因以及表达载体；所述目的基因为以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)基因；所述表达载体为pMA5质粒或插入了启动子的pMA5质粒；所述表达宿主为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

2.如权利要求1所述的一种可高效表达葡萄糖脱氢酶的枯草芽胞杆菌工程菌，其特征在于，所述工程菌包含重组质粒和表达宿主；所述重组质粒包含目的基因以及表达载体；所述目的基因为以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)基因；所述表达载体为pMA5质粒或插入了P_amyQ’启动子的pMA5质粒或插入了P₄₃启动子的pMA5质粒或插入了P_gsiB启动子的pMA5质粒或插入了P_opuaa启动子的pMA5质粒或插入了移除cre位点的P_amyQ’启动子的pMA5质粒；所述表达宿主为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；所述cre位点是指启动子上游的一段具有回文结构的保守序列。

3.如权利要求1或2所述的一种可高效表达葡萄糖脱氢酶的枯草芽胞杆菌工程菌，其特征在于，所述启动子的插入位点在pMA5质粒自带的P_HpaⅡ启动子的下游。

4.如权利要求1-3任一所述的一种可高效表达葡萄糖脱氢酶的枯草芽胞杆菌工程菌，其特征在于，所述以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)基因来源于洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)。

5.如权利要求1-4任一所述的一种可高效表达葡萄糖脱氢酶的枯草芽胞杆菌工程菌，其特征在于，所述以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)基因的核苷酸序列为SEQ IDNO.1。

6.如权利要求1-5任一所述的一种可高效表达葡萄糖脱氢酶的枯草芽胞杆菌工程菌，其特征在于，所述cre位点的核苷酸序列为SEQ ID NO.6：TGWAARCGYTWNCW，其中，W为碱基A或T，R为碱基A或G，N为任意碱基。

7.如权利要求1-6任一所述的一种可高效表达葡萄糖脱氢酶的枯草芽胞杆菌工程菌，其特征在于，所述表达宿主为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600。

8.一种生产葡萄糖脱氢酶的方法，其特征在于，所述方法为使用权利要求1-7任一所述的一种可高效表达葡萄糖脱氢酶的枯草芽胞杆菌工程菌。

9.如权利要求8所述的一种生产葡萄糖脱氢酶的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求1-7任一所述的一种可高效表达葡萄糖脱氢酶的枯草芽胞杆菌工程菌现在种子培养基中进行培养，得到种子液；再将种子液接种至发酵培养基进行培养，得到含葡萄糖脱氢酶的发酵培养液。

10.权利要求1-7任一所述的一种可高效表达葡萄糖脱氢酶的枯草芽胞杆菌工程菌或权利要求8或9所述的一种生产葡萄糖脱氢酶的方法在生产葡萄糖脱氢酶、制备葡萄糖传感器、制备葡萄糖检测试剂盒以及检测葡萄糖方面的应用。