CN102292439A

CN102292439A - 黄素结合型葡萄糖脱氢酶

Info

Publication number: CN102292439A
Application number: CN201080004947XA
Authority: CN
Inventors: 田岛辽子; 一柳敦; 市川惠一; 吉村太郎
Original assignee: Kitsu Kou Man K K
Current assignee: Kitsu Kou Man K K
Priority date: 2009-06-04
Filing date: 2010-04-19
Publication date: 2011-12-21
Anticipated expiration: 2030-04-19
Also published as: CN102292439B; KR20110050752A; JP4648993B2; US20110318810A1; EP2348108A4; KR101086189B1; EP2348108B1; EP2348108A1; WO2010140431A1; JPWO2010140431A1; US8445246B2

Abstract

本发明提供一种对D-葡萄糖的底物特异性高的黄素结合型葡萄糖脱氢酶。一种属于毛霉(Mucor)属的微生物来源的、新的黄素结合型葡萄糖脱氢酶，特征在于，与对D-葡萄糖的反应性相比，对麦芽糖、D-半乳糖、D-木糖的反应性低，不易受上述糖化合物的影响。该酶不易受溶解氧的影响，即使在试样中存在葡萄糖以外的糖化合物的情况下也能准确测定葡萄糖量。

Description

黄素结合型葡萄糖脱氢酶

技术领域

本发明涉及以黄素化合物为辅酶的新的黄素结合型葡萄糖脱氢酶及其制造法。

背景技术

血中葡萄糖浓度(血糖值)是糖尿病的重要标记。作为用于糖尿病患者管理自己血糖值的装置，正在广泛利用使用了电化学生物传感器的自我血糖监测(Self Monitoring of BloodGlucose：SMBG)仪器。SMBG仪器中所用的生物传感器一直以来使用的是葡萄糖氧化酶(GOD)等以葡萄糖为底物的酶。然而，GOD具有以氧为电子受体的特性，因此使用了GOD的SMBG仪器中，可能发生测定样品中的溶解氧对测定值产生影响、无法获得准确测定值的情况。

另一方面作为以葡萄糖为底物但并非以氧为电子受体的其它酶，已知有各种葡萄糖脱氢酶(以下记为GDH)。具体而言，已发现以烟酰胺二核苷酸(NAD)、烟酰胺二核苷酸磷酸(NADP)为辅酶的类型的GDH(NAD(P)-GDH)、以吡咯喹啉醌(PQQ)为辅酶的GDH(PQQ-GDH)，并已用于SMBG仪器的生物传感器中。然而，NAD(P)-GDH存在缺乏酶稳定性且必须添加辅酶的问题，另外PQQ-GDH底物特异性低，除与作为测定对象的葡萄糖作用以外，还与麦芽糖、D-半乳糖和D-木糖等糖化合物作用，因此存在测定样品中的葡萄糖以外的糖化合物影响测定值而无法获得准确测定值的问题。

近年来，报告了如下例子：在使用以PQQ-GDH作为生物传感器的SMBG仪器测定接受输液给药的糖尿病患者的血糖值时，PQQ-GDH还与输液中所含的麦芽糖作用，获得高于实际血糖值的测定值，基于该值进行处置，而导致患者发生低血糖症等。另外，已经明确在正在实施半乳糖负荷试验和木糖吸收试验的患者中也可能发生上述情况(例如参照非专利文献1)。基于该情况，日本厚生劳动省医药食品局为了调查当葡萄糖溶液中添加有各糖类时对血糖测定值的影响而进行了交差反应性试验，结果在添加600mg/dL的麦芽糖、300mg/dL的D-半乳糖、或200mg/dL的D-木糖的情况下，使用PQQ-GDH法的血糖测定试剂盒的测定值显示出比实际葡萄糖浓度高约2.5～3倍的值。即，已经明确待测试样中可能存在的麦芽糖、D-半乳糖、D-木糖导致测定值变得不准确，迫切希望开发出一种不受这类会导致测定误差的糖化合物的影响、能够特异性测定葡萄糖的底物特异性高的GDH。

在上述这样的背景之下，已经着眼于利用上述以外辅酶的类型的GDH。例如非专利文献2～5中虽然没有关于底物特异性的详细记载，但存在对来源于米曲霉的GDH的报告。在专利文献1～3中公开了以来源于曲霉属的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅酶的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)，专利文献4中公开了使对D-木糖的作用性降低的来源于曲霉属的FAD-GDH。

专利文献1～4中虽已记载了对于D-葡萄糖外的1种或多种糖化合物的反应性低的FAD-GDH，但具有对麦芽糖、D-半乳糖、D-木糖中的任一者反应性都足够低的特性的黄素结合型GDH尚且未知。另外，在存在D-葡萄糖、麦芽糖、D-半乳糖、D-木糖的条件下能够不受上述糖化合物的影响而准确测定葡萄糖浓度的黄素结合型GDH也是未知的。

专利文献1：日本特开2007-289148号公报

专利文献2：国际公开第04/058958号小册子

专利文献3：国际公开第07/139013小册子

专利文献4：日本特开2008-237210号公报

非专利文献1：医薬品·医療用具等安全性情報206号(Pharmaceuticals and Medical Devices Safety InformationNo.206)、2004年10月、日本厚生劳动省医药食品局

非专利文献2：Studies on the glucose dehydrogenase ofAspergillus oryzae.I.Induction of its synthesis byp-benzoquinone and hydroquinone，T.C.Bak，and R.Sato，Biochim.Biophys.Acta，139，265-276(1967).

非专利文献3：Studies on the glucose dehydrogenase ofAspergillus oryzae.II.Purification and physical and chemicalproperties，T.C.Bak，Biochim.Biophys.Acta，139，277-293(1967).

非专利文献4：Studies on the glucose dehydrogenase ofAspergillus oryzae.III.General enzymatic properties，T.C.Bak，Biochim.Biophys.Acta，146，317-327(1967).

非专利文献5：Studies on the glucose dehydrogenase ofAspergillus oryzae.IV.Histidyl residue as an active site，T.C.Bak，and R.Sato，Biochim.Biophys.Acta，146，328-335(1967).

发明内容

发明要解决的问题

本发明的课题在于提供对D-葡萄糖特异性高、即使在D-葡萄糖以外的糖化合物共存的条件下也能准确测定D-葡萄糖量的新的GDH。

用于解决问题的方案

为了解决上述课题，本发明人等反复进行了深入研究，对生产能够准确测定葡萄糖量的新的GDH的微生物实施筛选，结果从属于毛霉亚门的菌株中发现一种新的GDH，该GDH具有GDH活性，对葡萄糖特异性高，即使在葡萄糖以外的糖化合物共存的条件下进行测定时也能够准确测定葡萄糖。并且，对上述的新的GDH进行纯化并确定其各种性质，确认其为新的黄素结合型GDH，实际实施在麦芽糖、D-半乳糖、D-木糖存在下的D-葡萄糖的测定，并获得了该新的GDH的氨基酸序列和编码其的基因序列信息，从而完成了本发明。

即，本发明如下所述。

(1)黄素结合型GDH，其具有以下(i)～(iii)的性质：

(i)作用：在电子受体存在下显示GDH活性；

(ii)分子量：蛋白质的多肽链部分的分子量为约80kDa；

(iii)底物特异性：与对D-葡萄糖的反应性相比，对麦芽糖、D-半乳糖和D-木糖的反应性低。

(2)根据上述(1)所述的黄素结合型GDH，在设对D-葡萄糖的反应性为100％时，对麦芽糖、D-半乳糖和D-木糖的反应性均为2％以下。

(3)根据上述(1)或(2)所述的黄素结合型GDH，设不存在以下(a)～(c)时对D-葡萄糖的反应性为100％，在存在以下(a)～(c)的糖化合物中的1种以上时对D-葡萄糖的反应性为96％～104％，

(a)麦芽糖，

(b)D-半乳糖，

(c)D-木糖。

(4)根据上述(1)～(3)中任意一项所述的黄素结合型GDH，其最适pH为pH6.5～7.0，最适温度为37～40℃，稳定pH范围为pH3.5～7.0，在40℃热处理15分钟后具有80％以上的残存活性。

(5)根据上述(1)～(4)中任意一项所述的黄素结合型GDH，其来源于被分类为毛霉亚门、优选毛霉纲、更优选毛霉目、进一步优选毛霉科的微生物。

(6)根据上述(5)所述的黄素结合型GDH，其来源于被分类为毛霉(Mucor)属的微生物。

(7)上述(1)～(6)中任意一项所述的黄素结合型GDH的制造方法，其特征在于，在培养基中培养被分类为毛霉(Mucor)属的微生物，从该微生物菌体采集黄素结合型GDH。

(8)根据上述(7)所述的黄素结合型GDH的制造方法，微生物为选自普雷恩毛霉(Mucor prainii)、爪哇毛霉(Mucorjavanicus)、卷枝毛霉原变型(Mucor circinelloidesf.circinelloides)中的1种以上微生物。

(9)根据上述(1)～(6)中任意一项所述的黄素结合型GDH，其特征在于，其具有：序列号1或序列号3所示的氨基酸序列、或与该氨基酸序列80％以上同源的氨基酸序列、或在该氨基酸序列中缺失、置换或添加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列。

(10)由选自以下的(A)～(E)组成的组中的任意一个DNA构成的黄素结合型GDH基因：

(A)编码序列号1所示的氨基酸序列的DNA；

(B)由序列号2所示的碱基序列构成的DNA；

(C)编码序列号3所示的氨基酸序列的DNA；

(D)由序列号4所示的碱基序列构成的DNA；

(E)具有与序列号2或序列号4所示的碱基序列80％以上同源的碱基序列且编码具有黄素结合型GDH酶活性的蛋白质的DNA。

(11)重组体DNA，其特征在于，其是在载体DNA中插入上述(10)所述的黄素结合型GDH基因而成的。

(12)导入有上述(11)所述的重组体DNA的转化体。

(13)与对D-葡萄糖的反应性相比，对麦芽糖、D-半乳糖、D-木糖的反应性低的黄素结合型GDH的制造方法，其特征在于，培养含有上述(10)所述的黄素结合型GDH基因或上述(11)所述的重组体DNA且具有生产黄素结合型GDH能力的微生物，从该培养物采集黄素结合型GDH。

发明的效果

根据本发明的黄素结合型GDH，能够准确测定D-葡萄糖量，而不会受待测试样所含的麦芽糖、D-半乳糖、D-木糖等糖化合物的影响。从而即使对于正接受含有麦芽糖的输液给药的患者、正在实施半乳糖负荷试验和木糖吸收试验的患者的试样也能准确测定血糖值。

附图说明

图1是表示本发明的黄素结合型GDH的吸收光谱的图。

图2是表示本发明的黄素结合型GDH的最适pH的图。

图3是表示本发明的黄素结合型GDH的最适温度的图。

图4是表示本发明的黄素结合型GDH的热稳定性的图。

图5是表示本发明的黄素结合型GDH的pH稳定性的图。

图6是本发明的黄素结合型GDH的SDS-聚丙烯酰胺电泳结果。

图7是表示使用本发明的黄素结合型GDH测得的、D-葡萄糖量的测定结果的图。

具体实施方式

(黄素结合型GDH的底物特异性)

本发明的黄素结合型GDH，其特征在于，底物特异性优异，对D-葡萄糖的选择性极高。具体而言，本发明的黄素结合型GDH对麦芽糖、D-半乳糖、D-木糖的反应性极低。具体而言，特征在于，在设对D-葡萄糖的反应性为100％时，对麦芽糖、D-半乳糖和D-木糖的反应性均为2％以下。本发明的黄素结合型GDH由于具有如此高的底物特异性，因此即使对于正接受含有麦芽糖的输液给药的患者、正在实施半乳糖负荷试验和木糖吸收试验的患者的试样，也能准确测定D-葡萄糖量，而不会受待测试样所含的麦芽糖、D-半乳糖、D-木糖等糖化合物的影响。

如上所述，本发明的黄素结合型GDH，其特征在于，在使用麦芽糖、D-半乳糖、D-木糖等糖化合物代替D-葡萄糖作为底物进行测定时的测定值非常低，进而即使在混杂有麦芽糖、D-半乳糖、D-木糖等糖化合物的条件下也能准确测定葡萄糖测定值。具体而言，其特征在于，将不存在上述混杂糖化合物的条件下对D-葡萄糖的反应性设为100％时，存在作为混杂糖化合物的选自麦芽糖、D-半乳糖、D-木糖中的1种以上时的测定值为96％～103％，即使作为混杂糖化合物的麦芽糖、D-半乳糖和D-木糖这3种同时存在时测定值也为96％～104％。在使用具有这种特性的黄素结合型GDH的情况下，即使是待测试样中存在麦芽糖、D-半乳糖、D-木糖的情况下也能够准确测定葡萄糖量，故而优选。

(本发明的黄素结合型GDH的酶化学特征)

作为本发明的黄素结合型GDH的优选的酶的例子可列举出具有以下酶化学特征的酶。

(1)作用：在电子受体存在下显示GDH活性

(2)分子量：蛋白质的多肽链部分的分子量为约80kDa

(3)底物特异性：与对D-葡萄糖的反应性相比，对麦芽糖、D-半乳糖、D-木糖的反应性低

(4)最适pH：pH6.5～7.0

(5)最适温度：37～40℃

(6)稳定pH范围：pH3.5～7.0

(7)热稳定性：在40℃热处理15分钟后具有80％以上的残存活性

(8)以黄素化合物为辅酶

(9)Km值：对D-葡萄糖的Km值为26～33mM

只要是具有上述这样的酶化学特征的GDH，则能够准确测定D-葡萄糖量，而不会受待测试样所含的麦芽糖、D-半乳糖、D-木糖等糖化合物的影响。另外，由于能够在用于血糖值的测定等临床诊断的合适pH范围、温度范围内良好作用，因此能够适合用于诊断用测定试剂等用途。

此外，上述各种性质参数为典型的例子，在规定的测定条件下进行D-葡萄糖的测定时，在能够实现本发明效果的范围内，上述参数中具有可允许的变动幅度。例如稳定pH范围、最适pH范围、最适温度范围等参数在包含规定的测定条件的范围内既可以比上述典型的范围稍宽，相反也可以比上述典型的范围稍窄，只要在测定条件下确保充分的活性和/或稳定性即可。通常Km值越小则底物特异性越好，但作为本发明的酶，只要在规定的测定条件下具有实质上能够实现充分选择底物的范围的值即可。

上述各种酶化学性质可通过使用用于鉴定酶的各种性质的公知手法、例如以下实施例所述的方法进行调查。酶的各种性质可在生产本发明的黄素结合型GDH的微生物的培养液、纯化工序过程中的某个阶段进行某种程度地调查，更详细而言，可使用纯化酶进行调查。

纯化酶是指被分离为实质不含该酶以外的成分、特别是该酶以外的蛋白质(混杂蛋白质)的状态的酶。具体而言，例如以重量换算，混杂蛋白质的含量小于全体的约20％、优选小于约10％、更优选小于约5％、进一步优选小于约1％。此外，本说明书中后述的“MpGDH”、“MjGDH”和“McGDH”只要未特别限定则指纯化酶。

本发明的黄素结合型GDH所利用的电子受体没有特别限定，例如可使用作为适合用于血糖值测定的试剂成分而公知的任意电子受体。

本发明的黄素结合型GDH所利用的辅酶的特征在于，其为黄素化合物。黄素化合物可列举例如黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、黄素单核苷酸(FMN)等。

作为本发明的黄素结合型GDH的优选的酶的例子，可列举出用SDS-聚丙烯酰胺电泳测定时蛋白质的多肽链部分的分子量为约80kDa的黄素结合型GDH。此外，考虑到本发明的黄素结合型GDH中结合有糖链，在未进行除去糖链的操作的情况下，具有用SDS-聚丙烯酰胺电泳测定时测得的分子量比该数值大的倾向。

作为本发明的黄素结合型GDH的优选的酶的例子，可列举出对D-葡萄糖的Km值为26～33mM的黄素结合型GDH。

(黄素结合型GDH的作用原理和活性测定法)

本发明的黄素结合型GDH在电子受体存在下催化将葡萄糖的羟基氧化而生成葡糖酸-δ-内酯的反应。

因此，可利用该原理，通过使用例如吩嗪硫酸甲酯(PMS)和2，6-二氯靛酚(DCIP)作为电子受体的以下测定体系，测得本发明的黄素结合型GDH的活性。

(反应1)D-葡萄糖+PMS(氧化型)

→D-葡糖酸-δ-内酯+PMS(还原型)

(反应2)PMS(还原型)+DCIP(氧化型)

→PMS+DCIP(还原型)

首先，在(反应1)中随着葡萄糖的氧化而生成PMS(还原型)。通过随后进行的(反应2)，在氧化PMS的同时，DCIP被还原，因此可由600nm的波长的吸光度变化量测定氧化型DCIP的消失。

具体而言，在本发明中，黄素结合型GDH的活性可按照下述步骤进行测定。将1.79mL 100mM磷酸缓冲液(pH7.0)、0.08mL 1.25M D-葡萄糖溶液和0.01mL 20mM DCIP溶液混合，于37℃保温5分钟。接着，添加0.02mL 20mM PM S溶液和0.1mL酶样品溶液，开始反应。测定反应开始时的吸光度和经时性的吸光度，求出随酶反应的进行600nm处吸光度的每分钟减少量(ΔA600)，按照下式计算黄素结合型GDH活性。此时，黄素结合型GDH活性是将37℃下存在浓度50mM的D-葡萄糖时1分钟内还原1μmol的DCIP的酶量定义为1U。

[数学式1]

此外，式中的2.0表示反应试剂+酶试剂的液体量(mL)，16.3表示本活性测定条件下的毫摩分子吸光系数(cm²/μmol)，0.1表示酶溶液的液体量(mL)，1.0表示样品池的光路长(cm)，ΔA600_blank表示添加10mM醋酸缓冲液代替酶样品溶液而开始反应时600nm处吸光度的每分钟减少量，df表示稀释倍数。

(黄素结合型GDH的来源)

具有上述特征的本发明的黄素结合型GDH可从被分类为毛霉亚门、优选毛霉纲、更优选毛霉目、进而优选毛霉科的微生物获得。作为被分类为毛霉亚门、优选毛霉纲、更优选毛霉目、进而优选毛霉科的微生物，可列举出例如毛霉(Mucor)属、犁头霉(Absidia)属、放射毛霉(Actinomucor)属等。作为被分类为毛霉(Mucor)属的微生物且生产本发明的黄素结合型GDH的具体优选的微生物例子，可列举出普雷恩毛霉(Mucor prainii)、爪哇毛霉(Mucor javanicus)或卷枝毛霉原变型(Mucor circinelloides f.circinelloides)。更具体而言，可列举出普雷恩毛霉(Mucor prainii)NISL0103、爪哇毛霉(Mucorjavanicus)NISL0111或卷枝毛霉原变型(Mucor circinelloides f.circinelloides)NISL0117。作为被分类为犁头霉(Absidia)属且生产本发明的黄素结合型GDH的具体优选的微生物例子，可列举出柱孢犁头霉(Absidia cylindrospora)、透孢犁头霉(Absidia hyalospora)。更具体而言，可列举出柱孢犁头霉(Absidia cylindrospora)NISL0211、透孢犁头霉(Absidiahyalospora)NISL0218。作为被分类为放射毛霉(Actinomucor)属且生产本发明的黄素结合型GDH的具体优选的微生物例子，可列举出雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)。更具体而言，可列举出雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)NISL9082。此外，上述菌株为NISL(财团法人野田产业科学研究所)的保藏菌株，可通过规定的程序而获得。

如上所述，本发明的黄素结合型GDH是“来源于被分类为毛霉亚门、优选毛霉纲、更优选毛霉目、进而优选毛霉科的微生物且具有上述各种性质的黄素结合型GDH”。进而，利用通过公知的基因工程手法从这些生产黄素结合型GDH的微生物而获得编码黄素结合型GDH的基因，根据需要将其进行部分改变并通过各种公知的手法导入适当的宿主微生物中，这些宿主微生物生产的重组黄素结合型GDH也包括在本发明的“来源于被分类为毛霉亚门、优选毛霉纲、更优选毛霉目、进而优选毛霉科的微生物且具有上述各种性质的黄素结合型GDH”中。同样，对于记载为“被分类为毛霉(Mucor)属的微生物”、或特定的生产微生物菌株名的黄素结合型GDH而言，基于来源于各个微生物的基因信息而获得的、具备上述各种性质的黄素结合型GDH也包含在本发明中。

(黄素结合型GDH的氨基酸序列)

本发明的黄素结合型GDH，其特征在于，其具有：序列号1或序列号3所示的氨基酸序列、或与该氨基酸序列80％以上同源的氨基酸序列、或在该氨基酸序列中缺失、置换或添加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列。具有序列号1或序列号3所示的氨基酸序列的黄素结合型GDH具有上述各种性质。另外，具有如下氨基酸序列且与具有序列号1或序列号3所示的氨基酸序列的黄素结合型GDH具有同样的各种性质的GDH也包含在本发明的黄素结合型GDH中，所述氨基酸序列为与序列号1或序列号3所示的氨基酸序列具有80％以上同源性、优选具有85％、更优选具有90％、最优选具有95％以上同源性的氨基酸序列。

(编码黄素结合型GDH的基因序列)

编码本发明的黄素结合型GDH的基因是指编码如下黄素结合型GDH的DNA，所述黄素结合型GDH具有：序列号1或序列号3所示的氨基酸序列，或与该氨基酸序列80％以上同源的氨基酸序列，或在该氨基酸序列中缺失、置换或添加1个或多个的氨基酸而成的氨基酸序列。或者，编码本发明的黄素结合型GDH的基因是指由序列号2或序列号4所示的碱基序列构成的DNA。或者，编码本发明的黄素结合型GDH的基因是指：具有如下碱基序列且编码具有黄素结合型GDH酶活性的蛋白质的DNA，所述碱基序列为：与序列号2或序列号4所示的碱基序列具有80％以上的同源性、优选具有85％、更优选具有90％、最优选具有95％以上的同源性的碱基序列。

(含有编码黄素结合型GDH的基因序列的载体、转化体)

编码本发明的黄素结合型GDH的基因可插入适当的公知的各种载体中。进而，可将该载体导入适当的公知的各宿主中而制备导入有含黄素结合型GDH基因的重组体DNA的转化体。这些基因的获得方法以及基因序列、氨基酸序列信息的获得方法、各种载体的制造方法和转化体的制备方法对本领域技术人员而言是公知的，其一个例子如后所述。

可使用通常常规使用的基因克隆方法从生产黄素结合型GDH的微生物获得黄素结合型GDH基因。例如可从具有黄素结合型GDH生产能力的微生物菌体、各种细胞，通过常规方法例如Current Protocols in Molecular Biology(WILEYInterscience，1989)所述的方法提取染色体DNA或mRNA。进而可以以mRNA为模板而合成cDNA。可使用这样获得的染色体DNA或cDNA制备染色体DNA或cDNA的文库。

接着，基于黄素结合型GDH的氨基酸序列合成适当的探针DNA并使用其从染色体DNA或cDNA的文库进行筛选的方法、或基于上述氨基酸序列制备适当的引物DNA并通过5’RACE法、3’RACE法等适当的聚合酶链反应(PCR法)，扩增含有目的基因片段的DNA，将这些DNA连接，从而能够获得含有全长目的基因的DNA。

作为这样获得的编码黄素结合型GDH的基因的一个优选例子，可列举出毛霉(Mucor)属来源的黄素结合型GDH基因。这些基因在处理上优选的是按照常规方法被连接到各种载体上，例如制备含有分离出的毛霉(Mucor)属来源的编码黄素结合型GDH的基因的重组体质粒，通过使用例如QIAGEN(QiagenInc.制)能够从其中提取、纯化而获得这些基因。本发明中能够使用的载体DNA，可使用例如质粒载体DNA、噬菌体载体DNA等。具体而言，优选例如pBluescriptII SK+(STRATAGENE公司制)等。

通过上述方法获得的黄素结合型GDH基因的碱基序列测定、确认可通过例如Multi-CapillaryDNA解析系统CEQ2000(Beckman Coulter，Inc.制)等来进行。

可将如上获得的黄素结合型GDH基因，通过常规方法重组到噬菌体、粘粒(cosmid)、或者用于原核细胞或真核细胞的转化的质粒等载体中，通过常规方法对与各载体相应的宿主进行转化或转导。作为宿主，可列举出例如属于埃希氏杆菌属(Escherichia)的微生物，例如大肠杆菌K-12，优选列举出大肠杆菌JM109、DH5α(均为宝生物公司制)等，对这些宿主进行转化或对它们进行转导，能够获得各自的菌株。通过培养这样获得的上述转化体能够大量生产黄素结合型GDH。

(黄素结合型GDH的制造)

本发明的黄素结合型GDH可使用各种公知的酶生产方法进行制造。例如，可在培养基中培养前述生产黄素结合型GDH的微生物来生产目的黄素结合型GDH，从培养物或培养菌体内部采集酶。另外，可培养包含本发明的黄素结合型GDH基因或含该GDH基因的重组体DNA且具有黄素结合型GDH生产能力的微生物并从该培养物采集黄素结合型葡萄糖脱氢酶。

微生物的培养可以通过通常的固体培养法培养，但优选尽量采用液体培养法培养。培养中使用的培养基只要适当含有碳源、氮源、无机物、其它营养素即可，另外，可以是合成培养基、天然培养基中的任意一种，只要是能够高效制造目的酶的培养基，则可以为任意培养基。

作为培养基中使用的碳源，只要是能够同化的碳化合物即可，可列举出例如葡萄糖、淀粉水解物、甘油、果糖、糖蜜等。作为氮源，只要是能够利用的氮化合物即可，可列举出例如酵母提取物、胨、肉提取物、玉米浆、大豆粉、麦芽提取物、氨基酸、硫酸铵、硝酸铵等。作为无机物，可列举出例如食盐、氯化钾、硫酸镁、氯化锰、硫酸亚铁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、碳酸钠、氯化钙等各种盐。此外可根据需要添加维生素类、消泡剂等。

除此之外，还可以单独或组合使用能够通过添加而提高本发明的黄素结合型GDH制造量的营养源、成分。

培养条件根据所培养的微生物而异。例如可将培养基的起始pH调整为pH5～10，将培养温度适当设定为20～40℃，将培养时间适当设定为10～50小时、15～25小时、或1～2天等，通过通气搅拌浸没培养、震荡培养、静置培养等而实施。例如作为培养毛霉亚门微生物时的培养基和培养条件的一个例子，可列举出使用酵母提取物2.0％、葡萄糖4％、pH6.0的培养基在30℃、130rpm下震荡2天。另外，作为培养大肠杆菌等微生物的培养基和培养条件的一个例子，可列举出使用酵母提取物0.1％、麦芽提取物0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、pH7.3的培养基在25℃、120rpm下震荡培养4天。

生产酶的微生物的培养结束后从该培养物或培养菌体内部采集本发明的方法中使用的黄素结合型GDH时，可使用通常的酶采集手段。在上述酶存在于菌体内的情况下，优选通过例如过滤、离心分离等操作从培养物分离菌体并从该菌体采集酶。可单独或组合采用下述方法：例如使用超声波破碎机、弗氏压碎器、戴诺磨(Dyno-Mill)等常规破碎手段破碎菌体的方法；使用溶菌酶等细胞壁溶解酶而溶解菌体细胞壁的方法、使用TritonX-100等表面活性剂从菌体提取酶的方法等。

接着，通过过滤或离心分离等除去不溶物，获得酶提取液。从获得的提取液根据需要分离、纯化黄素结合型GDH时，在根据需要除去核酸后向其中加入硫酸铵、乙醇、丙酮等进行分级并采集沉淀物。进而为获得纯化度高的酶标品，可适当选择例如使用葡聚糖、Ultragel或Bio-Gel等的凝胶过滤法，使用离子交换体、羟基磷灰石等的吸附洗脱法，亲和色谱法，使用分子筛膜或中空纤维膜等的分级法等，或组合实施上述方法。

本发明的测定中使用的黄素结合型GDH可以使用公知的基因重组手法大量生产。例如可通过公知方法解析前述各种黄素结合型GDH的基因序列和氨基酸序列，基于其信息在各种宿主微生物中大量生产具有同样的构造和特性的黄素结合型GDH。另外，可使用公知的各种技术制造通过使黄素结合型GDH的基因序列和氨基酸序列的一部分缺失、置换、添加和/或插入进行改变从而赋予所期望的特性的黄素结合型GDH。

通过上述那样的方法制造得到的、本发明的黄素结合型GDH，即使在混杂糖化合物存在下也能够准确测定葡萄糖量，因此能够适合用于葡萄糖传感器等的应用和实用化中。

以下通过实施例对本发明进行更具体的说明。但本发明的保护范围不受这些例子任何限定。

实施例1

(本发明的黄素结合型GDH的获得)

1.GDH生产菌的筛选

从由自然界分离而得的菌株和从微生物保藏机构((财)野田产业科学研究所)配给的保藏菌约500株中筛选GDH生产菌。将供试菌株分别接种到3ml麦芽提取物培养基(麦芽提取物2.0％、D-葡萄糖2.0％、多聚蛋白胨(polypeptone)0.1％、pH6.0)中，在30℃下震荡培养3～5天。将该培养液以800×g离心分离10分钟从而获得菌体的沉淀。然后，将该菌体悬浮在10mM醋酸缓冲液(pH5.0)中，利用Multi-Beads Shocker(安井器械(株)制)破碎菌体(2000rpm，60秒，16次)，通过4℃、20,000×g、10分钟的离心而回收上清，将该上清作为粗酶液。

2.GDH活性的确认

按照以下步骤将各溶液混合，测定吸光度，调查粗酶液中的GDH活性。将100mM磷酸缓冲液(pH7.0)1.79mL、1.25MD-葡萄糖溶液0.08mL和20mM DCIP溶液0.01mL混合，在37℃下保温5分钟后，加入20mM PMS溶液0.02mL和酶样品溶液0.1mL，开始反应。从反应开始时起，测定随酶反应的进行600nm处吸光度的每分钟减少量(ΔA600)，按照下式算出GDH活性。此时，GDH活性是将37℃下存在浓度50mM的D-葡萄糖时1分钟内还原1μmol的DCIP的酶量定义为1U。

[数学式2]

此外，式中的2.0表示反应试剂+酶试剂的液体量(mL)，16.3表示本活性测定条件下毫摩分子吸光系数(cm²/μmol)，0.1表示酶溶液的液体量(mL)，1.0表示样品池的光路长(cm)，ΔA600_blank表示添加10mM醋酸缓冲液代替酶样品溶液而开始反应时600nm处吸光度的每分钟减少量，df表示稀释倍数。

对各菌株的粗酶液基于上述活性测定法调查有无GDH活性的结果如表1所示。

[表1]

粗酶液中检测出的GDH活性

其结果，在普雷恩毛霉(Mucor prainii)NISL0103、爪哇毛霉(Mucor javanicus)NISL0107、爪哇毛霉(Mucor javanicus)NISL0108、爪哇毛霉(Mucor javanicus)NISL0111、爪哇毛霉(Mucor javanicus)NISL0112、爪哇毛霉(Mucor javanicus)NISL0115、卷枝毛霉原变型(Mucor circinelloides f.circinelloides)NISL0116、卷枝毛霉原变型(Mucor circinelloidesf.circinelloides)NISL0117、林生冻土毛霉(Mucor hiemalis f.silvaticus)NISL0118、柱孢犁头霉(Absidia cylindrospora)NISL0211、透孢犁头霉(Absidia hyalospora)NISL0218、雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)NISL9082来源的粗酶液中检测出GDH活性。

实施例2

(毛霉(Mucor)属来源的黄素结合型GDH的纯化)

将0.1L预培养用培养基(酵母提取物2.0％、葡萄糖4％、pH6.0)加入0.5L容积的坂口烧瓶中，将预先在平板培养基上培养的普雷恩毛霉(Mucor prainii)NISL0103、爪哇毛霉(Mucorjavanicus)NISL0111、卷枝毛霉原变型(Mucor circinelloides f.circinelloides)NISL0117各接种约1cm²的量，在30℃下以130rpm旋转震荡培养2天。将其作为种子培养(seed cultures)，在加入到30L容积的发酵罐的20L上述培养基中各接种0.2L(2个发酵罐)，在30℃下以200rpm、0.5vvm培养3天。培养结束后，用滤布过滤40L培养液，回收菌体。接着，将获得的菌体悬浮于10mM醋酸缓冲液(pH5.0)中。

将上述菌体悬浮液输送(150ml/分钟)到戴诺磨中破碎，以6000×g离心30分钟，回收上清。用分级分子量6000的中空纤维膜AIP2013(旭化成化学公司制)浓缩该上清，在浓缩后的酶液中缓慢添加硫酸铵直至70％饱和度，使多余的蛋白质沉淀。于4℃放置一晚后，通过离心分离(200,000×g，60分钟)回收上清。

将该上清上样到用缓冲液A(10mM醋酸缓冲液，2M硫酸铵，pH5.0)预平衡的Toyopearl-Butyl 650C(Tosoh Corp.制)柱(26φ×28.5cm)中，按照从缓冲液A到缓冲液B(10mM醋酸缓冲液，pH5.0)的线性梯度进行洗脱。将洗脱获得的活性级分用Centricon Plus-70(Millipore公司制)浓缩后，用缓冲液C(10mM醋酸缓冲液，pH4.5)透析，上样到预先用缓冲液C平衡的SP Sepharose FastFlow(GE Healthcare公司制)柱(26φ×28.5cm)中，按照从缓冲液C到缓冲液D(10mM醋酸缓冲液，200mM氯化钾，pH4.5)的线性梯度洗脱。浓缩洗脱获得的活性级分，获得纯化酶。

下面对各纯化酶，将普雷恩毛霉(Mucor prainii)NISL0103来源的GDH标记为MpGDH，将爪哇毛霉(Mucor javanicus)NISL0111来源的GDH标记为MjGDH，将卷枝毛霉原变型(Mucor circinelloides f.circinelloides)NISL0117来源的GDH标记为McGDH。

实施例3

(毛霉(Mucor)属来源的黄素结合型GDH的酶化学性质研究)

调查了实施例2获得的各纯化GDH的各种性质。

(a)吸收光谱的测定

将MpGDH、MjGDH和McGDH用10mM醋酸缓冲液(pH5.0)透析后，用分光光度计U-3010(HitachiHigh-Technologies Corp.制)测定250～800nm的吸收光谱。测定结果如图1所示(图1的(A)表示MpGDH的吸收光谱，图1的(B)表示MjGDH的吸收光谱，图1的(C)表示McGDH的吸收光谱)。任意一个GDH均在波长340～350nm附近和波长420～430nm附近确认到显示极大值的2个峰，这样的吸收光谱形状是黄素酶所特有的形状，因此强烈暗示本发明的GDH为黄素结合型蛋白质。

(b)GOD活性的测定

使用实施例2所获得的MpGDH、MjGDH和McGDH以及黑曲霉(Aspergillus niger)来源的市售葡萄糖氧化酶(GOD，biozymelaboratories公司制)测定GDH活性和GOD活性。结果如表2所示。

GDH活性基于实施例1的方法进行测定，GOD活性使用4-氨基安替比林(4-AA)和N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)按照以下方法测定。将100mM磷酸缓冲液(pH7.0)30.0mL、833mM D-葡萄糖溶液6.0mL、25mM 4-AA溶液0.3mL、40mM TOOS溶液0.3mL和500U/mL POD溶液0.3mL混合后，将3.0mL混合物转移至试管中，在37℃下保温5分钟后，加入酶样品溶液0.1mL，开始反应。测定随酶反应的进行555nm处吸光度的每分钟增加量(ΔA555)，按照下式算出GOD活性。此时，GOD活性是将37℃下存在浓度131mM的D-葡萄糖时1分钟内生成1μmol的H₂O₂的酶量定义为1U。

[数学式3]

此外，式中的3.1表示反应试剂+酶试剂的液体量(mL)，32.8表示本活性测定条件下毫摩分子吸光系数(cm²/μmol)，0.5表示1分子H₂O₂被还原时产生的醌亚胺染料的分子数，0.1表示酶溶液的液体量(mL)，1.0表示样品池的光路长(cm)，ΔA555_blank表示添加10mM醋酸缓冲液代替酶样品溶液而开始反应时555nm处吸光度的每分钟增加量，df表示稀释倍数。

[表2]

各酶所具有的GDH活性和GOD活性的比较

如表2所示，MpGDH、MjGDH和McGDH均不显示GOD活性，专一显示GDH活性。另一方面，可判明GOD主要显示GOD活性，但同时具有GDH活性。即表明：本发明的GDH不利用氧作为电子受体，因此在定量D-葡萄糖时极其不易受到反应体系的溶解氧的影响。

(c)最适pH

调查了上述本发明的黄素结合型GDH的最适pH。结果如图2所示(图2的(A)表示MpGDH的结果，(B)表示MjGDH的结果，(C)表示McGDH的结果)。具体而言，使用100mM醋酸钾缓冲液(pH5.0～5.5，图中用△记号标绘)、100mMMES-NaOH缓冲液(pH5.5～6.5，图中用斜四边形记号标绘)、100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0～8.0，图中用圆形记号标绘)、100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5～9.0，图中用×记号标绘)，在各pH下于温度37℃进行酶反应，并比较相对活性。

其结果，上述黄素结合型GDH均在pH6.5或pH7.0下显示最高活性，在pH7.0附近具有最适pH。分开看的话，MpGDH和McGDH的最高相对活性是在pH7.0下，在其附近区域即pH6.5～7.5的范围内显示最大相对活性值的80％以上，因此优选在该范围内使用。另外，MjGDH的最高相对活性是在pH6.5下，在其附近区域即pH6.0～7.0的范围内显示最大相对活性值的80％以上，因此优选在该范围内使用。

(d)最适温度范围

基于实施例2所述的活性测定法，在各温度下测定了本酶的活性。具体而言，将100mM磷酸缓冲液(pH7.0)30.0mL、833mM D-葡萄糖溶液6.0mL、25mM 4-AA溶液0.3mL、40mMTOOS溶液0.3mL和500U/mL POD溶液0.3mL混合后，将3.0mL混合物转移至试管中，在各温度下保温5分钟以代替在37℃下保温，接着，加入20mM PMS溶液0.02mL和酶样品溶液0.1mL，在各温度下开始反应。测定反应开始时和2分钟后的吸光度，求出随酶反应的进行600nm处吸光度的每分钟减少量。结果如图3所示(图3的(A)表示MpGDH的结果，(B)表示MjGDH的结果，(C)表示McGDH的结果)。各酶均在37℃附近显示最大活性，显示最大活性的80％以上活性的温度范围是30～40℃。根据以上可认为，本发明的黄素结合型GDH的最适温度范围为30～40℃，最优选的温度为37℃。

(e)对D-葡萄糖的Km值

在前述活性测定法中，改变底物即D-葡萄糖的浓度并进行活性测定，由双倒数作图求出米氏常数(Km)。其结果是，MpGDH对D-葡萄糖的Km值为31.1mM，MjGDH对D-葡萄糖的Km值为26.4mM，McGDH对D-葡萄糖的Km值为33.2mM。

(f)热稳定性

使用100mM醋酸钾缓冲液(pH5.0)在各温度下对本发明的黄素结合型GDH进行15分钟处理时的热稳定性的结果如图4所示(图4的(A)表示MpGDH的结果，(B)表示MjGDH的结果，(C)表示McGDH的结果)。本发明的黄素结合型GDH在40℃、15分钟的热处理后具有80％以上的残存活性，可知其在约40℃以下是稳定的。

(g)稳定pH的范围

调查本发明的黄素结合型GDH的稳定pH。结果如图5所示(图5的(A)表示MpGDH的结果，(B)表示MjGDH的结果，(C)表示McGDH的结果)。具体而言，使用100mM甘氨酸-HCl缓冲液(pH2.5～3.5，图中用四边形记号标绘)、100mM醋酸钾缓冲液(pH3.5～5.5，图中用△记号标绘)、100mMMES-NaOH缓冲液(pH5.5～6.5，图中用斜四边形记号标绘)、100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0～8.0，图中用圆形记号标绘)、100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5～9.0，图中用×记号标绘)，在各pH下于25℃处理16小时后，分别测定本发明的黄素结合型GDH的残存活性。其结果，相对于在各酶显示最大残存活性的pH5.0附近的活性，显示80％以上活性的pH范围为pH3.5～7.0。由以上可知，本发明的黄素结合型GDH的稳定pH范围为pH3.5～7.0。

(h)分子量

通过使用Super Sep Ace 10～20％(和光纯药工业公司制)的SD S-聚丙烯酰胺电泳求出MpGDH、MjGDH和McGDH的分子量。另外，使用脱糖链试剂盒(Enzymatic Deglycosylation Kit，PZM制)对本发明的各黄素结合型GDH进行脱糖链处理，同样供于电泳。结果如图6所示。电泳样品如下所示。

泳道1：分子量标记(New England Biolab s公司制，ProteinLadder(10～250kDa)，从上方起为250kDa、150kDa、100kDa、80kDa、60kDa、50kDa、40kDa、30kDa、25kDa、20kDa、15kDa)

泳道2：MpGDH

泳道3：脱糖链处理后的MpGDH

泳道4：MjGDH

泳道5：脱糖链处理后的MjGDH

泳道6：McGDH

泳道7：脱糖链处理后的McGDH

泳道8：脱糖链反应中使用的酶

根据图6，本发明的黄素结合型GDH的分子量如下：MpGDH为约90～130kDa，MjGDH为约100～150kDa，McGDH为约130～200kDa；MpGDH、MjGDH和McGDH的通过脱糖链试剂盒(Enzymatic Deglycosylation Kit，PZM制)除去糖链后的分子量均为约80kDa。

(i)底物特异性

基于实施例1的酶活性测定方法，分别使用D-葡萄糖、麦芽糖、D-半乳糖、D-木糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖、麦芽三糖、麦芽四糖作为底物，测定本发明的黄素结合型GDH对各底物的活性。底物浓度为50mM。结果如表3所示。

[表3]

各GDH对各底物的相对活性

由该结果可知，在设对D-葡萄糖的活性为100％时，本发明的黄素结合型GDH对各种糖化合物的反应性均非常低。并且对麦芽糖、D-半乳糖、D-木糖的活性均为2％以下。

(j)1，10-菲咯啉的抑制效果

通过以下方法调查1，10-菲咯啉对本发明的黄素结合型GDH活性的抑制效果。基于实施例1的酶活性测定方法，但添加1，10-菲咯啉使终浓度为1mM、5mM、10mM、25mM和50mM，求出这种情况下的酶活性，并设未添加1，10-菲咯啉的抑制率为0％来计算其抑制率。结果如表4所示。

[表4]

1，10-菲咯啉的抑制效果

1，10-菲咯啉对本发明的黄素结合型GDH的抑制效果低，在添加1mM的1，10-菲咯啉时仅确认到2～4％左右的抑制效果，即使添加5mM，抑制率也仅为10％左右。

实施例4

(使用本发明的黄素结合型GDH的葡萄糖浓度定量性验证1)

使用本发明的黄素结合型GDH进行葡萄糖的测定。具体而言，将100mM磷酸缓冲液(pH7.0)1.79mL、D-葡萄糖溶液(250、750、1250、1750、2500、3250、4000、5000mg/dL)0.08mL和20mM DCIP溶液0.01mL混合，在37℃下保温5分钟后，加入20mM PMS溶液0.02mL和0.8U/mL GDH溶液0.1mL，开始反应。随酶反应的进行600nm处吸光度的每分钟减少量(ΔA600)和葡萄糖的终浓度的关系如图7所示(图7的(A)表示使用MpGDH的测定结果，(B)表示使用MjGDH的测定结果，(C)表示使用McGDH的测定结果)。

如图7所示，可确认：通过使用本发明的黄素结合型GDH，只要是终浓度200mg/dL以下的葡萄糖浓度则能够高精度测定待测试样中的葡萄糖浓度。

实施例5

(使用本发明的黄素结合型GDH的葡萄糖浓度定量性验证2)

将100mM磷酸缓冲液(pH7.0)1.77mL、D-葡萄糖溶液(10000、16000mg/dL)0.02mL和20mM DCIP溶液0.01mL混合。接着加入麦芽糖溶液(3000、6000、9000、12000、15000mg/dL)或D-半乳糖溶液(1500、3000、4500、6000、7500mg/dL)或D-木糖溶液(1000、2000、3000、4000、5000mg/dL)0.08mL，在37℃保温5分钟后，加入20mM PMS溶液0.02mL和2.0U/mL GDH溶液0.1mL，开始反应。随酶反应的进行600nm处吸光度的每分钟减少量(ΔA600)和葡萄糖的终浓度的关系如表5～7所示。

[表5]

[表6]

[表7]

如表5～7所示，本发明GDH能够高精度地对含有终浓度600mg/dL以下的麦芽糖、或终浓度300mg/dL以下的D-半乳糖、或终浓度200mg/dL以下的D-木糖的样品的葡萄糖浓度进行定量。

实施例6

(使用本发明的黄素结合型GDH的葡萄糖浓度定量性验证3)

将100mM磷酸缓冲液(pH7.0)1.61mL、D-葡萄糖溶液(10000、16000mg/dL)0.02mL和20mM DCIP溶液0.01mL混合。接着，分别添加0.08mL的麦芽糖溶液(3000、6000、9000、12000、15000mg/dL)、D-半乳糖溶液(1500、3000、4500、6000、7500mg/dL)和D-木糖溶液(1000、2000、3000、4000、5000mg/dL)，在37℃下保温5分钟后，添加20mM PMS溶液0.02mL和2.0U/mL的本发明的黄素结合型GDH溶液0.1mL，开始反应。随酶反应的进行600nm处吸光度的每分钟减少量(ΔA600)和葡萄糖的终浓度的关系如表8～9所示。

[表8]

[表9]

如表8～9所示，MpGDH或MjGDH能够以极高精度对含有终浓度600mg/dL以下的麦芽糖、终浓度300mg/dL以下的D-半乳糖和终浓度200mg/dL以下的D-木糖的试样中的葡萄糖浓度进行定量。

实施例7

(毛霉(Mucor)属来源的黄素结合型GDH基因的克隆和利用转化体进行的表达)

(1)mRNA的制备

将普雷恩毛霉(Mucor prainii)NISL0103接种到麦芽提取物培养基(麦芽提取物2.0％、葡萄糖4.0％、多聚蛋白胨0.1％、pH6.0)3mL中，在30℃下震荡培养2天。用滤纸过滤该培养液，回收菌丝体。在液氮中冻结所获得的菌丝，用研钵粉碎菌丝。接着，使用ISOGEN(Nippon Gene Co.，Ltd.制)，按照该试剂盒的使用说明从粉碎而得的菌体获得mRNA。

(2)GDH部分氨基酸序列的测定

将实施例2所获得的MpGDH供于Super Sep Ace 10～20％(和光纯药工业公司制)并进行电泳。将电泳后的凝胶用Quick-CBB(和光纯药工业公司制)染色，切出与该酶的分子量相当的条带部分。将切出的凝胶片段委托外部机构而获得其中所含的蛋白质的内部氨基酸序列信息。其结果，获得的氨基酸序列为LVENFTPPTPAQIE(序列号5)和IRNSTDEWANYY(序列号6)。

(3)GDH基因序列的测定

基于上述部分氨基酸序列信息，制备含有混合碱基(mixedbases)的简并引物(引物的一个例子如序列号7(正向引物)、序列号8(反向引物)所示)。此外，在序列号7和8所示的单字母标记中，混合碱基分别表示的是：h＝a+c+t、r＝a+g、y＝c+t、d＝a+g+t。以上述(1)制得的普雷恩毛霉(Mucorprainii)NISL0103的mRNA为模板，使用Prime Script RT-PCRKit(宝生物公司制)，按照该试剂盒的使用说明进行RT-PCR。逆转录反应中使用了该试剂盒附带的寡聚dT引物，利用PCR进行cDNA扩增时使用序列号7、8所示的简并引物。将反应液供于琼脂糖凝胶电泳时确认到与长度800bp左右相当的单一条带。纯化该条带所含的扩增DNA片段，使用LigationConvenient Kit(Nippon Gene Co.，Ltd.制)，将前述扩增DNA片段连接到pT7Blue(诺维信公司制)中，从而构建重组质粒pTMGD-1。

接着，使用获得的pTMGD-1，通过公知的热休克法对大肠杆菌JM109感受态细胞(Nippon Gene Co.，Ltd.制)进行转化。使用Gen Elute Plasmid Miniprep Kit(sigma公司制)从获得的转化体提取并纯化质粒，测定质粒中所含的前述扩增DNA片段的碱基序列(767bp)。

基于获得的前述扩增DNA片段的序列信息，使用3’-FullRACE Core Set(宝生物公司制)测定3’侧的GDH基因未知区域，另外，使用5’-Full RACE Core Set(宝生物公司制)测定5’侧的GDH基因未知区域。均按照各试剂盒的使用说明进行，3’-FullRACE Core Set中使用该试剂盒附带的3侧衔接头引物和序列号9所示的引物，另外，5’-Full RACE Core Set中使用序列号10、11、12、13、14所示的引物。解析按照前述方法获得的多个质粒中所含的DNA片段的碱基序列，结果确认其为序列号2和序列号4所示的全链长1926bp的普雷恩毛霉(Mucor prainii)NISL0103来源GDH基因序列。利用该基因序列预测的该酶基因的氨基酸序列如序列号1和序列号3所示。

(4)大肠杆菌的转化和GDH活性的确认

制备N末端区域的引物(序列号15)和C末端区域的引物(序列号16)，使用这些引物和上述(1)制备的普雷恩毛霉(Mucor prainii)NISL0103的mRNA进行RT-PCR。

将反应液供于琼脂糖凝胶电泳，结果能够确认到与长度约2kbp左右相当的单一条带。纯化该条带所含的扩增DNA片段，与经限制酶SmaI消化而得的质粒pUC19(宝生物公司制)进行连接，从而构建重组质粒puc-MGD。

使用获得的重组质粒puc-MGD，通过公知的热休克法对大肠杆菌JM109感受态细胞(Nippon Gene Co.，Ltd.制)进行转化。接着，在10mL的含有100μg/mL氨苄青霉素的T Y培养基(1％bacto胰蛋白胨，0.5％bacto酵母提取物，0.5％NaCl，pH7.0)中，在37℃下震荡培养经转化的大肠杆菌JM109(puc-MGD)菌体2小时后，添加IPTG至终浓度1mM，再在30℃下震荡培养6小时。

将该培养液在冰冷却下用超声波破碎器(Ultrasonicgenerator，Nissei公司制)进行4次20秒的处理，进行破碎。将破碎液加入到Eppendorf管中，用微量离心机以12000rpm离心分离10分钟后，将上清级分转移至另外的Eppendorf管中，作为粗酶液。通过前述酶活性测定法测定该粗酶液中的GDH活性，结果可确认到本发明的黄素结合型GDH活性。

(5)米曲霉的转化和GDH活性的确认

进行双连接PCR(Fungal Genetics and Biology，2004年，第41卷，p973～981)，构建由5’臂区域～PyrG基因(尿嘧啶营养缺陷型标记)～TEF1启动子基因～黄素结合型GDH基因～3’臂区域构成的盒，以酱油曲霉(Aspergillus sojae)KK1-2株为宿主，用原生质体-PEG法进行转化。通过PCR从获得的菌株中确认、筛选目的转化体。

在150mL三角烧瓶中加入5g洒水0.8％的小麦麸，用棉塞塞住，在121℃下高压蒸汽灭菌50分钟。向其中接种1×10⁵/g曲霉的插入了本发明的黄素结合型GDH基因的上述转化体、或对照株的分生孢子悬浮液，在30℃下培养64小时。使用未进行转化的宿主作为对照株。

对培养后的麸曲霉2g，加入5倍量的10mM醋酸缓冲液(pH5.0)，用Polytron均质器PT3000(Kinematica AG制)进行30秒×8次破碎。破碎后进行14000rpm、30分钟离心分离，将获得的上清级分作为粗酶液。通过前述酶活性测定法测定该粗酶液中的GDH活性，结果是：使用对照株获得的粗酶液中的GDH活性为0.3U/mL，与此相对，使用转化体获得的粗酶液中的GDH活性为14.0U/mL，可确认转化体表达了本发明的黄素结合型GDH。

使用插入了本发明的黄素结合型GDH基因的上述转化体，测定对各底物的GDH活性。基于实施例1的酶活性测定方法，分别使用D-葡萄糖、麦芽糖、D-半乳糖、D-木糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖作为底物进行测定。底物浓度为50mM。结果如表10所示。

[表10]

本发明的GDH对各底物的相对活性

底物	相对活性(％)
		D-葡萄糖	100
麦芽糖	1.02
		D-半乳糖	0.71
D-木糖	1.73
		甘露糖	0.63
蔗糖	0.16
		海藻糖	0.16

由该结果可判明，设对D-葡萄糖的活性为100％时，本发明的黄素结合型GDH对各种糖化合物的反应性均非常低。并且，对麦芽糖、D-半乳糖、D-木糖的活性均为2％以下。

产业上的可利用性

本发明的黄素结合型GDH对D-葡萄糖的底物特异性非常高，对D-葡萄糖以外的糖化合物(麦芽糖、D-半乳糖、D-木糖)的反应性足够低，因此即使对含有D-葡萄糖以外的糖化合物的试样进行测定的情况下也能高精度地对D-葡萄糖浓度进行定量，因而在血糖值的测定、食品中的葡萄糖浓度的定量等领域中有用。

Claims

1.黄素结合型葡萄糖脱氢酶，其具有以下(i)～(iii)的性质：

(i)作用：在电子受体存在下显示葡萄糖脱氢酶活性；

(ii)分子量：蛋白质的多肽链部分的分子量为约80kDa；

2.根据权利要求1所述的黄素结合型葡萄糖脱氢酶，在设对D-葡萄糖的反应性为100％时，对麦芽糖、D-半乳糖和D-木糖的反应性均为2％以下。

3.根据权利要求1或2所述的黄素结合型葡萄糖脱氢酶，设不存在以下(a)～(c)时对D-葡萄糖的反应性为100％，在存在以下(a)～(c)的糖化合物中的1种以上时对D-葡萄糖的反应性为96％～104％，

(a)麦芽糖，

(b)D-半乳糖，

(c)D-木糖。

4.根据权利要求1～3中任意一项所述的黄素结合型葡萄糖脱氢酶，其最适pH为pH6.5～7.0，最适温度为37～40℃，稳定pH范围为pH3.5～7.0，在40℃热处理15分钟后具有80％以上的残存活性。

5.根据权利要求1～4中任意一项所述的黄素结合型葡萄糖脱氢酶，其来源于被分类为毛霉亚门、优选毛霉纲、更优选毛霉目、进一步优选毛霉科的微生物。

6.根据权利要求5所述的黄素结合型葡萄糖脱氢酶，其来源于被分类为毛霉(Mucor)属的微生物。

7.权利要求1～6中任意一项所述的黄素结合型葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于，在培养基中培养被分类为毛霉(Mucor)属的微生物，从该微生物菌体采集黄素结合型葡萄糖脱氢酶。

8.根据权利要求7所述的黄素结合型葡萄糖脱氢酶的制造方法，微生物为选自于普雷恩毛霉(Mucor prainii)、爪哇毛霉(Mucor javanicus)、卷枝毛霉原变型(Mucor circinelloidesf.circinelloides)中的1种以上微生物。

9.根据权利要求1～6中任意一项所述的黄素结合型葡萄糖脱氢酶，其特征在于，其具有：序列号1或序列号3所示的氨基酸序列、或与该氨基酸序列80％以上同源的氨基酸序列、或在该氨基酸序列中缺失、置换或添加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列。

10.由选自以下的(A)～(E)组成的组中的任意一个DNA构成的黄素结合型葡萄糖脱氢酶基因：

(A)编码序列号1所示的氨基酸序列的DNA；

(B)由序列号2所示的碱基序列构成的DNA；

(C)编码序列号3所示的氨基酸序列的DNA；

(D)由序列号4所示的碱基序列构成的DNA；

(E)具有与序列号2或序列号4所示的碱基序列80％以上同源的碱基序列且编码具有黄素结合型葡萄糖脱氢酶酶活性的蛋白质的DNA。

11.重组体DNA，其特征在于，其是在载体DNA中插入权利要求10所述的黄素结合型葡萄糖脱氢酶基因而成的。

12.导入有权利要求11所述的重组体DNA的转化体。

13.与对D-葡萄糖的反应性相比，对麦芽糖、D-半乳糖、D-木糖的反应性低的黄素结合型葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于，培养含有权利要求10所述的黄素结合型葡萄糖脱氢酶基因或权利要求11所述的重组体DNA且具有生产黄素结合型葡萄糖脱氢酶能力的微生物，从该培养物采集黄素结合型葡萄糖脱氢酶。