WO2016114334A1 - Ｆａｄ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ - Google Patents

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WO2016114334A1
WO2016114334A1 PCT/JP2016/050913 JP2016050913W WO2016114334A1 WO 2016114334 A1 WO2016114334 A1 WO 2016114334A1 JP 2016050913 W JP2016050913 W JP 2016050913W WO 2016114334 A1 WO2016114334 A1 WO 2016114334A1
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fadgdh
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glucose
aspergillus
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悠 歌島
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東洋紡株式会社
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    • C12Y101/99—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with other acceptors (1.1.99)
    • C12Y101/9901—Glucose dehydrogenase (acceptor) (1.1.99.10)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
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    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3271—Amperometric enzyme electrodes for analytes in body fluids, e.g. glucose in blood

Definitions

  • the present invention relates to a FAD-dependent glucose dehydrogenase, a glucose sensor containing the FAD-dependent glucose dehydrogenase, and a method for measuring glucose concentration using them.
  • Measurement of blood glucose concentration is indispensable for diabetic patients to perform appropriate blood glucose control.
  • a glucose sensor using a glucose oxidase also referred to as GOD in the present specification
  • a glucose dehydrogenase also referred to as GDH in the present specification
  • a simple autoglycemia A measurement kit is used.
  • GOD has long been used as an enzyme for measuring blood glucose, but since dissolved oxygen has an effect on the measured value, GDH has become the mainstream in recent years.
  • a glucose sensor using GDH as a raw material measures the glucose concentration in blood using the following reaction of GDH.
  • D-glucose + electron acceptor oxidized form
  • D-Glucono- ⁇ -lactone + electron acceptor reduced form
  • glucose can be quantified by measuring the flow of electrons generated by oxidizing glucose.
  • GDH used for blood glucose measurement so far, nicotinamide-dependent type, pyrroloquinoline quinone (also referred to as PQQ in this specification) -dependent type, flavin adenine dinucleotide (due to difference in coenzyme required for reaction) In this specification, it is also referred to as FAD.)
  • PQQ pyrroloquinoline quinone
  • flavin adenine dinucleotide duee to difference in coenzyme required for reaction
  • FAD flavin adenine dinucleotide
  • nicotinamide-dependent type those derived from the genus Bacillus are commercially available, but since they cannot be purified in the state of a holoenzyme containing a coenzyme, nicotinamide adenine dinucleotide (which becomes a coenzyme in producing a sensor) In this specification, it is also referred to as NAD.).
  • NAD nicotinamide adenine dinucleotide
  • PQQ-dependent GDH can be provided by a holoenzyme and has an advantage of high specific activity and a sufficient response signal to glucose. The point that it reacts with saccharides other than glucose is regarded as a problem. FAD-dependent GDH is spreading as something that can clear these problems.
  • FAD-dependent glucose dehydrogenase (also referred to herein as FADGDH) is derived from the genus Aspergillus (Patent Documents 1, 2 and 7), derived from the genus Penicillium (Patent Document 3), Those derived from bacteria (Patent Documents 4 to 6) are known.
  • a glucose sensor (blood glucose sensor) using such GDH is also known.
  • An object of the present invention is to provide a superior FADGDH, to construct a superior glucose sensor using the FADGDH, and to provide a method for measuring a glucose concentration using them. It is.
  • the present inventors examined various characteristics of the glucose sensor using various FADGDHs. As a result, as an important problem, it has been found that there is a difference in the response value at the electrode in a glucose sensor manufactured using FADGDH having a sugar chain.
  • the present inventors have further studied and found that the cause of the difference in the response values at the electrodes is the uniformity of the molecular weight of FADGDH used for the glucose sensor.
  • the present inventors further revealed that the proportional relationship between the glucose concentration and the response value of the glucose sensor is maintained at a higher concentration by increasing the uniformity of the molecular weight of FADGDH used in the glucose sensor.
  • the present invention has been completed based on these findings and comprises the following items 1 to 4.
  • Item 1. A FAD-dependent glucose dehydrogenase whose width of molecular weight distribution observed by SDS-PAGE is within 50 kDa when viewed with a molecular weight distribution in which the relative value of the intensity of the band exceeds 60% of the maximum value.
  • Item 2. Item 2. The FAD-dependent glucose dehydrogenase according to Item 1, derived from a microorganism selected from any one of the following.
  • Item 3. A glucose sensor comprising the FAD-dependent glucose dehydrogenase according to Item 1 or 2.
  • FIG. 1 is a diagram comparing the identity of amino acid sequences of och1 orthologs of each Aspergillus genus.
  • FIG. 2 is a diagram showing a method for disrupting the och1 gene of Aspergillus oryzae.
  • FIG. 3 shows a vector map of the Aspergillus oryzae expression plasmid pTNE-AomFADGDH.
  • FIG. 4 is a SDS-PAGE of purified enzymes AomFADGDH and ⁇ och1-AomFADGDH.
  • FIG. 5 shows the response values measured at the electrodes using the purified enzymes AomFADGDH (indicated as AO in the figure, plotted with ⁇ ) and ⁇ och1-AomFADGDH (indicated as AO-och in the figure, plotted with ⁇ ).
  • AO polynomial
  • AO-och polynomial
  • FIG. 6 shows SDS-PAGE of purified enzymes AtFADGDH and ⁇ och1-AtFADGDH.
  • FIG. 7 is a graph in which the density of the band of AomFADGDH shown in FIG.
  • FIG. 4 is scanned and the molecular weight is plotted on the horizontal axis and the relative density of the band is plotted on the vertical axis.
  • FIG. 8 is a graph obtained by scanning the density of ⁇ och1-AOmFADGDH band shown in FIG. 4 and plotting the molecular weight on the horizontal axis and the relative density of the band on the vertical axis.
  • FIG. 9 is a graph obtained by scanning the density of the AtFADGDH band shown in FIG. 6 and plotting the molecular weight on the horizontal axis and the relative density of the band on the vertical axis.
  • FIG. 10 is a graph in which the density of ⁇ och1-AtFADGDH band shown in FIG. 6 is scanned, the molecular weight is plotted on the horizontal axis, and the relative density of the band is plotted on the vertical axis.
  • FADGDH width of the molecular weight distribution observed by SDS-PAGE is within 50 kDa when viewed with a molecular weight distribution in which the relative value of the density of the band exceeds 60% of the maximum value. FADGDH.
  • the molecular weight distribution is determined by SDS-PAGE. Specifically, the method described in the following (1) to (4) is followed. (1) SDS-PAGE was performed using Nu-PAGE 4-12% Bis-Tris Gel (manufactured by Invitrogen), and ladders with molecular weights of 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 160 and 220 kDa, respectively. Apply and run a molecular weight marker (BenchMark TM Protein Ladder). (2) Scan the density of the band indicated by the SDS-PAGE result of (1) above, and plot the molecular weight on the horizontal axis and the relative density of the band on the vertical axis.
  • a molecular weight marker BenchMark TM Protein Ladder
  • Gel Pro analyzer (manufactured by Nippon Roper) is used for scanning and plotting. (3) From the results plotted in (2) above, a molecular weight range in which the relative value of the band density exceeds 60% of the maximum value is read. (4) The molecular weight distribution in the present invention is expressed by dividing the minimum molecular weight range including the molecular weight range read in (3) above by each molecular weight set by the ladder of the molecular weight marker used in (1). . For example, if the molecular weight range read in (3) is 75-85 kDa, the molecular weight distribution is 70-90 kDa, and if it is 85-105 kDa, the molecular weight distribution is 80-120 kDa.
  • the width of the molecular weight distribution of FADGDH of the present invention is within 50 kDa when measured by the above method.
  • the width of the molecular weight distribution is more preferably within 40 kDa, more preferably within 30 kDa, and even more preferably within 20 kDa.
  • the origin of the FADGDH of the present invention is not particularly limited, but it is preferably derived from a microorganism selected from any one of the following groups (A).
  • A Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Monascus, Fusarium, Saccharomyces, Pichia, Candida, Schizosaccharomyces, Cryptococcus, Schizophyllium, Mucor, Absidia, Actinomucol, Coretotritium, Silcinera and Earthlinium.
  • the FADGDH of the present invention is more preferably derived from a microorganism selected from any one of the following groups (B).
  • B Aspergillus genus, Mucor genus, Absidia genus, Actinomucor genus, Coretotritium genus, Silcinera genus, Earthlinium genus and Penicillium genus
  • the FADGDH of the present invention is more preferably derived from any of the group consisting of Aspergillus, Mucor and Silcinera.
  • Aspergillus oryzae SEQ ID NO: 3
  • Aspergillus tereus SEQ ID NO: 4
  • Mucor plinii SEQ ID NO: 5
  • Mucor hyalis SEQ ID NO: 6
  • Mucor subtilismus SEQ ID NO: 7
  • silcinera simplex SEQ ID NO: 8
  • the FADGDH of the present invention is more preferably derived from Aspergillus microorganisms.
  • the FADGDH of the present invention is more preferably derived from any one microorganism in Aspergillus oryzae or Aspergillus terreus.
  • the FADGDH of the present invention may be one obtained by modifying the amino acid sequence of each microorganism to such an extent that the function as FADGDH is not lost.
  • the degree of the modification is not particularly limited. For example, one or several substitutions, deletions, insertions, and / or additions may be made. % (Preferably 75%, more preferably 80%, more preferably 85%, more preferably 90%, more preferably 95%, more preferably 98%, more preferably 99%) or more It may be.
  • the sugar chain content of the FADGDH of the present invention is preferably uniform as compared with that produced by wild-type microorganisms.
  • the degree of homogenization is represented by the width of the molecular weight distribution and is within 50 kDa when measured by the above method.
  • the width of the molecular weight distribution is more preferably within 40 kDa, more preferably within 30 kDa, and even more preferably within 20 kDa.
  • the sugar chain content of the FADGDH of the present invention is preferably reduced as compared with that produced by wild-type microorganisms.
  • the degree of the decrease is not particularly limited, but is preferably 60% or less, more preferably substantially equal to or less than 56.3% as compared to the wild type (in the present specification, “substantially the same”). "Means a state that is indistinguishable in consideration of measurement variations, etc.), more preferably substantially the same as or less than 55%, more preferably substantially the same or less than 51.5%. Less, more preferably substantially the same or less than 44.0%.
  • the sugar chain content of FADGDH includes the molecular weight of FADGDH as a whole (including both the polypeptide chain part and the sugar chain part) and the molecular weight of only the FADGDH polypeptide chain part (can be calculated from the amino acid sequence). After obtaining, the value obtained by subtracting the molecular weight of only the FADGDH polypeptide chain portion from the molecular weight of the whole FADGDH is taken as the molecular weight of the sugar chain portion, and this value is divided by the whole molecular weight of FADGDH.
  • the molecular weight is determined according to the method described in the following (1), (2), (5) to (7).
  • Gel Pro analyzer (manufactured by Nippon Roper) is used for scanning and plotting.
  • the molecular weight with the highest relative darkness of the band is read.
  • the width of the minimum molecular weight including the molecular weight range read in (5) is divided and expressed by each molecular weight set by the ladder of the molecular weight marker used in (1). For example, if the molecular weight having the highest relative density of the band read in (5) is 76 kDa, the molecular weight width is 70-80 kDa.
  • the molecular weight is the center value of the molecular weight range represented by (6) above (the value obtained by adding the upper and lower limits of the width and dividing by 2).
  • the FADGDH of the present invention preferably has a reduced molecular weight compared to that produced by a wild-type microorganism as a result of the decreased sugar chain content.
  • the degree of the reduction is not particularly limited, but is preferably 88% or less, more preferably 83% or less, further preferably 75% or less, more preferably 70% or less, more preferably substantially, compared to the wild type. Less than or equal to 69.7%, more preferably substantially less than or equal to 68.2%, more preferably substantially less than or equal to 65%, more preferably substantially less than 60.7%. Is less than or equal to%.
  • the molecular weight of the FADGDH of the present invention is preferably 100 kDa or less (more preferably 90 kDa or less, further preferably substantially the same or less than 88 kDa, more preferably 85 kDa or less.
  • the FADGDH of the present invention can take the form of an appropriate composition in consideration of application to a glucose sensor and a glucose measurement method described later.
  • the form of the composition is not particularly limited, and it may be in a dry state such as freeze-drying or powder and in a liquid state. Methods for producing such compositions have already been established in the art. Therefore, those skilled in the art can apply the knowledge to produce the composition of the present invention, and the embodiment is not particularly limited. Examples of substances that can be added to the composition include various substances exemplified in the present specification as may be contained in a glucose sensor described below.
  • the FADGDH of the present invention when used in a glucose sensor, has a good proportional relationship of the response value with respect to the true glucose concentration compared to when wild type FADGDH is used. To a higher glucose concentration range.
  • One of the reasons is that the activity per glycoprotein weight is improved by reducing the sugar chain content, so even if the glycoprotein weight mounted on the sensor is the same, the enzyme activity is relatively high, and the high concentration It is considered that a sufficient response is shown to glucose.
  • FADGDH obtained by the production method of the present invention has a uniform sugar chain content, so that efficiency is improved in chromatography and other steps in the enzyme purification stage, and as a result, purification yield is improved. Can be expected.
  • glucose sensor One embodiment of the present invention is a glucose sensor including the FADGDH.
  • the glucose sensor is not particularly limited as long as it includes FADGDH of the present invention.
  • a carbon electrode, a gold electrode, a platinum electrode, or the like is used as an electrode, and the enzyme of the present invention is immobilized on this electrode.
  • immobilization methods there are a method using a crosslinking reagent, a method of encapsulating in a polymer matrix, a method of coating with a dialysis membrane, a method of using a photocrosslinkable polymer, a conductive polymer, a redox polymer, etc.
  • Such a coenzyme or an electron mediator typified by ferrocene or a derivative thereof may be fixed in a polymer or adsorbed and fixed on an electrode, or may be used in combination.
  • the glutaraldehyde can be blocked by treatment with a reagent having an amine group.
  • electron mediators that can be used include those that receive electrons from FAD, which is a coenzyme of GDH, and can donate electrons to color-developing substances and electrodes.
  • examples include, but are not limited to, 1,4-benzoquinone, 2,5-dichloro-1,4-benzoquinone, nitrosoaniline, ferrocene derivatives, osmium complexes, ruthenium complexes, and the like.
  • surfactants such as proteins such as bovine serum albumin and sericin, Triton X-100, Tween 20, cholate and deoxycholate are used as stabilizers and / or activators.
  • It may contain a salt or a hydrophilic polymer such as pullulan, dextran, polyethylene glycol, polyvinyl pyrrolidone, carboxymethyl cellulose, polyglutamic acid.
  • One of the embodiments of the present invention is a method for measuring glucose concentration using the FADGDH or the glucose sensor.
  • a method for measuring glucose using glucose dehydrogenase has already been established in the art. Therefore, according to a known method, the amount or concentration of glucose in various samples can be measured using the FADGDH of the present invention.
  • the mode thereof is not particularly limited.
  • the FADGDH of the present invention is allowed to act on glucose in a sample, and the electrons accompanying the glucose dehydrogenation reaction This can be done by measuring the structural change of a receptor (eg, DCPIP) by absorbance.
  • the sample containing glucose is not particularly limited, and examples thereof include blood, beverages, and foods.
  • the amount of enzyme added to the sample is not particularly limited as long as the glucose concentration or amount can be measured.
  • the measurement of glucose concentration using the glucose sensor can be performed as follows. Put buffer in constant temperature cell and maintain at constant temperature.
  • As the mediator potassium ferricyanide, phenazine methosulfate, or the like can be used.
  • As a working electrode an electrode on which FADGDH of the present invention is immobilized is used, and a counter electrode (for example, platinum electrode) and a reference electrode (for example, Ag / AgCl electrode) are used. After a constant voltage is applied to the carbon electrode and the current becomes steady, a sample containing glucose is added and the increase in current is measured. The glucose concentration in the sample can be calculated according to a calibration curve prepared with a standard concentration glucose solution.
  • the glucose measurement method of the present invention can also be carried out by using a reagent, a kit, or the like for measuring glucose concentration in blood, such as a glucose measurement composition or a glucose assay kit, in addition to the glucose sensor.
  • composition for measuring glucose and the glucose assay kit are not particularly limited as long as they contain FADGDH of the present invention in an amount sufficient for at least one assay. Typically, it includes the FADGDH of the present invention, buffers, mediators and other necessary reagents for measurement, a glucose standard solution for creating a calibration curve, and usage guidelines.
  • the kit of the invention can be provided, for example, as a lyophilized reagent or as a solution in a suitable storage solution.
  • FADGDH of the present invention (Manufacturing method of FADGDH of this invention) FADGDH of the present invention described above (FADGDH whose width of molecular weight distribution observed by SDS-PAGE is within 50 kDa when viewed with a molecular weight distribution in which the relative value of the density of the band exceeds 60% of the maximum value)
  • the manufacturing method is not particularly limited.
  • the molecular weight uniformity can be increased by using a known technique capable of controlling the modification of the structure of a sugar chain added to a protein. Such techniques are exemplified below.
  • N-type that binds to asparagine residues of proteins
  • O-type that binds to serine or threonine.
  • the biosynthesis of sugar chains begins with the endoplasmic reticulum (ER), and then further glycosylation occurs in the Golgi apparatus.
  • ER endoplasmic reticulum
  • the sugar chains produced by ER have been found to be basically the same for fungi and mammalian cells.
  • the sugar chain has a core structure (Man8GlcNAc2) composed of 8 molecules of mannose (Man) and 2 molecules of N-acetylglucosamine (GlcNAc).
  • Man mannose
  • GlcNAc N-acetylglucosamine
  • the alg family gene synthesizes the sugar chain formation process at the ER.
  • GlcNAc is added by the alg7, alg13, and alg14 genes, and then mannose is added by the alg1, alg2, alg11, alg3, and alg9 to generate a core structure.
  • mannose is added by the alg1, alg2, alg11, alg3, and alg9 to generate a core structure.
  • the glycoprotein transported to the Golgi body is further added with mannose by och1, and then a large amount of mannose is added by Mnn1, Mnn4, and Mnn6 to produce a hypermannose sugar chain.
  • the FADGDH of the present invention can also be produced by a method of producing FADGDH using a modified microorganism having a reduced function of the och1 gene.
  • the och1 gene is a gene that controls the expression of och1, which is one of the enzymes involved in the biosynthesis of N-type sugar chains that bind to the asparagine residues of proteins.
  • the och1 gene is present in almost all microorganisms having a function of synthesizing glycoproteins.
  • Aspergillus Trichoderma, Neurospora, Monascus, Fusarium, Saccharomyces, Pichia, Candida, Schizosaccharomyces, Cryptococcus, Schizophyllium, Mucor, Absidia, Actinomucol Tritium, Silcinella, Earthrinium, Coccidioides, Botrytiana, Leptosparia, Podosporia, Thielaviria, Thielaviria (Yarrowia), Cyberlindera, Schefalomyces (Scheff) genus rsomyces, genus Eremothecium, genus Debaryomyces, genus Saccharomycetacea, genus Ashbya, genus L.
  • Zygosaccharomyces genus, Kazachstania genus, Torulaspora genus, Naumovozyma genus, Tetrapisspora genus, and Myceliofosora genus are limited.
  • the present inventors analyzed in detail about the influence which the sugar_chain
  • the purified enzyme purified from the culture medium in which FADGDH is expressed using Aspergillus oryzae as a host and the host is grown by liquid culture has a heterogeneous composition of the sugar chains to be bound, and has various chain lengths. It was inferred that the sugar chains of In addition, the sugar chain of FADGDH expressed using yeast Saccharomyces cerevisiae as a host is linked to sugar chains of various chain lengths similar to those expressed using Aspergillus oryzae as the host. Was confirmed to be longer than FADGDH expressed using Alpergillus oryzae as a host.
  • the present inventors have further conducted intensive studies in order to adjust the sugar chain content that binds to FADGDH.
  • the och1 gene which is one of the sugar chain synthesis-related genes of microorganisms capable of producing FADGDH, is disrupted or its function is reduced, thereby significantly reducing the sugar chain binding to FADGDH (as a result, It was found that the sugar chain content can be reduced) and that the sugar chain composition is almost uniform.
  • a more preferable means for reducing the function of the och1 gene of the microorganism is to destroy the DNA corresponding to the och1 gene.
  • the sequence of the och1 gene is not particularly limited.
  • the DNA sequence of SEQ ID NO: 2 may be mentioned. It is done.
  • SEQ ID NO: 2 is a DNA sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the sequence of the och1 gene varies depending on the type of microorganism, but is highly conserved among microorganisms belonging to the genus Aspergillus, for example. Further, in microorganisms other than the genus Aspergillus, from the homology search, the genus Coccidioides, Botrytiania, Leptosphaeria, Podspora, Thielavia, Verticillium, Fusarium, Yarrowia, Yerlowiaor , Scheffersomyces genus, Eremothecium genus, Debaryomyces genus, Saccharomycesaceae genus, Ashbya genus, Kluyveromyces genus, Lachancea genus, Zacyaccharomyces genus, Zygosaccharomyces genus In the genus Aumovozyma, Tetrapisspora, Naumovozyma, Schizosaccharomyces, Kazuch
  • the identity of the base sequence is calculated by using default (initial setting) parameters in the homology algorithm BLAST of the National Center for Biotechnology Information (NCBI).
  • E-value is a scale for comparing the similarity of two sequences. The smaller the value, the higher the similarity.
  • the och1 gene may be any of the following (a) and (b).
  • (A) 68% or more of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably Is a DNA encoding an amino acid sequence having an identity of 95% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more
  • B 68% or more of the DNA sequence of SEQ ID NO: 2 (preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more)
  • the och1 gene may be any of the following (c) and (d) in a microorganism belonging to the genus Aspergillus.
  • (C) encodes an amino acid sequence having 70% or more (preferably 73% or more, more preferably 74% or more, more preferably 75% or more, more preferably 76% or more) identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • DNA to do (D) DNA having the identity of 70% or more (preferably 73% or more, more preferably 74% or more, more preferably 75% or more, more preferably 76% or more) with the DNA sequence of SEQ ID NO: 2
  • the identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is 70% from Aspergillus nidulans, 73% from Aspergillus niger, 73% from Aspergillus niger (nigers) 74% from Kawachii, 77% from Aspergillus terreus, 78% from Aspergillus clavatus, 100% from Aspergillus flavus is there.
  • the sequence of the och1 gene may be as shown in (e) below for microorganisms belonging to the genus Aspergillus.
  • the identity to SEQ ID NO: 2 is 74% for Aspergillus nidulans, 76% for Aspergillus niger, and for Aspergillus clavatus 74% and 76% of those derived from Aspergillus terreus.
  • the microorganism before modification of the modified microorganism used in the method for producing FADGDH of the present invention exemplified above is not particularly limited as long as it is a microorganism having the och1 gene.
  • the microorganisms listed above can be used.
  • the modified microorganism used in the method for producing FADGDH of the present invention is a modified microorganism in which the function of the och1 gene of the microorganism before the modification is reduced.
  • it is a microorganism selected from any one of the following.
  • Aspergillus genus Trichoderma genus, Neurospora genus, Monascus genus, Fusarium genus, Saccharomyces genus, Pichia genus, Candida genus, Schizosaccharomyces genus, Cryptococcus genus, Schizophyllium genus, Mucor genus, Absidia genus, Actinomucor genus, Coretolithium genus , Genus Silcinella, genus Earthlinium.
  • microorganisms classified as filamentous fungi especially koji molds (microbes belonging to the genus Aspergillus) secrete and produce a large amount of carbohydrate-degrading enzymes such as amylase, glucoamylase, and proteolytic enzymes. It is not only widely used in the brewing industry but is also preferred as an expression host for producing the FADGDH of the present invention because of its high protein secretion ability.
  • Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus tereus and the like are more preferable.
  • the modified microorganism used in the FADGDH production method of the present invention exemplified above may be a transformant.
  • FADGDH is produced using a transformant obtained by introducing a DNA encoding FADGDH into a host microorganism using a modified microorganism having a reduced function of the och1 gene and introducing the DNA encoding FADGDH into the host microorganism. To do.
  • the means for reducing the function of the och1 gene is not particularly limited.
  • One of the means is to destroy the DNA corresponding to the och1 gene. This method is suitable when the och1 gene sequence of the microorganism to be used is specified.
  • the term “disruption” means that all or a part of the DNA sequence corresponding to the och1 gene is removed, a mutation is added to at least one position of the DNA sequence, or an arbitrary position at least other than both ends of the DNA sequence. The function is reduced or completely stopped by inserting the DNA sequence.
  • the method for producing a modified microorganism having a reduced function of the och1 gene may be performed using various known methods, and is not particularly limited.
  • a method using homologous recombination of DNA is generally used as a method for destroying the och1 gene.
  • the marker gene used for transformation includes an upstream untranslated region of the target gene and By constructing a gene disruption cassette linking the downstream translation regions and transforming the host microorganism, homologous recombination is caused upstream and downstream of the och1 gene, and the function of the gene is removed by removing the ORF portion of och1. It can be reduced. It is also possible to stop the function of the gene by constructing a gene disruption cassette so that transcription is terminated within the ORF of och1, and inserting the gene disruption cassette at the position of the target gene.
  • the frequency of the mutation may be increased by treating the microorganism to be used with a mutation treatment or physical treatment such as irradiation with ultraviolet rays, X-rays or gamma rays, but it is a naturally occurring variant. It doesn't matter.
  • This method is suitable when the microorganism to be used has a function corresponding to the function of the och1 gene, but the och1 gene sequence is not specified.
  • RNA interference As another means for reducing the expression of the och1 gene, transcription suppression by RNA interference (RNAi) is also possible.
  • DNA or RNA that is complementary to the mRNA transcribed by the gene of interest is introduced into the microorganism or transcribed in the microorganism, thereby destabilizing the mRNA by forming a duplex with the mRNA.
  • och1 By suppressing translation from mRNA to peptide. This method is effective when it is difficult to destroy the target gene by targeting in a microorganism with low homologous recombination efficiency of the gene.
  • the FADGDH of the present invention is produced using a transformant
  • the FADGDH is derived from a genus and / or species in the biological classification of the genus and / or species of the host microorganism. They can be the same or different.
  • the method for introducing and expressing the DNA encoding the FADGDH in a host microorganism is not particularly limited.
  • the DNA may be inserted into an appropriate vector corresponding to the host, and the vector is further introduced into the host for transformation.
  • Such a method is a standard recombinant DNA technique and can be performed by referring to, for example, Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
  • FADGDH can be produced using a modified microorganism produced by any of the methods described above. For example, it can be produced by culturing the modified microorganism to express FADGDH and purifying the obtained culture solution.
  • a method for producing a target protein by purifying a culture solution obtained by culturing a microorganism expressing the protein has already been established in the art. Therefore, those skilled in the art can apply the knowledge to produce FADGDH, and the mode is not particularly limited.
  • FIG. 1 shows a comparison of amino acid sequence identities of och1 orthologs of each Aspergillus genus.
  • the Aspergillus oryzae och1 gene disruption cassette was constructed as follows. Using Aspergillus oryzae genomic DNA as a template, PCR was performed using the primers shown in SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 to amplify the region from 2 kbp upstream of the gene to 2 kbp upstream of the gene, including the och1 gene of Aspergillus oryzae. The amplified PCR product was TA cloned using Target-clone Plus (Toyobo) and inserted into the pTA2 vector. The prepared vector was pTAooch1 ⁇ 2K.
  • an inverse PCR was performed using the primers shown in SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 using pTAooch1 ⁇ 2K as a template.
  • the obtained vector was pTAooch1 ⁇ 2K-ORF.
  • the sC marker part was excised from the pUSA vector with restriction enzymes XbaI and SbfI, and inserted into pTAooch1 ⁇ 2K-ORF digested with restriction enzymes NheI and SbfI.
  • the obtained vector was prepared as pT ⁇ Aooch1-sC.
  • the vector pT ⁇ Aoch1-sC obtained in (1) was prepared in large quantities using Qiafilter plasmid Midi kit (manufactured by QIAGEN) and used for transformation into Aspergillus.
  • Qiafilter plasmid Midi kit manufactured by QIAGEN
  • Neisseria gonorrhoeae Aspergillus oryzae NS4 was used, and the transformation was performed by the protoplast-PEG method.
  • the principle of gene disruption is shown in FIG.
  • the och1 gene disruption strain was selected from the obtained transformants after confirmation by PCR.
  • AoFADGDH gene Expression of the FADGDH gene derived from Aspergillus oryzae was performed as follows. A region containing niaD was amplified from the genomic DNA of Aspergillus oryzae using the primer of SEQ ID NO: 13 and the primer of SEQ ID NO: 14, and TA-cloned by Target clone plus manufactured by Toyobo Co., Ltd. to obtain pTN.
  • the primer of SEQ ID NO: 15 and the primer of SEQ ID NO: 16 were used to amplify the upstream 1 kbp from the translation start point of the gene predicted to be a translation elongation factor 1 ⁇ by PCR, and further, the genomic DNA of Aspergillus oryzae To AmyB terminator region was amplified by PCR using the primer of SEQ ID NO: 17 and the primer of SEQ ID NO: 18.
  • the plasmid was amplified by PCR using the primer of SEQ ID NO: 19 and the primer of SEQ ID NO: 20.
  • the three PCR products prepared as described above were fused using In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio Inc.) to prepare an expression vector pTNE containing the niaD marker, the EF1 promoter, and the AmyB terminator.
  • the sequence described in International Publication WO2009 / 119728 that is, a sequence obtained by introducing a mutation of G163R + V551C into the sequence cloned from the cDNA of Aspergillus oryzae TI strain was used.
  • the amino acid sequence encoding FADGDH is shown in SEQ ID NO: 21, and the DNA sequence is shown in SEQ ID NO: 22, respectively.
  • FADGDH derived from Aspergillus oryzae was amplified with the primer of SEQ ID NO: 23 and the primer of SEQ ID NO: 24, and the obtained PCR product was digested with the restriction enzyme SpeI, and forwardly downstream of the EF1 promoter of pTNE that was also digested with SpeI. The gene was inserted into.
  • the obtained vector was designated as pTNE-AomFADGDH.
  • a vector map of pTNE-AomFADGDH is shown in FIG.
  • pTNE-AomFADGDH was transformed into ⁇ och1 and NS4 strains. The obtained transformant was cultured in DP medium, and the transformant showing the highest productivity was selected.
  • AomFADGDH The transformant obtained in the above was inoculated into a sterilized 60 mL DP liquid medium / 500 ml Sakaguchi flask and shake-cultured at 30 ° C. for 2 days to obtain a preculture solution.
  • 7.0 L of YPM medium 5% yeast extract, 2% soybean peptone, 5% maltose
  • 10L jar fermenter was inoculated with the precultured solution, the culture temperature was 35 ° C., the stirring speed was 400 rpm, and the aeration rate.
  • the cells were cultured for 3 days under the conditions of 6.0 L / min and an internal pressure of 0.2 MPa.
  • the culture solution was filtered with a filter cloth, and the filtrate was recovered.
  • the filtrate was concentrated using a UF membrane (Millipore Corp.) with a molecular weight cut off of 30,000, and the buffer was replaced by adding phosphate buffer (50 mM, pH 6.0) continuously to the concentrate. did.
  • 40% (w / v) of ammonium sulfate was gradually added to the concentrate, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes, and then excess precipitate was removed using a filter aid.
  • the filtrate was charged into a 200 mL PS Sepharose FastFlow (GE Healthcare) column previously equilibrated with 50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) containing 40% (w / v) ammonium sulfate, and 50 mM was added.
  • the protein was eluted by stepwise replacement with phosphate buffer (pH 6.0).
  • the eluted fraction is concentrated with a hollow fiber membrane (Spectrum Laboratories) having a molecular weight cut-off of 10,000, and a phosphate buffer solution (50 M, pH 6.0) is continuously added to the concentrated solution to buffer.
  • a phosphate buffer solution 50 M, pH 6.0
  • FIG. 4 shows the results of SDS-PAGE using molecular weight markers (BenchMark TM Protein Ladder) having ladders with molecular weights of 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 160 and 220 kDa, respectively.
  • FIG. 7 AomFADGDH
  • FIG. 8 ⁇ och1-AomFADGDH plot the molecular weight on the horizontal axis and the relative density of the band on the vertical axis by scanning the density of the band shown in FIG. .
  • the molecular weight distribution of AomFADGDH was 80-160 kDa, while the molecular weight distribution of ⁇ och-AomFADGDH was about 70-90 kDa, and the width of the molecular weight distribution was reduced.
  • the molecular weight having the highest relative density of the band is between 120 kDa and 100 kDa, and the molecular weight is determined to be 110 kDa.
  • the molecular weight having the highest relative density of the band is between 80 kDa and 70 kDa, and the molecular weight is determined to be 75 kDa.
  • the width of the molecular weight distribution of FADGDH derived from Aspergillus oryzae produced by the production method of the present invention is a molecular weight distribution in which the relative value of the darkness of the band exceeds 60% of the maximum value. It was within 20 kDa.
  • the molecular weight of FADGDH derived from Aspergillus oryzae produced by the production method of the present invention is 80% or less (preferably 75% or less, more preferably 70% or less, more preferably Preferably, it was substantially equal to or less than 68.2%.
  • the sugar chain content of FADGDH derived from Aspergillus oryzae produced by the production method of the present invention is 60% or less (preferably 55% or less, more preferably substantially less than that of the wild type). 44.0% or less).
  • the molecular weight of FADGDH derived from Aspergillus oryzae produced by the production method of the present invention was 90 kDa or less (preferably 80% or less, more preferably substantially the same or less than 75 kDa).
  • 1 mM sodium citrate (pH 7.0) 50 mM potassium ferricyanide 0.4 mg / ml FADGDH First, 5 ⁇ L of 0.5% CMC (carboxymethylcellulose) was dropped on 3 electrodes and 5 ⁇ L of the above solution on the working electrode, counter electrode, and reference electrode of a disposable chip (DEP-CHIP, manufactured by Biodevice Technologies) having 3 electrodes. And dried by heating at 50 ° C. for 10 minutes.
  • CMC carboxymethylcellulose
  • the response value of AomFADGDH is higher than that of ⁇ och1-AomFADGDH at 100 mg / dl to 200 mg / dl, but the response value is lower than that of ⁇ och1-AomFADGDH at 300 mg / dl, and there is a problem in response at a high concentration. It has been found.
  • ⁇ och1-AomFADGDH has a linear increase in the response value according to the glucose concentration up to 300 mg / dl, and it has been found that it is advantageous for measurement at a high concentration.
  • FADGDH derived from Aspergillus tereus was similarly verified in order to confirm the effect of reducing the sugar chain content of FADGDH derived from other microorganisms.
  • FADGDH derived from Aspergillus terreus has its sequence information and characteristics disclosed in International Publications WO 2004/058958 and WO 2006/101239.
  • the full-length cDNA sequence of Aspergillus tereus-derived FADGDH described in the patent was artificially synthesized, and the gene was inserted into a pTNE vector to obtain pTNE-AtFADGDH.
  • the obtained plasmid was transformed into Aspergillus oryzae NS4 strain and ⁇ och1, and the transformant exhibiting the highest FADGDH activity was selected from the obtained transformants and used for purification of FADGDH.
  • Transformant culture and purification are as follows. As shown. FADGDH expressed using ⁇ och1 as the host was ⁇ och1-AtFADGDH, and FADGDH expressed using the NS4 strain as the host was AtFADGDH. The obtained AtFADGDH and ⁇ och1-AtFADGDH were subjected to SDS-PAGE, and the molecular weight was observed. For SDS-PAGE, Nu-PAGE 4-12% Bis-Tris Gel (manufactured by Invitrogen) was used.
  • FIG. 6 shows the result of SDS-PAGE using a molecular weight marker (BenchMark TM Protein Ladder). Further, FIG. 9 (AtFADGDH) and FIG. 10 ( ⁇ och1-AtFADGDH) plot the molecular weight on the horizontal axis and the relative density of the band on the vertical axis by scanning the density of the band shown in FIG. .
  • the molecular weight distribution of AtFADGDH was 100-220 kDa, whereas the molecular weight distribution of ⁇ och-AtFADGDH was about 80-100 kDa, and the width of the molecular weight distribution was reduced.
  • the molecular weight having the highest relative density of the band is between 160 kDa and 120 kDa, and the molecular weight is determined to be 140 kDa.
  • the molecular weight with the highest relative density of the band is between 90 kDa and 80 kDa, and the molecular weight is determined to be 85 kDa.
  • the width of the molecular weight distribution of FADGDH derived from Aspergillus terreus produced by the production method of the present invention is a molecular weight distribution in which the relative value of the darkness of the band exceeds 60% of the maximum value. It was within 20 kDa.
  • the molecular weight of FADGDH derived from Aspergillus tereus produced by the production method of the present invention is 80% or less (preferably 75% or less, more preferably 70% or less, more preferably Preferably, it was substantially equal to or less than 60.7%.
  • the sugar chain content of FADGDH derived from Aspergillus terreus produced by the production method of the present invention is 60% or less (preferably 55% or less, more preferably substantially less than that of the wild type). The same or less than 51.5%).
  • the molecular weight of FADGDH derived from Aspergillus terreus produced by the production method of the present invention was 90 kDa or less (preferably substantially equal to or less than 85 kDa).
  • the FADGDH of the present invention is suitable for measuring high concentration glucose in self blood glucose measurement, and is extremely useful in self blood glucose measurement.

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Abstract

　本発明の目的は、より優れたグルコースセンサを構築することであり、また、そのようなグルコースセンサにより適したＧＤＨを提供することである。　ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより観察される分子量分布の幅が、バンドの濃さの相対値が最大値の６０％を超える分子量分布で見た場合に５０ｋＤａ以内である、ＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ。

Description

ＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ
本発明は、ＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ、前記ＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースセンサ、およびそれらを用いてグルコース濃度を測定する方法に関する。
血中グルコース濃度の測定は、糖尿病患者が適当な血糖コントロールを行うにあたって必要不可欠である。日常的に血糖値をチェックするために、例えば、グルコースオキシダーゼ（本明細書ではＧＯＤとも記載する。）もしくはグルコースデヒドロゲナーゼ（本明細書ではＧＤＨとも記載する。）を利用したグルコースセンサや簡易型自己血糖測定キットが使われる。ＧＯＤは血糖測定用酵素として古くから用いられているが、溶存酸素が測定値に影響を与えることから、近年ではＧＤＨを用いたものが主流となってきている。ＧＤＨを原料としたグルコースセンサは、ＧＤＨの以下の反応を利用して血液中のグルコース濃度を測定するものである。
 
Ｄ－グルコース　＋　電子受容体（酸化型）　→
　　　　　　　　　　　　Ｄ－グルコノ－δ－ラクトン　＋　電子受容体（還元型）
 
すなわち、グルコースを酸化することによって生じる電子の流れを測定することにより、グルコースの定量を可能にしている。これまでに血糖測定に用いられているＧＤＨとしては、反応に要する補酵素の違いから、ニコチンアミド依存型、ピロロキノリンキノン（本明細書ではＰＱＱとも記載する。）依存型、フラビンアデニンジヌクレオチド（本明細書ではＦＡＤとも記載する。）依存型の３種類が知られている。ニコチンアミド依存型としてはバチルス属由来のものが市販されているが、補酵素を含んだホロ酵素の状態で精製することができないため、センサを作製するにあたって補酵素となるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（本明細書ではＮＡＤとも記載する。）などを加えなければならない。この煩雑さ及び補酵素となるＮＡＤ等が高価であることが問題点として挙げられる。一方、ＰＱＱ依存型ＧＤＨはホロ酵素での提供が可能であり、また比活性が高くグルコースに対する十分な応答シグナルを得られるという利点がある一方で、基質特異性の厳密さに欠け、マルトース等のグルコース以外の糖類にも反応してしまう点が問題視されている。これらの問題点をクリアしうるものとして、ＦＡＤ依存型ＧＤＨが浸透しつつある。
　ＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（本明細書ではＦＡＤＧＤＨとも記載する。）は、アスペルギルス属由来のもの（特許文献１、２および７）、ペニシリウム（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属由来のもの（特許文献３）、ケカビ科糸状菌由来のもの（特許文献４～６）などが知られている。また、こうしたＧＤＨを使用したグルコースセンサ（血糖センサ）も知られている。
特許第４４９４９７８号 特許第４２９２４８６号 米国特許７４９４４９４号 特許第４６４８９９３号 特開２０１３－９０６２１ 特開２０１３－１１６１０２ ＷＯ２００６／１０１２３９
　本発明の目的は、より優れたＦＡＤＧＤＨを提供することであり、前記ＦＡＤＧＤＨを用いてより優れたグルコースセンサを構築することであり、また、それらを用いてグルコース濃度を測定する方法を提供することである。
　本発明者らは、種々のＦＡＤＧＤＨを用いてグルコースセンサの特性を種々検討した。その結果、重要な問題点として、糖鎖を有するＦＡＤＧＤＨを用いて作製されたグルコースセンサにおいて、電極における応答値に差が生じることを見出した。
本発明者らは、さらに検討を行い、電極における応答値の差の原因がグルコースセンサに用いるＦＡＤＧＤＨの分子量の均一性にあることを見出した。本発明者らは、さらに、グルコースセンサに用いるＦＡＤＧＤＨの分子量の均一性を高めることによって、グルコース濃度とグルコースセンサの応答値との比例関係が、より高濃度まで維持されることを明らかにした。
本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものであり、以下の項１～項４から構成されるものである。
項１．
ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより観察される分子量分布の幅が、バンドの濃さの相対値が最大値の６０％を超える分子量分布で見た場合に５０ｋＤａ以内である、ＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ。
項２．
以下のいずれか１種より選ばれる微生物に由来する、項１に記載のＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ。
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、モナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）属、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、シゾフィリウム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、アブシジア（Ａｂｓｉｄｉａ）属、アクチノムコール（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ）属、コレトトリチウム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｉｕｍ）属、シルシネラ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属、アースリニウム（Ａｒｔｈｒｉｎｉｎｍ）属
項３．
項１または２に記載のＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコースセンサ。
項４．
項１または２に記載のＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼまたは項３に記載のグルコースセンサを用いてグルコース濃度を測定する方法。
本発明によれば、性能の優れたグルコースセンサを供給することが可能であり、そのようなグルコースセンサに好適なＧＤＨを提供することが可能となる。
図１は、各アスペルギルス属のｏｃｈ１オルソログのアミノ酸配列の同一性を比較した図である。 図２は、アスペルギルス・オリゼのｏｃｈ１遺伝子の破壊方法を示した図である。 図３は、アスペルギルス・オリゼ発現プラスミドｐＴＮＥ－ＡｏｍＦＡＤＧＤＨのベクターマップを示した図である。 図４は、精製酵素ＡｏｍＦＡＤＧＤＨとΔｏｃｈ１－ＡｏｍＦＡＤＧＤＨをＳＤＳ－ＰＡＧＥした図である。 図５は、精製酵素ＡｏｍＦＡＤＧＤＨ（図ではＡＯと記載、●でプロット）とΔｏｃｈ１－ＡｏｍＦＡＤＧＤＨ（図ではＡＯ－ｏｃｈと記載、▲でプロット）を用いて電極における応答値を測定した図である。図において、多項式（ＡＯ）、多項式（ＡＯ－ｏｃｈ）とは、それぞれプロットされた測定値を基に項数を２次として多項式近似を行って作成した近似曲線を示す。 図６は、精製酵素ＡｔＦＡＤＧＤＨとΔｏｃｈ１－ＡｔＦＡＤＧＤＨをＳＤＳ－ＰＡＧＥした図である。 図７は、図４で示されたＡｏｍＦＡＤＧＤＨのバンドの濃淡をスキャンして横軸に分子量、縦軸にバンドの相対的な濃さをプロットした図である。 図８は、図４で示されたΔｏｃｈ１－ＡＯｍＦＡＤＧＤＨのバンドの濃淡をスキャンして横軸に分子量、縦軸にバンドの相対的な濃さをプロットした図である。 図９は、図６で示されたＡｔＦＡＤＧＤＨのバンドの濃淡をスキャンして横軸に分子量、縦軸にバンドの相対的な濃さをプロットした図である。 図１０は、図６で示されたΔｏｃｈ１－ＡｔＦＡＤＧＤＨのバンドの濃淡をスキャンして横軸に分子量、縦軸にバンドの相対的な濃さをプロットした図である。
（ＦＡＤＧＤＨ）
本発明の実施形態の一つは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより観察される分子量分布の幅が、バンドの濃さの相対値が最大値の６０％を超える分子量分布で見た場合に５０ｋＤａ以内である、ＦＡＤＧＤＨである。
　本発明において、分子量分布はＳＤＳ－ＰＡＧＥにより決定する。具体的には、以下の（１）～（４）に記載の方法に従う。
（１）ＳＤＳ－ＰＡＧＥを、Ｎｕ－ＰＡＧＥ　４－１２％　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ　Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、分子量がそれぞれ５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１６０および２２０ｋＤａのラダーを持つ分子量マーカー（ＢｅｎｃｈＭａｒｋＴＭ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌａｄｄｅｒ）を適用して、実行する。
（２）前記（１）のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果で示されたバンドの濃淡をスキャンして、横軸に分子量、縦軸にバンドの相対的な濃さをプロットする。スキャンおよびプロットにはＧｅｌ　Ｐｒｏ　ａｎａｌｙｚｅｒ（日本ローパー製）を用いる。
（３）前記（２）でプロットした結果から、バンドの濃さの相対値が最大値の６０％を超える分子量範囲を読み取る。
（４）本発明における分子量分布は、前記（３）で読み取った分子量範囲を含む最少の分子量の幅を、前記（１）で使用した分子量マーカーのラダーで設定されている各分子量で区切って表す。例えば、前記（３）で読み取った分子量範囲が７５－８５ｋＤａであれば分子量分布は７０－９０ｋＤａとなり、８５－１０５ｋＤａであれば分子量分布は８０－１２０ｋＤａとなる。
本発明のＦＡＤＧＤＨの分子量分布の幅は、前記の方法で測定した場合５０ｋＤａ以内である。分子量分布の幅は、さらに好ましくは４０ｋＤａ以内、さらに好ましくは３０ｋＤａ以内、さらに好ましくは２０ｋＤａ以内である。
　本発明のＦＡＤＧＤＨの由来は特に限定されないが、以下の（Ａ）群で示される中のいずれか１種より選ばれる微生物に由来することが好ましい。
（Ａ）アスペルギルス属、トリコデルマ属、ニューロスポラ属、モナスカス属、フサリウム属、サッカロマイセス属、ピキア属、キャンディダ属、シゾサッカロマイセス属、クリプトコッカス属、シゾフィリウム属、ムコール属、アブシジア属、アクチノムコール属、コレトトリチウム属、シルシネラ属およびアースリニウム属。
本発明のＦＡＤＧＤＨは、以下の（Ｂ）群で示される中のいずれか１種より選ばれる微生物に由来することがより好ましい。
（Ｂ）アスペルギルス属、ムコール属、アブシジア属、アクチノムコール属、コレトトリチウム属、シルシネラ属、アースリニウム属およびペニシリウム属
本発明のＦＡＤＧＤＨは、さらに好ましくは、アスペルギルス属、ムコール属およびシルシネラ属からなる群のうちいずれかに由来する。このようなものとしては、たとえば、アスペルギルス・オリゼ（配列番号３）、アスペルギルス・テレウス（配列番号４）、ムコール・プライニ（ｐｒａｉｎｉｉ）（配列番号５）、ムコール・ヒエマリス（ｈｉｅｍａｌｉｓ）（配列番号６）、ムコール・スブチリシムス（ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ）（配列番号７）、シルシネラ・シンプレックス（ｓｉｍｐｌｅｘ）（配列番号８）などが挙げられる。
本発明のＦＡＤＧＤＨは、さらに好ましくはアスペルギルス属の微生物に由来する。本発明のＦＡＤＧＤＨは、さらに好ましくは、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｉｚａｅ）、または、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔｅｒｒｅｕｓ）中のいずれか１種の微生物に由来する。
本発明のＦＡＤＧＤＨは、前記それぞれの微生物のアミノ酸配列等に、ＦＡＤＧＤＨとしての機能を失わない程度に改変を加えたものであっても良い。アミノ酸配列を改変する場合、その改変の程度は特に限定されないが、たとえば、１または数個の置換、欠失、挿入、および／または付加がされていてもよいし、野生型のアミノ酸配列と７０％（好ましくは７５％、さらに好ましくは８０％、さらに好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％、さらに好ましくは９８％、さらに好ましくは９９％）以上の同一性を有するものであってもよい。
本発明のＦＡＤＧＤＨの糖鎖含量は、野生型の微生物により生産されるものと比較して均一化されていることが好ましい。その均一化の度合いは分子量分布の幅で表され、前記の方法で測定した場合５０ｋＤａ以内である。分子量分布の幅は、さらに好ましくは４０ｋＤａ以内、さらに好ましくは３０ｋＤａ以内、さらに好ましくは２０ｋＤａ以内である。
本発明のＦＡＤＧＤＨの糖鎖含量は、野生型の微生物により生産されるものと比較して減少していることが好ましい。その減少の度合いは特に限定されないが、好ましくは、野生型のものに比べて６０％以下、さらに好ましくは実質的に５６．３％と同じかそれ未満（本明細書では、「実質的に同じ」とは、測定のばらつき等を考慮して区別がつかない状態を言う。）、さらに好ましくは実質的に５５％と同じかそれ未満、さらに好ましくは実質的に５１．５％と同じかそれ未満、さらに好ましくは実質的に４４．０％と同じかそれ未満である。
　本明細書において、ＦＡＤＧＤＨの糖鎖含量は、ＦＡＤＧＤＨ全体（ポリペプチド鎖部分と糖鎖部分の両方を含む）の分子量とＦＡＤＧＤＨのポリペプチド鎖部分のみの分子量（アミノ酸配列から計算できる。）とを求めたのち、ＦＡＤＧＤＨ全体の分子量からＦＡＤＧＤＨのポリペプチド鎖部分のみの分子量を差し引いた値を糖鎖部分の分子量とし、この値をＦＡＤＧＤＨ全体の分子量で割ることにより求める。
　本明細書において、分子量は、以下の（１）（２）（５）～（７）に記載の方法に従って求める。
（１）ＳＤＳ－ＰＡＧＥを、Ｎｕ－ＰＡＧＥ　４－１２％　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ　Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、分子量がそれぞれ５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１６０および２２０ｋＤａのラダーを持つ分子量マーカー（ＢｅｎｃｈＭａｒｋＴＭ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌａｄｄｅｒ）を適用して、実行する。
（２）前記（１）のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果で示されたバンドの濃淡をスキャンして、横軸に分子量、縦軸にバンドの相対的な濃さをプロットする。スキャンおよびプロットにはＧｅｌ　Ｐｒｏ　ａｎａｌｙｚｅｒ（日本ローパー製）を用いる。
（５）前記（２）でプロットした結果から、バンドの相対的な濃さが最も高い分子量を読み取る。
（６）前記（５）で読み取った分子量範囲を含む最少の分子量の幅を、前記（１）で使用した分子量マーカーのラダーで設定されている各分子量で区切って表す。例えば、前記（５）で読み取ったバンドの相対的な濃さが最も高い分子量が７６ｋＤａであれば、その分子量の幅は７０－８０ｋＤａとなる。
（７）前記（６）で表した分子量の幅の中心値（その幅の上限値と下限値とを足して２で割った値）を分子量とする。
また、本発明のＦＡＤＧＤＨは、前記のとおり糖鎖含量が減少する結果、分子量が野生型の微生物により生産されるものと比較して減少していることが好ましい。その減少の度合いは特に限定されないが、好ましくは、野生型のものに比べて８８％以下、さらに好ましくは８３％以下、さらに好ましくは７５％以下、さらに好ましくは７０％以下、さらに好ましくは実質的に６９．７％と同じかそれ未満、さらに好ましくは実質的に６８．２％と同じかそれ未満、さらに好ましくは実質的に６５％と同じかそれ未満、さらに好ましくは実質的に６０．７％と同じかそれ未満である。
また、本発明のＦＡＤＧＤＨの分子量は、好ましくは１００ｋＤａ以下（さらに好ましくは９０ｋＤａ以下、さらに好ましくは実質的に８８ｋＤａと同じかそれ未満、さらに好ましくは８５ｋＤａと同じかそれ未満である。
前記の本発明のＦＡＤＧＤＨは、後述のグルコースセンサやグルコース測定方法への適用等を考慮して、適当な組成物の形態をとることが可能である。前記組成物の形態は特に限定されず、凍結乾燥や粉末などの乾燥状態および液体状態のどちらでもよい。そのような組成物の製造方法は既に当該技術分野において確立されている。よって、当業者はその知見を適用して本発明の組成物を製造することができ、その態様は特に制限されない。前記組成物に添加できる物質としては、例えば、後述のグルコースセンサに含まれても良いものとして本明細書に例示されている種々の物質が挙げられる。
本発明のＦＡＤＧＤＨは、後述の実施例で示されるように、グルコースセンサに用いた場合において、真のグルコース濃度に対する応答値の良好な比例関係が、野生型のＦＡＤＧＤＨを用いたときと比較して、より高いグルコース濃度範囲まで確保される。その理由の一つとしては、糖鎖含量が低下したことで糖タンパク質重量当たりの活性が向上するため、センサに搭載する糖タンパク質重量が同じでも、酵素活性が相対的に高くなり、高い濃度のグルコースに対しても十分な応答を示すものと考えられる。
また、本発明の生産方法により得られるＦＡＤＧＤＨは、糖鎖含量が均一化することにより、酵素の精製段階において、クロマトグラフィーなどの工程で効率が向上し、その結果、精製収率が向上することが期待できる。
（グルコースセンサ）
　本発明の実施形態の一つは、前記のＦＡＤＧＤＨを含むグルコースセンサである。
前記グルコースセンサは、本発明のＦＡＤＧＤＨを含むものであれば特に限定されない。例えば、電極としてカーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどを用いる方法があり、ＮＡＤもしくはＮＡＤＰといった補酵素、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のＦＡＤＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングすることができる。使用する電子メディエーターとしては、ＧＤＨの補酵素であるＦＡＤから電子を受け取り、発色物質や電極に電子を供与しうるものが挙げられ、たとえばフェリシアン化物塩、フェナジンエトサルフェート、フェナジンメトサルフェート、フェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルフェニレンジアミン、１－メトキシ－フェナジンメトサルフェート、２，６－ジクロロフェノールインドフェノール、２，５－ジメチル－１，４－ベンゾキノン、２，６－ジメチル－１，４－ベンゾキノン、２，５－ジクロロ－１，４－ベンゾキノン、ニトロソアニリン、フェロセン誘導体、オスミウム錯体、ルテニウム錯体等が例示されるが、これらに限定されない。また、電極上のＧＤＨ組成物中には、安定化剤及び／又は活性化剤としてウシ血清アルブミン、セリシン等のタンパク質、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、Ｔｗｅｅｎ２０、コール酸塩、デオキシコール酸塩などの界面活性剤、グリシン、セリン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシルグリシン等のアミノ酸、トレハロース、イノシトール、ソルビトール、キシリトール、グリセロール、スクロース等の糖及び／又は糖アルコール類、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類、さらにはプルラン、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、ポリグルタミン酸などの親水性ポリマーを含んでもよい。
（グルコース測定方法）
本発明の実施形態の一つは、前記のＦＡＤＧＤＨまたは前記のグルコースセンサを用いてグルコース濃度を測定する方法である。グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースの測定方法は既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い、本発明のＦＡＤＧＤＨを用いて、各種試料中のグルコースの量又は濃度を測定することができる。本発明のＦＡＤＧＤＨを用いてグルコースの濃度又は量が測定可能である限り、その態様は特に制限されないが、例えば、本発明のＦＡＤＧＤＨを試料中のグルコースに作用させ、グルコースの脱水素反応に伴う電子受容体（例えば、ＤＣＰＩＰ）の構造変化を吸光度で測定することにより実施することができる。グルコースを含有する試料は、特に制限されないが、例えば、血液、飲料、食品等を挙げることができる。グルコース濃度又は量の測定が可能である限り、試料に添加する酵素の量は特に制限されない。
前記のグルコースセンサを用いたグルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明のＦＡＤＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
　本発明のグルコース測定方法は、前記のグルコースセンサ以外に、グルコース測定用組成物やグルコースアッセイキットなど血中のグルコース濃度を測定する試薬、キット等を用いることによっても実行することができる。
前記グルコース測定用組成物、前記グルコースアッセイキットは、本発明のＦＡＤＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含むものであれば特に限定されない。典型的には、本発明のＦＡＤＧＤＨ、緩衝液、メディエーターなど測定に必要な試薬、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明のキットは、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
前記のグルコースセンサ、グルコース測定用組成物およびグルコースアッセイキット等の利用方法や製造方法などは既に当該技術分野において確立されている。よって、当業者はその知見を適用してそれらのグルコースセンサ、グルコース測定試薬、グルコース測用キット等を製造し使用することができ、その態様は特に制限されない。たとえば、ＦＡＤＧＤＨを用いてグルコース濃度を測定する目的で用いる１セットのうち一部または全部を構成する製品であって、本発明のＦＡＤＧＤＨを含むものであれば良い。
（本発明のＦＡＤＧＤＨの製造方法）
前記の本発明のＦＡＤＧＤＨ（ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより観察される分子量分布の幅が、バンドの濃さの相対値が最大値の６０％を超える分子量分布で見た場合に５０ｋＤａ以内である、ＦＡＤＧＤＨ）を製造する方法は特に限定されない。
　例えば、公知の、タンパク質に付加する糖鎖の構造を改変制御できる技術を用いることにより、分子量の均一性を高めることができる。そのような技術を以下に例示する。
タンパク質に結合する糖鎖にはタンパク質のアスパラギン残基に結合するＮ型とセリンまたはスレオニンに結合するＯ型の２種類があることが知られている。このうち、Ｎ型糖鎖の生合成経路については多くの知見があり、詳しく解析されている。
糖鎖の生合成は、まず小胞体（ＥＲ）で始まり、その後ゴルジ体でさらに糖鎖の修飾が起こる。このうちＥＲで生成する糖鎖は真菌も哺乳類細胞も基本的には同じであることが判明している。その糖鎖は８分子のマンノース（Ｍａｎ）と２分子のＮアセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）からなるコア構造（Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２）が構成されている。このコア構造糖鎖を持つタンパク質はゴルジ体に輸送されて、種々の修飾を受ける。
酵母に於いてＥＲでの糖鎖の生成過程は、ａｌｇファミリー遺伝子が合成を行う。まず、ａｌｇ７，ａｌｇ１３，ａｌｇ１４遺伝子によってＧｌｃＮＡｃが付加され、次いで、ａｌｇ１，ａｌｇ２，ａｌｇ１１，ａｌｇ３，ａｌｇ９によってマンノースが付加されてコア構造を生成する。次に、ゴルジ体に運ばれた糖タンパク質はｏｃｈ１によってさらにマンノースが付加された後、Ｍｎｎ１，Ｍｎｎ４，Ｍｎｎ６によって多量のマンノースが付加されて、ハイパーマンノース型糖鎖へと生成される。
酵母や糸状菌において、遺伝子工学的手法を用いることによって、上述する遺伝子の破壊により、分泌されるタンパク質に結合する糖鎖の構造を改変することが試みられている。例えば、Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　２００８　７４（４）：１０７６－８６には、糸状菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｒａｎｓにおいてａｌｇ３（ａｌｇＣ）遺伝子を破壊することによって、Ｎ型糖鎖に含まれるヘキソース量が低減することが示されており、ａｌｇ３遺伝子がα１，３マンノシルトランスフェラーゼをコードすることが調べられている。さらに、ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ．　２０１０　５（１２）においては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｕｍｉｇａｔｕｓにおいて、ｏｃｈ１遺伝子を破壊することによって、糖鎖組成が変化することが調べられている。
他方、糸状菌においては、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．　２００９　２８４（１８）：１１９００－１２によると、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、ａｌｇ２のＧ３７７Ｒ変異体は温度感受性になり、且つ糖鎖の鎖長も大幅に低減することが調べられている。また、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．　１９９９　９（１２）：１２８７－９３には、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ　ｐｕｓｉｌｌｕｓにおいてａｌｇ２の変異体を取得したことが報告されており、５ｂｐの挿入変異によってａｌｇ２の機能が低下した変異体においてＮ型糖鎖の殆どが、Ｍａｎ１ＧｌｃＮＡｃ２若しくは、Ｍａｎ２ＧｌｃＮＡｃ２の構造を有することが調べられている。
　また、以下に例示するように、ｏｃｈ１遺伝子の機能を低下させた改変微生物を用いてＦＡＤＧＤＨを生産する方法によっても、前記の本発明のＦＡＤＧＤＨを製造することができる。
ｏｃｈ１遺伝子とは、タンパク質のアスパラギン残基に結合するＮ型糖鎖の生合成の関わる酵素の１つであるｏｃｈ１の発現を制御する遺伝子である。
ｏｃｈ１遺伝子は糖タンパク質を合成する機能を有する微生物のほぼすべてに存在する。例えば、アスペルギルス属、トリコデルマ属、ニューロスポラ属、モナスカス属、フサリウム属、サッカロマイセス属、ピキア属、キャンディダ属、シゾサッカロマイセス属、クリプトコッカス属、シゾフィリウム属、ムコール属、アブシジア属、アクチノムコール属、コレトトリチウム属、シルシネラ属、アースリニウム属、コッシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）属、ボトリティアナ（Ｂｏｔｒｙｔｉａｎｉａ）属、レプトスファリア（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）属、ポドスポラ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）属、チラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）属、バーティシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ヤロイワ（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、シバリンデネラ（Ｃｙｂｅｒｌｉｎｄｎｅｒａ）属、シェファロマイセス（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ）属、エレモセシウム（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ）属、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属、サッカロマイセタセア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）属、アシビア（Ａｓｈｂｙａ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ラカンセア（Ｌａｃｈａｎｃｅａ）属、ザイゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、カザキスタニア（Ｋａｚａｃｈｓｔａｎｉａ）属、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属、ナウモボザイマ（Ｎａｕｍｏｖｏｚｙｍａ）属、テトラピシスポラ（Ｔｅｔｒａｐｉｓｉｓｐｏｒａ）属、マイセリオフォソラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）属などが挙げられるが特に限定されない。
本発明者らは、ＦＡＤＧＤＨの糖鎖含量がグルコースセンサにおける電極応答値に与える影響について、種々の、ＦＡＤＧＤＨを生産できる能力を有する微生物を用いて、より詳細に解析を行った。その結果、ＦＡＤＧＤＨを、アスペルギルス・オリゼを宿主として発現させ、液体培養によって前記宿主を増殖させた培養液から精製された精製酵素は、結合する糖鎖の組成が不均一であり、さまざまな鎖長の糖鎖が結合していると推察された。また、酵母サッカロマイセス・セレビシエを宿主として発現されたＦＡＤＧＤＨの糖鎖は、アスペルギルス・オリゼを宿主として発現されたものと同じく様々な鎖長の糖鎖が結合しており、さらにその糖鎖の鎖長はアルペルギルス・オリゼを宿主として発現されたＦＡＤＧＤＨよりも長いことが確認された。
そこで、本発明者らは、ＦＡＤＧＤＨに結合する糖鎖含量を調節するために、さらに鋭意検討を重ねた。その結果、ＦＡＤＧＤＨを生産できる能力を有する微生物の糖鎖合成関連遺伝子の一つであるｏｃｈ１遺伝子を破壊、若しくはその機能を低下させることによって、ＦＡＤＧＤＨに結合する糖鎖を大幅に短く（その結果、糖鎖含量を低減）することが出来、且つ、その糖鎖組成はほぼ均一となることを見出した。
微生物のｏｃｈ１遺伝子の機能を低下させるための、より好ましい手段は、ｏｃｈ１遺伝子に相当するＤＮＡを破壊することである。
上記で例示された、本発明のＦＡＤＧＤＨを製造する方法において、ｏｃｈ１遺伝子の配列は特に限定されないが、例えば、アスペルギルス・オリゼ（ｏｒｙｚａｅ）に由来するものであれば、配列番号２のＤＮＡ配列が挙げられる。配列番号２は、配列番号１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である。
ｏｃｈ１遺伝子の配列は、微生物の種類によって異なるが、例えば、アスペルギルス属の微生物の間では高度に保存されている。また、アスペルギルス属以外の微生物においても、相同性検索から、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ属、Ｂｏｔｒｙｔｉａｎｉａ属、Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ属、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ属、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ属、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属、Ｃｙｂｅｒｌｉｎｄｎｅｒａ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ属、Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ属、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ属、Ａｓｈｂｙａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｌａｃｈａｎｃｅａ属、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋａｚａｃｈｓｔａｎｉａ属、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ属、Ｎａｕｍｏｖｏｚｙｍａ属、Ｔｅｔｒａｐｉｓｉｓｐｏｒａ属、Ｎａｕｍｏｖｏｚｙｍａ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋａｚａｃｈｓｔａｎｉａ属、Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ属、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ属において、相同性の高い（Ｅ－ｖａｌｕｅ＜２ｅ－３４（２のマイナス３４乗（本書では「２ｅ－ｎ」で２のマイナスｎ乗を表す。）））配列を有していることが確認されており（結果を表１および表２に示す。）、このことはｏｃｈ１遺伝子の配列が真菌類において高度に保存されていることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
塩基配列の同一性は、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴにおいてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、算出する。Ｅ－ｖａｌｕｅとは、２つの配列の類似性を比較するための尺度で、その値が小さいほど類似度が高いことを示す。
上記で例示された、本発明のＦＡＤＧＤＨを製造する方法において、ｏｃｈ１遺伝子は、以下の（ａ）（ｂ）のいずれかであっても良い。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列と６８％以上（好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号２のＤＮＡ配列と６８％以上（好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上）の同一性を有するＤＮＡ
上記で例示された、本発明のＦＡＤＧＤＨを製造する方法において、ｏｃｈ１遺伝子は、アスペルギルス属に属する微生物においては、以下の（ｃ）（ｄ）のいずれかであっても良い。
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは７３％以上、さらに好ましくは７４％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは７６％以上）の同一性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号２のＤＮＡ配列と７０％以上（好ましくは７３％以上、さらに好ましくは７４％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは７６％以上）の同一性を有するＤＮＡ
ＢＬＡＳＴによる相同性検索によれば、配列番号１のアミノ酸配列との同一性は、アスペルギルス・ニードランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のものと７０％、アスペルギルス・ニガー（ｎｉｇｅｒ）由来のものと７３％、アスペルギルス・カワチ（ｋａｗａｃｈｉｉ）由来のものと７４％、アスペルギルス・テレウス（ｔｅｒｒｅｕｓ）由来のものと７７％、アスペルギルス・クラバタス（ｃｌａｖａｔｕｓ）由来のものと７８％、アスペルギルス・フラバス（ｆｌａｖｕｓ）由来のものと１００％である。
上記で例示された、本発明のＦＡＤＧＤＨを製造する方法において、ｏｃｈ１遺伝子の配列は、アスペルギルス属に属する微生物においては、以下の（ｅ）の通りであっても良い。
（ｅ）ＢＬＡＳＴによる相同性検索において、配列番号２に対する同一性が７３％以上（好ましくは７４％以上、さらに好ましくは７６％以上、さらに好ましくは９９％以上、）の値を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
ＢＬＡＳＴによる相同性検索によれば、配列番号２に対する同一性は、アスペルギルス・ニードランス由来のものに対して７４％、アスペルギルス・ニガー由来のものに対して７６％、アスペルギルス・クラバタス由来のものに対して７４％、アスペルギルス・テレウス由来のものに対して７６％である。
上記で例示された、本発明のＦＡＤＧＤＨを製造する方法に用いる改変微生物の、改変前の微生物は、ｏｃｈ１遺伝子を有する微生物であれば特に限定されない。例えば上記で列挙した微生物を用いることができる。
本発明のＦＡＤＧＤＨを製造する方法に用いる改変微生物は、前記改変前の微生物のｏｃｈ１遺伝子の機能を低下させた改変微生物である。例えば、以下のいずれか１種より選ばれる微生物である。
アスペルギルス属、トリコデルマ属、ニューロスポラ属、モナスカス属、フサリウム属、サッカロマイセス属、ピキア属、キャンディダ属、シゾサッカロマイセス属、クリプトコッカス属、シゾフィリウム属、ムコール属、アブシジア属、アクチノムコール属、コレトトリチウム属、シルシネラ属、アースリニウム属。
中でも、糸状菌に分類される微生物、特に、麹菌（アスペルギルス属に属する微生物）は糖質分解酵素であるアミラーゼやグルコアミラーゼ、タンパク質分解酵素などを大量に分泌生産するため、清酒や味噌などの発酵醸造産業に広く利用されているだけでなく、そのタンパク質分泌能力の高さから、本発明のＦＡＤＧＤＨを製造するための発現宿主として好ましい。中でも、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・二がー、アスペルギルス・テレウスなどがより好ましい。
上記で例示された、本発明のＦＡＤＧＤＨ生産方法に用いる改変微生物は、形質転換体であっても良い。この場合は、宿主微生物としてｏｃｈ１遺伝子の機能を低下させた改変微生物を用い、これにＦＡＤＧＤＨをコードするＤＮＡを適切なベクターを介して導入して得られた形質転換体を用いて、ＦＡＤＧＤＨを生産する。
ｏｃｈ１遺伝子の機能を低下させる手段は、特に限定されない。
その手段の一つは、前記ｏｃｈ１遺伝子に相当するＤＮＡを破壊することである。この方法は、用いようとする微生物のｏｃｈ１遺伝子配列が特定されている場合に適している。ここで破壊とは、ｏｃｈ１遺伝子に相当するＤＮＡ配列の全部または一部を除去するか、前記ＤＮＡ配列の少なくとも１箇所に変異を加えるか、または、前記ＤＮＡ配列の両端以外の少なくとも１箇所に任意のＤＮＡ配列を挿入すること等によって、その機能を低減若しくは完全に停止させることを言う。
ｏｃｈ１遺伝子の機能を低下させた改変微生物の作製方法は、種々の公知の方法を用いて行えばよく、特に限定されない。
例えば、形質転換体を用いる場合、ｏｃｈ１遺伝子を破壊する方法としては、ＤＮＡの相同組換えを用いる方法が一般的であり、形質転換に用いるマーカー遺伝子に、目的とする遺伝子の上流非翻訳領域と下流翻訳領域を連結させた遺伝子破壊カセットを構築し、宿主微生物を形質転換することによって、ｏｃｈ１遺伝子の上流と下流で相同組換えを起こさせ、ｏｃｈ１のＯＲＦ部分を除去することにより遺伝子の機能を低下させることが可能である。
また、遺伝子破壊カセットをｏｃｈ１のＯＲＦ内部で転写が終結するように構築し、目的遺伝子の位置に遺伝子破壊カセットを挿入することにより、遺伝子の機能を停止させることも可能である。
ｏｃｈ１遺伝子の機能を低下させる別の手段としては、突然変異によりｏｃｈ１遺伝子の機能を低下した改変微生物を得ることも可能である。
この方法では、用いようとする微生物に対して、変異剤処理や、紫外線、エックス線またはガンマ線の照射などの物理的処理によって、突然変異を起こす頻度を高めてもよいが、天然に生じるバリアントであっても構わない。
この方法は、用いようとする微生物にｏｃｈ１遺伝子の働きに該当する機能が認められるものの、ｏｃｈ１遺伝子配列が特定されていない場合に適している。
ｏｃｈ１遺伝子の発現を低下させる別の手段としては、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：　ＲＮＡｉ）による転写抑制も可能である。
この方法では、目的の遺伝子によって転写されるｍＲＮＡの相補鎖となるＤＮＡ若しくはＲＮＡを微生物に導入、若しくは微生物内で転写させることによって、ｍＲＮＡと二重鎖を形成することによってｍＲＮＡを不安定化させ、また、ｍＲＮＡからペプチドへの翻訳を抑制することによって、ｏｃｈ１の発現を低下させることが可能である。
この方法は、遺伝子の相同組換え効率が低い微生物において、ターゲティングによる目的遺伝子の破壊が困難な場合に有効である。
本発明のＦＡＤＧＤＨを形質転換体を用いて製造する場合、前記ＦＡＤＧＤＨの由来は、その生物学的分類における属（ｇｅｎｕｓ）および／または種（ｓｐｅｃｉｅｓ）が、宿主微生物の属および／または種に対して、同じであってもかまわないし異なっていてもかまわない。
本発明のＦＡＤＧＤＨを形質転換体を用いて製造する場合、前記ＦＡＤＧＤＨをコードするＤＮＡを宿主微生物に導入し発現させる方法は、特に限定されない。例えば、前記ＤＮＡを宿主に対応した適当なベクターへ挿入し、さらにそのベクターを宿主に導入して形質転換すればよい。このような方法は、標準的な組換えＤＮＡ技術であって、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ｔｈｉｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　１．８４，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋを参照して行うことができる。
本発明のＦＡＤＧＤＨを製造する方法においては、上述のいずれかの方法で作製された改変微生物を用いてＦＡＤＧＤＨを生産することができる。例えば、前記改変微生物を培養してＦＡＤＧＤＨを発現させ、得られた培養液を精製することによって製造することができる。一般に、目的の蛋白質を該蛋白質を発現する微生物を培養して得られた培養液を精製することによって製造する方法は、既に当該技術分野において確立されている。よって、当業者はその知見を適用してＦＡＤＧＤＨを製造することができ、その態様は特に制限されない。
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
１．アスペルギルス・オリゼ由来ｏｃｈ１遺伝子の選抜
アスペルギルス・オリゼ由来ｏｃｈ１糖鎖合成関連遺伝子の選抜は、糖鎖合成関連遺伝子がよく研究されている、酵母サッカロマイセス・セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の遺伝子情報から相同性が高い配列を選抜することにより行った。選抜した遺伝子がコードすると推定されるアミノ酸を配列番号１に、ｏｃｈ１をコードすると想定されるＤＮＡ配列を配列番号２に示す。選抜した遺伝子がコードすると推定されるアミノ酸配列情報を元に、同じアスペルギルス属においてホモロジー検索を行った結果、アスペルギルス・ニガーとは７３％、アスペルギルス・フミガタスとは７７％、アスペルギルス・ニードランスとは７０％の同一性を示すアミノ酸配列をコードする遺伝子が存在しており、これら遺伝子群はアスペルギルス属において高度に保存されていると考えられる。図１に、各アスペルギルス属のｏｃｈ１オルソログのアミノ酸配列の同一性の比較を示す。
２．アスペルギルス・オリゼ由来ｏｃｈ１遺伝子破壊カセットの作製
　アスペルギルス・オリゼのｏｃｈ１遺伝子破壊カセットは以下のようにして構築した。アスペルギルス・オリゼのゲノムＤＮＡをテンプレートとして、配列番号９と配列番号１０に示すプライマーでＰＣＲを行い、アスペルギルス・オリゼのｏｃｈ１遺伝子を含み、遺伝子の上流２ｋｂｐから遺伝子の下流２ｋｂｐまでの領域を増幅した。増幅したＰＣＲ産物は、Ｔａｒｇｅｔ－ｃｌｏｎｅ　Ｐｌｕｓ（東洋紡社製）を用いてＴＡクローニングし、ｐＴＡ２ベクターに挿入した。作製されたベクターはｐＴＡｏｏｃｈ１±２Ｋとした。
つづいて、ｏｃｈ１遺伝子のＯＲＦ部分を取り除くため、ｐＴＡｏｏｃｈ１±２Ｋをテンプレートに配列番号１１と配列番号１２に示すプライマーでｉｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲを行った。得られたベクターはｐＴＡｏｏｃｈ１±２Ｋ－ＯＲＦとした。続いて、マーカー遺伝子を挿入するため、ｐＵＳＡベクターから制限酵素ＸｂａＩと制限酵素ＳｂｆＩによってｓＣマーカー部分を切り出し、制限酵素ＮｈｅＩとＳｂｆＩで消化したｐＴＡｏｏｃｈ１±２Ｋ－ＯＲＦに挿入した。得られたベクターをｐＴΔＡｏｏｃｈ１－ｓＣを作製した。
３．糖鎖合成関連遺伝子破壊株の作製
２．で得られたベクターｐＴΔＡｏｏｃｈ１－ｓＣをＱｉａｆｉｌｔｅｒ　ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｄｉ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて大量に調製し、麹菌への形質転換に用いた。組換え宿主には麹菌アスペルギルス・オリゼ　ＮＳ４株を使用し、形質転換の手法は、プロトプラスト－ＰＥＧ法によって行った。遺伝子破壊の原理については図２に示す。得られた形質転換体の中からｏｃｈ１遺伝子破壊株を、ＰＣＲによって確認して選抜した。
４．ＡｏＦＡＤＧＤＨ遺伝子の発現
　アスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨ遺伝子の発現は以下のようにして行った。麹菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅのゲノムＤＮＡからｎｉａＤを含む領域を配列番号１３のプライマーと配列番号１４のプライマーによって増幅し、東洋紡社製のＴａｒｇｅｔ　ｃｌｏｎｅ　ｐｌｕｓによってＴＡクローニングしｐＴＮとした。次に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅのゲノムＤＮＡから配列番号１５のプライマーと配列番号１６のプライマーによって、Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ１αと予測される遺伝子の翻訳開始点から上流１ｋｂｐをＰＣＲによって増幅し、さらに、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅのゲノムＤＮＡから配列番号１７のプライマーと配列番号１８のプライマーによって、ＡｍｙＢターミネーターの領域をＰＣＲによって増幅した。ｐＴＮについては配列番号１９のプライマーと配列番号２０のプライマーでＰＣＲを行うことにより、プラスミドを増幅した。上述の通り作製した３つのＰＣＲ産物を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて融合させ、ｎｉａＤマーカーとＥＦ１プロモーター、ＡｍｙＢターミネーターを含む発現ベクターｐＴＮＥを作製した。
　つづいて、アスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨについては国際公開公報ＷＯ２００９／１１９７２８に記載の配列、すなわち、アスペルギルス・オリゼＴＩ株のｃＤＮＡからクローニングされた配列にＧ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃの変異を導入した配列を使用した。ＦＡＤＧＤＨをコードするアミノ酸配列を配列番号２１にＤＮＡ配列を配列番号２２にそれぞれ示す。アスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨを配列番号２３のプライマーと配列番号２４のプライマーによって増幅し、得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＳｐｅＩによって消化し、同じくＳｐｅＩによって消化されたｐＴＮＥのＥＦ１プロモーターの下流に順方向に遺伝子を挿入した。得られたベクターをｐＴＮＥ－ＡｏｍＦＡＤＧＤＨとした。ｐＴＮＥ－ＡｏｍＦＡＤＧＤＨのベクターマップを図３に示す。ｐＴＮＥ－ＡｏｍＦＡＤＧＤＨをΔｏｃｈ１株及びＮＳ４株に形質転換を行った。得られた形質転換体をＤＰ培地で培養し、最も高い生産性を示す形質転換体を選抜した。
５．ＡｏｍＦＡＤＧＤＨの精製
４．で得られた形質転換体を滅菌した６０ｍＬのＤＰ液体培地／５００ｍｌ坂口フラスコに植菌し、３０℃下で２日間振とう培養して前培養液とした。次に、７．０ＬのＹＰＭ培地（５％酵母エキス、２％大豆ペプトン、５％マルトース）／１０Ｌ容ジャーファーメンターに前培養液を植菌し、培養温度３５℃、攪拌速度４００ｒｐｍ、通気量６．０Ｌ／分、管内圧０．２ＭＰａの条件で３日間培養した。その後、培養液を濾布で濾過し、濾過液を回収した。
濾過液を分画分子量３０，０００のＵＦ膜（ミリポア（株）製）を用いて濃縮し、濃縮液に連続してリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）を添加することによってバッファーを置換した。続いて、濃縮液に硫酸アンモニウムを４０％（ｗ／ｖ）徐々に添加して、室温で３０分間攪拌した後、ろ過助剤を用いて余分な沈殿を除去した。次に、予め４０％（ｗ／ｖ）の硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した２００ｍＬのＰＳセファロースＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）カラムに濾過液をチャージし、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に段階的に置換してタンパク質を溶出させた。そして、溶出された画分を分画分子量１０，０００の中空糸膜（スペクトラムラボラトリーズ製）で濃縮し、濃縮液に連続してリン酸緩衝液（５０Ｍ，ｐＨ６．０）を添加することによってバッファーを置換した。続いて、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＤＥＡＥセファロースＦａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）カラム酵素液を通液し、精製酵素を得た。宿主をΔｏｃｈ１として発現されたＦＡＤＧＤＨをΔｏｃｈ１－ＡｏｍＦＡＤＧＤＨ、宿主をＮＳ４株として発現されたＦＡＤＧＤＨをＡｏｍＦＡＤＧＤＨとした。得られたＡｏｍＦＡＤＧＤＨとΔｏｃｈ１－ＡｏｍＦＡＤＧＤＨとをＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、分子量を観察した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥはＮｕ－ＰＡＧＥ　４－１２％　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ　Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用した。分子量がそれぞれ５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１６０および２２０ｋＤａのラダーを持つ分子量マーカー（ＢｅｎｃｈＭａｒｋＴＭ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌａｄｄｅｒ）を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った結果を図４に示す。さらに、図４で示されたバンドの濃淡をスキャンして横軸に分子量、縦軸にバンドの相対的な濃さをプロットしたのが図７（ＡｏｍＦＡＤＧＤＨ）および図８（Δｏｃｈ１－ＡｏｍＦＡＤＧＤＨ）である。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果、ＡｏｍＦＡＤＧＤＨの分子量分布は８０－１６０ｋＤａ、一方で、Δｏｃｈ－ＡｏｍＦＡＤＧＤＨの分子量分布は約７０－９０ｋＤａであり、分子量分布の幅が減少していた。
図７によれば、ＡｏｍＦＡＤＧＤＨの場合、バンドの相対的な濃さが最も高い分子量は１２０ｋＤａと１００ｋＤａとの間にあり、分子量は１１０ｋＤａと判断される。一方、図８によれば、Δｏｃｈ－ＡｏｍＦＡＤＧＤＨの場合は、バンドの相対的な濃さが最も高い分子量は８０ｋＤａと７０ｋＤａとの間にあり、分子量は７５ｋＤａと判断される。
このように、本発明の生産方法により得られたＦＡＤＧＤＨは、その分子量が野生型のものに比べて、７５÷１１０×１００＝６８．２（％）にまで減少していた。また、ＦＡＤＧＤＨのポリペプチド鎖部分のみの分子量は６０ｋＤａであるから、糖鎖含量は、野生型の｛（１１０－６０）÷１１０｝×１００＝４５．５（％）から｛（７５－６０）÷７５｝×１００＝２０．０（％）に減少していた（野生型の４４．０％）。
以上の試験結果より、本発明の生産方法で作製されたアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨの分子量分布の幅は、バンドの濃さの相対値が最大値の６０％を超える分子量分布で見た場合、２０ｋＤａ以内となっていた。
以上の試験結果より、本発明の生産方法で作製されたアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨの分子量は、野生型のものに比べて８０％以下（好ましくは７５％以下、さらに好ましくは７０％以下、さらに好ましくは実質的に６８．２％と同じかそれ未満）となっていた。
以上の試験結果より、本発明の生産方法で作製されたアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨの糖鎖含量は、野生型のものに比べて６０％以下（好ましくは５５％以下、さらに好ましくは実質的に４４．０％と同じかそれ未満）となっていた。
以上の試験結果より、本発明の生産方法で作製されたアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨの分子量は、９０ｋＤａ以下（好ましくは８０％以下、さらに好ましくは実質的に７５ｋＤａと同じかそれ未満）であった。
６．電気化学式センサにおける応答値への糖鎖含量の影響比較
まず、グルコース測定用試薬として、以下の組成からなる溶液（ｐＨ＝７．０）を作製した。
１ｍＭ　クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）
５０ｍＭ　フェリシアン化カリウム
０．４ｍｇ／ｍｌ　ＦＡＤＧＤＨ
まず、０．５％のＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）５μＬを３電極を上記溶液５μＬを、３電極を有するディスポーサブルチップ（ＤＥＰ－ＣＨＩＰ、バイオデバイステクノロジーズ社製）の作用極・対極・参照極上に滴下し、５０℃１０分の加温処理を行って乾燥させた。続いて、上記組成液５μＬをＣＭＣを固定化した箇所に滴下し、５０℃１０分の加温処理を行って、センサチップとした。このセンサチップを専用ソケットを介してポテンショ／ガルバノスタットに接続し、電極上の組成物に０～３００ｍｇ／ｄｌの標準グルコース溶液５μＬを添加して＋０．３Ｖの電圧を印加して電流値をモニタリングし、印加後３秒時点の電流値を応答値とした。グルコース標準液の濃度と応答値の関係を図５に示す。
測定の結果、ＡｏｍＦＡＤＧＤＨは１００ｍｇ／ｄｌから２００ｍｇ／ｄｌでの応答値がΔｏｃｈ１－ＡｏｍＦＡＤＧＤＨと比較して高いが、３００ｍｇ／ｄｌでは応答値がΔｏｃｈ１－ＡｏｍＦＡＤＧＤＨより低く、高濃度での応答において課題があることが判明した。一方で、Δｏｃｈ１－ＡｏｍＦＡＤＧＤＨは３００ｍｇ／ｄｌまでグルコースの濃度に応じて応答値が直線的に上昇しており、高濃度での測定に有利であることが判明した。
７．ＡｔＦＡＤＧＤＨの調製
続いて、他の微生物由来のＦＡＤＧＤＨについても糖鎖含量低減の効果を確認するため、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤＧＤＨについても同様に効果を検証した。アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤＧＤＨは国際公開公報ＷＯ２００４／０５８９５８及びＷＯ２００６／１０１２３９にその配列情報及び特性が開示されている。特許記載のアスペルギルス・テレウス由来ＦＡＤＧＤＨのｃＤＮＡ配列全長を人工的に合成し、さらにｐＴＮＥベクターに遺伝子を挿入することでｐＴＮＥ－ＡｔＦＡＤＧＤＨを得た。得られたプラスミドをＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ　ＮＳ４株及びΔｏｃｈ１に形質転換し、得られた形質転換体の中から最も高いＦＡＤＧＤＨ活性をしめす形質転換体を選抜し、ＦＡＤＧＤＨの精製に用いた。形質転換体の培養及び精製は２．で示すとおりに行った。宿主をΔｏｃｈ１として発現されたＦＡＤＧＤＨをΔｏｃｈ１－ＡｔＦＡＤＧＤＨ、宿主をＮＳ４株として発現されたＦＡＤＧＤＨをＡｔＦＡＤＧＤＨとした。得られたＡｔＦＡＤＧＤＨとΔｏｃｈ１－ＡｔＦＡＤＧＤＨとをＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、分子量を観察した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥはＮｕ－ＰＡＧＥ　４－１２％　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ　Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用した。分子量マーカー（ＢｅｎｃｈＭａｒｋＴＭ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌａｄｄｅｒ））を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った結果を図６に示す。さらに、図６で示されたバンドの濃淡をスキャンして横軸に分子量、縦軸にバンドの相対的な濃さをプロットしたのが図９（ＡｔＦＡＤＧＤＨ）および図１０（Δｏｃｈ１－ＡｔＦＡＤＧＤＨ）である。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果、ＡｔＦＡＤＧＤＨの分子量分布は１００－２２０ｋＤａ、一方で、Δｏｃｈ－ＡｔＦＡＤＧＤＨの分子量分布は約８０－１００ｋＤａであり、分子量分布の幅が減少していた。
図９によれば、ＡｔＦＡＤＧＤＨの場合、バンドの相対的な濃さが最も高い分子量は、１６０ｋＤａと１２０ｋＤａとの間にあり、分子量は１４０ｋＤａと判断される。一方、図１０によれば、Δｏｃｈ－ＡｔＦＡＤＧＤＨの場合は、バンドの相対的な濃さが最も高い分子量は９０ｋＤａと８０ｋＤａとの間にあり、分子量は８５ｋＤａと判断される。
このように、本発明の生産方法により得られたＦＡＤＧＤＨは、その分子量が野生型のものに比べて、８５÷１４０×１００＝６０．７（％）にまで減少していた。また、ＦＡＤＧＤＨのポリペプチド鎖部分のみの分子量は６０ｋＤａであるから、糖鎖含量は、野生型の｛（１４０－６０）÷１４０｝×１００＝５７．１（％）から｛（８５－６０）÷８５｝×１００＝２９．４（％）に減少していた（野生型の５１．５％）。
以上の試験結果より、本発明の生産方法で作製されたアスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤＧＤＨの分子量分布の幅は、バンドの濃さの相対値が最大値の６０％を超える分子量分布で見た場合、２０ｋＤａ以内となっていた。
以上の試験結果より、本発明の生産方法で作製されたアスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤＧＤＨの分子量は、野生型のものに比べて８０％以下（好ましくは７５％以下、さらに好ましくは７０％以下、さらに好ましくは実質的に６０．７％と同じかそれ未満）となっていた。
以上の試験結果より、本発明の生産方法で作製されたアスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤＧＤＨの糖鎖含量は、野生型のものに比べて６０％以下（好ましくは５５％以下、さらに好ましくは実質的に５１．５％と同じかそれ未満）となっていた。
以上の試験結果より、本発明の生産方法で作製されたアスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤＧＤＨの分子量は、９０ｋＤａ以下（好ましくは実質的に８５ｋＤａと同じかそれ未満）であった。
　本発明のＦＡＤＧＤＨは自己血糖測定において、高濃度グルコースを測定するのに適しており、自己血糖測定において極めて有用である。

Claims (4)

  1. ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより観察される分子量分布の幅が、バンドの濃さの相対値が最大値の６０％を超える分子量分布で見た場合に５０ｋＤａ以内である、ＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ。
  2. 以下のいずれか１種より選ばれる微生物に由来する、請求項１に記載のＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ。
    アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、モナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）属、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、シゾフィリウム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、アブシジア（Ａｂｓｉｄｉａ）属、アクチノムコール（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ）属、コレトトリチウム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｉｕｍ）属、シルシネラ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属、アースリニウム（Ａｒｔｈｒｉｎｉｎｍ）属
  3. 請求項１または２に記載のＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコースセンサ。
  4. 請求項１または２に記載のＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼまたは請求項３に記載のグルコースセンサを用いてグルコース濃度を測定する方法。
     
     
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