JP6461793B2 - ムコール属由来のフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法 - Google Patents

Description

本発明は、特定の微生物を宿主として利用した、糖鎖結合量が均一なムコール属由来のフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＦＡＤ−ＧＤＨとも記載する）の効率的な生産方法に関し、特に、血糖自己測定用のバイオセンサに使用するのに好適なＦＡＤ−ＧＤＨの生産方法に関する。

血糖自己測定は、糖尿病患者が通常の自分の血糖値を把握して治療に生かすために重要である。血糖自己測定に用いられるバイオセンサは、一般的に、絶縁体基板上に、測定電極、対電極及び検知電極からなる電極層を形成し、これらの電極基板上に、グルコースを基質とする酵素と電子受容体を含む試薬層を形成してなる。このバイオセンサの血糖値の測定は、バイオセンサに血液を添加して、試薬層中のグルコースを基質とする酵素を血液中のグルコースと反応させて、電子を生成させ、この電子による電子受容体の還元及び酸化から生じる電流値に基づいて血液中のグルコース濃度（血糖値）を求めることによって行われる。

このバイオセンサで使用されるグルコースを基質とする酵素の例としては、グルコースオキシダーゼ（ＥＣ １．１．３．４）が挙げられる。グルコースオキシダーゼは、グルコースに対する特異性が高く、熱安定性に優れているという利点を有していることから、血糖自己測定用のバイオセンサにおいて古くから利用されている。グルコースオキシダーゼを利用した血糖自己測定用のバイオセンサにおいては、グルコースを酸化してＤ−グルコノ−δ−ラクトンに変換する過程で生じる電子がメディエーターを介して電極に渡されることで血液中のグルコース濃度の測定がなされるが、グルコースオキシダーゼは反応で生じたプロトンを酸素に渡しやすいため、溶存酸素が測定値に影響してしまうという問題があった。

このような問題を回避するために、例えばＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４７）あるいはピロロキノリンキノン依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．５．２（旧ＥＣ１．１．９９．１７））といったグルコースデヒドロゲナーゼの使用が提案されている。これらの酵素は溶存酸素の影響を受けない点で優位であるが、前者のＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼは、安定性が乏しいという欠点や補酵素の添加が必要で測定が煩雑になるという欠点がある。一方、後者のピロロキノリンキノン依存型グルコースデヒドロゲナーゼは、基質特異性に乏しく、マルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用するため、測定値の正確性を損ねてしまうという欠点がある。

これらの欠点を有さないグルコースデヒドロゲナーゼとして、特許文献１には、アスペルギルス属由来のフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ−ＧＤＨ）の使用が提案されている。この酵素は、基質特異性に優れかつ溶存酸素の影響を受けない点で上述のグルコースデヒドロゲナーゼより優位である。また、この酵素は、５０℃、１５分処理で８９％程度の活性残存率を示し、熱安定性についても優れている。特許文献２には、アスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤ−ＧＤＨをコードするＤＮＡ配列が開示されており、特許文献３には、アスペルギルス属由来のＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列に改変を加えて熱安定性を向上させたＦＡＤ−ＧＤＨが開示されている。この特許文献３のＦＡＤ−ＧＤＨは、アスペルギルス属にセルフクローニングして糖鎖結合型にすることによって、熱安定性をさらに高めることができることが本発明者らによって判明している。しかし、これらの酵素は、キシロースに対する作用性が比較的高いため、キシロース負荷試験を受けている者の血糖を測定する場合には改善の余地がある。

近年、ムコール属に由来するＦＡＤ−ＧＤＨにおいて、キシロースに対する作用性が比較的低いものが相次いで開発されている（特許文献４、特許文献５、特許文献６参照）。特許文献７によると、特許文献４に記載のムコール・プライニ由来のＦＡＤ−ＧＤＨを酵母チゴサッカロマイセス・ロキシーで発現させた場合、約１５０ｋＤａから２５０ｋＤａに及ぶ幅広の分子量を示すＦＡＤ−ＧＤＨが生産されることが示されている。ムコール・プライニ由来のＦＡＤ−ＧＤＨのポリペプチド部分の分子量は８０ｋＤａ程度であることから、糖タンパク質中の糖鎖部分の比率は、４６％〜６８％であると推測される。また、チゴサッカロマイセス・ロキシーを宿主として、ムコール・プライニ由来のＦＡＤ−ＧＤＨを組換え発現させた場合の生産量は、培養液１ｍｌあたり、２７．６Ｕ程度とされている。

同じく、特許文献７によると、特許文献４に記載のムコール・プライニ由来のＦＡＤ−ＧＤＨを糸状菌アスペルギルス・オリゼで発現させた場合、約８０ｋＤａから１００ｋＤａに及ぶ幅広の分子量を示すＦＡＤ−ＧＤＨが生産されることが示されている。ムコール・プライニ由来のＦＡＤ−ＧＤＨのポリペプチド部分の分子量は８０ｋＤａ程度であることから、糖タンパク質中の糖鎖部分の比率は、０％〜２０％であると推測される。また、アスペルギルス・オリゼを宿主として、ムコール・プライニ由来のＦＡＤ−ＧＤＨを組換え発現させた場合の生産量は、培養液１ｍｌあたり、１４．０Ｕ程度とされている。

原核生物を宿主として用いたムコール属由来のＦＡＤ−ＧＤＨの発現としては、特許文献８にムコール・プライニ由来のＦＡＤ−ＧＤＨを大腸菌で発現させる試みが報告されており、分泌シグナル配列を除去することによって、生産量が向上することが示されているが、その生産量は培養液１ｍｌあたり、わずか０．０６８Ｕ程度とされている。

上記のように、ムコール属由来のＦＡＤ−ＧＤＨを高生産するためには、宿主として大腸菌ではなく酵母や糸状菌などの真核生物を用いることが有利であるが、宿主によっては不均一な量の糖鎖が結合したＦＡＤ−ＧＤＨしか得られない。このような糖鎖結合量が不均一なＦＡＤ−ＧＤＨを血糖自己測定用のバイオセンサに使用すると、ロットごとにＦＡＤ−ＧＤＨの性能が変動する可能性があり、結果として測定値にバラツキが生じるおそれがある。

国際公開２００４／０５８９５８号公報 特開２００８−２３７２１０号公報 特開２００８−１７８３８０号公報 特許４６４８９９３号 国際公開２０１１／００４６５４号公報 国際出願２００３／０６５６２３号公報 国際公開２０１２／０７３９８６ 国際公開２０１２／０７３９８７

本発明は、かかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は、血糖自己測定用のバイオセンサに好適な、糖鎖結合量が均一であるＦＡＤ−ＧＤＨの効率的な生産方法を提供することにある。

本発明者らは、かかる目的を達成するために鋭意検討した結果、担子菌酵母の一種であるクリプトコッカス属に分類される微生物を宿主として使用し、この微生物に、特許文献４に記載されているムコール・プライニ由来のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子、または、特許文献６に記載されているムコール・ヒマリス由来のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を導入してこの微生物中でこの遺伝子を発現させると、活性型で糖鎖含量が均一なＦＡＤ−ＧＤＨが高生産されることを見出した。

また、本発明者らは、この微生物を宿主としてムコール属由来のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を発現させる場合、遺伝子のコドンユーセージをこの微生物に合わせて最適化することが、封入体を形成せずに酵素活性を維持したままのＦＡＤ−ＧＤＨを培養液中に高レベルで分泌生産させるために必要であることを見出した。また、遺伝子配列本体に付加される分泌シグナルペプチド配列を最適化することにより、生産性がさらに飛躍的に向上されることを見出した。

本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものであり、以下の（１）〜（５）から構成されるものである。
（１）ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属に由来するフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法であって、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の微生物中で、以下の（Ａ）または（Ｂ）の塩基配列で表わされるフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を発現させる工程を含むことを特徴とする方法：
（Ａ）配列番号１または７で示される塩基配列；
（Ｂ）配列番号１または７で示される塩基配列に対して８０％以上相同な塩基配列であって、フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼ酵素活性を持つタンパク質をコードする塩基配列。
（２）クリプトコッカス属の微生物が、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｓ−２）（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９６１）またはその変異体であることを特徴とする（１）に記載の方法。
（３）フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子が、（１）に記載の（Ａ）または（Ｂ）の塩基配列の５′側に以下の（Ｃ）〜（Ｇ）からなる群より選択されるいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列を結合させて得られるものであることを特徴とする（１）または（２）に記載の方法：
（Ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列；
（Ｄ）配列番号３で示されるアミノ酸配列；
（Ｅ）配列番号４で示されるアミノ酸配列；
（Ｆ）配列番号５で示されるアミノ酸配列；
（Ｇ）配列番号６で示されるアミノ酸配列。
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載の方法によって生産されるフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼ酵素タンパク質であって、糖鎖を含んだ状態で９５〜１００ｋＤａの分子量を有することを特徴とするタンパク質。
（５）グルコースを基質とする酵素として、（４）に記載のフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼ酵素タンパク質を使用することを特徴とする血糖自己測定用バイオセンサ。

本発明の方法は、ムコール属の微生物由来の糖鎖結合型ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子のコドンユーセージを、この微生物とは全く異なる特定の宿主微生物中での発現のために最適化された状態で発現させるので、糖鎖結合量が均一であるＦＡＤ−ＧＤＨを宿主細胞外へ効率的に分泌生産することができる。かかるＦＡＤ−ＧＤＨは、血糖自己測定用のバイオセンサに使用するのに好適である。

図１は、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２用の発現ベクターｐＣｓＵＸ２の模式図である。 図２は、ムコール・ヒマリス由来の各ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子発現コントラクトを導入したクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２形質転換体のＦＡＤ−ＧＤＨ生産性を示す。 図３は、ムコール・ヒマリス由来のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を導入したクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２形質転換体の培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥし、分子量を算出した結果を示す。 図４は、ムコール・プライニ由来の各ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子発現コントラクトを導入したクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２形質転換体のＦＡＤ−ＧＤＨ生産性を示す。 図５は、ムコール・プライニ由来のＦＡＤ−ＧＤＨを導入したクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２形質転換体を流加培養したときのＦＡＤ−ＧＤＨ生産性を示す。 図６は、ムコール・プライニ由来ＦＡＤ−ＧＤＨを導入したクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２形質転換体を流加培養したときの培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥした結果を示す。

本発明は、ムコール属の微生物由来の糖鎖結合型ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子のコドンユーセージを最適化し、この微生物とは全く異なる特定の微生物中で発現させることにより、本来の宿主微生物中で発現させたＦＡＤ−ＧＤＨと比べて糖鎖結合量が均一であるＦＡＤ−ＧＤＨを効率的に得ることを特徴とするものである。

具体的には、本発明の方法では、遺伝子発現の宿主微生物として、担子菌酵母の一種であるクリプトコッカス属の微生物を使用する。好ましくは、クリプトコッカス属の微生物の中でも、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株という特定の菌株を使用する。この菌株は、独立行政法人酒類総合研究所において単離された酵母であり、αアミラーゼ、酸性キシラナーゼ、クチナーゼなどの酵素を大量に生産することが確認されている。なお、この菌株は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）（現在は日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２０号室（郵便番号２９２−０８１８）に移転）の独立行政法人産業技術総合研究所（現在の名称は、製品評価技術基盤機構） 特許生物寄託センターに１９９５年９月５日にＦＥＲＭ Ｐ−１５１５５として国内寄託し、２００８年４月２５日にＦＥＲＭ ＢＰ−１０９６１として国際寄託に移管済である。

さらにクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２のウラシル要求性変異体であるＵ−５株がＵＶ変異によって取得され、さらにＵ−５株からアデニン要求性変異株であるＵＡ１株が遺伝子変異導入により取得され、さらにＵＡ１株から細胞外多糖の生産性を低減させたＵＶ変異株であるＤ１１株が取得されている。Ｄ１１株は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）（現在は日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２０号室（郵便番号２９２−０８１８）に移転）の独立行政法人産業技術総合研究所（現在の名称は、製品評価技術基盤機構） 特許生物寄託センターに２０１２年３月２３日に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１４８２として国際寄託されている。

本発明の方法において、クリプトコッカス属の微生物を遺伝子発現の宿主微生物として使用することにより糖鎖結合量が均一であるＦＡＤ−ＧＤＨが得られる理由は未だ明確ではないが、クリプトコッカス属の微生物に特有の糖鎖合成及び結合システムが存在するためであると考えられる。

本発明の方法では、宿主微生物中で発現させる糖鎖結合型ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子は、（Ａ）配列番号１または７の塩基配列で表わされるものである。これらの塩基配列は、特許文献６に記載のムコール・ヒマリス及び特許文献４に記載のムコール・プライニ由来のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子の塩基配列そのものではなく、宿主のクリプトコッカス属の微生物中での発現に適するようにそのコドンユーセージが最適化されている。野生型遺伝子の塩基配列をクリプトコッカス属の微生物中にそのまま導入して発現させても、発現産物は封入体を形成してしまい、不活性なＦＡＤ−ＧＤＨしか得られない。本発明の方法によれば、発現させる遺伝子のコドンユーセージを宿主微生物のコドンユーセージに合わせて最適化することにより、封入体を形成させずに酵素活性を維持したままＦＡＤ−ＧＤＨを分泌生産させることができる。

配列番号１または７のコドンユーセージは、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２の発現に最適化されたものであり、その塩基配列のコドンの３文字目の塩基がＧもしくはＣである比率は８８．２％である。一方、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２で発現が確認されている、αアミラーゼ、クチナーゼ、キシラナーゼの塩基配列のコドンの３文字目の塩基がＧもしくはＣである比率はそれぞれ、８１．５％、８１．３％、８０．０％であり、コドンの３文字目の塩基がＧもしくはＣである比率は非常に高い傾向がある。これらのことから、配列番号１または７はクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２中での発現に適するだけでなく、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２と類似のコドンユーセージを有する他のクリプトコッカス属の微生物（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ， Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｕｓ， Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｕｓ， Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓなど）中での発現にも適すると予測される。なお、宿主微生物のコドンユーセージは、Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）から提供される情報を用いることで予測することが可能である。

また、本発明の方法では、（Ａ）配列番号１または７で示される塩基配列の代わりに、（Ｂ）配列番号１または７で示される塩基配列に対して８０％以上、好ましくは８３％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上相同な塩基配列であって、ＦＡＤ−ＧＤＨ酵素活性を持つタンパク質をコードする塩基配列も使用できる。この（Ｂ）の塩基配列は、（Ａ）の塩基配列の均等の範囲の塩基配列である。これは、酵素タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列の一部に変異が生じたり、またその結果として酵素タンパク質のアミノ酸配列の一部に変異が生じても、機能的には同等の酵素タンパク質であることが多いからである。（Ｂ）の塩基配列は、例えばＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製、ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；東洋紡製などの市販のキットやＰＣＲ法を利用して配列番号１に記載の塩基配列を改変することによって得ることができる。得られた遺伝子によってコードされるタンパク質の活性は、後述の実施例に記載の方法によって確認することができる。

配列番号７に示される塩基配列と、配列番号１に示される塩基配列の相同性は８３％であり、後述の実施例で示すように、どちらの塩基配列もクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２で効率的に発現させることが可能である。また、配列番号１がコードするポリペプチド配列と、配列番号８がコードするポリペプチド配列（分泌シグナル配列が除去された成熟型のＦＡＤ−ＧＤＨタンパク質の配列）の相同性は７８％である。これらのことから、配列番号１または７の均等範囲は、８０％以上の相同性とするのが適切であり、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性とするのが適切である。

本発明の方法では、（Ａ）または（Ｂ）の塩基配列で表されるＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子は、単独で宿主微生物中で発現させてもよいが、タンパク質の発現効率及び発現成功率を高めるためには、タンパク質のＮ末満に分泌シグナルペプチドを結合させた状態で発現させることが好ましい。一般的に、分泌タンパク質のＮ末端には、分泌シグナルペプチドが存在しており、この既存の分泌シグナルペプチドを高効率な分泌シグナルペプチドと置換することで、これら分泌タンパク質の発現効率及び発現成功率を上げることができることが報告されているからである。

本発明の方法で使用できる分泌シグナルペプチドとして、配列番号２〜６のいずれかで示されるアミノ酸配列（Ｃ）〜（Ｇ）を挙げることができる。これらのアミノ酸配列のうち、配列番号２で示される（Ｃ）のアミノ酸配列は、ムコール・ヒマリスが生産するＦＡＤ−ＧＤＨに由来する分泌シグナルペプチド配列である。配列番号３〜４で示される（Ｄ）〜（Ｅ）のアミノ酸配列は、いずれもクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２が生産する酸性キシラナーゼに由来する分泌シグナルペプチド配列であり、配列番号３で示される（Ｄ）のアミノ酸配列は分泌シグナルペプチド配列を開始コドンから２３番目のアミノ酸までとした配列（Ｘｓ２）であり、配列番号４で示される（Ｅ）のアミノ酸配列は分泌シグナルペプチド配列を開始コドンから１７アミノ酸までとした配列（Ｘｓ３）である。配列番号５で示される（Ｆ）のアミノ酸配列は、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２が生産するα―アミラーゼに由来する分泌シグナルペプチド配列（Ａｓ）である。配列番号６で示される（Ｇ）のアミノ酸配列は、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２が生産するクチナーゼに由来する分泌シグナルペプチド配列（Ｃｓ）である。

以下の実施例で示すように、これらの分泌シグナルペプチド配列はいずれも、極めて高効率であり、これらを用いることにより、クリプトコッカス属の微生物の細胞外へのＦＡＤ−ＧＤＨの生産効率を飛躍的に増大させることができる。

これらの分泌シグナルペプチドをタンパク質のＮ末端に結合された状態で発現させるためには、上述の（Ａ）または（Ｂ）の塩基配列の５′側にこれらの分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列（（Ｃ）〜（Ｇ）のアミノ酸配列）のいずれかをコードする塩基配列を結合させて得られる融合ＤＮＡを宿主微生物中で発現させればよい。

本発明の方法において宿主として使用することができる微生物であるクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２は、各種難分解性酵素を分泌生産することが確認されており、生でんぷん分解性のα―アミラーゼや酸性キシラナーゼ、生分解性プラスチックを分解するクチナーゼなどの酵素を分泌生産する。しかしながら、これらの分泌タンパク質の有する分泌シグナルペプチドは、従来から分泌タンパク質に見出されており、最も高効率な分泌シグナルペプチドかどうかは不明であった。また、分泌シグナルペプチドの配列を予測するコンピュータプログラムが提供されており、これらのコンピュータプログラムを用いることで、アミノ酸配列情報から分泌タンパク質に含まれる分泌シグナルペプチドの配列の存在を予測することが可能であるが、これらのコンピュータプログラムにより各分泌シグナルペプチドの能力を推測することは現在のところ困難である。すなわち、予測された分泌シグナルペプチドが、実際に、分泌タンパク質等のタンパク質の発現に利用可能であるか否か、さらにこれらタンパク質の大量生産に利用できる、より高効率なものであるか否かは予測することができない。さらに、予測される分泌シグナルペプチドの種類によっては、切断部位が数箇所に及ぶ場合もあり、分泌シグナル配列の最適な長さに関しても、予測することは困難である。本発明の方法で使用する上述の分泌シグナルペプチドは、単にコンピュータプログラムによって予測されたものではなく、本発明者らの繰り返しの実験によってその有効性を認められたものである。

次に、本発明の方法の具体的な工程について説明する。本発明の方法は、クリプトコッカス属の微生物中で、（Ａ）または（Ｂ）の塩基配列で表わされるＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を発現させる工程を含む。この工程は、具体的には、常法に従ってＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を適当な発現ベクターに挿入して組換えベクターを作成し、次にこの組換え発現ベクターをクリプトコッカス属の微生物に導入して形質転換体を作成し、この形質転換体を適当な条件下で培養することによって行うことができる。

本発明の方法で使用する発現ベクターとしては、特に限定するものではないが、従来公知のベクター、例えば大腸菌のベクターが挙げられる。大腸菌のベクターとしては、具体的にはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ、ｐＴＡ２、ｐＥＴなどが挙げられる。好ましくは、ベクターＤＮＡは、栄養要求性マーカー、薬剤耐性マーカー、発現プロモーターＤＮＡ配列、発現ターミネーターＤＮＡ配列を含み、より好ましくは、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２由来のｏｒｏｔａｔｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子、キシラナーゼプロモーター、キシラナーゼターミネーターを含む。

発現ベクターと宿主微生物の組み合わせとしては、特に限定するものではないが、例えば遺伝子を組み込む宿主由来の栄養要求性マーカー遺伝子または薬剤耐性マーカー遺伝子と、遺伝子を組み込む宿主由来の発現プロモーターＤＮＡ配列と、遺伝子を組み込む宿主由来のターミネーターＤＮＡ配列とを含む発現ベクターと、栄養要求性変異宿主または薬剤感受性宿主との組み合わせが挙げられる。最も好ましくは、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２由来のｏｒｏｔａｔｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子と、キシラナーゼプロモーターＤＮＡ配列と、キシラナーゼターミネーターＤＮＡ配列とを含む発現ベクターと、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２との組み合わせが挙げられる。

宿主微生物の細胞に組換え発現ベクターを導入する方法としては、特に限定するものではないが、エレクトロポレーションなどの方法が挙げられる。

形質転換体の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して適宜選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。なお、培養に先立って、高ＦＡＤ−ＧＤＨ生産細胞株を予め選抜しておくことが有利である。

培養に用いる窒素源は、特定のアミノ酸成分に欠失があるなど特殊なＮ源を除いて、宿主微生物が利用可能な窒素化合物であればどんなものでも良い。これらは主として有機窒素源であり、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ分解物などが使用される。特に、酵母エキスや大豆蛋白質が好ましいが、これに限定されるものではなく、カゼインポリペプトン、発酵麹エキス、麦芽抽出物などを用いることによっても、形質転換体を培養することができる。

その他の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、キシロース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。

培養温度は、菌が発育してＦＡＤ−ＧＤＨ酵素タンパク質を生産する範囲で適宜変更しうるが、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２の場合、通常は２０〜２５℃程度である。培養時間は、条件によって多少異なるが、ＦＡＤ−ＧＤＨ酵素タンパク質が最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく、通常は６０〜１２０時間程度である。培地ｐＨは、菌が発育しＦＡＤ−ＧＤＨ酵素タンパク質を生産する範囲で適宜変更しうるが、通常はｐＨ３．０〜９．０程度である。

本発明のＦＡＤ−ＧＤＨ酵素タンパク質は、上記形質転換体を培養して得られる菌体を含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、一般には、常法に従って、予め、濾過、遠心分離などにより、ＦＡＤ−ＧＤＨ酵素タンパク質含有溶液と菌体とを分離した後に利用することもできる。

あるいは、このようにして得られたＦＡＤ−ＧＤＨ酵素タンパク質含有溶液からＦＡＤ−ＧＤＨ酵素タンパク質を精製して利用してもよい。精製方法としては、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿、加温処理や等電点処理、吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー等の処理を挙げることができる。

本発明の方法により得られるＦＡＤ−ＧＤＨ酵素タンパク質は、以下の（ｉ）〜（ｉｉ）の性質を有する。
（ｉ）作用：電子受容体存在下でグルコースデヒドロゲナーゼ酵素活性を示す。
（ｉｉ）分子量：糖鎖を含んだ状態で９５〜１００ｋＤａである。

このうち、特に注目すべきは、その分子量である。従来の特許文献６のムコール・ヒマリス属の微生物中で発現されたＦＡＤ−ＧＤＨの分子量は、糖鎖を含んだ状態で約８５〜１０７ｋＤａであるので、本発明の方法により得られるＦＡＤ−ＧＤＨ酵素タンパク質は、従来のものと比べて糖鎖結合量が著しく均一である。従って、本発明の方法により得られるＦＡＤ−ＧＤＨ酵素タンパク質は、このような酵素化学的特徴を活かして、血糖自己測定用バイオセンサに好適に使用することができる。

上記の各種の酵素化学的性質は、酵素の諸性質を特定するための公知の手法、例えば、以下の実施例に記載の方法を用いて調べることができる。酵素の諸性質は、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを生産する形質転換体の培養液や、精製工程の途中段階において、ある程度調べることもでき、より詳細には、精製酵素を用いて調べることができる。

精製酵素とは、当該酵素以外の成分、特に当該酵素以外のタンパク質（夾雑タンパク質）を実質的に含まない状態に分離された酵素を指す。具体的には、例えば、夾雑タンパク質の含有量が重量換算で全体の約２０％未満、好ましくは約１０％未満、更に好ましくは約５％未満、より一層好ましくは約１％未満の酵素を指す。

本発明において、ＦＡＤ−ＧＤＨの活性測定は以下の条件で行う。

ＦＡＤ−ＧＤＨの活性測定法
＜反応試薬＞
下記のＰＩＰＥＳ緩衝液１５．６ｍｌ、ＤＣＰＩＰ溶液０．２ｍｌ、Ｄ―グルコース溶液４ｍｌを混合して反応試薬とする。
・ ５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ６．５（０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）
・ ６．８ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
・ １Ｍ Ｄ−グルコース溶液

＜測定条件＞
反応試薬３ｍｌを３７℃で５分間予備加温する。ＦＡＤ−ＧＤＨ溶液０．１ｍｌを添加し、ゆるやかに混和後、水を対照にして３７℃に制御された分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を５分間記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤ ＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＦＡＤ−ＧＤＨ溶液の代わりにＦＡＤ−ＧＤＨを溶解する溶媒を反応試薬に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤ ＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から以下の式（Ｉ）に従ってＧＤＨ活性を求める。ここでＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量として定義される。
ＦＡＤ−ＧＤＨの活性（Ｕ／ｍｌ）＝｛−（ΔＯＤ ＴＥＳＴ−ΔＯＤ ＢＬＡＮＫ）×３．１×希釈倍率｝／｛１６．３×０．１×１．０｝・・・（Ｉ）

なお、式（Ｉ）中の３．１は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍｌ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ^２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍｌ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。

実施例１：
１．ムコール・ヒマリス由来のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子の発現カセットの作製
特許文献６に記載のムコール・ヒマリス由来のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子のコドンユーセージの最適化は、クリプトコッカスｓｐ−Ｓ−２．の既知の遺伝子であるαアミラーゼ遺伝子、クチナーゼ遺伝子、キシラナーゼ遺伝子のコドンユーセージを参考に行った。最適化された遺伝子配列を配列番号１に示す。

配列番号１に示される１番目から６０番目の塩基配列は、ムコール・ヒマリス由来のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子の分泌シグナル配列をコードする塩基配列であると予測される。クリプトコッカスｓｐ−Ｓ−２．において組換え生産されたムコール・ヒマリス由来のＦＡＤ−ＧＤＨタンパク質は、本分泌シグナル配列が除去された成熟型の配列を有すると予測される。成熟型として分泌されるムコール・ヒマリス由来のＦＡＤ−ＧＤＨタンパク質をコードする塩基配列を配列番号８に示す。

次に、配列番号９のＭｈＦＡＤＧＤＨ（ｏｐｔ）ＭｕｌＩ＿Ｆ及び配列番号１０のＭｈＦＡＤＧＤＨ（ｏｐｔ）ＭｕｌＩ＿Ｒをプライマーとして用いて、配列番号１のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子全長配列をＰＣＲにより増幅し、増幅された配列（ＭｈＦＡＤＧＤＨ（ｏｐｔ））をＭｌｕＩ処理した。

一方、Ｘｙｌプロモーター、Ｘｙｌターミネーター、及びＵＲＡ５遺伝子を含むｐＣｓＵＸプラスミド（５．９ｋｂｐ）をＭｌｕＩ処理し、Ｘｙｌプロモーターの直ぐ下流を一箇所切断したのち、脱リン酸化処理した。処理後のプラスミドにＭｈＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ）のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子断片を連結し、組換えプラスミド（ｐＣｓＵＸＭｈＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ））を構築した。

ｐＣｓＵＸプラスミドの模式図を図１に示す。なお、このｐＣｓＵＸプラスミドはクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２に由来する酸性キシラナーゼプロモーター（Ｘｙｌ−ｐ）、酸性キシラナーゼターミネーター（Ｘｙｌ−ｔ）、及びｏｒｏｔａｔｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子（Ｕｒａ５）を市販のｐＵＣ１９ベクターに常法により連結して組換え体ＤＮＡを作製し、この組換え体ＤＮＡを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを常法に従い形質転換することで取得することができる。形質転換体はアンピシリン耐性により選択できる。

次に、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（東洋紡績社製）を用いて、ＩｎｖｅｒｓｅＰＣＲを行い、分泌シグナルペプチド配列を配列番号２以外のものに置換した。具体的には、
組換えプラスミドｐＣｓＵＸ―ＭｈＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ）において、配列番号１１のＭｈＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ―ｓｐ）Ｆ及び配列番号１２のＸｙｌａｎａｓｅ（ｓｐ２）−Ｘｙｌ−ｐｒｏ−ｃｏｍｐをプライマーとして用いて、分泌シグナルペプチド配列を、配列番号３に示す「Ｘｙｌａｎａｓｅ分泌シグナルペプチド配列２」に置換したもの（ｐＣｓＵＸＸｓ２ＭｈＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ））；
組換えプラスミドｐＣｓＵＸ―ＭｈＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ）において、配列番号１１のＭｈＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ―ｓｐ）Ｆ及び配列番号１３のＸｙｌａｎａｓｅ（ｓｐ３）−Ｘｙｌ−ｐｒｏ−ｃｏｍｐをプライマーとして用いて、分泌シグナルペプチド配列を、配列番号４に示す「Ｘｙｌａｎａｓｅ分泌シグナルペプチド配列３」に置換したもの（ｐＣｓＵＸＸｓ３ＭｈＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ））；
組換えプラスミドｐＣｓＵＸ―ＭｈＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ）において、配列番号１１のＭｈＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ―ｓｐ）Ｆ及び配列番号１４のＡｍｙｌａｓｅ（ｓｐ）−Ｘｙｌ−ｐｒｏ−ｃｏｍｐをプライマーとして用いて、分泌シグナルペプチド配列を、配列番号５に示す「Ａｍｙｌａｓｅ分泌シグナルペプチド配列」に置換したもの（ｐＣｓＵＸＡｓＭｈＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ））；
組換えプラスミドｐＣｓＵＸ―ＭｈＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ）において、配列番号１１のＭｈＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ―ｓｐ）Ｆ及び配列番号１５のＣｕｔｉｎａｓｅ（ｓｐ）−Ｘｙｌ−ｐｒｏ−ｃｏｍｐをプライマーとして用いて、分泌シグナルペプチド配列を、配列番号６に示す「Ｃｕｔｉｎａｓｅ分泌シグナルペプチド配列」に置換したもの（ｐＣｓＵＸＣｓＭｈＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ））；をそれぞれ作製した。

２．ムコール・ヒマリス由来のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子のクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２への導入
組換え宿主にはクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２． ＤＡ２５株を使用した。本菌株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１１４８２として国際寄託された、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株の変異体に、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株に由来するａｄｅ１遺伝子を導入した菌株である（特願２０１２−１１３４４９参照）。本菌は、形質転換体の選択のために、ウラシル要求性となっており、ｐＣｓＵＸ２プラスミドを形質転換することにより、ウラシル要求性によって形質転換体を選抜することが可能である。

形質転換は、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ． １９９２ Ｍａｒ；６０（３）：１１０１−８．（Ｖａｒｍａら）に記載の方法で実施した。クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２． ＤＡ−２５株を２０ｍｌＹＭ培地（酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ポリペプトン０．５％、グルコース１．０％）で２５℃、４８時間培養した。得られた培養液の吸光度（ＯＤ６６０ｎｍ）を測定した。次に、この培養液を２００ｍｌ液体培地（酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ポリペプトン０．５％、グルコース１．０％）に培養液の吸光度（ＯＤ６６０ｎｍ）が０．１Ａｂｓになる様に植菌して２５℃で培養し、培養液の吸光度（ＯＤ６６０ｎｍ）が約１．０Ａｂｓになるまで培養を行った。次に、この培養液を遠心分離して菌体を回収し、Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｕｅｒ（２７０ｍＭシュークロース、１ｍＭ塩化マグネシウム、４ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６）で菌体を２回洗浄し、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２７０ｍＭシュークロース、１ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６）に吸光度ＯＤ６６０＝５０Ａｂｓとなるように懸濁した。得られた懸濁液１００μｌに、予めＳｂｆＩによって制限酵素処理し、直鎖化したプラスミド１０μｇ（〜５μｌ）を添加し、エレクトロポレーション用のキュベットに移した後、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ （ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いて通電した。通電条件は、Ｃ＝２５μＦ； Ｖ＝０．４７ｋＶで行った。通電後の液中に６００μｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２７０ｍＭシュークロース、１ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６）を加え、選択プレート上に塗り広げた。選択プレートはＹＮＢ−ｕｒａ寒天培地（０．６７％Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ Ｗ／Ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ、０．０７８％ −ｕｒａ ＤＯ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２％グルコース、１％寒天粉末）を用いた。植菌したプレートを２５℃で１週間静置培養し、生育コロニーを選抜した。

形質転換で得られた形質転換体については、配列番号９のＭｈＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ―ｓｐ）Ｆ及び配列番号１０のＭｈＦＡＤＧＤＨ（ｏｐｔ）ＭｕｌＩ＿Ｒをプライマーとして用いてＫＯＤ−Ｆｘ（東洋紡績社製）によるコロニーＰＣＲを行うことにより遺伝子の導入を確認し、遺伝子が導入された菌株に関して、次の３．で培養を行った。

３．ムコール・ヒマリス由来の組換えＦＡＤ−ＧＤＨの活性の確認
２．で取得した形質転換体を、１ｍｌ液体培地（２％酵母エキス、５％キシロース）で２５℃、６００ｒｐｍ、４８時間培養し、培養液上清のＦＡＤ−ＧＤＨ活性を確認した。

数個の菌株に関して培養液上清中のＦＡＤ−ＧＤＨ活性を測定した。その結果を図２に示す。図２には、得られた数個の形質転換体のうち、最も生産性の高かった菌株のＦＡＤ−ＧＤＨ活性測定値を示している。

図２に示すとおり、コドンユーセージを最適化した遺伝子を導入し、分泌シグナルペプチド配列としてムコール・ヒマリスのＦＡＤ−ＧＤＨの分泌シグナルペプチド配列（配列番号２）を使用した菌株（図２のＵＸＭｈＧＤＨ（ｏｐｔ））では、約１２Ｕ／ｍＬのＦＡＤ−ＧＤＨ活性が検出された。本結果から、ムコール・ヒマリスのＦＡＤ−ＧＤＨの分泌シグナルペプチド配列は、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２においても有効に機能することが確認された。また、対照として、ムコール・ヒマリス野生株から取得した野生型遺伝子を導入した菌株（図２のＵＸＭｈＧＤＨ（ｎｔｖ））では、ＦＡＤ−ＧＤＨ活性は全く検出されなかった。

さらに、分泌シグナルペプチド配列をクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２のＸｙｌａｎａｓｅ分泌シグナルペプチド配列２（配列番号３）に変更したもの（図２のＵＸＸｓ２ＭｈＧＤＨ（ｏｐｔ））では、最大約６３Ｕ／ｍＬのＦＡＤ−ＧＤＨ活性が検出され、分泌シグナルペプチド配列をクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２のＸｙｌａｎａｓｅ分泌シグナルペプチド配列３（配列番号４）に変更したもの（図２のＵＸＸｓ３ＭｈＧＤＨ（ｏｐｔ））では、最大約１０６Ｕ／ｍＬのＦＡＤ−ＧＤＨ活性が検出され、分泌シグナルペプチド配列をクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２のＡｍｙｌａｓｅ分泌シグナルペプチド配列（配列番号５）に変更したもの（図２のＵＸＡｓＭｈＧＤＨ（ｏｐｔ））では、最大約３８Ｕ／ｍＬのＦＡＤ−ＧＤＨ活性が検出され、分泌シグナルペプチド配列をクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２のＣｕｔｉｎａｓｅ分泌シグナルペプチド配列（配列番号６）に変更したもの（図２のＵＸＣｓＭｈＧＤＨ（ｏｐｔ））では、最大約４５Ｕ／ｍＬのＦＡＤ−ＧＤＨ活性が検出された。本結果から、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株由来酵素の分泌シグナルペプチドに分泌シグナルペプチドを置換することによって、分泌発現効率を大幅に向上させることが可能であることが確認された。なお、本実施例で示されるムコール・ヒマリス由来のＦＡＤ−ＧＤＨの組換え発現による生産量は、特許文献６に示される野生株の発現量（０．４７Ｕ／ｍｌ）と比べて、２５倍〜２２５倍高かった。

４．ムコール・ヒマリス由来の組換えＦＡＤ−ＧＤＨ酵素タンパク質の解析
３．でＦＡＤ−ＧＤＨ活性が最も高かったＵＸＸｓ３ＭｈＧＤＨ（ｏｐｔ）株の形質転換体を、２００ｍｌ容バッフル付三角フラスコを用いて、培地（２％酵母エキス、５％キシロース、）で２５℃、６８時間培養した。培養液を遠心分離して培養上清を採取し、これを粗酵素溶液として、Ｎｕ−ＰＡＧＥ ４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動することにより、組み換えＦＡＤ−ＧＤＨの分子量を求めた。その結果を図３に示す。泳動サンプルは以下の通りである。
レーン１：分子量マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ）
レーン２：クリプトコッカス中で発現された組換えムコール・ヒマリス由来のＦＡＤ−ＧＤＨ培養液上清

図３からわかるように、クリプトコッカス中で発現された組換えムコール・ヒマリス由来のＦＡＤ−ＧＤＨの分子量は、９５ｋＤａ〜１００ｋＤａである。特許文献６には、野生株由来のＦＡＤ−ＧＤＨの分子量が８５ｋＤａ〜１０７ｋＤａであることが記載されている。このことから、クリプトコッカス中で発現された組換えムコール・ヒマリス由来のＦＡＤ−ＧＤＨの分子量は、野生株由来のＦＡＤ−ＧＤＨと比較して著しく均一であるといえる。

実施例２：
１．ムコール・プライニ由来のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子の発現カセットの作製
特許文献４に記載のムコール・プライニ由来のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子のコドンユーセージの最適化は、クリプトコッカスｓｐ−Ｓ−２．の既知の遺伝子であるαアミラーゼ遺伝子、クチナーゼ遺伝子、キシラナーゼ遺伝子のコドンユーセージを参考に行った。最適化された遺伝子配列を配列番号７に示す。

配列番号７に示される１番目から６０番目の塩基配列は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列をコードしており、ムコール・プライニ由来のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子の分泌シグナル配列をコードする塩基配列であると予測される。クリプトコッカスｓｐ−Ｓ−２．において組換え生産されたムコール・プライニ由来のＦＡＤ−ＧＤＨタンパク質は、本分泌シグナル配列が除去された成熟型の配列を有すると予測される。成熟型として分泌されるムコール・プライニ由来のＦＡＤ−ＧＤＨタンパク質をコードする塩基配列を配列番号１７に示す。

次に、配列番号１８のＭｐＦＡＤＧＤＨ（ｏｐｔ）ＳｐｅＩ＿Ｆ及び配列番号１９のＭｐＦＡＤＧＤＨ（ｏｐｔ）ＳｐｅＩ＿Ｒをプライマーとして用いて、配列番号７のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子全長配列をＰＣＲにより増幅し、増幅された配列（ＭｐＦＡＤＧＤＨ（ｏｐｔ））をＳｐｅＩ処理した。

一方、Ｘｙｌプロモーター、Ｘｙｌターミネーター、及びＵＲＡ５遺伝子を含むｐＣｓＵＸプラスミド（５．９ｋｂｐ）をＳｐｅＩ処理し、Ｘｙｌプロモーターの直ぐ下流を一箇所切断したのち、脱リン酸化処理した。処理後のプラスミドにＭｐＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ）のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子断片を連結し、組換えプラスミド（ｐＣｓＵＸＭｐＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ））を構築した。

次に、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（東洋紡績社製）を用いて、ＩｎｖｅｒｓｅＰＣＲを行い、分泌シグナルペプチド配列を配列番号１６以外のものに置換した。具体的には、
組換えプラスミドｐＣｓＵＸ―ＭｐＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ）において、配列番号１７のＭｐＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ―ｓｐ）Ｆ及び配列番号１２のＸｙｌａｎａｓｅ（ｓｐ２）−Ｘｙｌ−ｐｒｏ−ｃｏｍｐをプライマーとして用いて、分泌シグナルペプチド配列を、配列番号３に示す「Ｘｙｌａｎａｓｅ分泌シグナルペプチド配列２」に置換したもの（ｐＣｓＵＸＸｓ２ＭｐＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ））；
組換えプラスミドｐＣｓＵＸ―ＭｐＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ）において、配列番号１７のＭｐＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ―ｓｐ）Ｆ及び配列番号１３のＸｙｌａｎａｓｅ（ｓｐ３）−Ｘｙｌ−ｐｒｏ−ｃｏｍｐをプライマーとして用いて、分泌シグナルペプチド配列を、配列番号４に示す「Ｘｙｌａｎａｓｅ分泌シグナルペプチド配列３」に置換したもの（ｐＣｓＵＸＸｓ３ＭｐＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ））；
をそれぞれ作製した。

２．ムコール・プライニ由来のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子のクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２への導入
クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２への形質転換は、前述の実施例１の２．と同様に行った。

形質転換で得られた形質転換体については、配列番号１８のＭｐＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ―ｓｐ）Ｆ及び配列番号１９のＭｐＦＡＤＧＤＨ（ｏｐｔ）ＭｕｌＩ＿Ｒをプライマーとして用いてＫＯＤ−Ｆｘ（東洋紡績社製）によるコロニーＰＣＲを行うことにより遺伝子の導入を確認し、遺伝子が導入された菌株に関して、次の３．で培養を行った。

３．ムコール・プライニ由来の組換えＦＡＤ−ＧＤＨの活性の確認
２．で取得した形質転換体を、１ｍｌ液体培地（２％酵母エキス、５％キシロース）で２５℃、６００ｒｐｍ、４８時間培養し、培養液上清のＦＡＤ−ＧＤＨ活性を確認した。

数個の菌株に関して培養液上清中のＦＡＤ−ＧＤＨ活性を測定した。その結果を図４に示す。図４には、得られた数個の形質転換体のうち、最も生産性の高かった菌株のＦＡＤ−ＧＤＨ活性測定値を示している。

図４に示すとおり、コドンユーセージを最適化した遺伝子を導入し、分泌シグナルペプチド配列としてムコール・プライニのＦＡＤ−ＧＤＨの分泌シグナルペプチド配列（配列番号１６）を使用した菌株（図４のＵＸＭｐＧＤＨ（ｏｐｔ））では、約０．３Ｕ／ｍＬのＦＡＤ−ＧＤＨ活性が検出された。本結果から、ムコール・プライニのＦＡＤ−ＧＤＨの分泌シグナルペプチド配列は、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２においても有効に機能することが確認された。

さらに、分泌シグナルペプチド配列をクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２のＸｙｌａｎａｓｅ分泌シグナルペプチド配列２（配列番号３）に変更したもの（図４のＵＸＸｓ２ＭｐＧＤＨ（ｏｐｔ））では、最大約８．５Ｕ／ｍＬのＦＡＤ−ＧＤＨ活性が検出され、分泌シグナルペプチド配列をクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２のＸｙｌａｎａｓｅ分泌シグナルペプチド配列３（配列番号４）に変更したもの（図４のＵＸＸｓ３ＭｐＧＤＨ（ｏｐｔ））では、最大約３．８Ｕ／ｍＬのＦＡＤ−ＧＤＨ活性が検出された。

４．ムコール・プライニ由来ＦＡＤ−ＧＤＨ組換えクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株の流加培養
３．でＦＡＤ−ＧＤＨ活性が最も高かったＵＸＸｓ２ＭｐＧＤＨ（ｏｐｔ）株の形質転換体を、２００ｍｌ容バッフル付三角フラスコを用いて、６０ｍｌのＹＭ培地（酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ポリペプトン０．５％、グルコース１．０％）で２５℃、４８時間培養し、前培養液とした。前培養液を１０Ｌ用のファーメンターを用いて、６Ｌの培地（５％酵母エキス、０．０４％アデカノール）に植菌し、３００ｒｐｍ、通気量６Ｌ／分、２５℃で撹拌培養を開始した。さらに、培養液１Ｌに対して１時間当たり３ｍｌの５０％キシロース溶液を連続的に添加し、８８時間まで培養を行った。培養液は培養開始から、２４時間、４８時間、７２時間、８８時間でサンプリングを行い、培養液上清の活性を確認したところ、培養７２時間時点で培養液１ｍｌあたり１０４ＵのＦＡＤ−ＧＤＨ活性が検出された。その結果を図５に示す。

ここに示されるムコール・プライニ由来のＦＡＤ−ＧＤＨの組換え発現による生産量は、特許文献７に示される、チゴサッカロマイセスを宿主として発現させた場合（２７．６Ｕ／ｍｌ）や、アスペルギルス・オリゼを宿主として発現させた場合（１４Ｕ／ｍｌ）と比べて、３．７倍〜７．４倍高かった。

次に、培養７２時間時点で得られた培養液を遠心分離して培養上清を採取し、これを粗酵素溶液とし、この粗酵素溶液を Ｎｕ−ＰＡＧＥ ４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動することにより、組み換えＦＡＤ−ＧＤＨの分子量を求めた。その結果を図６に示す。泳動サンプルは以下の通りである。
レーン１：培養２４時間時点での培養液上清
レーン２：培養４８時間時点での培養液上清
レーン３：培養７２時間時点での培養液上清
レーン４：培養８８時間時点での培養液上清

図６からわかるように、クリプトコッカス中で発現された組換えムコール・プライニ由来のＦＡＤ−ＧＤＨの分子量は、９５ｋＤａ〜１００ｋＤａである。特許文献４には、野生株由来のＦＡＤ−ＧＤＨの分子量が９０ｋＤａ〜１３０ｋＤａであることが記載されており、また、特許文献７には、チゴサッカロマイセス中で発現された組換えＦＡＤ−ＧＤＨの分子量が１５０ｋＤａ〜２５０ｋＤａ、アスペルギルス・オリゼ中で発現された組換えＦＡＤ−ＧＤＨの分子量が８０ｋＤａ〜１００ｋＤａであることが記載されている。これらのことから、クリプトコッカス中で発現された組換えムコール・プライニ由来のＦＡＤ−ＧＤＨの分子量は、他の組換え発現宿主を用いた場合と比較して極めて均一であるといえる。

以上の結果から、コドンユーセージが最適化された遺伝子を用い、また、分泌シグナル配列を改変することによって、ムコール・ヒマリス由来のＦＡＤ−ＧＤＨ及び、ムコール・プライニ由来のＦＡＤ−ＧＤＨを、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２により活性型で且つ効率的に分泌発現することが可能であることが示され、さらに、クリプトコッカス中で発現されたムコール・ヒマリス由来のＦＡＤ−ＧＤＨ及びムコール・プライニ由来のＦＡＤ−ＧＤＨは、他の発現宿主中で発現させた場合と比較して糖鎖結合量が著しく均一であることが判明した。

なお、実施例２では分泌シグナルペプチドとしてクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株が生産するキシラナーゼ由来のもの（配列番号３または４）を使用しているが、分泌シグナルペプチドはＦＡＤ−ＧＤＨのタンパク質発現効率及び発現成功率に関与し、発現されたタンパク質への糖鎖結合には関与しないので、分泌シグナルペプチドを配列番号３または配列番号４以外のものに置換しても、クリプトコッカス属の微生物を宿主として使用する限り、実施例２と同様に糖鎖結合量が均一であるＦＡＤ−ＧＤＨが得られると考えられる。

本発明によれば、ムコール・ヒマリス由来及びムコール・プライニ由来のＦＡＤ−ＧＤＨと同等の特性を有し、しかも糖鎖結合量が均一であるＦＡＤ−ＧＤＨを効率的に組換え生産することができる。従って、本発明は、血糖自己測定バイオセンサ用の試薬として好適なＦＡＤ−ＧＤＨを生産するために極めて有用である。

Claims (5)

1. ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属に由来するフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法であって、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の微生物中で、以下の（Ａ）または（Ｂ）の塩基配列の５′側に分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列を結合させて得られる塩基配列で表わされるフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を発現させる工程を含むこと、分泌シグナルペプチドが、以下の（Ｃ）〜（Ｇ）からなる群より選択されるいずれかのアミノ酸配列で表わされること、生産されるフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼが、糖鎖を含んだ状態で９５〜１００ｋＤａの分子量を有する酵素タンパク質であること、およびクリプトコッカス属の微生物が、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１４８２で表わされるクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｓ−２）の変異体に、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９６１）に由来するａｄｅ１遺伝子を導入することによって得られるさらなる変異体であることを特徴とする方法：
   （Ａ）配列番号１または７で示される塩基配列；
   （Ｂ）配列番号１または７で示される塩基配列に対して９０％以上相同な塩基配列であって、フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼ酵素活性を持つタンパク質をコードする塩基配列；
   （Ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列；
   （Ｄ）配列番号３で示されるアミノ酸配列；
   （Ｅ）配列番号４で示されるアミノ酸配列；
   （Ｆ）配列番号５で示されるアミノ酸配列；
   （Ｇ）配列番号６で示されるアミノ酸配列。
2. 分泌シグナルペプチドが、（Ｄ）または（Ｅ）のアミノ酸配列で表わされることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 分泌シグナルペプチドが、（Ｅ）のアミノ酸配列で表わされることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
4. 請求項１〜３のいずれかに記載の方法によって生産されるフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
5. グルコースを基質とする酵素として、請求項４に記載のフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼを使用することを特徴とする血糖自己測定用バイオセンサ。