KR102520671B1

KR102520671B1 - 슈도모나스 속 미생물로부터 유래한 락토오스 옥시데이즈 효소 및 이를 이용한 락토비온산 생산방법

Info

Publication number: KR102520671B1
Application number: KR1020200137071A
Authority: KR
Inventors: 엄경태; 오유리; 장영아; 이승수
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2020-10-21
Filing date: 2020-10-21
Publication date: 2023-04-10
Also published as: KR20220052762A

Abstract

본 발명은 슈도모나스 속 미생물로부터 락토오스 옥시다이징 활성을 갖는 효소(Lactose oxidizing enzyme)를 분리 및 정제하여 특성을 밝혀내고, 상기 락토오스 옥시다이징 활성 효소를 암호화하는 유전자를 클로닝하여 락토비온산을 생산하는 재조합 균주를 제조해 내어, 상기 균주를 산업적으로 활용한 락토비온산 생산 방법을 제공한다.

Description

슈도모나스 속 미생물로부터 유래한 락토오스 옥시데이즈 효소 및 이를 이용한 락토비온산 생산방법{Novel lactose oxidase from Pseudomonas and method for producing lactobionic acid using the same}

본 발명은 슈도모나스 속 미생물로부터 유래한 락토오스 옥시데이즈 효소 및 이를 이용한 락토비온산 생산 방법에 관한 것이다.

차세대 피부미백 소재로서의 폴리하이드록시 비온산(Polyhydroxy bionic acid)의 한 종류인 락토비온산(Lactobionic acid)은 α-하이드록시산이 가지고 있는 각질제거, 주름개선, 피부미백 효과 외에 생분해성, 생체친화성, 항노화성, 항산화성, 보습성, 킬레이트성 등의 다양한 특성을 가지고 있으며, 피부에 대한 자극이 적어 글리콜릭산, 젖산을 대체할 수 있는 차세대 화장품 소재로서 매우 주목 받고 있으며, 락토비온산이 함유된 화장품이 상용화되어 현재 판매되고 있다.

락토비온산은 갈락토오스(Galactose)와 글루콘산(Gluconic acid)이 β-1,4 결합으로 형성된 물질로서, 분자량은 358.3이고, 수용성 백색 결정질 화합물이다. 락토비온산은 락토스 중의 유리 알데히드기의 산화반응에 의해 합성될 수 있는데, 이에 현재 화학적, 전기화학적, 촉매반응 또는 생물학적 산화에 의한 생산 연구가 많이 되고 있다. [문헌 Satory et al., Biotechnology letters 19(12) 1205-08, 1997].

이중 식품과 화장품 원료로 락토비온산의 관심과 쓰임에 대응하기 위하여 환경친화적인 미생물 배양법을 통한 생물학적 락토비온산 생산 연구가 집중적으로 진행되고 있으며, 현재까지 대표적인 락토비온산 생산 미생물 균주로 Pseudomonas taetrolens, Buckholderia cepacia, 및 Zymomonas mobilis 등이 보고되고 있다. 하지만 지금까지 보고된 락토비오산 생산성이 가장 높은 균주는 Buckholderia cepacia 으로 이는 병원성 균주로 분류되어있는 균주로써 산업적인 활용이 불가능하다는 문제점을 가지고있다.

이에 따라, 본 발명자들의 선행 출원인, 대한민국 공개특허 제 10-2018-0047470호는 비병원성 슈도모나스 테트로렌스 (Pseudomonas taetrolens) 균주의 배양 방법 최적화 연구를 통해 젖당으로부터 락토비온산 산화반응을 촉진시킴으로써 락토비온산 생산성을 증가시키는 방법을 개시한 바 있다.

한편, 락토비온산 생산에 있어 문제점은 공정 개발의 어려움도 있지만 우수한 균주 확보의 어려움이 크게 작용한다. 앞선 선행 연구를 통해 야생형 슈도모나스 테트로렌스의 배양 공정 개발을 통해 락토비온산 생산증가 가능성을 확인한 바에 이어, 재조합 균주 개발을 통해 락토비온산 전환 반응의 속도를 촉진하여 락토비온산 생산성을 증가시킬 수 있는 가능성에 따른 균주 개발을 통한 생산성 향상 연구가 필요하다. 또한, 현재 밝혀진 락토비온산 생산하는 미생물의 종류에 따라 생산된 효소의 작용과 환경 조건에 따라 그 활성이 매우 다르므로, 락토비온산 생산능력이 우수한 새로운 효소 발견 및 본 효소의 활성을 향상시키기 위한 특성 연구가 필요하며, 본 효소를 과발현 시켜 락토비온산 생산능력을 향상시킨 균주 개발의 필요성이 크고 이를 이용한 생산 기술 연구가 매우 중요하다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

대한민국 등록특허공보 제10-2030776호

본 발명자들은 락토비온산(Lactobionic acid) 생산 능력이 있는 슈도모나스 속 미생물로부터 락토오스 옥시다이징 활성을 갖는(Lactose oxidizing enzyme) 효소를 분리, 정제하여 특성을 밝혀 내고, 상기 슈도모나스 균주가 생산하는 락토오스 옥시다이징 활성 효소를 코딩하는 유전자를 클로닝하여 재조합 균주에 성공적으로 발현해내었다.

따라서, 본 발명의 목적은 산업적으로 락토비온산 생산에 활용할 수 있는 재조합 균주 및 이를 이용한 고효율 락토비온산 생산 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 하나의 관점은 슈도모나스 속 미생물로부터 유래한 말레이트 탈수소효소(malate dehydrogenase)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 락토비온산을 생산하는 재조합 균주 제조용 재조합 벡터; 또는 이를 포함하는 락토비온산 생산용 조성물을 제공하는 것이다.

락토비온산 생산에 있어 문제점은 공정 개발의 어려움도 있지만 우수한 균주 확보의 어려움이 크게 작용한다. 현재 밝혀진 락토비온산 생산하는 미생물의 종류에 따라 생산된 효소의 작용과 기질에 대한 산화 능력이 매우 다르므로, 이중 락토비온산 생산능력이 우수한 새로운 효소를 밝혀내고, 이에 따른 재조합 균주의 개발 및 이를 이용한 생산 기술 연구가 매우 중요하다.

이에 본 발명자들은 야생형 슈도모나스 속 미생물의 배양을 통한 락토비온산 생산량의 한계를 해결하고자, 본 균주 내의 락토오스 옥시다이징 효소(Lactose oxidizing enzyme)를 정제하여 본 효소의 특성을 파악한 결과, 말레이트 탈수소효소(malate dehydrogenase)가 슈도모나스 속 미생물 유래 락토비온산 생산 관여 효소임을 밝혀내었다.

상기 슈도모나스 속 미생물은 슈도모나스 플로로스캔스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 모라비언시스(Pseudomonas moraviensis), 슈도모나스 그라나덴시스(Pseudomonas granadensis), 슈도모나스 코레언시스 (Pseudomonas Koreensis) 등을 포함하며, 슈도모나스 테트로렌스(Pseudomonas taetrolens)에 제한되는 것은 아니다.

일 구현예에서, 상기 말레이트 탈수소효소(malate dehydrogenase)를 코딩하는 핵산 서열은 서열목록 제3서열에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며, 상기 말레이트 탈수소효소는 서열목록 제4서열로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

다른 구현예에서, 상기 말레이트 탈수소효소는 말레이트:퀴논 옥시도리덕타아제(malate:quinone oxidoreductase, EC 1. 1. 99. 16, GenBank accession number WP_048378186.1)일 수 있다.

상기 슈도모나스 속 미생물로부터 유래한 말레이트 탈수소효소는 락토오스 옥시다이징 활성을 가지며, 상기 말레이트 탈수소효소는 작용 온도가 15℃ 내지 45℃이고, pH 6.5 내지 pH 9.0의 조건에서 상대 효소 활성이 60% 이상 유지되는 것일 수 있다.

상기 말레이트 탈수소효소를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터는 플라스미드 벡터일 수 있고, 바람직하게는 pDSK519일 수 있다.

본 발명의 다른 관점은 상기 재조합 벡터가 도입된 말레이트 탈수소효소를 발현하는 재조합 균주; 또는 이를 포함하는 락토비온산 생산용 조성물을 제공하는 것이다.

일 구현예에서, 상기 균주는 그람음성균일 수 있는데, 예컨대 테라박테리아, 프로테오박테리아, 나선상균, 스핑고박테리아, 부유군류를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 상기 균주는 대장균에 상기 재조합 벡터가 도입된 것이다. 상기 재조합 대장균은 야생형 대장균과 달리 락토오스 옥시다이징 효소를 생산하여 락토오스로부터 락토비온산 생산이 가능한 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 관점은 슈도모나스 속 미생물로부터 유래한 말레이트 탈수소효소를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 수득하는 단계; 및 상기 재조합 벡터를 그람음성균에 도입하는 단계를 포함하는 락토비온산 생산용 재조합 균주의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명은 전술한 재조합 균주를 사용하여 락토비온산을 생산하는 방법 및/또는 슈도모나스 속 미생물로부터 유래한 락토오스 옥시다이징 활성을 갖는 말레이트 탈수소효소를 사용하여 락토비온산을 생산하는 방법을 제공한다.

상기 방법은 상기 재조합 균주 및/또는 슈도모나스 속 미생물로부터 유래한 락토오스 옥시다이징 활성을 갖는 말레이트 탈수소효소에 조효소 PQQ (pyrroloquinoline quinone)를 첨가하는 단계를 포함하여 수행될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 락토비온산 생산 방법은 1) 슈도모나스 테트로렌스 유래 락토비온산 생산 관여 효소를 분리 정제하는 단계; 2) 본 효소의 활성 유지를 위한 효소 안정성 및 활성도 최적화 단계; 3) 재조합 플라스미드를 제작하여 상기 플라스미드를 포함한 재조합 대장균을 형질전환하여 락토비온산 생산 대장균 제작 및 락토비온산 생산 관여 여부 확립하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 재조합 미생물을 제조하기 위하여, 슈도모나스 테트로렌스 유래 말레이트 탈수소효소 MQO(malate:quinone oxidoreductase, EC 1. 1. 99. 16)를 코딩하는 유전자를 PCR을 통하여 특정 프라이머를 통하여 증폭하였다.

이후, 상기 유전자를 대장균용 발현 벡터 pDSK519에 제한효소(XbaI, BamHI)를 이용하여 삽입시킨 재조합 플라스미드를 제작하였으며, 이를 pDSK519-MQO라고 명명하였다.

상기 재조합 된 플라스미드 pDSK519-MQO을 대장균(E.coli DH5α)에 형질전환하여 재조합 대장균을 제작하였으며, 본 재조합 균주를 젖당을 포함한 배양액에서 락토비온산 생산을 확인하였다.

본 발명의 일 구현예에 있어서 슈도모나스 및 대장균을 배양하는 단계에서는 1 내지 20 부피 % 농도의 젖당을 포함하고, 0.2 % 효모추출물과 0.5 % 펩톤 그리고 0.1 % 소고기추출물을 포함하고, 0.5 % NaCl을 포함할 수 있다.

상기 배양하는 단계는 NB 배지 50 ml 내지 2.0L, 20℃ 내지 37℃에서 48 내지 120시간 동안 배양시키는 것일 수 있다.

필요에 따라, 배양은 젖당 농도에 따라 배양 할 수 있고, pH 보정 물질인 CaCO₃ 존재 하의 배양 배지에서, 예를 들면 배지에 젖당 농도를 10 g/L 에서 200 g/L까지 다양하게 사용할 수 있고, CaCO₃ 첨가 또는 미첨가 상태로 수행될 수 있다.

바람직한 구현 예에서, 본 발명의 배양은 회분식 배양 (batch culture) 방법에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한 된 것은 아니다.

또한, 본 발명의 구현 예에 있어서, 상기 슈도모나스 테트로렌스 균주의 배양을 통한 생산성 향상 방법은 대한민국특허공개공보 10-2018-0047470에 개시된 내용과 같이 개발 될 수 있으며, 대한민국특허공개공보 10-2018-0047470에 개시된 내용 전체는 본원 명세서에 참고로서 포함된다.

본 발명은, 기존 락토오스 옥시다이징 활성을 갖는 슈도모나스 테트로렌스 균주의 락토비온산 전환에 효과적인 효소 단백질을 분리, 정제하였고, 그 특성을 명확히 밝힘으로써, 본 효소의 활성을 향상시키는 배양 방법을 확인하였다. 또한, 본 발명의 효소 단백질을 코딩하는 유전자 서열을 포함하는 재조합 벡터 및 재조합 균주를 제작함으로써 야생형 균주보다 락토비온산 생산성이 우수한 균주를 개발하여 락토비온산 전환 속도를 향상시킬 수 있다. 이에 따른 신규한 재조합 균주는 락토비온산 대량생산 공정에서 생산속도를 향상시킴으로써 다양한 산업분야에 효율적으로 이용될 수 있다.

도 1은 락토오스 옥시다이징 효소의 SDS-PAGE 전기영동 사진이다(Lane M; Mw standard, Lane 1; Crude enzyme, Lane 2; Ammonium sulfate 분획 샘플, Lane 3; Hitrap Q 크로마토그래피 분획 샘플, Lane 4; Sephadex G-100 크로마토그래피 분획 샘플).
도 2는 락토오스 옥시다이징 효소 활성 발현 최적 온도 및 pH 그래프이다. A) 온도에 따른 상대적 활성도, B) 열안정성, C) pH에 따른 상대적 활성도, D) pH에 대한 안정성
도 3은 pDSK519벡터를 이용해 대장균에서의 MQO 발현을 위한 재조합 플라스미드 모식도를 나타낸 것이다.
도 4는 젖당 존재 하에 야생형 대장균과 재조합 대장균의 조효소 첨가에 따른 락토비온산 전환 여부를 나타낸 결과이다.
도 5는 호기 발효조건에서 야생형 대장균과 본 발명을 통해 제조된 재조합 대장균의 락토비온산 생산 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 락토오스 옥시다이징 효소의 정제, 분리 및 분자량

슈도모나스 테트로렌스 유래 락토비온산 생산 관여 효소를 분리 및 정제하기 위하여, 다음과 같이 실험을 수행하였다.

실험예 1: 조효소 추출액(crude enzyme extract) 제조

슈도모나스 테트로렌스(한국생명공학연구원 생물자원센터에서 Pseudomonas taetrolens　Haynes 1957, KCTC 12501 균주를 분양받음)로부터 생산되는 배양액으로부터 락토비온산 생산 관여 효소를 분리하기 위해, 먼저 상기 미생물을 배양배지로 Nutrient broth (NB) (1 g/L beef extract, 2 g/L yeast extract, 5 g/L 펩톤, 5 g/L NaCl)를 사용하였고, 상기 젖당 농도 변화와 pH 보정 실험결과를 바탕으로 200 g/L 젖당과 pH 보정을 위해 30g/L CaCO₃를 첨가하여 발효시 pH6.5이상을 유지하여 진탕배양기에서 교반속도 200 rpm, 25℃에서 1일간 배양하였다. 본 배양액 1L를 13000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하여 미생물을 취하고, 수집한 세포 펠렛은 20mM 인산 완충액 (pH 7.2)에 재현탁하여 농도가 10%가 되게 한 다음 초음파분쇄기 (VCX-750, vibra cell, USA)로 앰플리튜드 (amplitude) 30 %, 10 sec pulse on, 30 sec pulse off로 20분간 세포의 세포벽을 깼다. 이후 4℃, 13000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상등액을 취한 후, 이를 조효소 추출액(crude enzyme extract)으로 지칭하였다.

실험예 2: 락토오스 옥시다이징 효소 정제

조효소액에 무게 대 부피비로 50 % 되는 유안((NH₄)₂SO₄)을 4℃에서 가하고 4시간 동안 잘 교반하여 주었다. 상기 효소액을 원심분리하여 용액만을 모으고, 이 용액에 최종 농도가 무게 대 부피비로 70 % 되는 유안을 4℃에서 가하고 4시간 동안 잘 교반하였다. 상기 효소액을 원심분리하여 침전물만을 모은 후, 이 침전물을 20 mM 인산화칼륨 완충용액 pH 7.5에 녹이고 같은 완충용액에서 하루 밤 동안 투석하였다. 이 효소액을 다시 원심분리하여 불용성 물질을 제거한 다음 0.22 μm필터로 정제하여 효소액으로 사용하였다.

본 단계에서 효소 활성은 1.350 ml의 0.075mM의 2,6-디클로로페놀 인도페놀 (2, 6-dichlorophenol indophenol, DCIP)과 5mM의 젖당 그리고 4mM의 sodium fluoride를 포함한 100mM 아세테이트 완충 용액 (pH 5.5)을 0.15ml의 효소 용액을 30℃에서 10분간 반응시켜 측정하였으며, 단백질 농도는 알부민을 표준으로 사용하여 Bradford 방법(Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976, 72, 248-254)으로 측정했다.

락토비온산 전환 활성을 포함한 분획 효소 샘플은 이온교환수지로 HiTrap-Q(GE Healthcare Life Sciences) 컬럼을 사용하여, 0-1M NaCl의 선형 구배(linear gradient)로 녹여서 분획되었으며, 이는 4.0 ml의 분획을 매 2분 마다 수집하였고, 각 분획에 효소활성도를 측정하여 분획을 선별하였다.

최종 정제 단계에서, 단백질은 그들의 분자량에 기초하여 0.1M의 붕산 나트륨 완충액 (pH 7.0)으로 평형화한 세파덱스 G-100 (Sephadex G-100, 1.5 Х 20cm, Bio-Rad 사)로 겔 여과하여 분리된다. 각 정제 단계를 통해 분획 된 샘플의 활성 및 단백질 농도는 표 1에 표시하였다.

Active fraction	총 단백질(μg)	총 활성 (U)	특이활성 (U/μg)	산출량 (%)	정제 배수
Crude enzyme extract	36.2	15.2	0.4	100.0	1.0
50 ~ 70 % ammonium sulfate	2.5	6.7	2.7	44.1	6.4
HitrapQ 이온교환크로마토그래피	1.1	4.2	3.8	27.6	9.1
Sephadex G-100 겔 여과 크로마토그래피	0.3	2.8	9.3	18.4	22.2

실험예 3: 락토오스 옥시다이징 효소 분리 및 분자량 확인

본 발명에서 정제된 효소의 순도 및 분자량을 측정하기 위해서 10% SDS-polyacrylamide gel 상에서 전기영동을 한 후, 단백질 marker와의 이동속도를 비교하여 분자량을 계산하였다. SDS-PAGE는 Laemmli의 방법에 따라 조제 하였으며, Bio-rad사의 protein marker (10-250 kDa)를 이용하였다. 도 1에 서 보여진 것과 같이 단일 밴드를 나타내었으며, 표준 단백질들로 구성된 분자량 marker들과 비교하여 분자량을 측정한 결과, 슈도모나스 테트로렌스가 생산하는 락토비온 생산 관여 효소의 분자량은 약 45 kDa으로 확인되었다.

단백질 밴드를 쿠마시 염색을 수행하여 비교한 후, 단일 단백질 밴드를 잘라낸 펩타이드 분획에 대한 질량분석법으로 단백질 서열에 대한 정보로 본 효소는 malate:quinone oxidoreductase(MQO, EC 1. 1. 99. 16, GenBank accession number WP_04837818.1)라는 것을 확인하였다.

실시예 2: 락토오스 옥시다이징 효소의 최적 온도 및 pH

실시예 1에서 확인한 락토오스 옥시다이징 효소의 효소 반응 최적 온도를 결정하기 위해서 15~65 ℃범위에서 5 ℃간격으로 10분 반응시켜 효소의 상대 활성으로 표시하였다. 열 안정성은 효소액을 15~65 ℃범위에서 5 ℃간격으로 하여 효소액을 1시간 단위로 열처리를 해서 효소의 잔존 활성도를 측정하였다. 본 효소의 최적 pH 측정은 0.1 M acetate buffer (pH 3.5-5.5), 0.1 M phosphate buffer (pH 5.5-8.0), 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0-9.0), 0.1 M glycine-NaOH buffer (pH 9.0-12.0)을 사용하였다. pH에 대한 안정성은 효소액에 각각의 pH의 buffer를 첨가하여 실온에서 1시간 방치 후 잔존하는 효 소의 활성을 측정하였고, pH에 대한 활성도는 활성 측정 시 사용되는 버퍼를 위 조성으로 하여 측정하여 분석되었다. 기타 방법은 실험예 <1-2>의 액체배양 효소활성 측정 방법과 동일하게 하였다. 본 발명에서 정제된 효소의 온도 및 pH에 대한 활성도 변화에 대한 결과는 도 2에 나타내었다. 온도에 대한 활성도는 55 ℃까지 최대활성도의 50 %이상 유지되었으며, 열에 대한 안정성은 45 ℃ 이상의 온도에서 급격히 감소하였다. pH에 대한 활성도는 pH 7.0에서 가장 높았으며, pH 6.0~pH 9.0 에서 상대적 활성도가 최대 활성도의 80 % 유지되는 성질을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 락토오스 옥시다이징 효소의 활성에 미치는 금속 이온 영향과 기질 특이성

본 정제된 효소의 다양한 금속이온(표 2)과 기질에 따른 특이성(표 3)에 활성도를 나타냈다.

DCIP 활성측정법을 통해 1mM의 다양한 금속 이온 및 시약과 함께 효소를 1시간 미리 배양하여 결정했다. 그런 다음 금속 이온 또는 시약의 존재 하에 활성도를 측정했다. 금속 이온 및 시약 없이 검정된 활성을 100%로 기록했다. 본 락토오스 옥시다이징 효소의 활성은 ZnCl₂ , AlCl₃, CuCl₂등에 의하여 최대 활성의 30% 이상으로 저해되는 영향을 받았으며, FeCl₂에 의해서는 활성이 향상되는 반응을 보여주었다.

다양한 기질에 따른 본 효소의 반응 특이성은, 락토오스, 셀로비오스, 말토오스와 같은 이당류에 반응을 보이는 반면, 다른 화합물들은 기질로서 작용하지 않았다. 락토오스 생산 관여 효소의 미카엘리스 상수 (Michaelis constant) (K_m) 및 최대 속도(maximum velocity) (V_max)의 수치를 0.2 내지 4.5 mM 범위 농도의 당 기질로서 사용하여 결정했다. K_m 및 V_max 의 수치를 표준 선형회귀 기술을 사용하여 라인위버-버크 플롯(Lineweaver-Burk plots)으로부터 결정했다.

하기 표 2는 금속이온이 락토오스 옥시다이징 효소에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

Inhibitor (1 mM)	Relative activity (%)
Control	100
CaCl₂	72.8±0.8
MgCl₂	67.3±1.6
ZnCl₂	29.7±2.1
FeCl₂	109.4±1.2
AlCl₃	30.1±3.8
CuCl₂	12.4±2.7
MnCl₂	75.2±1.1
NiCl₂	65.1±2.4
CoCl₂	63.7±0.7
KCl	97.5±0.4
NaCl	95.3±0.9

하기 표 3은 락토오스 옥시다이징 효소의 상대적 기질 특이성을 나타낸 것이다.

Substrate	Relative activity (%)	V _{max (mM/min)}	K _m (mM)	K _cat (S ^-1 )	K _cat /K _m (S ^-1 ·mM ^-1 )
Lactose	100	0.05 ± 0.018	0.46 ± 0.17	12.62	27.43
Cellobiose	64.34	0.03 ± 0.014	0.22 ± 0.19	7.57	34.41
Maltose	49.26	0.02 ± 0.007	0.66 ± 0.21	5.05	7.65
Sucrose	- ^a	-	-	-	-
D-glucose	-	-	-	-	-
D-galactose	-	-	-	-	-
D-xylose	-	-	-	-	-
D-mannose	-	-	-	-	-
L-Arabinose	-	-	-	-	-
D-fructose	-	-	-	-	-

^a: 전환이 이뤄지지 않음.

실시예 4: 형질전환 대장균으로부터 락토비온산 생산

대장균(E. coil)를 이용하여 본 정제된 효소가 락토비온산 생산에 관여하는 효소임을 선별하고 이를 락토비온산 생산을 위한 재조합 균주를 제조하기 위해 다음과 같이 실험을 수행하였다.

실험예 1: 재조합 플라스미드 제조

젖당(락토오스, lactose) 산화반응을 통해 락토비온산 생산 능력이 우수한 슈도모나스 테트로렌스로부터 락토비온산 생산에 관여하는 효소 malate:quinone oxidoreductase (MQO, EC 1. 1. 99. 16, GenBank accession number WP_048378186.1)를 암호화하는 뉴클레오티드를 슈도모나스 테트로렌스 게놈 유전자 주형으로부터 정방향(서열목록 제1서열: MQO_XbaI_F 5'-TCTAGAAGGAATATGATATGGCGCATAACGAAGCAGTC-3'), 역방향(서열목록 제2서열: MQO_BamHI_R 5'-GGATCCTTACGCGATGCTGGTGTTCGGTTC-3') 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응 (94℃ 5분동안 1회; 94℃ 30초간, 55℃ 2분 20초간, 72℃ 30초간 반응을 30회; 72℃ 7분간 1회)을 통하여 정방향 프라이머에는 XbaI 인식부위가 역방향 프라이머에는 BamHI 인식 부위가 존재하여 MQO 유전자를 증폭시켰다. 증폭된 유전자를 한천 겔 전기영동법을 통해 분리하였고, 증폭 분리된 DNA 단편을 XbaI와 BamHI으로 절단한 후에, XbaI와 BamHI로 절단된 통상의 대장균용 플라스미드 벡터인 pDSK519에 도입하여 재조합 플라스미드를 제작하였다.

실험예 2: 재조합 균주 제조

상기 실험예 1에서 제조된 플라스미드 pDSK519- MQO를 열충격 (42℃) 방법에 의해 재조합 대장균(E. coli JM109 △gcd)에 도입하여 형질전환시켰다. 대장균 또한 조효소 PQQ 존재 하에 락토비온산 생산에 관여하는 효소인 gdh (Quinoprotein glucose dehydrogenase) 유전자를 보유하고 있어 상기 유전자를 the Quick and Easy Conditional Knockout Kit (Gene Bridges, Heidelberg, Germany)방법으로 제거 (Knock-Out) 하여 음성대조군(negative control)으로 활용하였다. pDSK519 플라스미드는 선택표지로서 카나마이신(kanamycin) 저항성 유전자를 가지고 있으며, 카나마이신이 들어있는 LB-agar배지에서 pDSK519가 도입된 콜로니들을 선별하였고, 선별된 콜로니들의 콜로니 PCR을 통해 PCR산물의 DNA 시퀀싱(마크로젠, 한국) 확인하여 MQO 유전자 형질전환을 확인하였으며, 재조합 대장균을 LB(Luria-Bertani) 플레이트(1 % tryptone, 0.5 % yeast extract, 1 % NaCl, 1,5 % agar)에 도말하여 37℃ 정치배양기에서 24시간 동안 배양하였다. LB 플레이트에서 자란 균주의 콜로니를 항생제가 포함된 LB 액체배지 200mL에 접종하고, 37℃ 교반배양기에서 200rpm으로 OD(600nm)가 0.6 (분광광도계 (spectrophotometer)로 측정)이 될 때까지 배양하였다. 이를 통해 재조합 플라스미드인 pDSK519- MQO를 대장균에 형질전환한 재조합 균주를 개발하였다.

실시예 5: MQO 과발현된 재조합 대장균 제조 및 이를 이용한 락토비온산 생산 능력 확인

야생형 슈도모나스 테트로렌스 종으로부터 얻은 MQO(malate:quinone oxidoreductase)는 피롤로퀴놀린퀴논(PQQ)을 조효소로 하는 수용성 글루코스 탈수소효소로써, 상기 유전자가 젖당으로부터 락토비온산 전환에 필수적인 효소를 코딩하는 유전자인지의 여부를 확인하기 위해 대조군의 대장균(E.coli △gcd-pDSK)과 형질전환된 신규 대장균(E.coli △gcd-pDSK519-MQO)을 PQQ 및 NAD등 조효소가 포함된 젖당 배지에서 배양하고 균체 성장 및 락토비온산 전환 산물을 확인하였다.

MQO 유전자를 도입한 대장균 (E. coil △gcd /pDSK519-MQO)주와 대조군 (E. coil △gcd /pDSK519)을 각각 2ml의 LB배지 (Tryptone 10g, Yeast Extract 5g, NaCl 5g) 에 항생제 앰피실린 50 ㎍/ml을 포함하여 온도조건 30℃으로 16시간 배양하였고, 그 후, 각 균체를 초기 OD(600nm)가 0.2 가 되도록 대조군 대장균과 형질전환 대장균은 5ml의 LB배지 에 lactose 25g/L, CaCO₃ 3 g/L 및 PQQ 또는 NAD 20μM을 접종하여 30℃, 200rpm 조건으로 교반배양기에서 배양하고, 배양 개시로부터 4시간 후에 IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드)를 최종 농도 1mM가 되도록 첨가하여 총 24시간 배양하였다. 젖당과 락토비온산의 분석은 Refractive Index Detector(RID)가 장착된 Agilent사의 고성능 액체크로마토그래피 (HPLC 1260 모델)을 이용하였다. 컬럼은 Coregel ION 300 column을 사용하였고, 컬럼 온도는 70℃를 유지하였다. 이동상은 0.5mM H₂SO₄를 이용하였고, flow는 0.3 ml/min이었다. 상기 조건에서 젖당과 락토비온산은 retention time은 도3에서 나타나는 것처럼 각각 19.2분, 20.4분으로 분리되어 확인되었다.

이와 같은 방법으로 슈도모나스 테트로렌스 유래 락토비온산 생산에 관여하는 MQO를 과발현시킨 대장균에서도 조효소 PQQ를 넣어준 조건에서만, 대조균 대장균에서는 나타나지 않는 락토비온산 피크가 나타나는 것으로 확인 되었고 이에 본 발명에서 제조된 재조합 대장균은 gdh3 유전자의 도입에 의해 젖당을 대사하여 락토비온산 전환 능력이 있음을 확인하였다(도 4).

야생형균주와 재조합 균주의 젖당 25 g/L 발효를 통해 락토비온산 생산성을 비교한 결과(도 5), 조효소 PQQ를 넣어준 배양 조건에서 37시간 때 23 g/L의 젖당 대사 전환이 완료 되어 23 g/L의 락토비온산 생산이 되었으며, 이는 0.62 g/L/h의 생산성을 보이는 락토비온산 대사 가능한 재조합 대장균 균주를 개발할 수 있었다.

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY <120> Novel lactose oxidase from Pseudomonas and method for producing lactobionic acid using the same <130> P20-124 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MQO XbaI F <400> 1 tctagaagga atatgatatg gcgcataacg aagcagtc 38 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MQO BamHI R <400> 2 ggatccttac gcgatgctgg tgttcggttc 30 <210> 3 <211> 1500 <212> DNA <213> Pseudomonas taetrolens <400> 3 atggcgcata acgaagcagt cgacgtagta ctggttggag cgggcatcat gagtgccacc 60 ctcgccgtac tgctcaaaga gctcgacccc ggcattaagc tggaagttgt tgagcagatg 120 gactcaggtg ctgcggagag ttccaacccg tggaacaacg caggcaccgg ccacgccggg 180 ctgtgcgaat tgaactatac gccgcaagcg gctgacggtt cgatcgacat caaaaaggct 240 gtgcatatca atgcacagtt cgaagtctcg aaacagtttt gggcctacct ggcgcaacaa 300 gggaccttcg gctcatgcaa atccttcatc agcccagtgc ctcacctgag ctacgtgcaa 360 ggtgaaaaag gtgtgtcctt cctgaaaaaa cgttttgaag tgctgagcaa gcaccatgcg 420 ttttcagaca tggaatacac cgaagacaag gcaaaaatgg ctgaatggat gccattgatg 480 atgccgggcc gcccggcaga cgaagtcatc tccgccaccc gtgtcatgca cggcaccgac 540 gtcaacttcg gcgccctgac ccagcaactg ctcaagcatt tggccagcgc tcccgacacg 600 cagatcaaat acagcaaaaa agtcactggc ctcaagcgca atggcagcgg ctggacagtg 660 agcatcaaag acaccaacag cggcaacacg cgccacatcg atgccaaatt cgtgttcctc 720 ggtgccggtg gcgcggcctt gccgctgctg caagcctcgg gcattgagga aagcaaaggc 780 tacggcggtt tcccggtcag cggccagtgg ctgcgttgcg acaacccgga agtggtcaag 840 cttcaccagg ccaaggtcta cagccaggcg gccgtaggct ccccaccgat gtcggtaccg 900 catctggaca cccgtgtcgt ggacggcaag aagtccctgt tgtttggacc gtatgccggc 960 ttcacgacca agttcctcaa gcacggttcg ttcatggacc tgccgatgtc gattcgcttg 1020 ggtaatatcg gaccaatgct cgccgtcgcc cgtgacaaca tggatctgac caagtacctg 1080 gtcagtgagg tccgtcaatc gatggagcaa cgcctggact ccctgcgtcg cttctatcca 1140 caggccaagg ccgaagactg gcgtcttgag atcgcgggcc aacgggttca gatcatcaag 1200 aaagacccga aaaaaggcgg cgtgctgcag ttcggtaccg aactggttgc agccaaggac 1260 ggctcattgg ccgccctgct cggcgcctct ccgggcgctt cggtgacggt atcgatcatg 1320 ctcgacctga tcgagcgctg cttcccgcaa aaagcagctg gcgagtgggc gaccaagctc 1380 aaggaaattt tcccggcacg ggaaaaaacc cttgagaccg acgctgagtt gtaccgtgaa 1440 atcagcaccc gcaactccga gttgctggaa ctggtagaac cgaacaccag catcgcgtaa 1500 1500 <210> 4 <211> 499 <212> PRT <213> Pseudomonas taetrolens <400> 4 Met Ala His Asn Glu Ala Val Asp Val Val Leu Val Gly Ala Gly Ile 1 5 10 15 Met Ser Ala Thr Leu Ala Val Leu Leu Lys Glu Leu Asp Pro Gly Ile 20 25 30 Lys Leu Glu Val Val Glu Gln Met Asp Ser Gly Ala Ala Glu Ser Ser 35 40 45 Asn Pro Trp Asn Asn Ala Gly Thr Gly His Ala Gly Leu Cys Glu Leu 50 55 60 Asn Tyr Thr Pro Gln Ala Ala Asp Gly Ser Ile Asp Ile Lys Lys Ala 65 70 75 80 Val His Ile Asn Ala Gln Phe Glu Val Ser Lys Gln Phe Trp Ala Tyr 85 90 95 Leu Ala Gln Gln Gly Thr Phe Gly Ser Cys Lys Ser Phe Ile Ser Pro 100 105 110 Val Pro His Leu Ser Tyr Val Gln Gly Glu Lys Gly Val Ser Phe Leu 115 120 125 Lys Lys Arg Phe Glu Val Leu Ser Lys His His Ala Phe Ser Asp Met 130 135 140 Glu Tyr Thr Glu Asp Lys Ala Lys Met Ala Glu Trp Met Pro Leu Met 145 150 155 160 Met Pro Gly Arg Pro Ala Asp Glu Val Ile Ser Ala Thr Arg Val Met 165 170 175 His Gly Thr Asp Val Asn Phe Gly Ala Leu Thr Gln Gln Leu Leu Lys 180 185 190 His Leu Ala Ser Ala Pro Asp Thr Gln Ile Lys Tyr Ser Lys Lys Val 195 200 205 Thr Gly Leu Lys Arg Asn Gly Ser Gly Trp Thr Val Ser Ile Lys Asp 210 215 220 Thr Asn Ser Gly Asn Thr Arg His Ile Asp Ala Lys Phe Val Phe Leu 225 230 235 240 Gly Ala Gly Gly Ala Ala Leu Pro Leu Leu Gln Ala Ser Gly Ile Glu 245 250 255 Glu Ser Lys Gly Tyr Gly Gly Phe Pro Val Ser Gly Gln Trp Leu Arg 260 265 270 Cys Asp Asn Pro Glu Val Val Lys Leu His Gln Ala Lys Val Tyr Ser 275 280 285 Gln Ala Ala Val Gly Ser Pro Pro Met Ser Val Pro His Leu Asp Thr 290 295 300 Arg Val Val Asp Gly Lys Lys Ser Leu Leu Phe Gly Pro Tyr Ala Gly 305 310 315 320 Phe Thr Thr Lys Phe Leu Lys His Gly Ser Phe Met Asp Leu Pro Met 325 330 335 Ser Ile Arg Leu Gly Asn Ile Gly Pro Met Leu Ala Val Ala Arg Asp 340 345 350 Asn Met Asp Leu Thr Lys Tyr Leu Val Ser Glu Val Arg Gln Ser Met 355 360 365 Glu Gln Arg Leu Asp Ser Leu Arg Arg Phe Tyr Pro Gln Ala Lys Ala 370 375 380 Glu Asp Trp Arg Leu Glu Ile Ala Gly Gln Arg Val Gln Ile Ile Lys 385 390 395 400 Lys Asp Pro Lys Lys Gly Gly Val Leu Gln Phe Gly Thr Glu Leu Val 405 410 415 Ala Ala Lys Asp Gly Ser Leu Ala Ala Leu Leu Gly Ala Ser Pro Gly 420 425 430 Ala Ser Val Thr Val Ser Ile Met Leu Asp Leu Ile Glu Arg Cys Phe 435 440 445 Pro Gln Lys Ala Ala Gly Glu Trp Ala Thr Lys Leu Lys Glu Ile Phe 450 455 460 Pro Ala Arg Glu Lys Thr Leu Glu Thr Asp Ala Glu Leu Tyr Arg Glu 465 470 475 480 Ile Ser Thr Arg Asn Ser Glu Leu Leu Glu Leu Val Glu Pro Asn Thr 485 490 495 Ser Ile Ala

Claims

슈도모나스(Pseudomonas) 속 미생물로부터 유래한 말레이트 탈수소효소(malate dehydrogenase)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터; 및 조효소 PQQ(pyrroloquinoline quinone)를 포함하는 락토비온산 생산용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 말레이트 탈수소효소는 락토오스 옥시다이징 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 말레이트 탈수소효소는 작용 온도가 15℃ 내지 45℃이고, 작용 pH가 6.5 내지 9.0인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 핵산 서열은 서열목록 제3서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 말레이트 탈수소효소는 서열목록 제4서열로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 말레이트 탈수소효소는 말레이트:퀴논 옥시도리덕타아제(malate:quinone oxidoreductase, EC 1. 1. 99. 16, GenBank accession number WP_048378186.1)인 것을 특징으로 하는 특징으로 하는 조성물.
슈도모나스(Pseudomonas) 속 미생물로부터 유래한 말레이트 탈수소효소(malate dehydrogenase)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된, 락토비온산 생산용 재조합 그람음성균; 및 조효소 PQQ(pyrroloquinoline quinone)를 포함하는 락토비온산 생산용 조성물.
제7항에 있어서, 상기 재조합 그람음성균은 재조합 대장균이고, 이는 야생형 대장균과 달리 락토오스 옥시다이징 효소를 생산하여 락토오스로부터 락토비온산 생산이 가능한 것을 특징으로 하는 조성물.
슈도모나스(Pseudomonas) 속 미생물로부터 유래한 말레이트 탈수소효소(malate dehydrogenase)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 수득하는 단계; 및
상기 재조합 벡터를 그람음성균에 도입하는 단계
를 포함하는 락토비온산 생산용 재조합 그람음성균의 제조방법,
여기서 상기 락토비온산 생산용 재조합 그람음성균은 조효소 PQQ (pyrroloquinoline quinone)를 넣어준 조건에서 락토비온산을 생산하는 것임.
슈도모나스(Pseudomonas) 속 미생물로부터 유래한 말레이트 탈수소효소(malate dehydrogenase)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된, 락토비온산 생산용 재조합 그람음성균; 및 조효소 PQQ (pyrroloquinoline quinone)를 사용하여 락토비온산을 생산하는 방법.
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슈도모나스(Pseudomonas) 속 미생물로부터 유래한 말레이트 탈수소효소(malate dehydrogenase) 및 조효소 PQQ (pyrroloquinoline quinone)를 사용하여 락토비온산을 생산하는 방법으로서, 상기 말레이트 탈수소효소는 락토오스 옥시다이징 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 락토비온산을 생산하는 방법.