CN116790538B - 一种具有耐碱性的氧化硫化酶突变体及其应用 - Google Patents
一种具有耐碱性的氧化硫化酶突变体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有耐碱性的氧化硫化酶突变体及其应用。本发明的氧化硫化酶突变体的突变为选自以下突变位点中的至少一个：第86位氨基酸从V突变为S，第292位的氨基酸L突变为A，第348位氨基酸从T突变为K；本发明中所述的氧化硫化酶突变体制备麦角硫因的周期短、产量高，并且提高了其耐碱性及催化活性，使得碱性条件下制备麦角硫因的效率显著提高。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种具有耐碱性的氧化硫化酶突变体及其应用。
背景技术
麦角硫因(Ergothioneine,EGT)，又名2-巯基-L-组氨酸三甲基内盐，是一种天然的稀有氨基酸，自然界中含量较低且在绝大多数生物体中的含量极少，不能由动物机体自身合成，只能通过饮食等方式从外界环境中摄取。EGT主要以硫醇和硫酮两种形式的异构体存在，其纯品为白色晶体，无色无味，能溶于水，因为巯基的稳定性不如硫羰基高，故麦角硫因主要以硫酮的形式存在，在生理pH或者强碱溶液中不会自身氧化。1909年，Tanret首次从麦角菌Claviceps purpurea(寄生在禾本科植物黑麦上的一种真菌)中分离并得到该物质。麦角硫因具有极强的抗氧化活性、抗炎作用、抗应激作用、抗细胞衰老作用、抑制皱纹形成作用和抑制肿瘤发生等多种生理功效。由于麦角硫因的上述功能，决定了它在医药、食品、保健品、化妆品及生物技术等领域具有广泛的市场前景。
在相关技术中，麦角硫因可以经化学合成、提取法和生物发酵获得。而化学方法合成左旋的麦角硫因十分困难，且合成原料昂贵，成本高，产品安全性难以保证，限制了麦角硫因的应用。提取法主要是从大型真菌的子实体、麦角、谷物、猪血和动物组织中提取麦角硫因。在相关技术中，发现了麦角硫因广泛存在于食药用菌中，虽然食药用菌子实体中麦角硫因含量可观，但在大规模工业生产中使用提取法往往是不合适的，因为这一种方法中食用菌子实体栽培时间长，成本较高，且得到的麦角硫因杂质多，产出率低。
麦角硫因生物合成途径大致可分为两种，一种是在细菌中由EgtABCDE基因簇编码的5个酶进行连续催化合成的途径；另一种是在真菌中由Egt1、Egt2两个酶催化的合成途径。目前已报道的利用微生物发酵生产麦角硫因的相关文献较多，尽管深层发酵法是目前麦角硫因工业化生产的主要方法，但是也面临着发酵周期长，产物产率低，分离困难的问题。上述缺陷使得现有的生物法无法真正实现麦角硫因的大规模工业化生产，因此，迫切需要一种能够周期短、产量高、成本低、途经简单的新方法制备麦角硫因。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种具有耐碱性的氧化硫化酶突变体，能够提高氧化硫化酶在催化生产麦角硫因中的效率，提高了其耐碱性及催化活性，使得碱性条件下制备麦角硫因的效率显著提高。
本发明还提出编码上述突变体的核酸分子。
本发明还提出一种重组载体。
本发明还提出一种重组宿主细胞。
本发明还提出一种产品。
本发明还提出一种生产上述氧化硫化酶突变体的方法。
本发明还提出上述氧化硫化酶的突变体或重组宿主细胞在生产麦角硫因中的应用。
本发明的第一个方面，提供一种氧化硫化酶的突变体，所述突变体具有如SEQ IDNO.1所示的氧化硫化酶氨基酸序列经以下任一种氨基酸置换后的氨基酸序列：第86位氨基酸从V突变为S；第292位的氨基酸L突变为A；第348位氨基酸从T突变为K。
在本发明的一些实施方式中，所述氧化硫化酶是来自克雷伯氏菌属(Klebsiellasp.)的氧化硫化酶KsEanB。
在本发明的一些实施方式中，所述氧化硫化酶KsEanB的氨基酸序列为：
MKRVSQLTALAMLCGLASFSSLAADMPHAMTLSQLQAQHGAVIDTRASAFYNGWPQTLSAPSGHEPAALNLSASWLGAMSDDQIAVWARQHQLTPAMTIALYGRDADNQAVKTRLEKAGYHQISVLNDALQVPERLQRLPHFEQLVYPEWIHRLQQGKPVTAAPTGDWKVIEAAWGAPKFYLLNHIPGAGYIDTNEVESEPLWNKVSDDTLKAMLAKHGIRHDTTVILYGRDVYAAARVAQIMLYAGVKDVRILDGGWKAWSDAGLPVERGMPKDVKPAPDFGAPIPGQPQLMVDMAQARGMLHRQDASLVSIRSWPEFIGETSGYSYIKPKGEIAGARWGHAGSDATHMEDFHNPDGTMRSADDIAAMWKTWNILPEQHVAFYCGTGWRASETFMYARAMGWKNVAVYDGGWYEWSSHPQNPVSSGKRGPESTR(SEQ ID NO.1)。
在本发明的一些实施方式中，所述氧化硫化酶的突变体的氨基酸序列包括如下(1)-(5)中的任意一种：
(1)SEQ ID NO.2；
(2)SEQ ID NO.3；
(3)SEQ ID NO.4；
(4)SEQ ID NO.5；
(5)SEQ ID NO.6。
在本发明的一些实施方式中，所述SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中，氨基酸置换位点为V86S，所述氨基酸序列为：
在本发明的一些实施方式中，所述SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列中，氨基酸置换位点为L292A，所述氨基酸序列为：
在本发明的一些实施方式中，所述SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列中，氨基酸置换位点为T348K，所述氨基酸序列为：
在本发明的一些实施方式中，所述SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列中，氨基酸置换位点为V86S/L292A，所述氨基酸序列为：
在本发明的一些实施方式中，所述SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列中，氨基酸置换位点为V86S/L292A/T348K，所述氨基酸序列为：
其中，上述氨基酸序列中加粗且标有下划线的部分分别为氨基酸置换后的第86位的丝氨酸，第292位的丙氨酸，第348的赖氨酸。
在本发明的一些实施方式中，所述氧化硫化酶突变体的氨基酸序列还可以是与SEQ ID NO.2-6所示的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。
在本发明的一些具体实施方式中，所述氧化硫化酶突变体的氨基酸序列为SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示的其中一种氨基酸序列。
本发明的第二个方面，提供编码本发明第一个方面所述氧化硫化酶的突变体的核酸分子，所述核酸分子编码的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.8-12所示的序列。
其中，编码野生型KsEanB的核酸分子的核苷酸序列为：
5’-ATGAAAAGGGTATCACAATTAACAGCTCTAGCGATGCTGTGTGGTCTGGCGTCTTTTAGCAGTCTGGCGGCGGATATGCCGCACGCCATGACCCTGTCTCAGCTGCAAGCCCAGCACGGTGCAGTGATCGACACCCGTGCATCCGCATTTTATAACGGCTGGCCTCAGACCCTGAGCGCGCCGTCCGGCCATGAACCGGCGGCCCTCAACCTGTCGGCTAGCTGGCTGGGTGCCATGAGCGACGACCAGATCGCGGTGTGGGCTCGCCAGCACCAGTTGACCCCAGCGATGACCATTGCGCTGTACGGCCGTGACGCCGACAATCAGGCTGTCAAAACTCGTTTGGAAAAAGCGGGTTATCATCAGATCAGCGTTCTGAATGATGCGTTGCAAGTTCCGGAGCGTTTGCAACGTCTGCCTCACTTTGAACAATTGGTTTACCCGGAGTGGATTCATCGTTTACAGCAGGGTAAACCGGTGACCGCGGCTCCGACGGGTGATTGGAAGGTGATCGAAGCAGCGTGGGGTGCGCCAAAGTTCTACCTGCTGAATCATATTCCGGGTGCTGGCTACATCGACACGAACGAAGTTGAATCCGAGCCCCTGTGGAATAAAGTGAGCGACGACACCTTAAAAGCAATGTTGGCAAAACACGGCATCCGTCACGATACCACCGTTATCCTGTACGGCCGAGATGTGTATGCAGCTGCTCGCGTGGCCCAAATTATGTTGTACGCGGGAGTTAAGGACGTGCGTATTCTTGATGGCGGTTGGAAGGCGTGGTCCGACGCCGGTCTGCCGGTCGAGCGTGGCATGCCCAAAGATGTAAAGCCGGCGCCGGACTTCGGTGCGCCGATTCCGGGTCAGCCGCAACTGATGGTCGATATGGCACAAGCACGCGGTATGCTCCACCGCCAAGATGCGAGCCTGGTTAGCATTCGTAGCTGGCCGGAGTTCATCGGTGAGACTTCAGGCTACAGCTATATCAAACCGAAAGGTGAAATCGCAGGCGCGCGCTGGGGTCACGCGGGCAGCGACGCTACCCATATGGAAGATTTCCATAACCCGGACGGTACGATGCGTTCTGCCGATGACATCGCCGCGATGTGGAAGACCTGGAACATTCTGCCGGAGCAGCACGTTGCTTTCTACTGCGGCACAGGTTGGCGTGCCTCGGAGACGTTTATGTATGCGAGAGCAATGGGTTGGAAGAACGTTGCGGTGTATGATGGGGGCTGGTATGAATGGTCTAGCCATCCGCAAAACCCGGTCTCCTCCGGTAAGCGCGGTCCGGAGAGCACCCGT-3’(SEQ ID NO.7)；
编码V86S突变的KsEanB突变体的核酸分子的核苷酸序列为：
5’-ATGAAAAGGGTATCACAATTAACAGCTCTAGCGATGCTGTGTGGTCTGGCG TCTTTTAGCAGTCTGGCGGCGGATATGCCGCACGCCATGACCCTGTCTCAGCTGCAAGCCCAGCACGGTGCAGTGATCGACACCCGTGCATCCGCATTTTATAACGGCTGGCCTCAGACCCTGAGCGCGCCGTCCGGCCATGAACCGGCGGCCCTCAACCTGTCGGCTAGCTGGCTGGGTGCCATGAGCGACGACCAGATCGCGTCGTGGGCTCGCCAGCACCAGTTGACCCCAGCGATGACCATTGCGCTGTACGGCCGTGACGCCGACAATCAGGCTGTCAAAACTCGTTTGGAAAAAGCGGGTTATCATCAGATCAGCGTTCTGAATGATGCGTTGCAAGTTCCGGAGCGTTTGCAACGTCTGCCTCACTTTGAACAATTGGTTTACCCGGAGTGGATTCATCGTTTACAGCAGGGTAAACCGGTGACCGCGGCTCCGACGGGTGATTGGAAGGTGATCGAAGCAGCGTGGGGTGCGCCAAAGTTCTACCTGCTGAATCATATTCCGGGTGCTGGCTACATCGACACGAACGAAGTTGAATCCGAGCCCCTGTGGAATAAAGTGAGCGACGACACCTTAAAAGCAATGTTGGCAAAACACGGCATCCGTCACGATACCACCGTTATCCTGTACGGCCGAGATGTGTATGCAGCTGCTCGCGTGGCCCAAATTATGTTGTACGCGGGAGTTAAGGACGTGCGTATTCTTGATGGCGGTTGGAAGGCGTGGTCCGACGCCGGTCTGCCGGTCGAGCGTGGCATGCCCAAAGATGTAAAGCCGGCGCCGGACTTCGGTGCGCCGATTCCGGGTCAGCCGCAACTGATGGTCGATATGGCACAAGCACGCGGTATGCTCCACCGCCAAGATGCGAGCCTGGTTAGCATTCGTAGCTGGCCGGAGTTCATCGGTGAGACTTCAGGCTACAGCTATATCAAACCGAAAGGTGAAATCGCAGGCGCGCGCTGGGGTCACGCGGGCAGCGACGCTACCCATATGGAAGATTTCCATAACCCGGACGGTACGATGCGTTCTGCCGATGACATCGCCGCGATGTGGAAGACCTGGAACATTCTGCCGGAGCAGCACGTTGCTTTCTACTGCGGCACAGGTTGGCGTGCCTCGGAGACGTTTATGTATGCGAGAGCAATGGGTTGGAAGAACGTTGCGGTGTATGATGGGGGCTGGTATGAATGGTCTAGCCATCCGCAAAACCCGGTCTCCTCCGGTAAGCGCGGTCCGGAGAGCACCCGT-3’(SEQ ID NO.8)；
编码L292A突变的KsEanB突变体的核酸分子的核苷酸序列为：
5’-ATGAAAAGGGTATCACAATTAACAGCTCTAGCGATGCTGTGTGGTCTGGCG TCTTTTAGCAGTCTGGCGGCGGATATGCCGCACGCCATGACCCTGTCTCAGCTGCAAGCCCAGCACGGTGCAGTGATCGACACCCGTGCATCCGCATTTTATAACGGCTGGCCTCAGACCCTGAGCGCGCCGTCCGGCCATGAACCGGCGGCCCTCAACCTGTCGGCTAGCTGGCTGGGTGCCATGAGCGACGACCAGATCGCGGTGTGGGCTCGCCAGCACCAGTTGACCCCAGCGATGACCATTGCGCTGTACGGCCGTGACGCCGACAATCAGGCTGTCAAAACTCGTTTGGAAAAAGCGGGTTATCATCAGATCAGCGTTCTGAATGATGCGTTGCAAGTTCCGGAGCGTTTGCAACGTCTGCCTCACTTTGAACAATTGGTTTACCCGGAGTGGATTCATCGTTTACAGCAGGGTAAACCGGTGACCGCGGCTCCGACGGGTGATTGGAAGGTGATCGAAGCAGCGTGGGGTGCGCCAAAGTTCTACCTGCTGAATCATATTCCGGGTGCTGGCTACATCGACACGAACGAAGTTGAATCCGAGCCCCTGTGGAATAAAGTGAGCGACGACACCTTAAAAGCAATGTTGGCAAAACACGGCATCCGTCACGATACCACCGTTATCCTGTACGGCCGAGATGTGTATGCAGCTGCTCGCGTGGCCCAAATTATGTTGTACGCGGGAGTTAAGGACGTGCGTATTCTTGATGGCGGTTGGAAGGCGTGGTCCGACGCCGGTCTGCCGGTCGAGCGTGGCATGCCCAAAGATGTAAAGCCGGCGCCGGACTTCGGTGCGCCGATTCCGGGTCAGCCGCAAGCGATGGTCGATATGGCACAAGCACGCGGTATGCTCCACCGCCAAGATGCGAGCCTGGTTAGCATTCGTAGCTGGCCGGAGTTCATCGGTGAGACTTCAGGCTACAGCTATATCAAACCGAAAGGTGAAATCGCAGGCGCGCGCTGGGGTCACGCGGGCAGCGACGCTACCCATATGGAAGATTTCCATAACCCGGACGGTACGATGCGTTCTGCCGATGACATCGCCGCGATGTGGAAGACCTGGAACATTCTGCCGGAGCAGCACGTTGCTTTCTACTGCGGCACAGGTTGGCGTGCCTCGGAGACGTTTATGTATGCGAGAGCAATGGGTTGGAAGAACGTTGCGGTGTATGATGGGGGCTGGTATGAATGGTCTAGCCATCCGCAAAACCCGGTCTCCTCCGGTAAGCGCGGTCCGGAGAGCACCCGT-3’(SEQ ID NO.9)；
编码T348K突变的KsEanB突变体的核酸分子的核苷酸序列为：
5’-ATGAAAAGGGTATCACAATTAACAGCTCTAGCGATGCTGTGTGGTCTGGCG TCTTTTAGCAGTCTGGCGGCGGATATGCCGCACGCCATGACCCTGTCTCAGCTGCAAGCCCAGCACGGTGCAGTGATCGACACCCGTGCATCCGCATTTTATAACGGCTGGCCTCAGACCCTGAGCGCGCCGTCCGGCCATGAACCGGCGGCCCTCAACCTGTCGGCTAGCTGGCTGGGTGCCATGAGCGACGACCAGATCGCGGTGTGGGCTCGCCAGCACCAGTTGACCCCAGCGATGACCATTGCGCTGTACGGCCGTGACGCCGACAATCAGGCTGTCAAAACTCGTTTGGAAAAAGCGGGTTATCATCAGATCAGCGTTCTGAATGATGCGTTGCAAGTTCCGGAGCGTTTGCAACGTCTGCCTCACTTTGAACAATTGGTTTACCCGGAGTGGATTCATCGTTTACAGCAGGGTAAACCGGTGACCGCGGCTCCGACGGGTGATTGGAAGGTGATCGAAGCAGCGTGGGGTGCGCCAAAGTTCTACCTGCTGAATCATATTCCGGGTGCTGGCTACATCGACACGAACGAAGTTGAATCCGAGCCCCTGTGGAATAAAGTGAGCGACGACACCTTAAAAGCAATGTTGGCAAAACACGGCATCCGTCACGATACCACCGTTATCCTGTACGGCCGAGATGTGTATGCAGCTGCTCGCGTGGCCCAAATTATGTTGTACGCGGGAGTTAAGGACGTGCGTATTCTTGATGGCGGTTGGAAGGCGTGGTCCGACGCCGGTCTGCCGGTCGAGCGTGGCATGCCCAAAGATGTAAAGCCGGCGCCGGACTTCGGTGCGCCGATTCCGGGTCAGCCGCAACTGATGGTCGATATGGCACAAGCACGCGGTATGCTCCACCGCCAAGATGCGAGCCTGGTTAGCATTCGTAGCTGGCCGGAGTTCATCGGTGAGACTTCAGGCTACAGCTATATCAAACCGAAAGGTGAAATCGCAGGCGCGCGCTGGGGTCACGCGGGCAGCGACGCTAAGCATATGGAAGATTTCCATAACCCGGACGGTACGATGCGTTCTGCCGATGACATCGCCGCGATGTGGAAGACCTGGAACATTCTGCCGGAGCAGCACGTTGCTTTCTACTGCGGCACAGGTTGGCGTGCCTCGGAGACGTTTATGTATGCGAGAGCAATGGGTTGGAAGAACGTTGCGGTGTATGATGGGGGCTGGTATGAATGGTCTAGCCATCCGCAAAACCCGGTCTCCTCCGGTAAGCGCGGTCCGGAGAGCACCCGT-3’(SEQ ID NO.10)；
编码V86S/L292A突变的KsEanB突变体的核酸分子的核苷酸序列为：
5’-ATGAAAAGGGTATCACAATTAACAGCTCTAGCGATGCTGTGTGGTCTGGCG TCTTTTAGCAGTCTGGCGGCGGATATGCCGCACGCCATGACCCTGTCTCAGCTGCAAGCCCAGCACGGTGCAGTGATCGACACCCGTGCATCCGCATTTTATAACGGCTGGCCTCAGACCCTGAGCGCGCCGTCCGGCCATGAACCGGCGGCCCTCAACCTGTCGGCTAGCTGGCTGGGTGCCATGAGCGACGACCAGATCGCGTCGTGGGCTCGCCAGCACCAGTTGACCCCAGCGATGACCATTGCGCTGTACGGCCGTGACGCCGACAATCAGGCTGTCAAAACTCGTTTGGAAAAAGCGGGTTATCATCAGATCAGCGTTCTGAATGATGCGTTGCAAGTTCCGGAGCGTTTGCAACGTCTGCCTCACTTTGAACAATTGGTTTACCCGGAGTGGATTCATCGTTTACAGCAGGGTAAACCGGTGACCGCGGCTCCGACGGGTGATTGGAAGGTGATCGAAGCAGCGTGGGGTGCGCCAAAGTTCTACCTGCTGAATCATATTCCGGGTGCTGGCTACATCGACACGAACGAAGTTGAATCCGAGCCCCTGTGGAATAAAGTGAGCGACGACACCTTAAAAGCAATGTTGGCAAAACACGGCATCCGTCACGATACCACCGTTATCCTGTACGGCCGAGATGTGTATGCAGCTGCTCGCGTGGCCCAAATTATGTTGTACGCGGGAGTTAAGGACGTGCGTATTCTTGATGGCGGTTGGAAGGCGTGGTCCGACGCCGGTCTGCCGGTCGAGCGTGGCATGCCCAAAGATGTAAAGCCGGCGCCGGACTTCGGTGCGCCGATTCCGGGTCAGCCGCAAGCGATGGTCGATATGGCACAAGCACGCGGTATGCTCCACCGCCAAGATGCGAGCCTGGTTAGCATTCGTAGCTGGCCGGAGTTCATCGGTGAGACTTCAGGCTACAGCTATATCAAACCGAAAGGTGAAATCGCAGGCGCGCGCTGGGGTCACGCGGGCAGCGACGCTACCCATATGGAAGATTTCCATAACCCGGACGGTACGATGCGTTCTGCCGATGACATCGCCGCGATGTGGAAGACCTGGAACATTCTGCCGGAGCAGCACGTTGCTTTCTACTGCGGCACAGGTTGGCGTGCCTCGGAGACGTTTATGTATGCGAGAGCAATGGGTTGGAAGAACGTTGCGGTGTATGATGGGGGCTGGTATGAATGGTCTAGCCATCCGCAAAACCCGGTCTCCTCCGGTAAGCGCGGTCCGGAGAGCACCCGT-3’(SEQ ID NO.11)；
编码V86S/L292A/T348K突变的KsEanB突变体的核酸分子的核苷酸序列为：
5’-ATGAAAAGGGTATCACAATTAACAGCTCTAGCGATGCTGTGTGGTCTGGCG TCTTTTAGCAGTCTGGCGGCGGATATGCCGCACGCCATGACCCTGTCTCAGCTGCAAGCCCAGCACGGTGCAGTGATCGACACCCGTGCATCCGCATTTTATAACGGCTGGCCTCAGACCCTGAGCGCGCCGTCCGGCCATGAACCGGCGGCCCTCAACCTGTCGGCTAGCTGGCTGGGTGCCATGAGCGACGACCAGATCGCGTCGTGGGCTCGCCAGCACCAGTTGACCCCAGCGATGACCATTGCGCTGTACGGCCGTGACGCCGACAATCAGGCTGTCAAAACTCGTTTGGAAAAAGCGGGTTATCATCAGATCAGCGTTCTGAATGATGCGTTGCAAGTTCCGGAGCGTTTGCAACGTCTGCCTCACTTTGAACAATTGGTTTACCCGGAGTGGATTCATCGTTTACAGCAGGGTAAACCGGTGACCGCGGCTCCGACGGGTGATTGGAAGGTGATCGAAGCAGCGTGGGGTGCGCCAAAGTTCTACCTGCTGAATCATATTCCGGGTGCTGGCTACATCGACACGAACGAAGTTGAATCCGAGCCCCTGTGGAATAAAGTGAGCGACGACACCTTAAAAGCAATGTTGGCAAAACACGGCATCCGTCACGATACCACCGTTATCCTGTACGGCCGAGATGTGTATGCAGCTGCTCGCGTGGCCCAAATTATGTTGTACGCGGGAGTTAAGGACGTGCGTATTCTTGATGGCGGTTGGAAGGCGTGGTCCGACGCCGGTCTGCCGGTCGAGCGTGGCATGCCCAAAGATGTAAAGCCGGCGCCGGACTTCGGTGCGCCGATTCCGGGTCAGCCGCAAGCGATGGTCGATATGGCACAAGCACGCGGTATGCTCCACCGCCAAGATGCGAGCCTGGTTAGCATTCGTAGCTGGCCGGAGTTCATCGGTGAGACTTCAGGCTACAGCTATATCAAACCGAAAGGTGAAATCGCAGGCGCGCGCTGGGGTCACGCGGGCAGCGACGCTAAGCATATGGAAGATTTCCATAACCCGGACGGTACGATGCGTTCTGCCGATGACATCGCCGCGATGTGGAAGACCTGGAACATTCTGCCGGAGCAGCACGTTGCTTTCTACTGCGGCACAGGTTGGCGTGCCTCGGAGACGTTTATGTATGCGAGAGCAATGGGTTGGAAGAACGTTGCGGTGTATGATGGGGGCTGGTATGAATGGTCTAGCCATCCGCAAAACCCGGTCTCCTCCGGTAAGCGCGGTCCGGAGAGCACCCGT-3’(SEQ ID NO.12)。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子序列为SEQ ID NO.8-12所示的序列；或者核酸分子的序列为与SEQ ID NO.8-12具有90％以上同源性的序列。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子的序列为SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12所示的其中一种序列。
在本发明的一些实施方式中，所述定点突变中所使用的引物序列如SEQ IDNO.13-18所示。
本发明的第三个方面，提供一种重组载体，所述重组载体含有第二个方面所述的核酸分子。
在本发明的一些实施方式中，所述重组载体为质粒载体。
在本发明的一些实施方式中，所述质粒载体包括双链或单链线状或环状形式的任何质粒、粘粒、噬菌体或农杆菌二元核酸分子，也可以是原核表达质粒，也可以是真核表达质粒；所述质粒可选自pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-14b(+)、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-28a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31a(+)、pET-32a(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-l、pGEX-6p-l、pGEX-6p-2、pBV220、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pBR322、pUC-18或pUC-19。
在本发明的一些实施方式中，为了在枯草芽孢杆菌中表达，所述载体也可以选自pWB980、pHT43、pBE2、pMUTIN4、pUB110、pE194、pMA5、pMK3、pMK4、pHT304、pHY300PLK、pBest502、pDG1363、pSG1154、pAX01、pSAS144、pDL、pDG148-stu、pDG641、pUCX05-bgaB、pHT01或pC194。
在本发明的一些实施方式中，所述重组质粒中的核酸分子置于重组质粒的适当位置，使得本发明第二个方面所述的核酸分子能够正确地、顺利地复制、转录或表达。
在本发明的一些具体实施方式中，所述载体为pET-28a(+)和pMA5。
本发明的第四个方面，提供一种重组宿主细胞，含有第二个方面所述的核酸分子和/或第三个方面所述的重组载体。
在本发明的一些实施方式中，所述重组宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述重组宿主细胞为大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。
在本发明的一些实施方式中，所述大肠杆菌宿主细胞选自DH5α、Rosetta或BL21(DE3)，枯草芽孢杆菌宿主细胞选自WB600、WB800、WB700或WB800N。
本发明的第五个方面，提供一种产品，所述产品包括本发明第一个方面所述的氧化硫化酶的突变体。
本发明的第六个方面，提供一种生产本发明第一个方面所述氧化硫化酶的突变体的方法，所述方法的步骤包括：培养本发明第四个方面所述的重组宿主细胞后，回收所述氧化硫化酶突变体。
在本发明的一些实施方式中，所述生产氧化硫化酶的突变体的方法包括：以具有氧化硫化酶活性的基因作为模板，设计核苷酸引物并扩增获得该氧化硫化酶的突变体，将所获得的氧化硫化酶的突变体的基因插入到重组载体当中，再将所述重组载体转化到重组宿主细胞中，培养转化成功的重组宿主细胞，回收重组宿主细胞分泌的氧化硫化酶突变体和/或提取细胞内的氧化硫化酶突变体。
在本发明的一些实施方式中，所述生产氧化硫化酶突变体的方法的具体步骤为：
(1)以来源于克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)的具有氧化硫化酶活性的基因作为模板，其中，克雷伯氏菌属的具有氧化硫化酶活性的基因的GeneBank登录号为：MCL6720960.1，设计核苷酸引物(引物核苷酸序列如SEQ ID NO.13-18所示)，通过本领域常规PCR方法扩增获得该氧化硫化酶突变体；
(2)将所获得的氧化硫化酶突变体基因插入到适合的表达质粒中，从而产生含有氧化硫化酶突变体基因的重组质粒，并且将所述重组质粒转化到宿主细胞中；
(3)将上述转化的宿主细胞进行摇瓶培养，或者在实验室或工业发酵罐中通过发酵培养来制得的宿主细胞；
(4)根据氧化硫化酶突变体的分泌情况回收酶：如果氧化硫化酶突变体分泌到该营养培养基中，那么可直接从培养基中回收酶；如果氧化硫化酶突变体不被分泌到该营养培养基中，则将所培养得到宿主细胞制得成细胞裂解液，从细胞裂解液中进行回收。
在本发明的一些实施方式中，所述发酵方式为本领域常用的连续发酵、分批发酵和补料分批发酵中的其中一种。
在本发明的一些实施方式中，所述培养是使用本领域中的常用操作，并在本领域中常用的营养培养基中发生，所述营养培养基包含碳源、氮源和无机盐。
在本发明的一些实施方式中，所述氧化硫化酶突变体可以使用本领域己知的方法回收，从所述营养培养基中回收氧化硫化酶突变体。
本发明的第七个方面，提供本发明第一个方面所述的氧化硫化酶的突变体或第四个方面重组宿主细胞在生产麦角硫因中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述应用中生产麦角硫因的反应体系pH值为9.0-11.0。
在本发明的一些实施方式中，所述应用中生产麦角硫因的氧化硫化酶突变体可利用底物浓度为1-2％(w/v)的N-(α)-三甲基组氨酸(TMH)作为底物，在温度为30-40℃的条件下进行催化生产麦角硫因。
本发明的有益效果为：
(1)本发明首次发现将来源于克雷伯氏菌属的氧化硫化酶KsEanB经过定点突变改造后，提高了其耐碱性及催化活性，由于麦角硫因在强碱溶液中不会自身氧化，稳定性强，故碱性条件下制备麦角硫因的效率也显著提高。
(2)本发明利用大肠杆菌表达该氧化硫化酶突变体V86S/L292A/T348K，以N-(α)-三甲基组氨酸等原料作为底物，在不需要氧气参与下，该氧化硫化酶突变体V86S/L292A/T348K催化ε位的C形成C-S键，能够一步合成麦角硫因。
(3)本发明所制得的氧化硫化酶突变体具有高转化效率，仅需16h底物转化率已经达到33.6％。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明实施例中氧化硫化酶在枯草芽孢杆菌中的表达图，其中M泳道为蛋白质分子量标准Marker；1号泳道为B.subtilis/pMA5；2号泳道为B.subtilis/pMA5-V86S；3号泳道为B.subtilis/pMA5-V86S/L292A；4号泳道为B.subtilis/pMA5-V86S/L292A/T348K；
图2为本发明实施例中突变体酶V86S/L292A/T348K的最适反应pH曲线；
图3为本发明实施例中突变体酶V86S/L292A/T348K的最适反应温度曲线；
图4为本发明实施例中野生型KsEanB与突变体V86S/L292A/T348K的pH耐受性曲线；
图5为本发明实施例中野生型KsEanB及突变体酶V86S/L292A/T348K催化N-(α)-三甲基组氨酸制备麦角硫因的转化率曲线。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
在以下实施例中，麦角硫因液相检测的设置条件为：色谱柱：Kromasil 100-5-NH2柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-5mM醋酸铵(80:20)；流速：1.0mL/min；检测波长：254nm；柱温：30℃；进样量：20μL。
实施例1
本实施例制备了可用于生产麦角硫因的KsEanB酶突变体，具体过程为：
1.克隆表达野生型KsEanB酶基因
本实施例的野生型氧化硫化酶基因是通过通用生物(安徽)股份有限公司商业合成获得的，来源于克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)的氧化硫化酶的基因(GeneBank登录号为：MCL6720960.1)，经密码子优化后，通过利用限制性内切酶Nde I和BamH I，将获得的野生型KsEanB酶基因插入到表达质粒pET-28a(+)中，从而产生重组质粒pET-28a-KsEanB；再通过本领域常规转化方法，将该重组质粒转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中。将转化得到的含有野生型KsEanB基因的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-KsEanB保存在-80℃的超低温冰箱中。
2.以野生型KsEanB氨基酸序列为模板进行定点突变
以上述所制得的含有重组质粒pET-28a-KsEanB的重组大肠杆菌的野生型KsEanB氨基酸序列(如SEQ ID NO.1所示)为模板，设计突变引物，分别将KsEanB第86位缬氨酸突变为丝氨酸，将第292位亮氨酸突变为丙氨酸，将第348位苏氨酸突变为赖氨酸；得到了3种包含不同突变位点的KsEanB酶突变体的重组表达菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-V86S、E.coli BL21(DE3)/pET-28a-L292A、E.coli BL21(DE3)/pET-28a-T348K。
引入V86S突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-ACGACCAGATCGCGTCGTGGGCTCGCCAGCACCA-3’(SEQ ID NO.13)；
反向引物：5’-ACGACGCGATCTGGTCGTCGCTCATGGCACCCA-3’(SEQ ID NO.14)；
引入L292A突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-GCAAGCGATGGTCGATATGGCACAAGCACGCGG-3’(SEQ ID NO.15)；
反向引物：5’-ATATCGACCATCGCTTGCGGCTGACCCGGAATC-3’(SEQ ID NO.16)；
引入T348K突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-CGACGCTAAGCATATGGAAGATTTCCATAACCCG-3’(SEQ ID NO.17)；
反向引物：5’-TCCATATGCTTAGCGTCGCTGCCCGCGTGACCC-3’(SEQ ID NO.18)。
单定点突变：以pET-28a-KsEanB重组质粒为模板，利用Vazyme 2×phanta mastermix(来源于南京诺唯赞生物科技股份有限公司)进行全质粒扩增，按照表1设置反应体系。
表1定点突变体系
| 名称 | 体积(μL) |
| Vazyme 2×phanta master mix | 12.5 |
| pET-28a-KsEanB模板 | 1 |
| 正向引物(10μM) | 1 |
| 反向引物(10μM) | 1 |
| ddH2O | 补充至25 |
PCR程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸5min，反应30个循环后，再72℃延伸10min，最后4℃保温。PCR反应结束后，加入1μL DpnI消化酶，37℃反应2h消化模板，回收纯化后的PCR产物转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。
转化方法：取上述10μL PCR产物与100μL的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞(来源于南京诺唯赞生物科技股份有限公司)混匀冰浴20min后，42℃热激90s后迅速拿出，冰浴2min，加入400μL的LB液体培养基，其中液体LB培养基中含有蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母提取物5g/L，在摇床上37℃恒温复苏50min，转速为200rpm，取100μL菌液涂布于含有50μg/mL卡那霉素的固体LB平板上，37℃恒温箱过夜培养。次日，从平板中挑选重组大肠杆菌BL21三株，将上述重组菌从平板分别接种到装有5mL含有50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基的50mL的摇管中，在摇床上37℃恒温培养12h，转速为200rpm。培养结束后按照从南京诺唯赞生物科技股份有限公司购买的质粒抽提试剂盒FastPure EndoFree PlasmidMini Kit中提供的方法进行抽提质粒，送至通用生物(安徽)股份有限公司进行测序。最后将测序结果与野生型酶蛋白核酸序列进行比对，确定突变是否成功。
双点及多点突变：
(1)双点突变：经过验证比对，确认上述操作步骤中单点突变正确后，参考上述突变的操作步骤，并将原来使用的重组质粒pET-28a-KsEanB模板更换为pET-28a-V86S，引入L292A突变的定点突变引物，其他操作步骤相同，即可得到双点的突变质粒pET-28a-V86S/L292A。
(2)多点突变：验证比对上述双点突变，确认突变正确后，将pET-28a-V86S模板更换为pET-28a-V86S/L292A，引入T348K突变的定点突变引物，其他操作步骤相同，即可得到多点的突变质粒pET-28a-V86S/L292A/T348K。
将制得的双点和多点的突变质粒进一步参照上述转化方法转化后，即可制备得到另外2种分别包含双点和多点突变的KsEanB酶突变体的重组表达菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-V86S/L292A、E.coli BL21(DE3)/pET-28a-V86S/L292A/T348K。
3.KsEanB酶在枯草芽孢杆菌中的表达
将上述重组质粒pET-28a-KsEanB、pET-28a-V86S、pET-28a-L292A、pET-28a-T348K、pET-28a-V86S/L292A、pET-28a-V86S/L292A/T348K和质粒pMA5分别用Nde I和BamHI双酶切后，回收野生型KsEanB序列、KsEanB突变序列和酶切后的线性化质粒pMA5，回收得到的序列分别与线性化质粒pMA5连接，该连接操作中使用来源于南京诺唯赞生物科技股份有限公司的同源重组试剂盒进行连接；同源重组体系如表2所示，该体系中的线性化载体pMA5的体积V1和目的基因片段的体积V2通过公式计算得到，分别为：
线性化载体pMA5的体积V1计算公式：
在上式中，V1代表线性化载体pMA5体积，单位为μL；
base代表载体长度，单位为bp；
c代表线性化载体pMA5核酸浓度，单位为ng/μL；
目的基因片段的体积V2计算公式：
在上式中，V2代表目的基因片段体积，单位为μL；
base代表目的基因片段长度，单位为bp；
c代表目的基因片段核酸浓度，单位为ng/μL。
表2同源重组连接体系
| 名称 | 体积(μL) |
| 5×CE Buffer | 2 |
| Exnase II | 1 |
| 线性化载体pMA5 | V1 |
| 目的基因片段 | V2 |
| ddH2O | 补充至10 |
将上述同源重组体系置于37℃条件下，连接60min后得到重组质粒pMA5-KsEanB、pMA5-V86S、pMA5-L292A、pMA5-T348K、pMA5-V86S/L292A、pMA5-V86S/L292A/T348K。
将重组质粒分别转入枯草芽孢杆菌WB600，经卡那霉素抗性筛选得到可以分别表达含野生型KsEanB酶和含突变体KsEanB酶的重组菌B.subtilis/pMA5-KsEanB、B.subtilis/pMA5-V86S、B.subtilis/pMA5-L292A、B.subtilis/pMA5-T348K、B.subtilis/pMA5-V86S/L292A和B.subtilis/pMA5-V86S/L292A/T348K。
由于pMA5质粒中，多克隆位点上游的HpaII启动子是一种组成型强启动子，无需诱导即可启动外源基因的高效转录。
将上述重组菌从平板分别接种到装有5mL液体LB培养基的50mL的摇管中，加入终浓度50μg/mL的卡那霉素，在摇床上37℃恒温培养12h，转速200rpm。再分别取2mL培养液接种至含有50μg/mL卡那霉素的100mL液体LB培养基中，在摇床上37℃发酵培养24h，转速设定200rpm。培养结束后，提取发酵培养后包含粗酶的上清液，置于4℃低温离心8000rpm，6min后，舍去含有菌体的沉淀物，得上清液。
将上清液取样进行SDS-PAGE电泳，结果如图1所示，其中四株重组菌B.subtilis/pMA5-KsEanB、B.subtilis/pMA5-V86S、B.subtilis/pMA5-V86S/L292A和B.subtilis/pMA5-V86S/L292A/T348K均可以检测到一条分子量约49kDa的特异性条带；检测结果与预测的目标蛋白大小一致，说明野生型KsEanB和各突变体酶均可以在枯草芽孢杆菌WB600中正确表达。然后，将其余上清液用质量分数为50％的硫酸铵溶液进行沉淀，再用10mL 50mM的磷酸纳缓冲液(pH为7.5)溶解沉淀蛋白，作为胞外酶液，于4℃冰箱保存待后续实施例中使用。
KsEanB酶突变体的酶活力评估
本实施例为测试验证实验，测定KsEanB酶突变体的酶活力，具体步骤为：
筛选可用于生产高浓度麦角硫因的KsEanB酶突变体，设置反应条件均为：取上述实施例1中制得的野生型KsEanB和各突变体酶相应的胞外酶液各160μL，加入160μL底物反应液作为底物原料，在30℃恒温水浴锅中反应2h，90℃热处理10min终止反应，然后12000rpm离心5分钟，取上清液用高效液相色谱法(HPLC)进行检测，计算KsEanB酶活力。其中，将野生型KsEanB的酶活力作为对照，设置为100％。
在本实施例以及后续实施例中，所使用的底物反应液为：pH为9，其含有50mM甘氨酸-NaOH缓冲液、50mM硫代硫酸钠、200mM氧化钠和1mM N-(α)-三甲基组氨酸(TMH)。
酶活力定义：在pH为9、30℃条件下，每分钟催化TMH产生1微摩尔麦角硫因所需要的酶量定义为1个酶活力单位U。
野生型及突变体KsEanB酶活测定的比较结果如表3所示。
表3野生型KsEanB酶与KsEanB酶突变体的相对酶活力
| 酶 | 相对酶活力(％) |
| 野生型KsEanB | 100 |
| V86S | 245 |
| L292A | 190 |
| T348K | 96 |
| V86S/L292A | 344 |
| V86S/L292A/T348K | 360 |
可以发现突变体V86S、V86S/L292A、V86S/L292A/T348K的酶活力相对野生型分别提高了2.4、3.4、3.6倍，即本发明实施例中的KsEanB酶突变体V86S、V86S/L292A、V86S/L292A/T348K的酶活力都获得了明显的提升。
KsEanB酶突变体在不同pH和温度下的酶活力评估
本实施例为测试验证实验，为了研究不同pH和温度对活性最高的突变体V86S/L292A/T348K酶活性的影响，按照上述酶活力评估中的酶活测定方法，比较了在不同温度和pH下的酶活力，具体步骤为：
(1)不同pH下突变体V86S/L292A/T348K酶的酶活力测试：分别使用50mM Tris-HCl(pH为7.5～9.0)的缓冲溶液和50mM甘氨酸-NaOH(pH为9.0～11.0)的缓冲溶液，将突变体V86S/L292A/T348K酶处于不同pH环境下反应，观察表现出最大酶活力的pH，结果如图2所示。
(2)不同温度下突变体V86S/L292A/T348K酶的酶活力测试：在pH为9、50mM甘氨酸-NaOH缓冲溶液中，温度范围25-45℃中反应2h，观察表现出最大酶活力的温度，结果如图3所示。
如图2-3结果显示，该突变体酶V86S/L292A/T348K的最佳酶活力的pH为10.0，温度为40℃。
KsEanB酶突变体的pH耐受性评估
本实施例为测试验证实验，用于探究野生型KsEanB与突变体V86S/L292A/T348K的pH耐受性，具体步骤为：
以实施例1所制得的突变体V86S/L292A/T348K的胞外酶液为反应样品，以野生型KsEanB为对照样品，以两种氧化硫化酶不作处理的酶活力为100％基准，将两个样品分别在pH为10.0的条件下进行30℃保温处理，每隔1h取样，在温度30℃、缓冲液pH为9.0的条件下，按照上述酶活力评估中的酶活测定方法，计算剩余酶活。
结果如图4所示，可以看出，在10h后，本发明突变体V86S/L292A/T348K相对活性仍存留在80％以上，与野生型KsEanB酶相比，突变体V86S/L292A/T348K的耐碱性有明显提高，说明本发明突变体V86S/L292A/T348K具有良好的耐碱性，而且麦角硫因主要以硫酮的形式存在，在生理pH或者强碱溶液中不会自身氧化，在碱性条件下更适宜生产保存。
上述结果表明，与突变前相比，突变后的氧化硫化酶提高了其耐碱性，更适合在碱性条件下的麦角硫因生产中应用。由于最佳pH只是酶在短时间内的活力最高的pH，也是酶可以耐受的极限pH，一旦在这个pH下更长时间反应，酶会出现失活的现象，所以要研究长时间的耐受性，需要降低pH，耐受性和高活性这二者不可以兼得，所以在该KsEanB酶突变体的酶活力测试中，在接近最高活性的pH9.0下研究耐受性更合适。KsEanB酶突变体的催化效果评估
本实施例为测试验证实验，用于野生型KsEanB和氧化硫化酶突变体V86S/L292A/T348K催化底物TMH的转化率比较的区别，具体步骤为：
设置500mL的pH为10.0、50mM的磷酸钠缓冲溶液作为反应体系，底物TMH的浓度为20g/L，加酶量为12000U/g底物，反应温度40℃恒温水浴摇床，转速为200rpm。
反应20h后，取样后参考测试例1所述方法处理后，以90℃热处理反应液10min终止反应，12000rpm离心5分钟，取上清液用HPLC进行检测，测定麦角硫因生成量并计算底物转化率。
底物转化率的计算公式为：
结果如图5所示，可以看出，野生型KsEanB催化底物TMH的转化率在20h内仅达到21.4％，而氧化硫化酶突变体V86S/L292A/T348K在16h内已经达到平衡33.6％，可以发现该突变体的转化效率明显提升。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (8)
1.一种氧化硫化酶的突变体，其特征在于，所述氧化硫化酶的突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示的其中一种氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述氧化硫化酶的突变体的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列为SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的序列。
3.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包括如权利要求2所述的核酸分子。
4.一种重组宿主细胞，其特征在于，含有权利要求2所述的核酸分子和/或权利要求3所述的重组载体。
5.一种产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1所述的氧化硫化酶的突变体；所述产品为用于制备麦角硫因的产品。
6.一种生产权利要求1所述氧化硫化酶的突变体的方法，其特征在于，所述方法包括：以权利要求1中所述氧化硫化酶的突变体的基因作为模板，设计核苷酸引物并扩增获得氧化硫化酶的突变体的基因，将所获得的氧化硫化酶的突变体的基因插入到重组载体当中，再将所述重组载体转化到重组宿主细胞中，培养转化成功的重组宿主细胞，回收重组宿主细胞分泌的氧化硫化酶突变体和/或提取细胞内的氧化硫化酶突变体。
7.权利要求1所述的氧化硫化酶的突变体或权利要求4所述的重组宿主细胞在生产麦角硫因中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用中生产麦角硫因的反应体系pH值为9.0-11.0。
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