CN116478974B - 一种谷氨酸脱羧酶及其基因和应用 - Google Patents
一种谷氨酸脱羧酶及其基因和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种谷氨酸脱羧酶及其基因和应用，谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列为SEQ ID No.4，为一种谷氨酸脱羧酶突变体。谷氨酸脱羧酶突变体的最适反应温度为55℃，最适反应pH为pH 5.0，T50 15为59.1℃，60℃条件下的半衰期t1/2为25.6分钟，对底物L‑谷氨酸的米氏常数为26.80mM，催化效率为2.14s‑1mM‑1；具有良好的热稳定性、底物亲和力和催化活性。
Description
技术领域
本发明涉及酶工程技术领域，具体涉及一种谷氨酸脱羧酶及其基因和应用。
背景技术
γ-氨基丁酸(GABA)是一种非蛋白天然氨基酸，具有降血压、利尿、改善睡眠、抗抑郁等多种重要的生理功能，在医药、食品及化妆品等领域应用前景广阔。生物法合成GABA不受资源、环境和空间等限制，是研究的一个主要方向。谷氨酸脱羧酶(glutamic aciddecarboxylase,GAD；EC 4.1.1.15)是生物法合成GABA的关键限速酶，其能够专一、不可逆地催化L-谷氨酸(或L-谷氨酸盐)脱去α-羧基生成GABA并释放出CO2。获取具有良好催化性能的谷氨酸脱羧酶是实现生物法高效合成GABA的重要前提。
目前，来源于乳酸乳球菌、嗜热链球菌、屎肠球菌、植物乳杆菌、短促生乳杆菌、清酒乳杆菌、保加利亚乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、布氏乳杆菌、大肠杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌、巨大芽孢杆菌、米曲霉、绿色木霉及少孢根霉等不同微生物染色体上的GAD基因已被克隆和异源表达，但随后的酶学性质研究显示，天然的GAD普遍存在热稳定性差和催化活性低的缺陷。为此，包括国内外研究者通过拉氏图信息、脯氨酸效应、蛋白质表面电荷优化、结构域增减、序列一致性等方法在一定程度上提升了GAD的催化性能，但生物法合成GABA在工业应用中，仍受到谷氨酸脱羧酶热稳定性差、以及活性与热稳定性不兼容等问题的制约。
近年来，来源于大肠杆菌(PDB IDs.1XEY,3FZ6,3FZ7,3FZ8,2DGK,1PMO)与短促生乳杆菌(原短乳杆菌，PDB ID.5GP4)的微生物源GAD晶体结构模型先后被解析，这为GAD的“结构-功能”关系提供了重要的信息。如何在提升谷氨酸脱羧酶热稳定性的同时、强化其对底物的亲和力并进一步提高其催化活性，具有重要的研究意义和价值。
发明内容
针对现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种谷氨酸脱羧酶及其基因和应用，具有良好的热稳定性、底物亲和力和催化活性。
本发明公开了一种谷氨酸脱羧酶，所述谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列为SEQ IDNo.4。
优选的，氨基酸序列的获取方法包括：
获取短促生乳杆菌谷氨酸脱羧酶的野生型氨基酸序列；
固定野生型氨基酸序列的多个位点；
基于祖先酶序列重建方法，构建所述野生型氨基酸序列的祖先酶进化树；
根据所述祖先酶进行树，获得所述谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列。
优选的，所述位点包括以下氨基酸位点的组合：
F65,K89,C130,G164,Q166,W169,I178,M185,I211,T215,D246,A248,T254,L267,H278,K279和P285。
优选的，谷氨酸脱羧酶的制备方法包括：根据所述氨基酸序列，获得相应的基因序列；合成并扩增所述基因序列；根据所述基因序列以及表达载体，构建重组质粒；根据所述重组质粒以及宿主，构建工程菌或工程细胞；利用工程菌或工程细胞表达重组蛋白；从表达重组蛋白的工程菌或工程细胞中分离纯化谷氨酸脱羧酶。
优选的，构建工程菌的方法包括：
设计第一引物对和第二引物对，其中第一引物对为：gadB1413-F1和gadB1413-R1，第二引物对为gadB1413-F2和gadB1413-R2；
分别以第一引物对和第二引物对，扩增所述基因序列，获得第一序列和第二序列；
利用限制性内切酶Nde I和Sal I分别处理载体pET28a和纯化后的第一序列，获得双酶切pET28a和双酶切第一序列；通过T4-DNA连接酶，连接所述双酶切pET28a和双酶切第一序列，获得第一质粒；将所述第一质粒导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，获得第一工程菌；
利用限制性内切酶Nco I和Kpn I分别处理载体pNZ8149和纯化后的第二序列，获得双酶切pNZ8149和双酶切第二序列；通过T4-DNA连接酶，连接所述双酶切pNZ8149和双酶切第二序列，获得第二质粒；将所述第二质粒导入L.lactis NZ3900感受态细胞中，获得第二工程菌。
优选的，所述谷氨酸脱羧酶的最适反应温度为55℃，最适反应pH为pH5.0，T50 15为59.1℃，60℃条件下的半衰期t1/2为25.6分钟，对底物L-谷氨酸的米氏常数为26.80mM，催化效率为2.14s-1mM-1。
本发明还提供上述谷氨酸脱羧酶的基因序列。优选的，所述基因为SEQ IDNo.2。
本发明还提供一种上述谷氨酸脱羧酶的应用，用于催化L-谷氨酸或L-谷氨酸盐脱去α-羧基生成γ-氨基丁酸。
优选的，基于谷氨酸脱羧酶突的氨基酸序列构建的工程菌经诱导表达后，用于催化L-谷氨酸或L-谷氨酸盐脱去α-羧基生成γ-氨基丁酸。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：具有良好的热稳定性、底物亲和力和催化活性。
附图说明
图1是野生型谷氨酸脱羧酶与谷氨酸脱羧酶突变体的一致性分析图；
图2是重组载体的示意图和双酶切琼脂糖凝胶电泳图；
图3是突变体可溶性表达的电流图；
图4是突变体催化的最初反应速率图；
图5是不同温度下的催化活性分析图；
图6是不同pH的催化活性分析图；
图7是不同温度条件下孵育15min后相对活性的分析图(T50 15)；
图8是在60℃条件下孵育不同时间后的相对活性分析图(t1/2)；
图9是游离工程菌的催化性能分析图；
图10本发明的谷氨酸脱羧酶的制备方法流程图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面结合附图对本发明做进一步的详细描述：
一种谷氨酸脱羧酶，其氨基酸序列为SEQ ID No.4，为一种谷氨酸脱羧酶突变体。
在具体的检测中，谷氨酸脱羧酶突变体的最适反应温度为55℃，最适反应pH为pH5.0，T50 15为59.1℃，60℃条件下的半衰期t1/2为25.6分钟，对底物L-谷氨酸的米氏常数为26.80mM，催化效率为2.14s-1mM-1；具有良好的热稳定性、底物亲和力和催化活性。
如图10所示，谷氨酸脱羧酶的制备方法包括：
步骤S1：设计谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列。具体的，获取短促生乳杆菌谷氨酸脱羧酶的野生型氨基酸序列；固定野生型氨基酸序列的多个位点；基于祖先酶序列重建方法，构建所述野生型氨基酸序列的祖先酶进化树；根据所述祖先酶进行树，获得所述谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列。
步骤S2：合成并扩增所述基因序列。
步骤S3：根据所述基因序列、及其表达载体，构建重组质粒。
步骤S4：根据所述重组质粒、及其宿主，构建工程菌或工程细胞。
步骤S5：利用工程菌或工程细胞表达重组蛋白；
步骤S6：从表达重组蛋白的工程菌或工程细胞中分离纯化谷氨酸脱羧酶。
其中，构建工程菌的方法包括：
设计第一引物对和第二引物对，其中第一引物对为：gadB1413-F1和gadB1413-R1，第二引物对为gadB1413-F2和gadB1413-R2；
分别以第一引物对和第二引物对，扩增所述基因序列，获得第一序列和第二序列；
利用限制性内切酶Nde I和Sal I分别处理载体pET28a和纯化后的第一序列，获得双酶切pET28a和双酶切第一序列；通过T4-DNA连接酶，连接所述双酶切pET28a和双酶切第一序列，获得第一质粒；将所述第一质粒导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，获得第一工程菌；
利用限制性内切酶Nco I和Kpn I分别处理载体pNZ8149和纯化后的第二序列，获得双酶切pNZ8149和双酶切第二序列；通过T4-DNA连接酶，连接所述双酶切pNZ8149和双酶切第二序列，获得第二质粒；将所述第二质粒导入L.lactis NZ3900感受态细胞中，获得第二工程菌。
实施例
谷氨酸脱羧酶突变体的设计
谷氨酸脱羧酶突变体的获得方法为：
以短促生乳杆菌(Levilactobacillus brevis)CGMCC No.1306的野生型谷氨酸脱羧酶(PDB ID:5GP4)为模板蛋白，在固定野生型谷氨酸脱羧酶氨基酸序列的多个位点情况下，利用数据库https://loschmidt.chemi.muni.cz/fireprotasr/构建GAD祖先酶进化树获取谷氨酸脱羧酶突变体氨基酸序列(SEQ ID No.4)。具体的，所固定的位点为：F65,K89,C130,G164,Q166,W169,I178,M185,I211,T215,D246,A248,T254,L267,H278,K279和P285；这些位点与谷氨酸脱羧酶的催化活性密切相关。为便于描述，下文中将野生型谷氨酸脱羧酶简写为野生型，谷氨酸脱羧酶突变体简称为突变体。
随后，以E.coli为目标表达宿主，通过http://www.jcat.de/优化并获取编码突变体的基因序列(SEQ ID No.2)，命名为gadB1413；并合成该基因序列。应当指出的是，合成突变体的基因序列可以有多种，不限于本申请所采用的基因序列。
SEQ ID No.1示出了野生型的基因序列(GAD1407，GeneBank ID:GU987102.1)；SEQID No.3为该基因序列所编码的蛋白(GAD，GeneBank ID:ADG02973.1)。突变体命名为GAD1413，其与野生型GAD1407的序列一致性为72.98％，如图1所示；图1中一致性聚类的空白表示其中一个序列在该位点缺失，*表示为位点相同，：表示为位点不同。
工程菌的构建
包括以下步骤：
步骤201：以化学合成的gadB1413基因为模板，设计引物gadB1413-F1(5’-GGAATTCCA TATGCTGTACGGTAAAAAAAACCGTG-3’)和gadB1413-R1(5’-ACGCGTCGACTTAGTGGGTGAAACCGTAGGTTT-3’)，以及gadB1413-F2(5’-CATGCCATGGGCCTGTACGGTAAAAAAAACCGTG-3’)和gadB1413-R2(5’-CGGGGTACCTTAGTGGGTGAAACCGTAGGTTT-3’)，PCR克隆获取两个目的基因片段。两个目的基因片段分别用于与质粒pET28a和pNZ8149连接。
步骤202：使用PCR产物纯化试剂盒，参照说明书纯化目的基因gadB1413。
步骤203：利用限制性内切酶Nde I和Sal I处理纯化后的gadB1413与载体pET28a；另外利用Nco I和Kpn I处理纯化后的gadB1413与载体pNZ8149，37℃酶切30min。
步骤204：分别采用琼脂糖凝胶电泳分离酶切后的基因片断与载体片段，切胶回收目的条带，并使用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒对上述基因片断和载体片段进行纯化；
步骤205：使用T4-DNA连接酶分别将纯化后的gadB1413和pET28a于25℃条件下连接15min，获得重组载体pET28a-gadB1413；另外使用T4-DNA连接酶将gadB1413与pNZ8149于25℃条件下连接15min，获得重组载体pNZ8149-gadB1413。
步骤206：利用“热击转化法”将构建好的重组载体pET28a-gadB1413导入E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，于含有50μg/mL卡纳霉素的LB固体平板中培养12h，菌落PCR初步筛选重组子，而后进行菌株扩培及质粒提取，并测序验证，获取正确的基因工程菌株，即为表达GAD1413的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-gadB1413。重组载体pET28a-gadB1413的示意图及酶切琼脂糖凝胶电泳图谱分别如图2A与2B所示，图2B和2D中，M表示为标准条带(marker)，1表示为重组载体的双酶切条带。
步骤207：采用“电击转化法”将建好的重组载体pNZ8149-gadB1413导入L.lactisNZ3900感受态细胞中，于Elliker固体平板中培养36h，菌落PCR初步筛选重组子，而后进行菌株扩培及质粒提取，并测序验证，获取正确的基因工程菌株，即为表达GAD1413的工程菌L.lactis NZ3900/pNZ8149-gadB1413。其中，Elliker培养基(g/L)的成份为：蛋白胨20，酵母粉5，氯化钠4，无水乙酸钠1.5，L-抗坏血酸0.5，灭菌后添加0.5％的乳糖(20％的母液)和0.004％的溴甲酚紫(0.4％的母液)。重组载体pNZ8149-gadB1413的示意图及酶切琼脂糖凝胶电泳图谱分别如图2C与2D所示所示。
谷氨酸脱羧酶的表达
将工程菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-gadB1413接种于5mL含有终浓度为50μg/mLKan的LB液体培养基中，37℃、220rpm培养12h。随后，以2％(V/V)接种量转接至200mL LB液体培养基中继续震荡培养。当菌液OD600值达到0.5-0.7时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，并于25℃、150rpm条件下诱导8h-12h，离心(8000×g，4℃，15min)收集菌体细胞，并采用无菌生理盐水离心洗涤2-3次。
谷氨酸脱羧酶的分离纯化及纯度分析
取经IPTG诱导后的E.coli BL21(DE3)/pET28a-gadB1413菌体细胞，采用10％培养体积的破胞缓冲液(0.1M PBS，pH 7.5)溶解细胞沉淀，随后置于冰水浴中进行超声破碎处理(输出功率：300w，超声3s，间隔6s，循环90次)。超声处理完毕后，离心获取上清液(13,000×g，10min，4℃)，即粗酶液；经0.45μm的微孔滤膜过滤后，采用镍离子亲和层析法(Ni-NTAAgarose)对GAD突变体进行分离纯化。
利用SDS-PAGE方法鉴定纯化后蛋白的纯度，其浓缩胶与分离胶分别为5％和12％。突变体GAD1413与野生型GAD1407在E.coli BL21(DE3)中可溶性表达及纯酶的SDS-PAGE分析如图3所示。其中，(M)蛋白Marker；(1)未诱导的E.coli BL21(DE3)/pET28a-gadB1413细胞破碎离心上清液；(2)IPTG诱导的E.coli BL21(DE3)/pET28a-gadB1413细胞破碎离心上清液；(3)未诱导的E.coli BL21(DE3)/pET28a-gadB1407细胞破碎离心上清液；(4)IPTG诱导的E.coli BL21(DE3)/pET28a-gadB1407细胞破碎离心上清液；(5)纯化后的GAD1413；(6)纯化后的GAD1407；箭头标出了目标条带。酶的浓度采用改良型Bradford蛋白浓度测定试剂盒进行测定。
谷氨酸脱羧酶的酶学性质分析
配置不同pH的底物溶液(0.2M醋酸-醋酸钠缓冲液，pH 3.6-5.6；0.1M磷酸钠缓冲液，pH 6.0-8.0；内含0.01mM PLP与100mM L-Glu)；取480μL底物溶液，向其加入20μL纯酶并于不同温度及pH条件下反应5min；利用0.2M NaHCO3溶液(pH 9.8)终止反应并采用RP-HPLC法测定反应生成的GABA含量。突变体GAD1413的动力学参数于含有不同底物浓度的反应体系中测定，反应温度与pH分别为55℃和pH 5.0。酶活(U)定义为每分钟生成1μmol GABA所需的酶量。
如图4所示，突变体GAD1413具备催化底物L-谷氨酸合成GABA的能力，且根据最初反应速率与底物浓度的关系，可获得该突变体的酶促反应动力学参数，如表1所示。其中，突变体GAD1413对底物L-Glu的Km值为26.80mM，表明其对底物的亲和力较野生型酶明显提升，且突变体GAD1413与野生型GAD1407的kcat/Km分别为2.14s-1mM-1和0.79s-1mM-1，表明该突变体催化效率为野生型的2.71倍。
表1
如图5所示，野生型GAD1407的最适反应温度为48℃；突变体GAD1413的最适反应温度为55℃，较野生型提升了7℃。如图6所示，野生型GAD1407的最适反应pH为pH 4.8；突变体GAD1413最适反应pH为pH 5.0，且在pH5.0-6.0时相对活性高于野生型GAD。
动力学稳定性的测定
半失活温度(T50 15)的测定：将纯化后的野生酶GAD1407及突变体GAD1413分别在0-65℃条件下孵育15min，孵育结束后迅速放置冰上冷却5min，而后，测定其残余活力。以温度为横坐标，以热处理后与未经热处理的酶活力比值为纵坐标，数据进行Boltzmann s型函数拟合，依据拟合曲线计算T50 15值。T50 15是指酶在不同温度条件下孵育15min后，酶残余活力降低到50％时所对应的温度。如图7所示，突变体GAD1413的T50 15为59.1℃，比野生型(56.5℃)提高了2.6℃。
半衰期(t1/2)的测定：将野生酶GAD1407及突变体GAD1413纯酶分别在60℃下孵育不同时间后，迅速放到冰上冷却5min，而后测定残余酶活。以未经孵育处理的酶的活力为100％，利用ExpGro1型函数拟合曲线，计算当酶活力降至50％时所对应的时间，即为t1/2。如图8所示，突变体GAD1413在60℃条件下的半衰期t1/2为25.6min，是野生型GAD(7.4min)的3.46倍，表明该突变体GAD1413的热稳定性显著提升。
游离工程菌催化L-谷氨酸(L-Glu)合成GABA的性能分析
以终浓度为0.5mM的IPTG诱导8h后的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-gadB1413游离细胞作为催化剂，反应体系为2L，溶剂为纯水，底物L-Glu初始添加量为883g，游离细胞浓度OD600调整为20，反应温度设定为50℃，搅拌速率为150rpm，反应过程中不控制反应体系pH。如图9A所示：随着反应的进行，产物(GABA)快速合成并伴随着反应体系pH逐渐上升；反应0.5-2.5h时GABA的时空产率相对较高；反应3h时GABA产量已达到285.81g/L，而反应3.5h后，GABA产量则高达300.94g/L，pH值上升至6.8，转化率则超过99.6％，呈现出良好的工业应用前景。
以终浓度为10ng/mL的nisin(乳酸链球菌素)诱导12h后的L.lactis NZ3900/pNZ8149-gadB1413游离细胞催化L-Glu合成食品级GABA。该反应体系亦设定为2L，纯水为溶剂，底物L-Glu初始添加量为883g，游离细胞浓度OD600为20，反应温度为50℃，搅拌速率为150rpm，反应过程中亦不控制反应体系pH。如图9B所示，反应16h后，GABA产量为271.26g/L，pH值上升至6.5，转化率为89.8％，高于现有的基于乳酸乳球菌催化合成GABA的转化率。
为了提升GAD的热稳定性，发明人曾以具有工业应用潜力的短促生乳杆菌源GAD(GeneBank ID:ADG02973.1)为模板，基于祖先酶序列重构策略通过FireProtASR系统构建过一个GAD祖先酶(AncGAD)。酶学性质分析显示，AncGAD的半失活温度(T50 15)为60.1℃，比父本酶提高了3.6℃，热稳定性显著提升。尽管AncGAD催化效率(kcat/Km，0.88s-1mM-1)与野生型酶相近，但其对底物L-谷氨酸的米氏常数(Km，54.78mM)值较野生型酶增加了13.77mM，表明其对底物L-谷氨酸的亲和力下降。
而本发明的GAD1413对底物L-谷氨酸的米氏常数为26.80mM，底物亲和力明显改善；GAD1413表现出良好的热稳定性、底物亲和力和催化活性，更加适合酶法或游离细胞催化合成GABA，尤其是食品级GABA的工业化生产需求。本发明不仅为谷氨酸脱羧酶的工业应用提供了技术支撑，同时为提高其它酶的催化性能提供了指导。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种谷氨酸脱羧酶，其特征在于，所述谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列为SEQ ID No.4。
2.根据权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶，其特征在于，氨基酸序列的获取方法包括：
获取短促生乳杆菌谷氨酸脱羧酶的野生型氨基酸序列；
固定野生型氨基酸序列的多个位点；
基于祖先酶序列重建方法，构建所述野生型氨基酸序列的祖先酶进化树；
根据所述祖先酶进行树，获得所述谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的谷氨酸脱羧酶，其特征在于，所述位点包括以下氨基酸位点的组合：
F65,K89,C130,G164,Q166,W169,I178,M185,I211,T215,D246,A248,T254,L267,H278,K279和P285。
4.根据权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶，其特征在于，谷氨酸脱羧酶的制备方法包括：
根据所述氨基酸序列，获得相应的基因序列；
合成并扩增所述基因序列；
根据所述基因序列以及表达载体，构建重组质粒；
根据所述重组质粒以及宿主，构建工程菌或工程细胞；
利用工程菌或工程细胞表达重组蛋白；
从表达重组蛋白的工程菌或工程细胞中分离纯化谷氨酸脱羧酶。
5.根据权利要求4所述的谷氨酸脱羧酶，其特征在于，构建工程菌的方法包括：
设计第一引物对和第二引物对，其中第一引物对为：gadB1413-F1：5’-GGAATTCCATATGCTGTACGGTAAAAAAAACCGTG-3’和gadB1413-R1：5’-ACGCGTCGACTTAGTGGGTGAAACCGTAGGTTT-3’，第二引物对为gadB1413-F2：5’-CATGCCATGGGCCTGTACGGTAAAAAAAACCGTG-3’和gadB1413-R2：5’-CGGGGTACCTTAGTGGGTGAAACCGTAGGTTT-3’；
分别以第一引物对和第二引物对，扩增所述基因序列，获得第一序列和第二序列；
利用限制性内切酶Nde I和Sal I分别处理载体pET28a和纯化后的第一序列，获得双酶切pET28a和双酶切第一序列；通过T4-DNA连接酶，连接所述双酶切pET28a和双酶切第一序列，获得第一质粒；将所述第一质粒导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，获得第一工程菌；
利用限制性内切酶Nco I和Kpn I分别处理载体pNZ8149和纯化后的第二序列，获得双酶切pNZ8149和双酶切第二序列；通过T4-DNA连接酶，连接所述双酶切pNZ8149和双酶切第二序列，获得第二质粒；将所述第二质粒导入L.lactis NZ3900感受态细胞中，获得第二工程菌。
6.根据权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶，其特征在于，所述谷氨酸脱羧酶的最适反应温度为55℃，最适反应pH为pH 5.0，T50 15为59.1℃，60℃条件下的半衰期t1/2为25.6分钟，对底物L-谷氨酸的米氏常数为26.80mM，催化效率为2.14s-1mM-1。
7.一种编码权利要求1所述谷氨酸脱羧酶的基因，其特征在于，所述基因的序列如SEQID No.2所示。
8.一种如权利要求1-6任一项所述谷氨酸脱羧酶的应用，其特征在于，用于催化L-谷氨酸或L-谷氨酸盐脱去α-羧基生成γ-氨基丁酸。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，基于谷氨酸脱羧酶突的氨基酸序列构建的工程菌经诱导表达后，用于催化L-谷氨酸或L-谷氨酸盐脱去α-羧基生成γ-氨基丁酸。
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| CN102911927A (zh) * | 2012-11-02 | 2013-02-06 | 浙江大学宁波理工学院 | 一种谷氨酸脱羧酶及其编码基因和用途 |
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| CN106967659A (zh) * | 2017-03-28 | 2017-07-21 | 江南大学 | 一种表达谷氨酸脱羧酶的无抗生素抗性重组枯草芽孢杆菌的构建及发酵方法 |
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Patent Citations (5)
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| "Characterization of a novel glutamate decarboxylase (GAD) from Latilactobacillus curvatus K285 isolated from Gat -Kimchi";Lee S J等;《Food Science and Biotechnology》(第31期);第69-78页 * |
| 定向突变谷氨酸脱羧酶及其生物合成γ-氨基丁酸的研究;高翠娟;;中国农业科技导报(第02期);第67-72页 * |
Also Published As
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