CN115806951B - NADH依赖型7β-羟基类固醇脱氢酶突变体、编码序列、基因工程菌及应用 - Google Patents
NADH依赖型7β-羟基类固醇脱氢酶突变体、编码序列、基因工程菌及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种NADH依赖型7β‑羟基类固醇脱氢酶突变体、编码序列、基因工程菌及应用。对来源于鸡粪木质乳杆菌的NADH依赖型7β‑羟基类固醇脱氢酶进行突变，获得的突变体Cle7β‑3的还原活力提高了4.3倍，还原氧化活力比值提高了9倍，且有良好的底物耐受性，在浓度为100mM的7‑oxo‑LCA条件下孵育2小时，活力仅下降了10.5％；突变体Cle7β‑3在30℃，pH8.0条件下催化合成熊去氧胆酸，牛磺熊去氧胆酸，熊胆酸和12‑酮‑熊去氧胆酸，都能在3小时内将相应的底物转化完全。突变后的7β‑HSDH极大程度地降低了生产成本，提高了生产效率，更适合于工业化应用。
Description
技术领域
本发明属于基因工程及酶工程领域，具体涉及一种NADH依赖型7β-羟基类固醇脱氢酶突变体、编码序列、重组表达载体、基因工程菌及它们在制备熊去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸、熊胆酸和12-酮-熊去氧胆酸中的应用。
背景技术
熊去氧胆酸(UDCA)是名贵中药——“熊胆粉”的主要有效成分，目前已应用于治疗各种肝胆疾病，帕金森症甚至用于新冠的辅助治疗，具有明显的疗效。UDCA传统的制备方法是采用“活熊引流法”从熊的胆囊中插入导管提取，但这种方法手段过于残忍有违动物保护法且产物收率低，导致UDCA价格昂贵，无法大规模工业应用。
当前，工业上生产UDCA和T-UDCA主要有化学和酶法合成，其中化学合成法是通过七步反应且需要使用大量有毒试剂合成的，这导致其成本高，“三废”严重和条件苛刻等；而酶法具有成本较低、工艺简单、绿色无污染及反应条件温和等优点，因此日益受到重视。
在酶法合成UDCA过程中，都要使用一种重要的酶——7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-hydroxysteroid dehydrogenase，7β-HSDH，EC 1.1.1.201)，其主要作用是催化7-酮取代胆酸上7位的酮基还原成β-型羟基，从而得到这种重要的医用原料药及其相应类似物。
野生型7β-HSDH来源十分广泛，目前，国内外科研工作者已经筛选出众多产7β-HSDH的微生物并将其编码基因克隆出来，如产气柯林斯菌(Collinsellaaerofaciens)、撒丁岛梭菌(Clostridium absonum)、活泼瘤胃菌属(Ruminococcusgnavus)、扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques ATCC 35915)、马赛梭菌(Clostridium Marseille)等。与此同时，许多科研工作者运用蛋白质工程手段对野生型7β-HSDH进行突变改造以提高其工业应用能力。如中国专利CN109182284A中，黄斌等对产气柯林斯菌(Collinsellaaerofaciens)来源的野生型7β-HSDH进行突变，突变体E175D/E197D活力提高8倍且解除了产物抑制，应用该突变体制备UDCA和T-UDCA,100mM的底物都能在2小时内转化完全。如中国专利CN 106636285A中，傅荣昭等对来源于Turneriella parva的野生型7β-HSDH进行突变，突变体V38R/V39R的活力由254.8U/ml提高到412.8U/ml，其反应温度由25℃提高到30℃，酶液投量和NADP+投量显著降低。如中国专利CN 105274070A中，刘志斌等对来源于活泼瘤胃菌属来源的7β-HSDH进行突变，其突变子RU-8C2和RU-4F9的活力由野生型的5.1U/ml提高到9.5U/ml和16.6U/ml，其对应的氨基酸残基变化分别为T210N和L3M/T219N。Mingmin Zheng等(J.Agric.Food Chem.,2017,65(6),pp 1178-1185)对来源于Ruminococcus torques ATCC35915的7β-HSDH进行突变，他们采用易错PCR和DNA重排的定向进化手段，其突变子V3-1的比活由野生型的21.9U/mg提高到41.8U/mg，对应的氨基酸残基为T189V/V207M。尽管如此，这些报道的7β-HSDH都是NADPH依赖型的，而辅酶NADP(H)价格昂贵且不稳定，这大大限制了该酶在工业生产UDCA上的应用。相对于NADP(H)来说，NAD(H)价格只有NADP(H)的七分之一且更加稳定，进行辅酶循环次数更多，更不易钝化。因此，采用NADH依赖型的7β-羟基类固醇脱氢酶替代当前工业应用的NADPH依赖型的7β-羟基类固醇脱氢酶，其更具有成本优势及应用前景。
不同于NADPH依赖型的7β-HSDH早在2011年就被研究报道，来源于Lactobacillusspicheri(Ls7β-HSDH)的NADH依赖型的7β-HSDH直到2018年才被荷兰科学家IsabelW.C.E.Arends等首次报道(ChemSusChem.,2019,12(13),pp3192-3203)，但是该酶的活力仅为3.1U/mg且时空产率仅为26g/L/d，这大大限制了该酶的应用。与此同时，我国科学家许建和课题组采用蛋白工程手段对NADPH依赖型的Rt7β-HSDH进行辅酶偏好性颠换(ACSCatalysis.,2018,9(1)pp466-473)，突变体Rt7β-HSDHG39D/T17A成功被改造成NADH依赖型7β-HSDH，但是其活力也仅为5.35U/mg，时空产率为149g/L/d仅相当于野生型NADPH依赖型Rt7β-HSDH的水平。因此，通过基因工程及蛋白工程手段开发一种活力高，时空产率高且产物抑制弱的NADH依赖型的7β-HSDH，对于降低UDCA及其类似物的工业生产成本具有重要意义。
发明内容
本发明首要目的在于提供一种NADH依赖型7β-羟基类固醇脱氢酶突变体，以解决制备熊去氧胆酸及其类似物时，野生型酶的活力偏低和底物耐受性弱，反应时间长及成本高等技术问题。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供的技术方案之一是：提供一种NADH依赖型7β-羟基类固醇脱氢酶突变体。本发明中利用计算机模拟技术结合高通量筛选方法对鸡粪木质乳杆菌(CandidatusLigilactobacillus excrementigallinarum)来源的野生型NADH依赖型7β-羟基类固醇脱氢酶进行定向改造，以获得活力高及底物耐受性强的突变体。
本发明所述突变体是在氨基酸序列SEQ ID NO.2所示的NADH依赖型7β-羟基类固醇脱氢酶的第94位、第95位、第191位中的至少一个位点进行突变得到的。
进一步地，所述突变体为以下任一种：
(a)将具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第94位的异亮氨酸突变成缬氨酸，该突变体命名为Cle7β-1A；该突变体比野生型的7β-羟基类固醇脱氢酶还原活力和还原氧化活力比值高，且能耐受高底物浓度。
(b)将具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第95位的丙氨酸均突变成缬氨酸，该突变体命名为Cle7β-1B；该突变体比野生型的7β-羟基类固醇脱氢酶还原活力和还原氧化活力比值高。
(c)将具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第191位的丙氨酸突变成苏氨酸，该突变体命名为Cle7β-1C；该突变体比野生型的7β-羟基类固醇脱氢酶还原活力和还原氧化活力比值高。
(d)将具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第94位的异亮氨酸和第95位的丙氨酸均突变成缬氨酸，该突变体命名为Cle7β-2A；该突变体能耐受高底物浓度，使得时空产率提升；该突变体比野生型的7β-羟基类固醇脱氢酶还原活力和还原氧化活力比值高，且能耐受高底物浓度。
(e)将具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第94位的异亮氨酸突变成缬氨酸和第191位的丙氨酸突变成苏氨酸，该突变体命名为Cle7β-2B；该突变体比野生型的7β-羟基类固醇脱氢酶还原活力和还原氧化活力比值高。
(f)将具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第95位的丙氨酸突变成缬氨酸和第191位的丙氨酸突变成苏氨酸，该突变体命名为Cle7β-2C；该突变体比野生型的7β-羟基类固醇脱氢酶还原活力和还原氧化活力比值高。
(g)将具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第94位的异亮氨酸和第95位的丙氨酸均突变成缬氨酸，第191位的丙氨酸突变成苏氨酸，该突变体命名为Cle7β-3；该突变体催化活力高且能耐受高底物浓度，使得反应时间大幅缩短，且能将底物7-oxo-LCA转化完全，整体成本降低。
本发明第二个目的在于提供上述NADH依赖型7β-羟基类固醇脱氢酶突变体的编码基因序列。
本发明提供的技术方案之二是：提供一种编码NADH依赖型7β-羟基类固醇脱氢酶突变体的基因序列，为编码上述的NADH依赖型7β-羟基类固醇脱氢酶突变体中的任一种的基因序列。
所述编码基因序列的制备方法为本领域常规的制备方法，所述制备方法包括：(1)从自然界中提取；(2)通过基因克隆技术获得；(3)通过人工全基因合成中的任一种。如本领域技术人员所知：所述编码基因序列在不影响表达功能的前提下可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加碱基来制得。
本发明第三个目的在于提供上述NADH依赖型7β-羟基类固醇脱氢酶突变体的编码基因序列的重组表达载体。
本发明提供的技术方案之三是：提供一种含有上述NADH依赖型7β-羟基类固醇脱氢酶突变体的编码基因序列中的一种或几种的重组表达载体。
所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即：将本发明所述的编码基因序列连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体。所述载体包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，本发明所述载体优选原核表达载体pET30a(+)。
本发明第四个目的在于提供上述NADH依赖型7β-羟基类固醇脱氢酶突变体的编码基因序列重组表达载体的基因工程菌。
本发明提供的技术方案之四是：提供一种包含有上述重组表达载体的一种或几种的基因工程菌。
所述重组表达基因工程菌的制备方法为：将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。其中所述宿主细胞包括大肠杆菌(E.coli)，优选为E.coliBL21(DE3)。将上述重组表达载体通过电转化或者化学转化的方法转入E.coliBL21(DE3)中，即可得本发明优选的重组基因工程菌。
本发明的第五个目的是提供上述NADH依赖型7β-羟基类固醇脱氢酶突变体的应用，包括：使用上述的NADH依赖型7β-羟基类固醇脱氢酶突变体催化7-酮石胆酸制备熊去氧胆酸，或者使用上述的NADH依赖型7β-羟基类固醇脱氢酶突变体催化牛磺-7-酮石胆酸制备牛磺熊去氧胆酸，或者使用上述的NADH依赖型7β-羟基类固醇脱氢酶突变体催化7-酮胆酸制备熊胆酸，或者使用上述的NADH依赖型7β-羟基类固醇脱氢酶突变体催化7，12-二酮胆酸制备12-酮-熊去氧胆酸。
进一步的，催化反应中用到的辅酶NADH由甲酸脱氢酶辅酶循环系统得到的，反应过程中，甲酸在甲酸脱氢酶催化下转变成CO2，同时反应中的NAD+还原成NADH，从而实现辅酶NADH的循环再生。
本发明上述NADH依赖型7β-羟基类固醇脱氢酶突变体的应用，具体如下：
是在添加NAD+和甲酸，由甲酸脱氢酶(FDH)催化甲酸循环制备NADH的条件下，直接催化7-酮石胆酸(7-oxo-LCA)制备熊去氧胆酸(UDCA)，该方法能大大减少辅酶NADH的投量，从而有效地节省成本；
或者是在添加NAD+和甲酸，由甲酸脱氢酶(FDH)催化甲酸循环制备NADH的条件下，催化牛磺-7-酮石胆酸(T-7-oxo-LCA)制备牛磺熊去氧胆酸(T-UDCA)。
或者是在添加NAD+和甲酸，由甲酸脱氢酶(FDH)催化甲酸循环制备NADH的条件下，催化7-酮胆酸(7-oxo-CA)制备熊胆酸(UCA)。
或者是在添加NAD+和甲酸，由甲酸脱氢酶(FDH)催化甲酸循环制备NADH的条件下，催化7,12-二酮胆酸(7,12-dioxo-CA)制备12-酮基熊去氧胆酸(12-oxo-UDCA)。
本发明采用NADH依赖型7β-羟基类固醇脱氢酶的高通量筛选方法，从而筛选有益突变体。
本发明所述高通量筛选方法是采用NADH测定法，其在340nm处有最大吸收峰，以7-oxo-LCA为底物测定该酶的活力，测定NADH的消耗量，通过酶标仪测定其在340nm的吸光值，数值越小，酶活性越高。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明的NADH依赖型7β-羟基类固醇脱氢酶突变体，与野生型Cle7β-HSDH氨基酸序列存在特定位点的氨基酸不同，具有活力高，耐受高底物浓度及反应时间短等优点。
2、与现有酶法制备熊去氧胆酸及其类似物方法相比，本发明提供的方法具有反应条件温和、反应速率快、转化效率高、底物反应浓度大和辅酶添加少等优点，其反应时间仅为3小时，各底物的转化率均大于99.5％，可以更有效，快速地催化合成UDCA及其类似物。
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，但并不构成对本发明的不当限定。
附图说明
图1是本发明实施例中的NADH依赖型Cle7β-HSDH与底物7-oxo-LCA的蛋白-底物对接图；
图2是本发明实施例中的NADH依赖型Cle7β-HSDH底物结合口袋示意图。
图3是本发明实施例中的NADH依赖型Cle7β-HSDH催化合成熊去氧胆酸以及甲酸脱氢酶催化下的辅酶NADH循环再生；
图4是本发明实施例中的NADH依赖型Cle7β-HSDH催化合成牛磺熊去氧胆酸以及甲酸脱氢酶催化下的辅酶NADH循环再生；
图5是本发明实施例中的NADH依赖型Cle7β-HSDH催化合成熊胆酸以及甲酸脱氢酶催化下的辅酶NADH循环再生；
图6是本发明实施例中的NADH依赖型Cle7β-HSDH催化合成12-酮-熊去氧胆酸以及甲酸脱氢酶催化下的辅酶NADH循环再生。
具体实施方式
以下实施例及其说明用于解释本发明，但并不构成对本发明的不当限定。
本申请中下述实施例中所使用的方法如无特殊说明均为常规方法，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译。第3版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。基因合成、突变引物合成以及序列测序均为北京擎科生物科技有限公司完成。大肠杆菌宿主菌为E.coli BL21(DE3)购于北京擎科生物科技有限公司。大肠杆菌宿主菌还可以是E.coli BL21(DE3)plys，购于天根公司。原核表达载体pET30a(+)购于Merck公司。DNA内切酶EcoR I、Xho I和Dpn I及DNAT4连接酶购于Fermentas公司，其余试剂及材料均为市售。同时，本发明中的氨基酸无特别说明外均用其缩写或代号标明(氨基酸中英文名称及其缩写和代号见表1)。
表1氨基酸中英文名称及其缩写和代号
| 中文名称 | 英文名称 | 缩写 | 代号 | 中文名称 | 英文名称 | 缩写 | 代号 |
| 丙氨酸 | Alanine | Ala | A | 脯氨酸 | Proline | Pro | P |
| 精氨酸 | Arginine | Arg | R | 亮氨酸 | Leucine | Leu | L |
| 天冬酰胺 | Asparagine | Asn | N | 异亮氨酸 | Isoleucine | Ile | I |
| 天冬氨酸 | Aspartic acid | Asp | D | 甘氨酸 | Glycine | Gly | G |
| 半胱氨酸 | Cysteine | Cys | C | 苯丙氨酸 | Phenylalanine | Phe | F |
| 谷氨酰胺 | Glutamine | Gln | Q | 蛋氨酸 | Methionine | Met | M |
| 谷氨酸 | Glutamicacid | Glu | E | 赖氨酸 | Lysine | Lys | K |
| 苏氨酸 | Threonine | Thr | T | 组氨酸 | Histidine | His | H |
| 色氨酸 | Tryptophan | Trp | W | 缬氨酸 | Valine | Val | V |
| 丝氨酸 | Serine | Ser | S | 酪氨酸 | Tyrosine | Tyr | Y |
实施例1：野生型NADH依赖型Cle7β-HSDH重组基因工程菌的构建、表达及重组蛋白的纯化
1-1野生型NADH依赖型Cle7β-HSDH重组基因工程菌的构建及表达
为了得到还原活力高、氧化活力低和产物抑制弱的NADH依赖型7β-HSDH突变体，本发明采用的野生型NADH依赖型7β-HSDH基因及氨基酸序列是来源于鸡粪木质乳杆菌(CandidatusLigilactobacillusexcrementigallinarum)(GeneBank登录号：HIX02396)，通过大肠杆菌密码子偏爱性将该编码基因进行优化并进行全基因合成，并将该野生型NADH依赖型7β-羟基类固醇脱氢酶命名为Cle7β-HSDH，其编码基因命名为Cle7β-hsdh，其核苷酸序列及氨基酸序列见SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
将全基因合成的野生型NADH依赖型7β-HSDH编码基因Cle7β-hsdh与原核表达载体pET30a(+)分别进行EcoR I和Xho I双酶切，酶切3小时后分别进行切胶回收，将回收产物按照产物：载体为3：1的摩尔比例进行混合，加入T4 DNA ligase于16℃过夜连接。将连接产物5μL转入50μL的DH5α感受态大肠杆菌中，涂布于含50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基平板于37℃中进行过夜培养。挑选单菌落进行菌落PCR验证，将阳性克隆接种于含50μg/ml卡那霉素的LB培养基过夜培养，提质粒，进行EcoR I和Xho I双酶切验证，将大小正确的克隆子送往测序公司进行DNA测序验证，序列比对正确后，将该重组表达载体命名为pET-7β-hsdh，这样就得到了在N端和C端都带有一个His-tag的质粒，其表达的野生型Cle7β-HSDH蛋白带有两个组氨酸标签，可用固定化金属螯合亲和层析(IMAC)的方式进行蛋白纯化。
通过化学转化的方法将上述重组表达载体pET-7β-hsdh转化入E.coli BL21(DE3)或者E.coli BL21(DE3)plys感受态大肠杆菌细胞，转化细胞涂布于含50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基平板于37℃中进行过夜培养即获得重组野生型Cle7β-HSDH基因工程菌。
挑取单菌落接种于装有LB培养基的三角瓶中，其中LB培养基为100ml且含有50μg/ml的卡那霉素，于37℃，240rmp的恒温摇床中培养8个小时后，加入1％的乳糖，于25℃，240rmp的恒温摇床中诱导表达8小时，即得到重组野生型7β-HSDH蛋白。
1-2重组野生型NADH依赖型Cle7β-HSDH蛋白的分离纯化
由于在表达载体构建过程中引入了原核表达载体pET30a(+)中的N和C端的2个His-tag，因此，本发明人利用该组氨酸标签进行固定化金属螯合亲和层析(IMAC)来纯化重组蛋白，具体方法如下。
取100mL过夜诱导后的野生型Cle7β-HSDH发酵液，离心后弃上清收集菌体(10000rpm、4℃、10min)，用磷酸盐缓冲液(pH 8.0、0.1mol/L)反复洗涤菌体两次，离心收集菌体，浓缩5倍重悬于20ml磷酸盐缓冲液(pH 8.0、0.1mol/L)中。将上述处理后的菌液置于冰水中进行超声破碎直至澄清，其中的超声破碎条件为：工作3s，间隔5s。将上述破碎后的裂解液置于低温高速离心机中离心(12,000rpm、4℃、20min)，收集上清，得到重组野生型Cle7β-HSDH蛋白，将该粗重组蛋白进样到已活化并结合Ni+的IDA树脂上，用不同浓度的咪唑进行梯度洗脱，利用蛋白层析系统(Bio-Rad)进行实时监控，当计算机中出现稳定的蛋白峰时，开始收集直到该峰消失为止。重组酶蛋白经过分离纯化后密封于无菌袋中放置于4℃冰箱以备后续实验。
1-3NADH依赖型Cle7β-HSDH的酶活检测方法
在1cm规格的石英比色皿中，依次加入已预热至25℃终浓度为1mM的7-KLCA溶液，再加入酶液或去离子水稀释后酶液(酶液稀释至酶活为0.8～2U/ml)0.1ml，混合均匀后，于波长340nm处校零，加入已预热至25℃终浓度为2.5mM的NADH溶液，快速混合一下开始测定，每隔10秒记录吸光度A340，记录10个测量点的吸光度A340。建立测量时间(min)—吸光度A340的曲线，算出斜率(要求相关系数R2≥0.999)。
活力计算
活力(25℃)＝[ΔA/min]*[1/S]*[1/d]*[Vt/Vs]*X(U/ml)
ΔA/min—表示每分钟吸光度的变化值，即为斜率；
S—NADPH的摩尔消光系数，通过标准曲线求得；
d—比色皿的光径(1cm)；
Vt—表示反应液的总体积，ml，
Vs—表示样品酶液的体积0.1ml；
X—表示样品酶液的稀释倍数。
实施例2：Cle7β-HSDH突变体的制备
2-1突变热点鉴定及突变体文库构建和高通量筛选方法
2-1-1Cle7β-HSDH突变热点鉴定
由于Cle7β-HSDH没有晶体结构且其与具有晶体结构NADPH依赖型的7β-HSDH同源性太低，因此本发明采用AlphaFold 2软件进行从头建模。随后，将构建好的Cle7β-HSDH三维模型与底物7-oxo-LCA用Autodock 4.0软件进行对接，对接好的模型如图1所示。同时，采用Pymol软件鉴定了Cle7β-HSDH催化口袋4A°范围内可能与酶催化能力有关的位点(图2)。由于G18、D21、G22、L23和G24位于保守基序“GXXXGXG”中，而S146、Y159和K163构成其催化三联体，因此排除这些保守氨基酸残基，剩下的I94、A95、A96、Y144、S145、L147、T148、L189、G190、A191、T192、T194、T196和E197共14个氨基酸残基被鉴定为突变热点用于进行突变建库及筛选。
2-1-2Cle7β-HSDH突变体文库的构建
为了提高野生型Cle7β-HSDH的活力，本发明人以重组表达载体Cle7β-hsdh为DNA模板，对被鉴定为突变热点的14个氨基酸残基进行定点饱和突变。定点饱和突变文库采用全质粒PCR来构建，所涉及的定点饱和突变引物如表2所示。
表2定点饱和突变引物
依次见序列表SEQ ID NO.3-30。
全质粒PCR反应体系：
| 10×Buffer | 5μL |
| 2mmol/LdNTPS | 5μL |
| 50mmol/L MgSO4 | 3μL |
| 正向引物 | 1.5μL |
| 反向引物 | 1.5μL |
| 模板Cle7β-hsdh | 1μL |
| KOD-401DNA聚合酶 | 1μL |
| ddH2O | 32μL |
全质粒PCR反应条件是：先98℃预变性2min；然后95℃变性30s，68℃4min，共30个循环；最后68℃延伸10min。
将上述得到的全质粒PCR产物进行电泳并纯化，将纯化后的产物用限制性内切酶DpnI酶切以消除模板DNA，酶切3小时再进行胶回收，将回收产物采用电转化法转入E.coliBL21(DE3)中，即可得到定点饱和突变体文库。
2-1-3Cle7β-HSDH突变体文库的高通量筛选方法
本发明中Cle7β-HSDH突变体文库的高通量筛选方法是采用NADH测定法，以7-oxo-LCA和NADH为底物，通过酶标仪测定NADH在340nm的吸光值，数值越小，酶活性越高。
具体方法及操作步骤如下所述：
(1)酶液的制备
用高温灭菌后的牙签，小心挑取突变体文库中的单菌落接种于装有LB培养基的96孔细胞培养板中，其中LB培养基体积为200μL/孔且含有50μg/ml的卡那霉素，于37℃，240rmp的恒温摇床中培养8个小时后，加入1％的乳糖，于25℃，240rmp的恒温摇床中诱导培养8小时。诱导完毕后，将96孔细胞培养板放入-86℃的超低温冰箱中冷冻2个小时，取出放置于室温中半个小时，后置于96孔细胞培养板离心机中于4,000rmp，4℃离心20分钟。
(2)反应及测定
取20μL上清液加入含有180μL反应液(150μL 0.3mmo/L的NADH，20μL10mmo/L的7-oxo-LCA，NADH和7-oxo-LCA都用0.05mol/L pH8.0的Tris-HCl配置)的96孔微孔板中于30℃放置30分钟，反应完后将96孔微孔板放入酶标仪中，于波长340nm处测定其吸光度，读取数值。
2-2Cle7β-HSDH突变体的制备
(1)定点饱和突变
将上述14个饱和突变文库中各筛选了96个克隆，共1344个克隆，得到20个数值变化明显的突变子。接着对这20个突变子进行摇瓶复筛。具体过程为：将这20个突变子接种于含20ml LB培养基的150ml摇瓶中进行发酵及诱导，并通过HPLC法测定活力，得到3个比对照活力高的突变体，经测序发现三个突变体为I94V、A95V和A191T，分别命名为Cle7β-1A、Cle7β-1B和Cle7β-1C。
(2)迭代组合突变
在7β-HSDH催化生产UDCA及其类似物过程中，我们发现，Cle7β-HSDH会受到高浓度底物的强烈抑制，使其活性迅速下降且不能将底物反应完全，导致酶法制备UDCA及其类似物的成本过高。因此，需要再次对Cle7β-HSDH进行蛋白工程改造以降低其受底物的抑制作用。
表3定点突变引物
本发明人，沿着这一目标设定开发路线，对上述Cle7β-HSDH突变体进行进一步改造。以Cle7β-1A编码基因为模板，表3中的引物为定点突变引物，按照实施例2-1-1方法得到3个双点突变体和1个三点突变体，同时我们对这些突变体与野生型及Cle7β-1A进行性质比较。双点突变体Cle7β-2A和三点突变体Cle7β-3的活力及相关性质比野生型和Cle7β-1A都有很显著提升，具体数值如表4所示。
表4突变体与野生型Cle7β-HSDH性质初步比较
注：还原活力是以7-oxo-LCA为底物的测定的；氧化活力是以UDCA为底物的测定的。
实施例3：野生型与突变型Cle7β-HSDH底物耐受性比较
将上述野生型及突变型Cle7β-HSDH按照实施例1的方法进行纯化，并将所得到的纯酶蛋白以相同酶量(1000U)分别置于10mM、25mM、50mM和100mM浓度的7-oxo-LCA溶液中(由于其他底物耐受性实验结果与7-oxo-LCA的相似，这里仅以7-oxo-LCA为例说明)，于30℃温育2个小时后，测定其残余活力，具体数据如表5所示。
结果表明，随着7-oxo-LCA浓度的增加，野生型Cle7β-HSDH的活力急剧下降，在100mM的浓度下，其活力下降了95％；而突变体Cle7β-1A、Cle7β-2A和Cle7β-3比野生型Cle7β-WT有着更好的7-oxo-LCA耐受性，受7-oxo-LCA的反馈抑制作用减弱非常多。尤其是Cle7β-3，在100mM的浓度下，其活力仅下降了10.5％。
表5野生型与突变型Cle7β-HSDH对7-oxo-LCA浓度耐受性比较
实施例4野生型与突变型Cle7β-3制备UDCA及其类似物的应用
4-1野生型与突变型Cle7β-HSDH制备UDCA实验
将上述野生型与突变型Cle7β-HSDH纯酶，以相同酶量(2000U)分别置于终浓度为100mM的7-oxo-LCA、2mM NAD+、150mM的甲酸、3000U甲酸脱氢酶(FDH)(购于湖南佰奥莱博生物科技有限公司)的1L反应体系中，于30℃，pH8.00条件下反应，反应过程中不断滴加3mol/L的氢氧化钠，使pH恒定在8.00，每隔一定时间取样测定反应液中的7-oxo-LCA和UDCA的含量，当反应达到终点后(判定终点的方法是：7-oxo-LCA反应完全或者增加反应时间其不再减少)，记录下总反应时间。将上述反应液通过膜过滤，纯酶蛋白用Tris-HCl缓冲液清洗，备用。取上述反应液，检测UDCA生成量，同时计算7-oxo-LCA的摩尔转化率，具体实验对比数据见表6。
表6野生型Cle7β-HSDH与Cle7β-3制备UDCA的应用实验对比
由表6可知，野生型Cle7β-HSDH在30℃，反应24小时，7-oxo-LCA的摩尔转化率仅为9.3％；Cle7β-3在反应3小时后，7-oxo-LCA的摩尔转化率达到了99％以上。
4-2野生型与突变型Cle7β-HSDH制备T-UDCA实验
按照上述实施例4-1的方法，只是将底物7-oxo-LCA替换成T-7-oxo-LCA，其他条件一致，当反应完成时，检测T-UDCA生成量，同时计算T-7-oxo-LCA的摩尔转化率，具体实验对比数据见表7。
表7野生型Cle7β-HSDH与Cle7β-3制备T-UDCA的应用实验对比
由上表可知，野生型Cle7β-HSDH在30℃，反应24小时，T-7-oxo-LCA的摩尔转化率仅为9.5％；Cle7β-3在反应3小时后，T-7-oxo-LCA的摩尔转化率达到了99.9％。
4-3野生型与突变型Cle7β-HSDH制备UCA实验
按照上述实施例4-1的方法，只是将底物7-oxo-LCA替换成7-oxo-CA，其他条件一致，当反应完成时，检测UCA生成量，同时计算7-oxo-CA的摩尔转化率，具体实验对比数据见表8。
表8野生型Cle7β-HSDH与Cle7β-3制备UCA的应用实验对比
由上表可知，野生型Cle7β-HSDH在30℃，反应24小时，7-oxo-CA的摩尔转化率仅为11.3％；Cle7β-3在反应3小时后，7-oxo-CA的摩尔转化率达到了99.9％。
4-4野生型与突变型Cle7β-HSDH制备12-oxo-UDCA实验
按照上述实施例4-1的方法，只是将底物7-oxo-LCA替换成7,12-dioxo-CA，其他条件一致，当反应完成时，检测12-oxo-UDCA生成量，同时计算7,12-dioxo-CA的摩尔转化率，具体实验对比数据见表9。
表9野生型Cle7β-HSDH与Cle7β-3制备12-oxo-UDCA的应用实验对比
由上表可知，野生型Cle7β-HSDH在30℃，反应24小时，7,12-dioxo-CA的摩尔转化率仅为14.2％；Cle7β-3在反应3小时后，7,12-dioxo-CA的摩尔转化率达到了99.9％。
实验结果表明，野生型Cle7β-HSDH由于受底物7-oxo-LCA及其类似物的强烈抑制作用，无论增加多少时间，其都不能将底物转化完全，后期产物生成量甚至会减少；而Cle7β-3突变体活力大幅度提高，同时降低了高浓度底物7-oxo-LCA的反馈抑制作用，使其能在3小时内将底物7-oxo-LCA及其类似物转化完全。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
SEQ ID NO.1:鸡粪木质乳杆菌(Candidatus Ligilactobacillusexcrementigallinarum)来源的野生型NADH依赖型7β-羟基类固醇脱氢酶编码基因序列
atgaccctgagcgactttcaggccaaatatggtaaatacgcggtgctgtttgggggggcg
gatggtctgggtgccgaaaccgcgaaaaagctggccgaaaaaggtctgagcattatttgt
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aaaagccaggttaaaaagtggcgtattgaaaacgacgatgacggactggcagaatatatg
ggaaaattttatgaa
SEQ ID NO.2:鸡粪木质乳杆菌(Candidatus Ligilactobacillusexcrementigallinarum)来源的野生型NADH依赖型7β-羟基类固醇脱氢酶氨基酸序列
MTLSDFQAKYGKYAVLFGGADGLGAETAKKLAEKGLSIICVDYSQEKLDQFEAEFRKIYSVDFIPVKIDLSEENAVLDVFDVTDRLDVGFVSYIAALHKFGKIQDISWDDYMKMFNVNILNFTKAMKHYMGIFVEQGHGGIMNYSSLTALTSSPYNVEYGAGKAYIKSFTQAMAYEGEKEGVDVMVATLGATATPTELKAQPQGDLGAKIQSMALTPEDTVNEIFDNFGKVHSYYVGEHPKSQVKKWRIENDDDGLAEYMGKFYE。
Claims (9)
1.一种NADH依赖型7β-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于， 所述突变体为以下任一种：
(a)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第94 位的异亮氨酸突变成缬氨酸，该突变体命名为Cle7β-1A；
(b)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第95位的丙氨酸均突变成缬氨酸，该突变体命名为Cle7β-1B；
(c)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第191位的丙氨酸突变成苏氨酸，该突变体命名为Cle7β-1C；
(d)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第94位的异亮氨酸和第95位的丙氨酸均突变成缬氨酸，该突变体命名为Cle7β-2A；
(e)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第94位的异亮氨酸突变成缬氨酸和第191位的丙氨酸突变成苏氨酸，该突变体命名为Cle7β-2B；
（f）将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第95位的丙氨酸突变成缬氨酸和第191位的丙氨酸突变成苏氨酸，该突变体命名为Cle7β-2C；
（g）将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第94位的异亮氨酸和第95位的丙氨酸均突变成缬氨酸，第191位的丙氨酸突变成苏氨酸，该突变体命名为Cle7β-3。
2.一种编码NADH依赖型7β-羟基类固醇脱氢酶突变体的基因，其特征在于，为编码权利要求1所述的NADH依赖型7β-羟基类固醇脱氢酶突变体中的任一种的基因序列。
3.含有权利要求2所述编码基因的重组表达载体。
4.含有权利要求3所述重组表达载体的基因工程菌。
5.NADH依赖型7β-羟基类固醇脱氢酶突变体的应用，其特征在于，使用权利要求1所述的7β-羟基类固醇脱氢酶突变体催化7-酮石胆酸制备熊去氧胆酸。
6.NADH依赖型7β-羟基类固醇脱氢酶突变体的应用，其特征在于，使用权利要求1所述的7β-羟基类固醇脱氢酶突变体催化牛磺-7-酮石胆酸制备牛磺熊去氧胆酸。
7.NADH依赖型7β-羟基类固醇脱氢酶突变体的应用，其特征在于，使用权利要求1所述的7β-羟基类固醇脱氢酶突变体催化7-酮胆酸制备熊胆酸。
8.NADH依赖型7β-羟基类固醇脱氢酶突变体的应用，其特征在于，使用权利要求1所述的7β-羟基类固醇脱氢酶突变体催化7，12-二酮胆酸制备12-酮-熊去氧胆酸。
9.根据权利要求5～8任一项所述NADH依赖型7β-羟基类固醇脱氢酶突变体的应用，其特征在于，催化反应中用到的辅酶NADH是由甲酸脱氢酶催化甲酸合成得到的，甲酸在甲酸脱氢酶催化下转变成CO2，同时反应中的NAD+还原成NADH，从而实现辅酶NADH的循环再生。
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