CN114854707B - 一种7β-羟基甾体脱氢酶突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种7β‑羟基甾体脱氢酶突变体，其氨基酸序列选自SEQ ID Nos.3‑5。该7β‑羟基甾体脱氢酶突变体能够在高底物浓度下快速催化7‑羰基石胆酸转化为熊去氧胆酸，具有工业化应用前景。

Description

一种7β-羟基甾体脱氢酶突变体
技术领域
本发明属于生物催化技术领域，具体地说，涉及一种7β-羟基甾体脱氢酶突变体及其在催化合成熊去氧胆酸中的应用。
背景技术
熊去氧胆酸(Ursodeoxycholic acid,UDCA)，化学名为3α,7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸，又名乌索去氧胆酸、熊脱氧胆酸，是鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholic acid,CDCA)的7β-羟基差向异构体，其化学结构式如下所示：
熊去氧胆酸是名贵中药熊胆粉的活性药物成分，临床上用于治疗胆固醇性结石和胆汁淤积性肝病。1997年，熊去氧胆酸成为第一个被美国食品药品监督管理局(FDA)批准治疗原发性胆汁性肝硬化(PBC)的药物。目前，熊去氧胆酸主要从熊胆中提取和化学合成。近年来，利用生物催化技术合成熊去氧胆酸由于具有反应条件温和、选择性高、绿色环保等优点，受到极大关注。其中7β-羟基甾体脱氢酶(7β-HSDH)是酶法合成熊去氧胆酸过程中最为重要的关键酶，其催化性能好坏直接决定了熊去氧胆酸的生产成本和产品质量。
2015年，华东理工大学许建和等从瘤胃球菌(Ruminococcus torques)中挖掘得到一个新的Rt7β-HSDH，也是当时第四个报道基因序列的7β-HSDH酶，通过进化改造得到活性提高5.5倍、40℃半衰期提高3倍、最适pH从弱酸性偏移至弱碱性的突变体Rt7β-HSDHT189V/V207M，并通过两步酶法级联反应成功将鹅去氧胆酸高效地转化为熊去氧胆酸。但是Rt7β-HSDH的比活力依然不高，并且伴有严重的底物和产物抑制，导致最终的底物上载量仅为40g/L(Process Biochemistry,2015,50(4):598–604；Journal of Agricultural andFood Chemistry,2017,65:1178-1185；CN107099516A；CN108546691A)。
2019年，中国科学院天津工业生物技术研究所朱敦明等人利用基因组挖掘策略，最终获得来源于Clostridium sp.Marseille的Cm7β-HSDH，其比活力达到26.5U mg-1，将其与7α-HSDH耦联后，可将10～60g/L鹅去氧胆酸完全转化为熊去氧胆酸，转化率大于98％(Advanced Synthesis&Catalysis,2019,361:2497–2504；CN109722442A)。
2021年，专利文献CN113416717A公开了一种通过分子改造得到酶比活力提高2.59倍的7β-HSDH，虽然该7β-HSDH酶的活力有一定程度提升，但是仍不够显著，它仅能催化50g/L底物7-羰基石胆酸转化为熊去氧胆酸，不利于工业规模化应用。
综上所述，通过酶法催化7-羰基石胆酸(7-oxo-LCA)的不对称还原反应合成熊去氧胆酸，具有立体选择性高和环境友好等优势，已有诸多相关报道，并取得了一定进展。但是，现有技术的7β-羟基甾体脱氢酶依然存在许多不足之处，例如我们通过实验验证发现目前公开报道的许多7β-羟基甾体脱氢酶的催化活性实际上都较低，存在对底物/产物浓度的耐受性较差以及整体生产效率不高等问题。
发明内容
为了开发催化性能更好的酶催化剂，以满足催化转化效率高、底物上载量高和时空产率高等工业化应用的需求，我们在之前CN107099516A和CN108546691A的Rt7β-HSDH研究基础上继续进行酶突变体的发掘，筛选出多个综合性能进一步提高的7β-羟基甾体脱氢酶突变体，具有比活力更高、反应底物浓度高、热稳定性更好等优点。具体地，本发明包括如下技术方案。
一种7β-羟基甾体脱氢酶突变体，其选自下组：
氨基酸序列为SEQ ID No.3的多肽，本文中命名为M8或者7β-HSDHM8；
氨基酸序列为SEQ ID No.4的多肽，本文中命名为M18或者7β-HSDHM18；
氨基酸序列为SEQ ID No.5的多肽，本文中命名为M19或者7β-HSDHM19。
本发明第二方面提供了编码上述7β-羟基甾体脱氢酶突变体SEQ ID Nos.3-5的基因。
相应地，本发明还提供了包含上述7β-羟基甾体脱氢酶突变体SEQ ID Nos.3-5编码基因的重组表达载体。该重组表达载体可以是任何适于表达上述基因的质粒，优选载体是PET系列，比如载体是pET22b、pET24a、pET28a等质粒，但并不受限于此。
本发明的另一方面还提供了一种用于表达上述7β-羟基甾体脱氢酶突变体SEQ IDNos.3-5的微生物。例如，该微生物是转化了上述质粒的转化子。优选微生物能满足重组表达载体可稳定地自行复制，并且其所编码的7β-羟基甾体脱氢酶突变体基因能被有效表达。
上述微生物可以选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。
上述的7β-羟基甾体脱氢酶突变体SEQ ID Nos.3-5及其表达微生物能够高效地催化合成熊去氧胆酸。
在一种合成熊去氧胆酸的实施方式中，以7-羰基石胆酸为底物，用所述7β-羟基甾体脱氢酶突变体SEQ ID Nos.3-5或者其表达微生物静息细胞催化不对称还原反应，得到熊去氧胆酸。
在另一种实施方式中，以鹅去氧胆酸为底物，用7β-羟基甾体脱氢酶突变体或者其表达微生物静息细胞催化与7α-羟基甾体脱氢酶(7α-HSDH)进行串联催化(顺序催化)鹅去氧胆酸的差向异构化反应，得到熊去氧胆酸。
具体地，该实施方式包括以下步骤：
(1)使用7α-羟基甾体脱氢酶催化鹅去氧胆酸立体选择性氧化生成7-羰基石胆酸；
(2)加入所述7β-羟基甾体脱氢酶突变体或者所述微生物静息细胞催化上述步骤(1)所得7-羰基石胆酸的不对称还原，制得熊去氧胆酸。
优选地，在步骤(1)结束后，采用化学或者物理的方法使7α-羟基甾体脱氢酶灭活，然后再进行步骤(2)的反应。例如，可采用物理加热的方法使7α-羟基甾体脱氢酶失活，以防止7-羰基石胆酸被逆转还原为鹅去氧胆酸。
上述实施方式中，可以在反应体系中加入辅酶再生系统。
上述辅酶再生系统可以选自下组：
(1)以葡萄糖为辅酶再生底物、以葡萄糖脱氢酶为辅酶再生酶，包含NADPH或NADP+的葡萄糖脱氢酶再生系统；
(2)以丙酮酸为辅酶再生底物、以乳酸脱氢酶为辅酶再生酶，包含NADH或NAD+的乳酸脱氢酶再生系统。
例如，上述反应条件可以为：底物7-羰基石胆酸的加料浓度为50～150g/L，葡萄糖用量为7-羰基石胆酸的1.0～1.5倍当量，NADP+用量为0～0.5mM，缓冲溶液为pH 6.0～9.0的磷酸盐缓冲液，反应温度为20～35℃。
上述反应体系中，所述7β-羟基甾体脱氢酶突变体和/或所述7α-羟基甾体脱氢酶和/或辅酶再生酶既可以呈酶形式，也可以呈其表达微生物菌体静息细胞形式。
与专利文献CN107099516A、CN108546691A、CN113416717A和CN109722442A中报道的酶活性最高的7β-羟基甾体脱氢酶(突变体)相比，本发明筛选得到的7β-羟基甾体脱氢酶突变体SEQ ID Nos.3-5在催化7-羰基石胆酸进行不对称还原反应时表现出明显提高酶活性和明显降低的底物/产物抑制性，反应底物浓度高，底物7-羰基石胆酸的浓度能够高达150g/L，因而更适合生物催化法生产熊去氧胆酸的工业化应用。
具体实施方式
本发明是对我们之前从瘤胃球菌(Ruminococcus torques)中挖掘得到的7β-羟基甾体脱氢酶Rt7β-HSDH(参见Journal of Agricultural and Food Chemistry,2017,65:1178-1185；CN107099516A和CN108546691A)的应用研究的延续。通过继续对文献Journalof Agricultural and Food Chemistry,2017,65:1178-1185中报道的7β-羟基甾体脱氢酶突变体7β-HSDHT189V/V207M(本文中称为出发酶、母本或者初始酶，氨基酸序列为SEQ ID No.2)的编码基因(本文中SEQ ID No.1)继续进行易错PCR技术的随机突变，经过大量的筛选工作，幸运地筛选到酶活力和/或热稳定性都进一步明显提高的突变体SEQ ID Nos.3-5，通过公升级反应器的小试，证实了它们应用于合成熊去氧胆酸的可行性。
为了表述方便起见，在本文中可以将出发酶7β-羟基甾体脱氢酶与其衍生的突变体统称为“7β-羟基甾体脱氢酶”。
上述所用术语“(酶活力、热稳定性)提高”或“改善”表示相较于参考水平提高至少10％，例如相较于参考水平提高至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或最高达并包括100％的提高，或者在10％-100％之间的任意提高，或相较于参考水平的至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍的提高，或2倍-10倍之间或更多的任意提高。
这三个突变体SEQ ID Nos.3-5(本文中编号M8、M18、M19)的共同特征是相对于出发酶SEQ ID No.2而言，都发生了下述4个位点的氨基酸突变：第41位精氨酸替换为天冬酰胺、第94位苯丙氨酸替换为酪氨酸、第196位丝氨酸替换为丙氨酸、第253位酪氨酸替换为苯丙氨酸。另外，实施例中编号为M3、M6、M7的突变体中也包含这4个突变，提示这4个突变属于正向突变，可能与酶的活性中心有关。另一方面也说明SEQ ID No.2中的其他位点突变会也造成突变体之间的酶活力和/或热稳定性发生重大变化，比如突变体M3、M6、M7的性能改善程度要比M8、M18、M19来的小；M8的热稳定性提高幅度要比M18大，这些位点突变的差异有待于进一步研究。
7β-羟基甾体脱氢酶突变体SEQ ID Nos.3-5可以通过基因工程菌发酵方法得到，基于其氨基酸序列，本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。
本领域技术人员通过所熟知的基因工程构建方式可以容易地获得这些基因、表达盒、质粒、转化体。
在催化潜手性氮杂环化合物进行氧化的反应体系中，7β-羟基甾体脱氢酶既可以呈现酶的形式，也可以呈现菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等；所述菌体的形式包括存活菌体(静息细胞)和死亡菌体。
本领域技术人员容易理解，微生物菌体本身就是一种天然的酶固定化形式，有时不需要进行破碎处理、甚至提取纯化蛋白的处理，就可以作为一种酶制剂用于催化反应。而且，菌体内包含有辅酶NADPH/NADP+(烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸，辅酶II)、NADH/NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，辅酶I)，对于需要辅酶参与的反应而言，这在经济方面是有利的。另一方面，相比分离出的酶的催化，本发明利用微生物的简单发酵就可以源源不断、取之不尽地提供酶或的供应，无需进一步提取、纯化分离酶等操作，经济效益明显，为工业化应用创造条件。
下面将结合具体实施例，对本发明中的技术方案和技术效果进行清楚、完整的描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例，凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
实施例
实施例中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
材料和方法
实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由苏州金唯智生物科技有限公司完成。
实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、感受态细胞制备、转化等主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。
重组质粒pET28a-7β-HSDHT189V/V207M，含有如SEQ ID No.1所示的核酸序列，为发明人自行构建，在文献Journal of Agricultural and Food Chemistry,2017,65:1178-1185中也有公开。
空质粒载体pET-28a购自Novagen公司。
E.coli BL21(DE3)感受态细胞、2×Taq PCR MasterMix、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。
限制性内切酶EcoR I、Xho I和T4 DNA连接酶均为New England Biolabs(NEB)公司的市售产品。
LB培养基：5g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，10g/L氯化钠。(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)
实施例1：7β-羟基甾体脱氢酶突变体的构建及高通量筛选
采用易错PCR技术对编码初始7β-羟基甾体脱氢酶SEQ ID No.2的核苷酸序列SEQID No.1进行随机突变。
使用的引物对包括：
上游引物序列：CCGGAATTCATGAATCTGCGTGAAAAATAC，
下游引物序列：CCGCTCGAGTTAATTGTTGCTATAGAAGC。
其中上游引物中下划线序列为EcoR I的酶切位点，下游引物中下划线序列为XhoI的酶切位点。
以pET28a-7β-HSDHT189V/V207M为模板，用rTaq DNA聚合酶进行易错PCR，构建随机突变库。PCR体系(50μL)：rTaq DNA聚合酶0.5μL，10×PCR buffer(Mg2+Plus)5.0μL，dNTPMixture(各2.0mM)4.0μL，终浓度为150μmol/L的MnCl2，pET28a-7β-HSDHT189V/V207M质粒0.5ng，上、下游引物(10μM)各2μL，加灭菌蒸馏水补足至50μL。
PCR反应程序：(1)95℃预变性5min；(2)94℃变性30s；(3)58℃退火30s；(4)72℃延伸1min；步骤(2)～(4)共进行30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存产物。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后切胶纯化回收，对回收后的目的基因DNA片段与空载质粒pET28a分别用限制性内切酶EcoR I和Xho I在37℃双酶切12h。双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后切胶纯化回收，用T4 DNA连接酶将得到的线性化pET28a质粒与纯化后的目的基因DNA片段置于16℃连接过夜。将连接产物转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，并均匀涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上，置于37℃培养箱中静置培养约12h。
将转化平板上的转化子用灭菌牙签挑入96孔深孔板中，于37℃，220rpm摇床中培养过夜。从一级板中吸取20μL菌液接入二级板中，于37℃，220rpm摇床中培养3-4h后，加入终浓度为0.2mM的IPTG，16℃培养20h。然后于4℃、3500×g离心10min，倒掉上层培养基，每个孔中加入200μL溶菌酶液(750mg溶菌酶和10mg DNA酶溶解于1L去离子水中)，振荡混匀，再于37℃摇床上处理2h。随后4℃、3500×g离心10min，取10μL适当稀释的细胞破碎上清转移到包含190μL反应液的96孔酶标板中(反应液配方为：100mM KPB,pH 8.0，0.5mM 7-羰基石胆酸，0.1mM NADPH)中，于30℃检测340nm处吸光度在1min内的变化值，突变体的活力越高其在340nm处的吸光度值变化越快。选择在340nm处吸光度值变化比出发酶大的突变体进行复筛，通过摇瓶诱导表达、纯化测定纯酶比活力，并对相应的基因进行测序。
通过筛选，获得的优选突变体对7-羰基石胆酸的活性显著提高，进而对这些突变体的热稳定性进行了表征，优选热稳定性增高的系列突变体。对突变体的基因组中相应的7β-羟基甾体脱氢酶编码区基因进行测序，确定突变位点。全基因合成突变体编码基因，并在基因两端设计限制性内切酶位点EcoR I和Xho I，亚克隆到载体pET28a的相应位点，获得重组表达质粒，将重组表达质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态，得到表达重组7β-羟基甾体脱氢酶突变体的系列重组大肠杆菌。
实施例2：重组7β-羟基甾体脱氢酶突变体的纯化
将2.0g重组7β-羟基甾体脱氢酶突变体的静息细胞用10mL的缓冲液(A液)重悬，冰水浴中进行超声破碎：400W功率，工作4s，间歇6s，进行99个循环，4℃下15000rpm离心40分钟，收集上清液，利用镍柱亲和层析进行蛋白纯化。以下为缓冲液配方：A液：KPB缓冲液(20mM,pH 7.4)，含有0.5M NaCl、10mM咪唑；B液：KPB缓冲液(20mM,pH 7.4)，含有0.5MNaCl、0.5M咪唑；C液：KPB缓冲液(25mM,pH 7.4)，150mM NaCl、1mM DTT。将7β-羟基甾体脱氢酶粗酶液上样到镍柱上，首先用A液洗脱杂蛋白，随后用B液洗脱目标蛋白，洗脱液超滤浓缩到一定体积后用C液进行置换，降低蛋白溶液中的咪唑浓度。根据SDS-PAGE检测的结果收集纯化的蛋白质，加入终浓度为20％(w/v)的甘油，于-80℃保存备用。
实施例3：7β-羟基甾体脱氢酶突变体的活力测定
测活反应体系1mL：包括970μL磷酸盐缓冲液(100mM,pH 8.0)，10μL NADPH(10mM)，10μL浓度为50mM的7-羰基石胆酸，30℃水浴恒温2min后加入10μL酶液(注：酶液可能需要适当稀释，以控制每分钟吸光值的变化在0.1～0.2左右)，混合均匀后通过分光光度计检测340nm处吸光度的变化。酶活力单位(U)为在上述条件下，每分钟催化1μmol NADPH氧化所需要的酶量。
酶活力的计算公式：酶活力(U)＝ΔA×V×103/(6220×l)。式中ΔA为1min内340nm处吸光度的变化；V为反应液的体积，单位mL；6220为摩尔消光系数，单位L/(mol·cm)；l为光程距离，单位cm。此处计算的活力为1mL测活体中添加的10μL酶液活力。
酶比活力和热稳定性都得到提高的突变体列于表1中。在表1的催化活性列中，一个加号“+”表示突变体蛋白的比活力比由出发酶SEQ ID No.2提高了1.0～2.0倍；两个加号“++”表示突变体蛋白的比活力比出发酶SEQ ID No.2提高了2.1～5.0倍；三个加号“+++”表示突变体蛋白的比活力比SEQ ID No.2提高了5.1～10.0倍。在热稳定性列(残余活力列)中，一个加号“+”对应于45℃保温30min后，突变体蛋白的残余活性保留5.0～20.0％；两个加号“++”对应于45℃保温30min后，突变体蛋白的残余活性保留20.1～50.0％；三个加号“+++”对应于45℃保温30min后，突变体蛋白的残余活性保留50.1～80.0％。出发酶7β-羟基甾体脱氢酶SEQ ID No.2的比活为41.6U/mg蛋白，45℃保温30min后，酶的残余活性为20％。
表1、7β-羟基甾体脱氢酶突变体和相应的活性改进列表
对应于突变体编号的7β-羟基甾体脱氢酶突变体的氨基酸序列分别如下：
(1)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第18位谷氨酸替换为天冬氨酸；
(2)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第18位谷氨酸替换为天冬氨酸，第20位缬氨酸替换为亮氨酸；
(3)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第33位甲硫氨酸替换为缬氨酸，第41位精氨酸替换为天冬酰胺，第94位苯丙氨酸替换为酪氨酸，第196位丝氨酸替换为丙氨酸，第253位酪氨酸替换为苯丙氨酸；
(4)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第40位精氨酸替换为异亮氨酸，第41位精氨酸替换为天冬酰胺；
(5)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第46位谷氨酰胺替换为亮氨酸；
(6)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第41位精氨酸替换为天冬酰胺，第70位丝氨酸替换为甘氨酸，第94位苯丙氨酸替换为酪氨酸，第196位丝氨酸替换为丙氨酸，第253位酪氨酸替换为苯丙氨酸；
(7)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第41位精氨酸替换为天冬酰胺，第78位谷氨酸替换为甘氨酸，第94位苯丙氨酸替换为酪氨酸，第196位丝氨酸替换为丙氨酸，第253位酪氨酸替换为苯丙氨酸；
(8)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第41位精氨酸替换为天冬酰胺，第81位赖氨酸替换为精氨酸，第94位苯丙氨酸替换为酪氨酸，第196位丝氨酸替换为丙氨酸，第253位酪氨酸替换为苯丙氨酸，命名为7β-HSDHM8；
(9)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第41位精氨酸替换为天冬酰胺，第82位天冬氨酸替换为甘氨酸，第196位丝氨酸替换为丙氨酸；
(10)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第93位半胱氨酸替换为丙氨酸；
(11)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第41位精氨酸替换为天冬酰胺，第94位苯丙氨酸替换为酪氨酸；
(12)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第96位苏氨酸替换为异亮氨酸；
(13)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第41位精氨酸替换为天冬酰胺，第99位赖氨酸替换为亮氨酸，第196位丝氨酸替换为丙氨酸；
(14)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第142位丝氨酸替换为丙氨酸；
(15)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第145位苏氨酸替换为丙氨酸；
(16)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第161位丝氨酸替换为甘氨酸；
(17)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第190位异亮氨酸替换为亮氨酸；
(18)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第41位精氨酸替换为天冬酰胺，第94位苯丙氨酸替换为酪氨酸，第196位丝氨酸替换为丙氨酸，第208位甲硫氨酸替换为缬氨酸，第253位酪氨酸替换为苯丙氨酸，命名为7β-HSDHM18；
(19)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第41位精氨酸替换为天冬酰胺，第94位苯丙氨酸替换为酪氨酸，第196位丝氨酸替换为丙氨酸，第209位赖氨酸替换为精氨酸，第253位酪氨酸替换为苯丙氨酸，命名7β-HSDHM19；
(20)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第210位苏氨酸替换为异亮氨酸；
(21)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第240位天冬酰胺替换为丙氨酸；
(22)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第250位天冬氨酸替换为谷氨酸。
由表1可知，三个突变体M8(本文中命名为7β-HSDHM8，氨基酸序列为SEQ ID No.3)、M18(本文中命名为7β-HSDHM18，氨基酸序列为SEQ ID No.4)、M19(本文中命名为7β-HSDHM19，氨基酸序列为SEQ ID No.5)的酶活力提高最显著，其中M8的热稳定性提高幅度最大，M19的热稳定性也有提高。
实施例4：重组7β-羟基甾体脱氢酶突变体的发酵制备
将实施例1中所得的包含7β-羟基甾体脱氢酶突变体的重组表达转化体接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃摇床振荡培养12小时，作为种子液。将发酵罐温度和搅拌转速分别设置为37℃和400rpm，通气量调至1vvm(3L/min)。待发酵罐各参数稳定后，在火焰保护下将200mL种子液接入装有3L培养基(甘油5g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，Na2HPO4 3g/L，Na2SO4 0.7g/L，KH2PO4 3.4g/L，MgSO4 0.25g/L，NH4Cl 2.7g/L)的发酵罐中，发酵开始。随着细胞生长，溶氧(DO)下降，当DO降至30％以下时提高搅拌转速，至转速升高至500rpm。发酵过程中流加氨水控制pH在7.0左右。发酵开始2h后每隔1h取样，检测发酵液中的细胞浓度(OD600)。培养4h后，补加碳氮源(250g/L甘油、60g/L蛋白胨、60g/L酵母膏)，流速为35mL/h。培养5h时，将发酵罐料液温度调节至25℃，同时将补料速率降低至27mL/h，培养5.5h加入IPTG水溶液(母液浓度1M，终浓度0.2mM)对目标蛋白进行诱导表达。诱导表达后每隔2h取样，测定OD600，诱导后10h，结束发酵。将发酵液离心共获得200g静息细胞。
实施例5：重组7β-羟基甾体脱氢酶突变体粗酶粉的制备
将100g实施例4中收获的重组细胞进行冷冻干燥，获得含有所述7β-羟基甾体脱氢酶突变体的冻干细胞25g。将80g收获的重组细胞悬浮于0.5L的缓冲液中，高压匀浆破碎，离心收集上清液，即可获得所述重组7β-羟基甾体脱氢酶突变体的粗酶液。收集的粗酶液放置在-80℃下冷冻，然后使用真空冷冻干燥机低温干燥，获得所述重组7β-羟基甾体脱氢酶突变体的粗酶粉约10g。将所获得的冻干酶粉保存在4℃冰箱内，可以方便地随取随用。
实施例6：7β-羟基甾体脱氢酶转化7-羰基石胆酸合成熊去氧胆酸
10mL反应体系包含7-羰基石胆酸(7-oxo-LCA)50g/L、葡萄糖(底物7-oxo-LCA的1.5倍当量)、5g/L如实施例4所述重组表达转化体的静息细胞(5kU/L)、10kU/L的葡萄糖脱氢酶(Journal of Agricultural and Food Chemistry,2017,65:1178-1185.)、辅酶NADP+(0.05mM)、磷酸盐缓冲液(100mM,pH 8.0)，磁力搅拌，利用水浴控制反应温度25℃，反应过程中利用1M氢氧化钠滴定控制反应体系pH为8.0。反应6小时后，取200μL反应液，用1M HCl调节pH至3～4后加入1mL乙酸乙酯萃取，取出有机相，挥干后加入100μL甲醇进行液相色谱分析转化率。液相色谱分析条件为：使用C18柱(250mm×4.6mm)，流动相为甲醇/水＝75:25(v/v，用磷酸调节pH为3.0)，柱温30℃，流速0.8ml/min，检测波长210nm。各种7β-羟基甾体脱氢酶催化7-羰基石胆酸反应的反应性列于表2中。
表2、7β-羟基甾体脱氢酶催化7-羰基石胆酸不对称还原反应的转化率
由表2可知，三个突变体M8、M18和M19催化底物反应的转化率都不低于95％，其中M8催化的转化率达到98％，几近反应完全。
实施例29-32：三个突变体与现有技术7β-羟基甾体脱氢酶的比较
为了考察上述三个突变体M8、M18和M19相对于现有技术7β-羟基甾体脱氢酶的优缺点，选取专利文献中报道的酶活力和/或稳定性最好的7β-羟基甾体脱氢酶(含突变体)作为比较对象，包括CN107099516A中编号M12、CN108546691A中编号M12、CN113416717A中7β-HSDHCM和CN109722442A中7β-HSDHRtV3。根据它们的氨基酸序列，进行大肠杆菌偏好性的密码子优化，得到相应的编码基因。全基因合成这4种现有技术7β-羟基甾体脱氢酶的编码基因，并在基因两端设计限制性内切酶位点EcoR I和Xho I，亚克隆到载体pET28a的相应位点，获得重组表达质粒，将重组表达质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态，得到分别表达CN107099516A中编号M12、CN108546691A中编号M12、CN113416717A中7β-HSDHCM和CN109722442A中7β-HSDHRtV3的重组大肠杆菌。分别按照实施例4和实施例5的方法，制备上述4种重组大肠杆菌的静息细胞和粗酶粉。
按照实施例6的方法，分别采用10mL反应体系进行催化实验，反应体系包含7-羰基石胆酸(100g/L)、葡萄糖(底物的1.5倍当量)、10g/L静息细胞催化剂、20kU/L的葡萄糖脱氢酶、辅酶NADP+(0.1mM)、磷酸盐缓冲液(100mM,pH 8.0)，磁力搅拌，利用水浴控制反应温度25℃，反应过程中利用1M氢氧化钠滴定控制反应体系pH为8.0。反应6小时后，取200μL反应液，用1M HCl调节pH至3～4后加入1mL乙酸乙酯萃取，取出有机相，挥干后加入100μL甲醇进行液相色谱分析转化率。液相色谱分析条件为：使用C18柱(250mm×4.6mm)，流动相为甲醇/水＝75:25(v/v，用磷酸调节pH为3.0)，柱温30℃，流速0.8ml/min，检测波长210nm。三个突变体M8、M18和M19及四种现有技术7β-羟基甾体脱氢酶催化7-羰基石胆酸反应的反应性列于表3中。
表3、七种7β-羟基甾体脱氢酶(突变体)催化7-羰基石胆酸不对称还原反应的转化率
如表3所示，在相同反应条件下，本发明筛选得到的三个突变体M8、M18和M19催化底物反应的转化率都超过91％，其中M8催化反应的转化率达到97％，都比已经报道的现有技术7β-羟基甾体脱氢酶有成倍数地提高，证明三个突变体M8、M18和M19的酶活力显著高于现有技术7β-羟基甾体脱氢酶。
将突变体M8(7β-HSDHM8)作为重点开发对象，进一步研究其底物/产物抑制性及工业应用可能性。
实施例35：突变体7β-HSDHM8催化7-羰基石胆酸转化合成熊去氧胆酸
10mL反应体系包含150g/L底物7-羰基石胆酸、葡萄糖(底物的1.5倍当量)、20g/L如实施例4所述重组表达转化体7β-HSDHM8的冻干酶粉(20kU/L)、40kU/L的葡萄糖脱氢酶、辅酶NADP+(0.2mM)、磷酸盐缓冲液(100mM,pH 8.0)，磁力搅拌，利用水浴控制反应温度30℃，反应过程中利用1M氢氧化钠滴定控制反应体系pH为8.0。间歇取样检测反应转化率，反应10h后，测得转化率为98％。
该结果表明，突变体7β-HSDHM8能够耐受至少150g/L的高底物浓度，底物/产物抑制性低，这是一种具有工业化应用价值的优良性状。
实施例36：7β-HSDHM8与7α-HSDH串联催化鹅去氧胆酸差向异构化合成熊去氧胆酸
10mL反应体系包含150g/L底物鹅去氧胆酸(CDCA)、丙酮酸钠(底物CDCA的1.2倍当量)、10kU/L 7α-HSDH、15kU/L的乳酸脱氢酶、辅酶NAD+(0.2mM)、磷酸盐缓冲液(100mM,pH8.5)，30℃条件下磁力搅拌反应3h，检测转化率大于99％。
混合液于90℃加热5分钟，冷却后，加入20g/L如实施例4所述重组表达转化体7β-HSDHM8的冻干酶粉(20kU/L)、40kU/L葡萄糖脱氢酶、葡萄糖(7-羰基石胆酸的1.2倍当量)、辅酶NADP+(0.2mM)，磁力搅拌，利用水浴控制反应温度30℃，反应过程中利用1M氢氧化钠滴定控制反应体系pH为8.5。间歇取样检测反应转化率，反应10h后，测得转化率为99％。
该结果表明，突变体7β-HSDHM8能够与7α-羟基甾体脱氢酶进行高效率的顺序催化，使鹅去氧胆酸发生差向异构化反应，得到熊去氧胆酸。
实施例37：公升规模7β-HSDHM8静息细胞催化7-羰基石胆酸合成熊去氧胆酸
在2L夹套反应器中进行反应，1L磷酸钾缓冲液(10mM,pH 8.0)中加入150g/L底物7-羰基石胆酸、葡萄糖(底物的1.2倍当量)、20g/L如实施例4所述重组表达转化体7β-HSDHM8的冻干细胞(20kU/L)、40kU/L的葡萄糖脱氢酶、辅酶NADP+(0.2mM)，机械搅拌反应，搅拌转速为350rpm，利用水浴控制反应温度30℃，反应过程中利用1M氢氧化钠滴定控制反应体系pH为8.0。间歇取样检测反应转化率，反应8h后，测得转化率大于99％，用1M的HCl调节pH至3～4终止反应，用等体积的乙酸乙酯萃取三次，将萃取液混合，用等体积饱和食盐水洗涤两次，洗涤后的萃取液用无水硫酸钠干燥过夜。旋转蒸发浓缩至有结晶析出，冷却至室温，抽滤除去残余溶剂，获得熊去氧胆酸产品130g，分离得率为87％，产品比旋光度为+61.1°。
该实验结果表明本发明的突变酶能够用于小试规模的熊去氧胆酸合成反应，具有规模放大化的可行性。
实施例38：公升规模催化鹅去氧胆酸差向异构化合成熊去氧胆酸
在2L夹套反应器中进行反应，1L磷酸钾缓冲液(10mM,pH 8.5)中加入150g/L鹅去氧胆酸(CDCA)、丙酮酸钠(底物CDCA的1.2倍当量)、10kU/L 7α-HSDH、15kU/L的乳酸脱氢酶、辅酶NAD+(0.2mM)，30℃条件下机械搅拌反应，搅拌转速为350rpm，反应4h后，混合液于85℃加热30分钟，冷却后再加入20g/L如实施例4所述重组表达转化体7β-HSDHM8的冻干酶粉(20kU/L)、40kU/L的葡萄糖脱氢酶、葡萄糖(7-羰基石胆酸的1.2倍当量)、辅酶NADP+(0.2mM)，机械搅拌反应，搅拌转速为350rpm，利用水浴控制反应温度30℃，反应过程中利用1M氢氧化钠滴定控制反应体系pH为8.5。间歇取样检测反应转化率，反应9h后，测得转化率大于99％，用1M的HCl调节pH至3～4终止反应，用等体积的乙酸乙酯萃取三次，将萃取液混合，用等体积饱和食盐水洗涤两次，洗涤后的萃取液用无水硫酸钠干燥过夜。旋转蒸发浓缩至有结晶析出，冷却至室温，抽滤除去残余溶剂，获得熊去氧胆酸产品128g，分离得率为85％，产品比旋光度为+60.5°。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的提示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该视为仍在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 苏州百福安酶技术有限公司
<120> 一种7β-羟基甾体脱氢酶突变体
<130> SHPI2210138
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 792
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaatctgc gtgaaaaata cggcgaatgg ggcatcattc tgggcgcgac cgagggcgtg 60
ggcaaggcgt ttgcggaaaa gattgcgagc gaaggcatga gcgtggtcct ggtgggccgt 120
cgtgaagaaa aactgcaaga actgggtaaa tctattagcg aaacctatgg cgtggatcat 180
atggtcattc gtgccgattt cgcgcaaagc gattgcaccg acaagatctt tgaagcgacc 240
aaagatctgg acatgggctt tatgagctat gtggcgtgtt ttcacacctt tggcaagctg 300
caggataccc cgtgggaaaa acatgaacag atgattaatg tgaacgtgat gacctttctg 360
aagtgttttt accattatat gggcatcttt gcgaaacagg atcgtggcgc ggtgatcaat 420
gtgagcagcc tgaccgcgat tagcagcagc ccgtataatg cgcagtatgg cgcaggcaag 480
agctacatca aaaagctgac cgaagcggtg gcagcggaat gcgaaagcac caatgtggat 540
gtggaagtga ttaccctggg caccgttatt accccgagcc tgctgagcaa tctgccaggt 600
ggcccagcag gtgaagcaat gatgaaaacg gcgatgaccc cggaagcgtg cgtggaagaa 660
gcgtttgata atctgggcaa aagcctgagc gttattgcgg gcgaacataa caaagccaat 720
gttcataatt ggcaggcgaa caaaaccgat gatgaatata tccgttacat gggtagcttc 780
tatagcaaca at 792
<210> 2
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Asn Leu Arg Glu Lys Tyr Gly Glu Trp Gly Ile Ile Leu Gly Ala
1 5 10 15
Thr Glu Gly Val Gly Lys Ala Phe Ala Glu Lys Ile Ala Ser Glu Gly
20 25 30
Met Ser Val Val Leu Val Gly Arg Arg Glu Glu Lys Leu Gln Glu Leu
35 40 45
Gly Lys Ser Ile Ser Glu Thr Tyr Gly Val Asp His Met Val Ile Arg
50 55 60
Ala Asp Phe Ala Gln Ser Asp Cys Thr Asp Lys Ile Phe Glu Ala Thr
65 70 75 80
Lys Asp Leu Asp Met Gly Phe Met Ser Tyr Val Ala Cys Phe His Thr
85 90 95
Phe Gly Lys Leu Gln Asp Thr Pro Trp Glu Lys His Glu Gln Met Ile
100 105 110
Asn Val Asn Val Met Thr Phe Leu Lys Cys Phe Tyr His Tyr Met Gly
115 120 125
Ile Phe Ala Lys Gln Asp Arg Gly Ala Val Ile Asn Val Ser Ser Leu
130 135 140
Thr Ala Ile Ser Ser Ser Pro Tyr Asn Ala Gln Tyr Gly Ala Gly Lys
145 150 155 160
Ser Tyr Ile Lys Lys Leu Thr Glu Ala Val Ala Ala Glu Cys Glu Ser
165 170 175
Thr Asn Val Asp Val Glu Val Ile Thr Leu Gly Thr Val Ile Thr Pro
180 185 190
Ser Leu Leu Ser Asn Leu Pro Gly Gly Pro Ala Gly Glu Ala Met Met
195 200 205
Lys Thr Ala Met Thr Pro Glu Ala Cys Val Glu Glu Ala Phe Asp Asn
210 215 220
Leu Gly Lys Ser Leu Ser Val Ile Ala Gly Glu His Asn Lys Ala Asn
225 230 235 240
Val His Asn Trp Gln Ala Asn Lys Thr Asp Asp Glu Tyr Ile Arg Tyr
245 250 255
Met Gly Ser Phe Tyr Ser Asn Asn
260
<210> 3
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Asn Leu Arg Glu Lys Tyr Gly Glu Trp Gly Ile Ile Leu Gly Ala
1 5 10 15
Thr Glu Gly Val Gly Lys Ala Phe Ala Glu Lys Ile Ala Ser Glu Gly
20 25 30
Met Ser Val Val Leu Val Gly Arg Asn Glu Glu Lys Leu Gln Glu Leu
35 40 45
Gly Lys Ser Ile Ser Glu Thr Tyr Gly Val Asp His Met Val Ile Arg
50 55 60
Ala Asp Phe Ala Gln Ser Asp Cys Thr Asp Lys Ile Phe Glu Ala Thr
65 70 75 80
Arg Asp Leu Asp Met Gly Phe Met Ser Tyr Val Ala Cys Tyr His Thr
85 90 95
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145 150 155 160
Ser Tyr Ile Lys Lys Leu Thr Glu Ala Val Ala Ala Glu Cys Glu Ser
165 170 175
Thr Asn Val Asp Val Glu Val Ile Thr Leu Gly Thr Val Ile Thr Pro
180 185 190
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195 200 205
Lys Thr Ala Met Thr Pro Glu Ala Cys Val Glu Glu Ala Phe Asp Asn
210 215 220
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225 230 235 240
Val His Asn Trp Gln Ala Asn Lys Thr Asp Asp Glu Phe Ile Arg Tyr
245 250 255
Met Gly Ser Phe Tyr Ser Asn Asn
260
<210> 4
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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1 5 10 15
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20 25 30
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
Met Gly Ser Phe Tyr Ser Asn Asn
260
<210> 5
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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180 185 190
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195 200 205
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225 230 235 240
Val His Asn Trp Gln Ala Asn Lys Thr Asp Asp Glu Phe Ile Arg Tyr
245 250 255
Met Gly Ser Phe Tyr Ser Asn Asn
260

Claims (10)

1.一种7β-羟基甾体脱氢酶突变体，其选自下组：氨基酸序列为SEQ ID No.3的多肽，氨基酸序列为SEQ ID No.4的多肽，氨基酸序列为SEQ ID No.5的多肽。
2.编码如权利要求1所述7β-羟基甾体脱氢酶突变体的基因。
3.一种表达如权利要求1所述7β-羟基甾体脱氢酶突变体的微生物。
4.如权利要求3所述的微生物，其特征在于，为大肠杆菌。
5.如权利要求1所述的7β-羟基甾体脱氢酶突变体或者如权利要求3所述的微生物在催化合成熊去氧胆酸中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，以7-羰基石胆酸为底物，用所述7β-羟基甾体脱氢酶突变体或者所述微生物静息细胞催化不对称还原反应，得到熊去氧胆酸。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，以鹅去氧胆酸为底物，用7β-羟基甾体脱氢酶突变体或者其表达微生物静息细胞催化与7α-羟基甾体脱氢酶进行串联催化鹅去氧胆酸的差向异构化反应，得到熊去氧胆酸。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)使用7α-羟基甾体脱氢酶催化鹅去氧胆酸立体选择性氧化生成7-羰基石胆酸；
(2)加入所述7β-羟基甾体脱氢酶突变体或者所述微生物静息细胞催化上述步骤(1)所得7-羰基石胆酸的不对称还原，制得熊去氧胆酸。
9.如权利要求7或8所述的应用，其特征在于，反应体系中加入辅酶再生系统。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述辅酶再生系统选自下组：
(1)以葡萄糖为辅酶再生底物、以葡萄糖脱氢酶为辅酶再生酶，包含NADPH或NADP+的葡萄糖脱氢酶再生系统；
(2)以丙酮酸为辅酶再生底物、以乳酸脱氢酶为辅酶再生酶，包含NADH或NAD+的乳酸脱氢酶再生系统。
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