CN112746067A - 用于制备d-鸟氨酸的赖氨酸脱羧酶突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种L‑赖氨酸脱羧酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6，能够有效催化L‑鸟氨酸的脱羧反应，从而通过外消旋鸟氨酸拆分法制备D‑鸟氨酸，具有工业化开发应用价值。

Description

用于制备D-鸟氨酸的赖氨酸脱羧酶突变体
技术领域
本发明属于基因工程和酶催化技术领域，具体地说，涉及一种L-赖氨酸脱羧酶(L-lysine decarboxylase，Ldc)突变体、及其在制备D-鸟氨酸中的用途。
背景技术
D-鸟氨酸是一种非天然氨基酸，具有独特的生物学特性，在多肽药物以及一些氨基酸类抗生素中杂入D-鸟氨酸后，新形成的药物因难以被细菌降解，可以降低细菌耐药性的产生。此外，D-鸟氨酸也可用于新型氨基酸农药的合成，应用前景广阔。
已报道的D-鸟氨酸生产技术，一般是，以L-精氨酸为底物，经过水解和消旋反应得到DL-鸟氨酸混旋中间产物，然后使用蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)A S1.1009中的赖氨酸脱羧酶进行拆分反应，获得D-鸟氨酸。目前也可以通过使用表达赖氨酸脱羧酶的大肠杆菌工程菌作为催化剂进行拆分反应，获得D-鸟氨酸。赖氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.18)，一般既可以催化L-赖氨酸发生脱羧反应，也可以催化L-鸟氨酸发生脱羧反应，其中L-鸟氨酸在L-赖氨酸脱羧酶(L-lysine decarboxylase，Ldc)的催化下，生成腐胺和二氧化碳。
发明内容
发明人对于能够催化L-鸟氨酸脱酸的赖氨酸脱羧酶进行了广泛筛选，发现来源于反刍月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)的赖氨酸脱羧酶(UniProtKB-O50657)具有该功能，但酶活力偏低，难以进行工业化应用。于是尝试对其进行定向进化筛选，终于获得了酶活力明显提升的优良突变体，可以用于DL-鸟氨酸的拆分，实现D-鸟氨酸的制备。具体来说，本发明包括如下技术方案：
一种L-赖氨酸脱羧酶突变体，其氨基酸序列为：
SEQ ID NO:4，其为SEQ ID NO:1第136位的R替换为V、第64位的G替换为D、第207位的M替换为H的突变体，即：
MKNFRLSEKEVKTLAKRIPTPFLVASLDKVEENYQFMRRHLPRAGVFYAMKANPTPEILSLLADLGSHFDVASAGEMEILHELGVDGSQMIYANPVKDARGLKAAADYNVRRFTFDDPSEIDKMAKAVPGADVLVVIAVRNNKALVDLNTKFGAPVEEALDLLKAAQDAGLHAMGICFHVGSQSLSTAAYEEALLVARRLFDEAEEHGMHLTDLDIGGGFPVPDAKGLNVDLAAMMEAINKQIDRLFPDTAVWTEPGRYMCGTAVNLVTSVIGTKTRGEQPWYILDEGIYGCFSGIMYDHWTYPLHCFGKGNKKPSTFGGPSCDGIDVLYRDFMAPELKIGDKVLVTEMGSYTSVSATRFNGFYLAPTIIFEDQPEYAARLTEDDDVKKKAAV(SEQ ID NO:4)；
SEQ ID NO:6，其为SEQ ID NO:1第136位的R替换为V、第67位的S替换为I、第241位的K替换为A、第310位的K替换为G的突变体，即：
MKNFRLSEKEVKTLAKRIPTPFLVASLDKVEENYQFMRRHLPRAGVFYAMKANPTPEILSLLAGLGIHFDVASAGEMEILHELGVDGSQMIYANPVKDARGLKAAADYNVRRFTFDDPSEIDKMAKAVPGADVLVVIAVRNNKALVDLNTKFGAPVEEALDLLKAAQDAGLHAMGICFHVGSQSLSTAAYEEALLVARRLFDEAEEMGMHLTDLDIGGGFPVPDAKGLNVDLAAMMEAINAQIDRLFPDTAVWTEPGRYMCGTAVNLVTSVIGTKTRGEQPWYILDEGIYGCFSGIMYDHWTYPLHCFGGGNKKPSTFGGPSCDGIDVLYRDFMAPELKIGDKVLVTEMGSYTSVSATRFNGFYLAPTIIFEDQPEYAARLTEDDDVKKKAAV(SEQ ID NO:6)。
优选上述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:6。
本发明的第二个目的在于提供编码上述L-赖氨酸脱羧酶突变体的基因。
优选地，编码上述突变体SEQ ID NO:4的基因具有下述核苷酸序列：
atgaaaaatttcagacttagcgaaaaagaagtaaaaacgcttgccaagcgtatcccgacgccctttttggtggcttcactggacaaggttgaggaaaactaccagtttatgcgccgtcatttgccgcgggcgggagtgttttatgccatgaaggcgaatcctacgccagaaatactgtccctgctggctGATcttggttctcactttgatgtggcctctgccggggagatggagatcctccatgaattgggcgtagatggttcccagatgatatatgccaatccggtaaaggatgcccgtggcctcaaggctgcggctgactacaatgtccgccggtttactttcgacgatccgtcggaaatcgacaagatggccaaggctgtgccgggagccgatgtgctggtgGTGatcgccgtgcgcaacaacaaagctttggtggatctgaatacgaagtttggtgcgccggtggaagaagcgctggatcttttaaaggctgcgcaggatgctggcctgcatgccatggggatttgcttccatgtgggcagccagtccctgtctacggcggcttatgaggaagccctgctggtggctcgtaggctctttgatgaggcggaagaaCATggcatgcacctgactgacctcgacatcggcggcggtttccctgttcccgatgccaaggggctcaatgtggatctggcggccatgatggaagccatcaacaagcagatcgaccgcctgttcccggatacagctgtttggacggaaccgggccgttatatgtgcggtacggcggtgaacctcgtcacatcggttatcggcacgaaaacccgtggtgagcagccttggtatatcttagatgaaggcatctatggctgcttctccggcatcatgtatgaccactggacgtacccgcttcattgcttcggcaaggggaataagaaaccttcgactttcggcggccccagctgcgatggcatcgatgtgctctatcgcgacttcatggcaccggagctcaagatcggggacaaggtgctggtgacggaaatgggttcctataccagcgtcagcgctacgcgtttcaacggtttctacctggcgcccaccatcatctttgaggaccagccggaatatgcagcccgtctgacggaagatgatgatgtgaagaaaaaggcggctgtataa(SEQ ID NO:3)。
编码上述突变体SEQ ID NO:6的基因具有下述核苷酸序列：
atgaaaaatttcagacttagcgaaaaagaagtaaaaacgcttgccaagcgtatcccgacgccctttttggtggcttcactggacaaggttgaggaaaactaccagtttatgcgccgtcatttgccgcgggcgggagtgttttatgccatgaaggcgaatcctacgccagaaatactgtccctgctggctggccttggtATCcactttgatgtggcctctgccggggagatggagatcctccatgaattgggcgtagatggttcccagatgatatatgccaatccggtaaaggatgcccgtggcctcaaggctgcggctgactacaatgtccgccggtttactttcgacgatccgtcggaaatcgacaagatggccaaggctgtgccgggagccgatgtgctggtgGTGatcgccgtgcgcaacaacaaagctttggtggatctgaatacgaagtttggtgcgccggtggaagaagcgctggatcttttaaaggctgcgcaggatgctggcctgcatgccatggggatttgcttccatgtgggcagccagtccctgtctacggcggcttatgaggaagccctgctggtggctcgtaggctctttgatgaggcggaagaaatgggcatgcacctgactgacctcgacatcggcggcggtttccctgttcccgatgccaaggggctcaatgtggatctggcggccatgatggaagccatcaacGCCcagatcgaccgcctgttcccggatacagctgtttggacggaaccgggccgttatatgtgcggtacggcggtgaacctcgtcacatcggttatcggcacgaaaacccgtggtgagcagccttggtatatcttagatgaaggcatctatggctgcttctccggcatcatgtatgaccactggacgtacccgcttcattgcttcggcGGCgggaataagaaaccttcgactttcggcggccccagctgcgatggcatcgatgtgctctatcgcgacttcatggcaccggagctcaagatcggggacaaggtgctggtgacggaaatgggttcctataccagcgtcagcgctacgcgtttcaacggtttctacctggcgcccaccatcatctttgaggaccagccggaatatgcagcccgtctgacggaagatgatgatgtgaagaaaaaggcggctgtataa(SEQ ID NO:5)。
本发明的第三个目的在于提供包含上述基因的质粒。该质粒例如可以选自pSH质粒、pET系列比如pET24a或pET28a等。
本发明的第四个目的在于提供一种表达上述L-赖氨酸脱羧酶突变体SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的微生物。该微生物例如是转化了上述质粒的微生物。
优选地，上述微生物选自大肠杆菌、酵母、枯草杆菌。更优选大肠杆菌BL21(DE3)。
通过上述微生物的发酵，可获得L-赖氨酸脱羧酶突变体。例如，在微生物发酵后，菌体用缓冲液重悬，超声破碎，离心，收集上清过柱层析，洗脱目的蛋白，即得纯化的L-赖氨酸脱羧酶突变体。
本发明的第四个方面在于提供一种生产D-鸟氨酸的方法。该方法通过对外消旋的DL-鸟氨酸进行酶促拆分来制备D-鸟氨酸，即，以外消旋体DL-鸟氨酸为底物，使用上述L-赖氨酸脱羧酶突变体或者上述微生物来催化L-鸟氨酸发生脱羧反应，得到未反应的残留D-鸟氨酸。
上述生产D-鸟氨酸的外消旋体拆分反应体系可以为缓冲液体系比如磷酸盐缓冲液，pH5.0-9.0，优选pH6.0-8.0、pH6.2-7.5，例如为pH6.5-7.0。反应温度可以为25-45℃，例如28-42℃，优选30-38℃、最优选35-37℃。
该反应体系中不需要添加有磷酸吡哆醛(PLP)，不像鸟氨酸脱羧酶那样需要PLP作为辅酶。而且，本发明得到的L-赖氨酸脱羧酶突变体SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6都对于脱羧产物腐胺具有较高浓度的耐受性，即，产物抑制性较小，可以在反应体系中加入较高浓度的DL-鸟氨酸，提高时空反应速率，这对于拆分反应也是有利的。
与来源的野生型L-赖氨酸脱羧酶SEQ ID NO:1相比，本发明获得的L-赖氨酸脱羧酶突变体SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6具有显著提高的酶活力，能够有效催化L-鸟氨酸的脱羧反应，从而通过外消旋体拆分法制备D-鸟氨酸。
具体实施方式
为了获得高酶活力的能催化L-鸟氨酸脱羧的L-赖氨酸脱羧酶，为工业化生产D-鸟氨酸提供基础，发明人对于赖氨酸脱羧酶进行了大量的筛选比较，选择底物抑制性低、产物抑制性低和对L-鸟氨酸立体专一性高的酶品种，最终选择反刍月形单胞菌(Selenomonasruminantium)来源的赖氨酸脱羧酶(UniProtKB-O50657)作为改造对象。该野生型Ldc的氨基酸序列为SEQ ID NO:1：
MKNFRLSEKEVKTLAKRIPTPFLVASLDKVEENYQFMRRHLPRAGVFYAMKANPTPEILSLLAGLGSHFDVASAGEMEILHELGVDGSQMIYANPVKDARGLKAAADYNVRRFTFDDPSEIDKMAKAVPGADVLVRIAVRNNKALVDLNTKFGAPVEEALDLLKAAQDAGLHAMGICFHVGSQSLSTAAYEEALLVARRLFDEAEEMGMHLTDLDIGGGFPVPDAKGLNVDLAAMMEAINKQIDRLFPDTAVWTEPGRYMCGTAVNLVTSVIGTKTRGEQPWYILDEGIYGCFSGIMYDHWTYPLHCFGKGNKKPSTFGGPSCDGIDVLYRDFMAPELKIGDKVLVTEMGSYTSVSATRFNGFYLAPTIIFEDQPEYAARLTEDDDVKKKAAV(SEQ ID NO:1)。
该野生酶的编码基因(KEGG，SELR_16380)的碱基序列为SEQ ID NO:2：
atgaaaaatttcagacttagcgaaaaagaagtaaaaacgcttgccaagcgtatcccgacgccctttttggtggcttcactggacaaggttgaggaaaactaccagtttatgcgccgtcatttgccgcgggcgggagtgttttatgccatgaaggcgaatcctacgccagaaatactgtccctgctggctggccttggttctcactttgatgtggcctctgccggggagatggagatcctccatgaattgggcgtagatggttcccagatgatatatgccaatccggtaaaggatgcccgtggcctcaaggctgcggctgactacaatgtccgccggtttactttcgacgatccgtcggaaatcgacaagatggccaaggctgtgccgggagccgatgtgctggtgcgcatcgccgtgcgcaacaacaaagctttggtggatctgaatacgaagtttggtgcgccggtggaagaagcgctggatcttttaaaggctgcgcaggatgctggcctgcatgccatggggatttgcttccatgtgggcagccagtccctgtctacggcggcttatgaggaagccctgctggtggctcgtaggctctttgatgaggcggaagaaatgggcatgcacctgactgacctcgacatcggcggcggtttccctgttcccgatgccaaggggctcaatgtggatctggcggccatgatggaagccatcaacaagcagatcgaccgcctgttcccggatacagctgtttggacggaaccgggccgttatatgtgcggtacggcggtgaacctcgtcacatcggttatcggcacgaaaacccgtggtgagcagccttggtatatcttagatgaaggcatctatggctgcttctccggcatcatgtatgaccactggacgtacccgcttcattgcttcggcaaggggaataagaaaccttcgactttcggcggccccagctgcgatggcatcgatgtgctctatcgcgacttcatggcaccggagctcaagatcggggacaaggtgctggtgacggaaatgggttcctataccagcgtcagcgctacgcgtttcaacggtttctacctggcgcccaccatcatctttgaggaccagccggaatatgcagcccgtctgacggaagatgatgatgtgaagaaaaaggcggctgtataa(SEQ ID NO:2)。
本发明对野生酶Ldc的基因序列SEQ ID NO:2进行点突变。通过易错PCR技术获得一个氨基酸第136位点精氨酸(R)取代的突变体氨基酸序列，然后采用组合突变的技术，将包括64位甘氨酸(G)、67位丝氨酸(S)、第207位甲硫氨酸(M)、第241位赖氨酸(K)、第310位赖氨酸(K)进行组合突变，获得本发明中具有氨基酸序列SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的突变体，两者的氨基酸序列保持了90％以上的同源性。
在本发明中，术语“野生(型)”、“野生酶”、“野生型酶”表示相同的意义，都是指野生型L-赖氨酸脱羧酶SEQ ID NO:1。
本发明的L-赖氨酸脱羧酶突变体的氨基酸数量有393个，序列明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。
这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。
上述转化体宿主可以使任何适合表达L-赖氨酸脱羧酶的微生物，包括细菌和真菌。优选微生物是枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、或者大肠杆菌，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。
为了在不同微生物中进行蛋白质SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的最佳表达，可以针对特定的微生物比如大肠杆菌、毕赤酵母、或者枯草芽孢杆菌进行密码子优化。密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在生长快速的微生物如大肠杆菌中，优化密码子反映出其各自的基因组tRNA库的组成。因此，在生长快速的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以被用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化的DNA序列的表达在快速生长的微生物中得以改良。
当作为生物催化剂用于通过外消旋体拆分法生产D-鸟氨酸时，本发明的L-赖氨酸脱羧酶突变体呈现酶的形式、或者其表达微生物菌体的形式。上述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、载体固定的酶等。
作为另一种可选的实施方式，可以采用表达上述L-赖氨酸脱羧酶突变体的微生物菌体作为酶催化反应的生物催化剂。微生物可以呈菌体或者其细胞破碎物形式，菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体，因为当微生物比如枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母或者大肠杆菌不再进行发酵增殖、而是用于酶催化反应时，本身就是一种天然的固定化酶，而且不需要进行破碎处理、甚至提取纯化处理，就可以作为一种酶制剂用于催化反应。由于反应底物和反应产物都是小分子化合物，可以很方便地穿过菌体的生物屏障--细胞膜，因此不需要对菌体进行破碎处理，这在经济方面是有利的。
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
实施例
材料和方法
实施例中引物和基因合成、测序由南京金唯智生物技术有限公司完成。
实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、感受态细胞、转化等主要参考《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。
主要培养基：
LB液体培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠。(固体培养基另加20g/L琼脂粉。)
TB培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K2HPO4.3H2O、2.31g/LKH2PO4、5g/L甘油，pH7.0-7.5。(固体培养基另加20g/L琼脂粉。)
质粒pSH质粒由浙江华睿生物技术有限公司惠赠。
质粒pSH-Ldc质粒由洛阳华荣生物技术有限保存，任何单位和个人都可以获得该质粒及相关质粒和细菌用于验证本发明，但未经洛阳华荣生物技术有限允许不得用作其他用途，包括开发利用、科学研究和教学。
L-赖氨酸脱羧酶催化L-鸟氨酸脱酸的酶活力测定方法如下：
反应体系：1ml，50mM L-鸟氨酸，1mM PLP，0.1M，pH6.5的磷酸钾缓冲液，投酶量1％w/v(菌体或者破壁菌体)。
反应方案：将反应体系配制完成后，加入1％w/v(菌体或者破壁菌体)，37℃反应10min；反应完成后90℃加热5min终止反应；加入等体积的2×赖氨酸氧化酶/过氧化酶混合液(0.1U/ml赖氨酸氧化酶，1U/ml过氧化酶，3.6mM 2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)，0.1M，pH8.0的磷酸钾缓冲液)，混合均匀；13000rpm离心5min，上清检测OD412。
HPLC检测方法：安捷伦1260高效液相色谱，流动相A：流动相B＝1:3，流动相A为浓度为3％的NaH2PO4溶液，流动相B为水，色谱柱aglient SB-AQ，进样量5μL，流速1ml/min，柱温度25℃，波长205nm。
酶活定义：在pH6.5、温度37℃的条件下，每分钟催化底物L-鸟氨酸产生1微摩尔(μmol)腐胺所需要的酶量定义为1个单位(U)。
为描述方便起见，在实施例中有时将某一种酶蛋白编号、其基因编号和其表达菌株编号混用/套用，本领域技术人员容易理解它们在不同的环境指代不同的生物体含义。
实施例1：野生型Ldc表达菌株构建
委托苏州金维智生物技术有限公司对野生型L-赖氨酸脱羧酶的基因碱基序列SEQID NO:2进行全基因合成，亚克隆到pSH质粒(浙江华睿生物技术有限公司提供)中的NdeI/XhoI位点，得到用于表达野生型L-赖氨酸脱羧酶SEQ ID NO:1的质粒pSH-ldc。
然后将质粒pSH-ldc转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，菌株按常规方法培养后，提取质粒，测序验证正确，备用。
将重组质粒pSH-ldc电转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(Invitrogen公司)，得到表达野生型L-赖氨酸脱羧酶SEQ ID NO:1的重组菌株，命名为BL21(DE3)-Ldc或者简称Ldc。
实施例2：易错PCR法构建Ldc随机突变点库和筛选
2.1易错PCR法构建Ldc随机突变点库构建
以序列SEQ ID NO:2为模板，应用易错PCR技术构建随机突变体库。设计如下引物对ldc-Nde1-F和ldc-Xho1-R：
正向引物ldc-Nde1-F：5’-ATGAAAAATTTCAGACTTAGCGAAA-3’，
反向引物ldc-Xho1-R：5’-CTCGAGTTATACAGCCGCCTTTTTCT-3’。
50μL易错PCR反应体系包括：50ng质粒模板pSH-ldc，30pmol一对引物ldc-Nde1-F和ldc-Xho1-R，1X Taq buffer，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP，1mM dTTP，7mM MgCl2，(0mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM)MnCl2，2.5个单位的Taq酶(Fermentas)。
PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min/kbp；30个循环；72℃10min。胶回收1.2kb随机突变片段作为大引物，用KOD-plus DNA聚合酶做MegaPrimer PCR：94℃5min，；98℃10s，60℃30s，68℃2min/kbp，25个循环；68℃10min。
DpnI消化质粒模板，电转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到超过104个克隆的随机突变库。
2.2突变体库的高通量筛选
选取突变体库中的转化子接种到含700μL LB培养基的96孔深孔培养板中，培养基中含100μg/mL卡那霉素，37℃培养6h后，加入终浓度0.1mM IPTG后，降温至25℃，培养过夜。5000rpm离心10min，弃上清，置于-70℃冷冻1h，室温融化30min。加入200μL含50mM Tris-HCl(pH7.5)，重悬菌体，用于酶活力测定。
2.3高酶活力突变体的筛选
底物反应液：50mM的L-鸟氨酸，100mM的磷酸钾缓冲液调节pH6.5。
终止反应条件：90℃，5min。
将实施例2中获得的突变体库菌株的100μL菌液加入到100μL底物反应液中，37℃反应10min；反应完成后90℃加热5min终止反应；然后5000rpm离心10min。离心后取上清，加入等体积的2×赖氨酸氧化酶/过氧化酶混合液(0.1U/ml赖氨酸氧化酶，1U/ml过氧化酶，3.6mM 2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)，0.1M，pH8.0的磷酸钾缓冲液)，混合均匀；然后13000rpm离心5min，上清检测OD412。
筛选酶活力比实施例1中所得BL21(DE3)-Ldc菌株(Ldc)提高的突变菌株，构建了不少于5000克隆子的ldc酶活力提高的突变体库。
实施例3：Ldc的定向进化筛选
3.1对于实施例2中筛选得到的突变菌株，进一步验证其酶活力，其中两个突变菌株的酶活力提高了两倍以上，根据编号分别命名为Ldc-1298和Ldc-2590。
通过基因比较组学的研究方法，对菌株Ldc-1298和Ldc-2590进行基因组测序后，确定两个突变菌株中Ldc的突变位点，如表1所示。
表1：菌株对L-鸟氨酸脱羧反应的催化活力比较
Figure BDA0002916489250000081
*酶比活力：以野生酶的发酵活力(U/ml)与菌体浓度OD(OD/ml)的比值为100％。
酶活力比较显示，菌株Ldc-1298相比提高了2.4倍，而Ldc-2590则提高了11.3倍。有趣的是，它们都在Ldc的第136位氨基酸发生了R136V突变。
实施例4：突变体考察
委托南京金唯智生物技术有限公司分别对菌株Ldc-1298中编码L-赖氨酸脱羧酶突变体的基因碱基序列SEQ ID NO:3、菌株Ldc-2590中编码L-赖氨酸脱羧酶突变体的基因碱基序列SEQ ID NO:5进行全基因合成，亚克隆到pSH质粒(浙江华睿生物技术有限公司提供)中的NdeI/XhoI位点，分别得到用于表达L-赖氨酸脱羧酶突变体SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:6的质粒pSH-ldc-1298和pSH-ldc-2590。
然后分别将重组质粒质粒pSH-ldc-1298和pSH-ldc-2590电转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)(Invitrogen公司)感受态细胞中，涂含卡那霉素的LB平板培养过夜，分别挑选10个单菌落，接种到含有LB培养基的试管中，培养过夜，离心收集菌体，抽提质粒，基因测序确定突变正确，分别得到表达L-赖氨酸脱羧酶突变体SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的重组菌株，仍命名为Ldc-1298和Ldc-2590。
以下实验重点考察重组菌株Ldc-2590。
实施例5：突变酶Ldc-2590考察
从含有工程菌Ldc-2590的LB平板上挑选单克隆，接种到5ml LB培养基中，37℃培养过夜；1％v/v接种到含有100ml TB培养基的1000ml摇瓶中培养4-6小时，OD600达到1.2-1.5，加入0.2mM的IPTG诱导，降温到25℃，继续培养10-16小时，离心获得菌体，-80℃冻存24小时备用。
反应体系200mL，底物DL-鸟氨酸100g/L，加酶量分别为2％、4％、6％、8％w/v菌浓度，于37℃，200rpm下，控制pH 6.5，反应2h，测定腐胺生成量，计算产物生成率。结果如表2所示。
Figure BDA0002916489250000091
上述实验结果表明，相对于野生L-赖氨酸脱羧酶SEQ ID NO:1，L-赖氨酸脱羧酶突变体SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的酶活力都有了明显提高，为酶法拆分外消旋体制备D-鸟氨酸方法的工业化奠定了基础。
序列表
<110> 洛阳华荣生物技术有限公司
<120> 用于制备D-鸟氨酸的赖氨酸脱羧酶突变体
<130> SHPI2110013
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 393
<212> PRT
<213> Selenomonas ruminantium
<400> 1
Met Lys Asn Phe Arg Leu Ser Glu Lys Glu Val Lys Thr Leu Ala Lys
1 5 10 15
Arg Ile Pro Thr Pro Phe Leu Val Ala Ser Leu Asp Lys Val Glu Glu
20 25 30
Asn Tyr Gln Phe Met Arg Arg His Leu Pro Arg Ala Gly Val Phe Tyr
35 40 45
Ala Met Lys Ala Asn Pro Thr Pro Glu Ile Leu Ser Leu Leu Ala Gly
50 55 60
Leu Gly Ser His Phe Asp Val Ala Ser Ala Gly Glu Met Glu Ile Leu
65 70 75 80
His Glu Leu Gly Val Asp Gly Ser Gln Met Ile Tyr Ala Asn Pro Val
85 90 95
Lys Asp Ala Arg Gly Leu Lys Ala Ala Ala Asp Tyr Asn Val Arg Arg
100 105 110
Phe Thr Phe Asp Asp Pro Ser Glu Ile Asp Lys Met Ala Lys Ala Val
115 120 125
Pro Gly Ala Asp Val Leu Val Arg Ile Ala Val Arg Asn Asn Lys Ala
130 135 140
Leu Val Asp Leu Asn Thr Lys Phe Gly Ala Pro Val Glu Glu Ala Leu
145 150 155 160
Asp Leu Leu Lys Ala Ala Gln Asp Ala Gly Leu His Ala Met Gly Ile
165 170 175
Cys Phe His Val Gly Ser Gln Ser Leu Ser Thr Ala Ala Tyr Glu Glu
180 185 190
Ala Leu Leu Val Ala Arg Arg Leu Phe Asp Glu Ala Glu Glu Met Gly
195 200 205
Met His Leu Thr Asp Leu Asp Ile Gly Gly Gly Phe Pro Val Pro Asp
210 215 220
Ala Lys Gly Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Met Met Glu Ala Ile Asn
225 230 235 240
Lys Gln Ile Asp Arg Leu Phe Pro Asp Thr Ala Val Trp Thr Glu Pro
245 250 255
Gly Arg Tyr Met Cys Gly Thr Ala Val Asn Leu Val Thr Ser Val Ile
260 265 270
Gly Thr Lys Thr Arg Gly Glu Gln Pro Trp Tyr Ile Leu Asp Glu Gly
275 280 285
Ile Tyr Gly Cys Phe Ser Gly Ile Met Tyr Asp His Trp Thr Tyr Pro
290 295 300
Leu His Cys Phe Gly Lys Gly Asn Lys Lys Pro Ser Thr Phe Gly Gly
305 310 315 320
Pro Ser Cys Asp Gly Ile Asp Val Leu Tyr Arg Asp Phe Met Ala Pro
325 330 335
Glu Leu Lys Ile Gly Asp Lys Val Leu Val Thr Glu Met Gly Ser Tyr
340 345 350
Thr Ser Val Ser Ala Thr Arg Phe Asn Gly Phe Tyr Leu Ala Pro Thr
355 360 365
Ile Ile Phe Glu Asp Gln Pro Glu Tyr Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asp
370 375 380
Asp Asp Val Lys Lys Lys Ala Ala Val
385 390
<210> 2
<211> 1182
<212> DNA
<213> Selenomonas ruminantium
<400> 2
atgaaaaatt tcagacttag cgaaaaagaa gtaaaaacgc ttgccaagcg tatcccgacg 60
ccctttttgg tggcttcact ggacaaggtt gaggaaaact accagtttat gcgccgtcat 120
ttgccgcggg cgggagtgtt ttatgccatg aaggcgaatc ctacgccaga aatactgtcc 180
ctgctggctg gccttggttc tcactttgat gtggcctctg ccggggagat ggagatcctc 240
catgaattgg gcgtagatgg ttcccagatg atatatgcca atccggtaaa ggatgcccgt 300
ggcctcaagg ctgcggctga ctacaatgtc cgccggttta ctttcgacga tccgtcggaa 360
atcgacaaga tggccaaggc tgtgccggga gccgatgtgc tggtgcgcat cgccgtgcgc 420
aacaacaaag ctttggtgga tctgaatacg aagtttggtg cgccggtgga agaagcgctg 480
gatcttttaa aggctgcgca ggatgctggc ctgcatgcca tggggatttg cttccatgtg 540
ggcagccagt ccctgtctac ggcggcttat gaggaagccc tgctggtggc tcgtaggctc 600
tttgatgagg cggaagaaat gggcatgcac ctgactgacc tcgacatcgg cggcggtttc 660
cctgttcccg atgccaaggg gctcaatgtg gatctggcgg ccatgatgga agccatcaac 720
aagcagatcg accgcctgtt cccggataca gctgtttgga cggaaccggg ccgttatatg 780
tgcggtacgg cggtgaacct cgtcacatcg gttatcggca cgaaaacccg tggtgagcag 840
ccttggtata tcttagatga aggcatctat ggctgcttct ccggcatcat gtatgaccac 900
tggacgtacc cgcttcattg cttcggcaag gggaataaga aaccttcgac tttcggcggc 960
cccagctgcg atggcatcga tgtgctctat cgcgacttca tggcaccgga gctcaagatc 1020
ggggacaagg tgctggtgac ggaaatgggt tcctatacca gcgtcagcgc tacgcgtttc 1080
aacggtttct acctggcgcc caccatcatc tttgaggacc agccggaata tgcagcccgt 1140
ctgacggaag atgatgatgt gaagaaaaag gcggctgtat aa 1182
<210> 3
<211> 1182
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
atgaaaaatt tcagacttag cgaaaaagaa gtaaaaacgc ttgccaagcg tatcccgacg 60
ccctttttgg tggcttcact ggacaaggtt gaggaaaact accagtttat gcgccgtcat 120
ttgccgcggg cgggagtgtt ttatgccatg aaggcgaatc ctacgccaga aatactgtcc 180
ctgctggctg atcttggttc tcactttgat gtggcctctg ccggggagat ggagatcctc 240
catgaattgg gcgtagatgg ttcccagatg atatatgcca atccggtaaa ggatgcccgt 300
ggcctcaagg ctgcggctga ctacaatgtc cgccggttta ctttcgacga tccgtcggaa 360
atcgacaaga tggccaaggc tgtgccggga gccgatgtgc tggtggtgat cgccgtgcgc 420
aacaacaaag ctttggtgga tctgaatacg aagtttggtg cgccggtgga agaagcgctg 480
gatcttttaa aggctgcgca ggatgctggc ctgcatgcca tggggatttg cttccatgtg 540
ggcagccagt ccctgtctac ggcggcttat gaggaagccc tgctggtggc tcgtaggctc 600
tttgatgagg cggaagaaca tggcatgcac ctgactgacc tcgacatcgg cggcggtttc 660
cctgttcccg atgccaaggg gctcaatgtg gatctggcgg ccatgatgga agccatcaac 720
aagcagatcg accgcctgtt cccggataca gctgtttgga cggaaccggg ccgttatatg 780
tgcggtacgg cggtgaacct cgtcacatcg gttatcggca cgaaaacccg tggtgagcag 840
ccttggtata tcttagatga aggcatctat ggctgcttct ccggcatcat gtatgaccac 900
tggacgtacc cgcttcattg cttcggcaag gggaataaga aaccttcgac tttcggcggc 960
cccagctgcg atggcatcga tgtgctctat cgcgacttca tggcaccgga gctcaagatc 1020
ggggacaagg tgctggtgac ggaaatgggt tcctatacca gcgtcagcgc tacgcgtttc 1080
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ctgacggaag atgatgatgt gaagaaaaag gcggctgtat aa 1182
<210> 4
<211> 393
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 4
Met Lys Asn Phe Arg Leu Ser Glu Lys Glu Val Lys Thr Leu Ala Lys
1 5 10 15
Arg Ile Pro Thr Pro Phe Leu Val Ala Ser Leu Asp Lys Val Glu Glu
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Asn Tyr Gln Phe Met Arg Arg His Leu Pro Arg Ala Gly Val Phe Tyr
35 40 45
Ala Met Lys Ala Asn Pro Thr Pro Glu Ile Leu Ser Leu Leu Ala Asp
50 55 60
Leu Gly Ser His Phe Asp Val Ala Ser Ala Gly Glu Met Glu Ile Leu
65 70 75 80
His Glu Leu Gly Val Asp Gly Ser Gln Met Ile Tyr Ala Asn Pro Val
85 90 95
Lys Asp Ala Arg Gly Leu Lys Ala Ala Ala Asp Tyr Asn Val Arg Arg
100 105 110
Phe Thr Phe Asp Asp Pro Ser Glu Ile Asp Lys Met Ala Lys Ala Val
115 120 125
Pro Gly Ala Asp Val Leu Val Val Ile Ala Val Arg Asn Asn Lys Ala
130 135 140
Leu Val Asp Leu Asn Thr Lys Phe Gly Ala Pro Val Glu Glu Ala Leu
145 150 155 160
Asp Leu Leu Lys Ala Ala Gln Asp Ala Gly Leu His Ala Met Gly Ile
165 170 175
Cys Phe His Val Gly Ser Gln Ser Leu Ser Thr Ala Ala Tyr Glu Glu
180 185 190
Ala Leu Leu Val Ala Arg Arg Leu Phe Asp Glu Ala Glu Glu His Gly
195 200 205
Met His Leu Thr Asp Leu Asp Ile Gly Gly Gly Phe Pro Val Pro Asp
210 215 220
Ala Lys Gly Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Met Met Glu Ala Ile Asn
225 230 235 240
Lys Gln Ile Asp Arg Leu Phe Pro Asp Thr Ala Val Trp Thr Glu Pro
245 250 255
Gly Arg Tyr Met Cys Gly Thr Ala Val Asn Leu Val Thr Ser Val Ile
260 265 270
Gly Thr Lys Thr Arg Gly Glu Gln Pro Trp Tyr Ile Leu Asp Glu Gly
275 280 285
Ile Tyr Gly Cys Phe Ser Gly Ile Met Tyr Asp His Trp Thr Tyr Pro
290 295 300
Leu His Cys Phe Gly Lys Gly Asn Lys Lys Pro Ser Thr Phe Gly Gly
305 310 315 320
Pro Ser Cys Asp Gly Ile Asp Val Leu Tyr Arg Asp Phe Met Ala Pro
325 330 335
Glu Leu Lys Ile Gly Asp Lys Val Leu Val Thr Glu Met Gly Ser Tyr
340 345 350
Thr Ser Val Ser Ala Thr Arg Phe Asn Gly Phe Tyr Leu Ala Pro Thr
355 360 365
Ile Ile Phe Glu Asp Gln Pro Glu Tyr Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asp
370 375 380
Asp Asp Val Lys Lys Lys Ala Ala Val
385 390
<210> 5
<211> 1182
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
atgaaaaatt tcagacttag cgaaaaagaa gtaaaaacgc ttgccaagcg tatcccgacg 60
ccctttttgg tggcttcact ggacaaggtt gaggaaaact accagtttat gcgccgtcat 120
ttgccgcggg cgggagtgtt ttatgccatg aaggcgaatc ctacgccaga aatactgtcc 180
ctgctggctg gccttggtat ccactttgat gtggcctctg ccggggagat ggagatcctc 240
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aacaacaaag ctttggtgga tctgaatacg aagtttggtg cgccggtgga agaagcgctg 480
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cctgttcccg atgccaaggg gctcaatgtg gatctggcgg ccatgatgga agccatcaac 720
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ctgacggaag atgatgatgt gaagaaaaag gcggctgtat aa 1182
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<211> 393
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 6
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Ile Ile Phe Glu Asp Gln Pro Glu Tyr Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asp
370 375 380
Asp Asp Val Lys Lys Lys Ala Ala Val
385 390

Claims (10)

1.一种L-赖氨酸脱羧酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6。
2.编码如权利要求1所述L-赖氨酸脱羧酶突变体的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，编码L-赖氨酸脱羧酶突变体SEQ ID NO:4的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3，编码L-赖氨酸脱羧酶突变体SEQ ID NO:6的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:5。
4.包含如权利要求3所述基因的质粒。
5.一种微生物，其表达如权利要求1所述的L-赖氨酸脱羧酶突变体。
6.如权利要求5所述的微生物，其特征在于，所述微生物选自大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌。
7.如权利要求6所述的微生物，其特征在于，所述微生物是大肠杆菌BL21(DE3)。
8.一种生产D-鸟氨酸的方法，其特征在于，以外消旋体DL-鸟氨酸为底物，使用如权利要求1所述的L-赖氨酸脱羧酶突变体、或者如权利要求5-7中任一项所述的微生物催化L-鸟氨酸发生脱羧反应，得到未反应的D-鸟氨酸。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，反应体系为磷酸盐缓冲液，pH5.0-9.0。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，反应温度为25-45℃。
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