CN113174375B

CN113174375B - Aro3蛋白突变体及其应用

Info

Publication number: CN113174375B
Application number: CN202110441218.0A
Authority: CN
Inventors: 罗云孜; 刘化一
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2021-04-23
Filing date: 2021-04-23
Publication date: 2022-11-04
Anticipated expiration: 2041-04-23
Also published as: CN113174375A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及ARO3蛋白突变体及其应用。本发明所述的ARO3突变体为酵母菌中的ARO3蛋白第154位氨基酸由天冬氨酸突变为天冬酰胺。本发明实验证明，突变体ARO3^D154N蛋白能够解除苯丙氨酸对ARO3蛋白的别构抑制，在微生物中表达突变体蛋白，微生物芳香族氨基酸衍生物的生物合成能力明显增强，工业应用前景良好。

Description

ARO3蛋白突变体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及ARO3蛋白突变体及其应用。

背景技术

芳香族氨基酸衍生物是诸多天然产物、药品的中间体。同时芳香族氨基酸及其衍生物也在保健品、药品、化妆品有等领域具有广泛的应用前景和开发价值。微生物发酵生产芳香族氨基酸及其衍生物具有对自然环境的依赖较小、价格较低等优势。而莽草酸途径以及紧接的芳香族氨基酸途径是酿酒酵母合成芳香族氨基酸及其衍生物的关键途径。

酿酒酵母中莽草酸途径的起始步骤为赤藓糖-4-磷酸(erythosd-phosphate，E4P)和磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)在DAHP合酶的作用下缩合生成DAHP，即为3-脱氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸。DAHP合酶为莽草酸途径的关键酶，在酿酒酵母中有两个同工酶ARO4和ARO3，其酶活分别受到酪氨酸和苯丙氨酸的反馈抑制。其中ARO4的突变体ARO4^K229L能够缓解酪氨酸的反馈抑制，并表达解除反馈抑制的ARO4突变体可以提高莽草酸及其衍生物、芳香族氨基酸及其衍生物的产量。但目前ARO3尚未寻找到能够缓解苯丙氨酸反馈抑制的突变体。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供ARO3蛋白突变体及其应用，从而解除苯丙氨酸对ARO3蛋白的别构抑制，提高莽草酸及其衍生物、芳香族氨基酸及其衍生物的产量。

本发明提供的酵母ARO3蛋白的突变体，其第154位氨基酸为Asn。

本发明所述酵母ARO3蛋白在酵母菌不同的菌种中具有较高同源性。在酿酒酵母中，ARO3蛋白的第154位氨基酸由Asp变为Asn。而在其他酵母菌种中，该突变位点的位置因序列中氨基酸残基的添加或缺失可能会发生改变，但只要在相应位置，Asp突变为Asn，皆可具有解除别构抑制的作用。

本发明中，所述酿酒酵母为S288C或CEN.PK。

即本发明所述的突变体，是在酿酒酵母S288C或酿酒酵母CEN.PK的ARO3蛋白第154位发生突变，由Asp变为Asn，记为ARO3^D154N。

本发明所述的突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

本发明的实验证明，酿酒酵母ARO3^D154N突变体，与野生型相比，能够解除苯丙氨酸的别构抑制，其芳香族氨基酸衍生物的产量有显著提高，因此具有良好的工业应用前景。

本发明还提供了编码本发明所述所述突变体的核酸。

本发明所述的核酸的序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

本发明所述的突变体，或所述的核酸，在制备代谢产物中的应用；所述代谢产物为莽草酸途径代谢产物或芳香族氨基酸衍生物。

一些实施例中，所述代谢产物包括苯乙醇、色醇、酪醇、红景天苷或羟基酪醇中至少一种。

本发明所述突变体的应用包括体外应用或在体应用两种。所述在体应用包括：构建如下酵母菌株，发酵表达获得代谢产物：①在酿酒酵母基因组原始位置ARO3基因编码第154位编码的天冬氨酸的密码子突变为编码天冬酰胺的密码子；②将ARO3^D154N基因前加上启动子构成ARO3^D154N的基因表达盒整合至酿酒酵母菌株基因组；③利用质粒在酿酒酵母游离表达ARO3^D154N基因前加上启动子构成ARO3^D154N的基因表达盒。所述体外应用为，将编码ARO3^D154N突变体的基因插入大肠杆菌中，得到重组载体表达获得蛋白，使蛋白与底物在体外孵育，获得代谢产物。

关于ARO3^D154N突变体蛋白体外应用，本发明提供了：

包含编码ARO3^D154N突变体的核酸的重组载体。本发明一些实施例中，所述重组载体的骨架载体为PET21b。

还提供了转化或转染所述重组载体的宿主细胞。一些实施例中，所述宿主细胞为大肠杆菌。一些具体实施例中，所述宿主为大肠杆菌Rosetta(DE3)。

本发明所述的突变体的制备方法，包括：发酵所述的宿主细胞，获得含有所述的突变体的发酵液。获得所述发酵液后，可对突变体进行纯化，也可仅以发酵液作为酶进行反应。

本发明还提供了一种莽草酸途径代谢产物或芳香族氨基酸衍生物的制备方法，其将底物与所述的突变体或所述制备方法制得的突变体混合，经孵育制得莽草酸途径代谢产物或芳香族氨基酸衍生物。

本发明中，所述底物为赤藓糖-4磷酸钾和磷酸烯醇式丙酮酸钠，所述孵育的缓冲液为100mM磷酸缓冲液(pH＝6.4)，底物的浓度为孵育的条件为30℃，30分钟。

关于ARO3^D154N突变体蛋白的在体应用，本发明提供了：

基因改造的酵母菌株，其ARO3蛋白的第154位氨基酸为Asn。

所述基因改造的酵母菌株的构建方法，包括：采用CRISPR/Cas9介导的基因组定点突变技术对原始菌株进行改造。本发明实施例中，所述CRISPR/Cas9介导的基因组定点突变技术中，spacer序列如SEQ ID NO.5所示，同源臂序列如SEQ ID NO.6所示。

莽草酸途径代谢产物或芳香族氨基酸衍生物的制备方法，其以含有底物的培养基对酵母菌株进行培养；所述酵母菌株为所述基因改造的酵母菌株。

本发明中，所述底物为葡萄糖，所述发酵的培养基为YPD(酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L)，其中底物的浓度为20g/L孵育的条件为30℃，220rpm。

本发明还提供了ARO3突变体的表达盒，其包括TEF1p启动子、编码所述突变体的核酸和PGK1t终止子。

含有所述表达盒的重组载体。一些实施例中，所述重组载体的骨架载体为游离型质粒。另一些实施例中，所述重组载体的骨架载体为整合型质粒。

过表达ARO3突变体的酵母菌株，其转化有含有所述表达盒的重组载体。

莽草酸途径代谢产物或芳香族氨基酸衍生物的制备方法，其特征在于，以含有底物的培养基对酵母菌株进行培养；所述酵母菌株为过表达ARO3突变体的酵母菌株。

本发明所述的ARO3突变体为酵母菌中的ARO3蛋白第154位氨基酸由天冬氨酸突变为天冬酰胺。本发明实验证明，突变体ARO3^D154N蛋白能够解除苯丙氨酸对ARO3蛋白的别构抑制，在微生物中表达突变体蛋白，微生物芳香族氨基酸衍生物的生物合成能力明显增强，工业应用前景良好。

附图说明

图1为ARO3^D154N突变体蛋白能够缓解苯丙氨酸别构抑制与原始ARO3受到苯丙氨酸别构抑制的比较图；

图2为在酿酒酵母中表达ARO3^D154N突变体蛋白明显提高酿酒酵母生产芳香族氨基酸衍生物酪醇、苯乙醇、色醇产量图。

具体实施方式

本发明提供了ARO3蛋白突变体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的ARO3突变体的氨基酸序列为：MFIKNDHAGDRKRLEDWRIKGYDPLTPPDLLQHEFPISAKGEENIIKARDSVCDILNGKDDRLVIVIGPCSLHDPKAAYDYADRLAKISEKLSKDLLIIMRAYLEKPRTTVGWKGLINDPDMNNSFQINKGLRISREMFIRLVEKLPIAGEMLNTISPQFLSDCFSLGAIGARTTESQLHRELASGLSFPIGFKNGTDGGLQVAIDAMRAAAHDHYFLSVTKPGVTAIVGTEGNKDTFLILRGGKNGTNFDKESVQNTKKQLEKAGLTDDSQKRIMIDCSHGNSNKDFKNQPKVAKCIYDQLTEGENSLCGVMIESNINEGRQDIPKEGGREGLKYGCSVTDACIGWETTEQVLELLAEGVRNRRKALKK(SEQ ID NO:1，野生型序列来源于酿酒酵母S288C)；

或为MFIKNDHAGDRKRLEDWRIKGYDPLTPPDLLQHEFPISAKGEENIIKARDSVCDILNGKDDRLVIVIGPCSLHDPKAAYDYADRLAKISEKLSKDLLIIMRAYLEKPRTTVGWKGLINDPDMNNSFQINKGLRISREMFIKLVEKLPIAGEMLNTISPQFLSDCFSLGAIGARTTESQLHRELASGLSFPIGFKNGTDGGLQVAIDAMRAAAHEHYFLSVTKPGVTAIVGTEGNKDTFLILRGGKNGTNFDKESVQNTKKQLEKAGLTDDSQKRIMIDCSHGNSNKDFKNQPKVAKCIYDQLTEGENSLCGVMIESNINEGRQDIPKEGGREGLKYGCSVTDACIGWESTEQVLELLAEGVRNRRKALKK(SEQ ID NO:2，野生型序列来源于酿酒酵母CEN.PK)。

编码突变体的核酸序列为atgttcattaaaaacgatcacgccggtgacaggaaacgcttggaagactggagaatcaaaggttatgatccattaacccctccagatctgcttcaacatgaatttccaatttcagccaaaggtgaggaaaacattatcaaggcaagagactccgtctgtgatattttgaatggtaaagatgatcgtttagttatcgtgatcgggccatgttccctacatgaccccaaagccgcttacgattacgctgacagattggctaaaatttcagaaaagttgtcaaaagacttattgattattatgagagcgtatttagaaaaaccaaggactaccgttggctggaaagggttgattaacgaccctgatatgaataactcttttcaaatcaataaaggtctacggatttcgagagaaatgttcataagactggttgaaaaattacccattgctggtgaaatgctgaacaccatttctccgcagtttttgagtgattgtttctccttgggtgccatcggtgctagaactactgaatcccaactgcacagagaattagcatccggtctatctttccctattggatttaagaacggtactgatggtggtttgcaagtcgccatcgacgctatgagagccgctgcacatgatcattacttcctttctgtcacaaagccaggtgtcactgctatcgtgggcactgaaggtaacaaggataccttcctgatcttgagaggtggtaagaacggtactaactttgacaaagaaagtgttcaaaatactaagaaacaattagaaaaggccggtttgactgacgattcacagaaaagaatcatgatcgattgttcacacgggaacagtaataaagatttcaagaaccaaccgaaggttgccaaatgcatttatgaccaactgacggaaggtgaaaatagtctttgtggtgttatgattgagtccaacataaatgaaggtagacaagatattcctaaagaaggtggcagagagggattgaagtatggttgttctgtaacggatgcttgtattggttgggagaccaccgaacaggtattggagctattggccgaaggtgttagaaacagaagaaaagccttgaagaaataa

或为atgttcattaaaaacgatcacgccggtgacaggaaacgcttggaagactggagaatcaaaggttatgatccattaacccctccagatctgcttcaacatgaatttccaatttcagccaaaggtgaggaaaacattatcaaggcaagagactccgtctgtgatattttgaatggtaaagatgatcgtttagttatcgtgatcgggccatgttccctacatgaccccaaagccgcttacgattacgctgacagattggctaaaatttcagaaaagttgtcaaaagacttattgattattatgagagcgtatttagaaaaaccaaggactactgttggctggaaagggttgattaacgaccctgatatgaataactcttttcaaatcaataaaggtctacggatttcgagagaaatgttcataaaactggttgaaaaattacccattgctggtgagatgttgaacaccatttctccgcagtttttgagtgattgtttctccttgggtgccatcggcgccagaactactgaatcccaactgcacagagaattagcatccggtctatctttccctattggatttaagaacggtactgatggtggtttgcaagtcgccatcgacgctatgagagccgctgcacatgaacattacttcctttctgtcacaaagccaggtgtcactgctatcgtgggcactgaaggtaacaaggataccttcctgatcttgagaggtggtaagaacggtactaactttgacaaagaaagtgttcaaaatactaagaaacagttagaaaaggccggtttgactgatgattcccagaaaagaattatgatcgattgttcccacggcaacagtaataaagatttcaagaaccaaccaaaggttgccaaatgtatttatgaccagctgacggagggtgagaatagtctctgtggtgttatgattgagtccaacataaatgaaggtagacaagatattcccaaagaaggtggcagagagggattgaagtatggttgttctgttacggatgcttgtattggctgggagtccaccgaacaggtattggagctattggcagaaggtgttagaaacagaagaaaggccttgaaaaaatag。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1 ARO3^D154N突变体蛋白体外应用及相关质粒、菌株

将编码ARO3^D154N突变体的基因(SEQ ID NO:3)插入大肠杆菌表达载体PET21b中，得到重组载体。

将上述重组载体转化至表达大肠杆菌Rosetta(DE3)中。

将上述菌株接至LB培养基(100μg/ml氨苄抗生素)过夜培养，然后转接到LB培养基(100μg/ml氨苄抗生素)，养至OD₆₀₀＝0.6-0.8，加入终浓度为0.1mMIPTG，16℃，110rpm过夜诱导表达。收集菌体，破菌后离心收集上清，与镍胶孵育后利用低咪唑(20mM咪唑)的磷酸缓冲液洗脱杂蛋白后再用带250mM咪唑的磷酸缓冲液收集突变体蛋白。磷酸缓冲液：50mM磷酸氢钾，pH为6.5-6.8，150mM氯化钠。将洗脱得到的蛋白透析至缓冲液50mM磷酸氢钾，pH为6.5-6.8，150mM氯化钠中，得到的溶液中，含有ARO3^D154N突变体。

所述ARO3^D154N突变体与底物4-磷酸-赤藓糖钠(sodium D-erythrose 4-phosphate)、磷酸烯醇式钾(potassium enolpyruvate phosphate)孵育，对照组不加苯丙氨酸、实验组加入苯丙氨酸。孵育的缓冲液是100mM磷酸缓冲液(pH＝6.5)，孵育条件是30分钟，静置。

结果如图1，ARO3和ARO3^D154N突变体可以在体外将磷酸烯醇式丙酮酸和赤藓糖-4-磷酸催化生成DAHP(3-脱氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸)，但是ARO3受到了苯丙氨酸的抑制而RO3^D154N突变体不受苯丙氨酸的抑制。图1中柱形图横坐标示ARO3原始蛋白(WT)和ARO3^D154N突变体蛋白。纵坐标代表反应生成的DAHP的相对产量。不同颜色的柱代表反应液中添加不同的芳香族氨基酸。由图1可以看出，ARO3原始蛋白(WT)不受到其他芳香族氨基酸的抑制，只受到苯丙氨酸的抑制。而ARO3^D154N突变体蛋白不受抑制。

实施例2 ARO3^D154N突变体蛋白体内应用及相关质粒、菌株

2.1酿酒酵母基因组原始位置突变ARO3为ARO3^D154N

在原始菌株CEN.PK2-1C菌株基因组上，利用CRISPR/Cas9介导的基因组定点突变技术；基因定点突变的方法，采用的质粒携带有Cas9蛋白的基因和一段用来转录的基因，转录的RNA与Cas9蛋白结合，只需在质粒上再导入一段与目标基因配对的基因spacer和同源重组片段，将重新构建好的质粒导入细胞，因为设计的同源重组片段是定点突变的，酵母真核细胞体内被切断的目的基因，以同源重组方式，以质粒上的同源臂为模板，修复造成定点突变，从而完成基因定点突变目的。

spacer：acccattgctggtgagatgt

同源臂：taaaggtctacggatttcgagagaaatgttcataagactggttgaaaaattacccattgctggtgaaatgctgaacaccatttctccgcagtttttgagtgattgtttctccttgggtgccatcggtgct

构建过程(转化-验证)：

1、接种目的菌株(CEN.PK2-1C)于5mlYPAD，30℃振养过夜；

2、取2ml菌液于50mlYPAD，置30℃振养4-5h，OD600＝0.8-1.0；

3、离心，3500rpm，2min，弃上清；

4、将ssDNA样品煮沸10min，快速插入冰中；

5、用50ml无菌水重悬菌体，离心；

6、用1ml的100mMLiAc重悬，12000rpm，3s吸尽上清；

7、悬浮细胞到最终体积500μl，约加100mMLiAc 400μl，分成50μl/管，离心，弃上清；

8、按顺序加入“转化混合液”：

240μl PEG3350(50％)

36μl 1M LiAc

10μl ssDNA(10mg/ml)

50μl 带有spacer的Cas9质粒1μg和同源臂片段10μg

9、涡旋震荡每个反应管直到细胞完全混匀；

10、置30℃保温30min；

11、置42℃热激20min；

12、YPD培养基孵育2小时，30℃，220rpm；

13、涂板YPD-G418抗性平板。

上述是转化过程；

14、待转化的平板生长出克隆，挑取单克隆菌落PCR得到目的片段，sanger测序验证ARO3第154位是否突变成为了天冬氨酸。

15、挑取验证成功的克隆，于YPD中培养24小时，30℃，220rpm，存菌。

由此得到在ARO3基因的第154位的天冬氨酸突变为天冬酰胺的酿酒酵母工程菌株。

发酵方法：

1)在YPD平板培养酿酒酵母菌株，活化酿酒酵母菌株；

2)挑取单克隆于5mlYPD液体，培养36小时；

3)将5mlYPD培养液按照1:50转接至50mlYPD，在30℃，220rpm培养84小时；

4)收集发酵液上清，即可获得含有酪醇、苯乙醇、色醇的发酵液。

2.2 ARO3^D154N过表达酿酒酵母菌株的构建

1)、以ARO3^D154N突变体(实施例1构建，SEQ ID NO:1)的基因为模板，以如下引物进行PCR扩增：

Forward引物：5’-catagcaatctaatctaagttttaattacaaaatgttcattaaaaacgatcac gccggt-3’

Reverse引物：5’-gatctatcgatttcaattcaattcaatctattttttcaaggcctttcttctg-3’。

PCR扩增条件如下：

先95℃预变性10min，然后98℃30s，58℃30s，72℃1min30s，共25个循环；最后72℃延伸5min。

胶回收上述PCR产物，获得大小约1172bp大小的片段，其中含有编码突变体的核酸片段(带有TEF1p启动子同源臂和PGK1t终止子的同源臂)。

2)将上述带有TEF1p启动子同源臂和PGK1t终止子同源臂的基因表达盒利用同源重组连接在带有TEF1p启动子和PGK1t终止子的载体PRS405-TEF1p-PGK1t；

3)测序验证正确后，利用EcoRI线性化(酶切)后，转化至酿酒酵母菌株中，即获得酿酒酵母ARO3^D154N过表达基因盒PRS405-TEF1p-ARO3^D154N-PGK1t。

发酵方法：

1)在YPD平板培养酿酒酵母菌株，活化酿酒酵母菌株；

2)挑取单克隆于5ml YPD液体，培养36小时；

3)将5ml YPD培养液按照1:50转接至50ml YPD，在30℃，220rpm培养84小时；

4)收集发酵液上清，即可获得含有芳香族衍生物的发酵液。底物是葡萄糖，20g/L。

结果如图2，在CEN.PK菌株上过表达ARO3原始基因(WT)和ARO3^D154N突变体蛋白的基因后菌株的发酵结果(菌株构建方法如实施例2中2.2所示)。其横坐标示不同的发酵产物，纵坐标示产量。不同颜色的柱子代表的是菌株基因型。从图中可以看出，表达ARO3^D154N突变体蛋白的菌株的三个产物的产量都比表达ARO3原始蛋白的菌株高。另，实施例2中2.1所示方法构建获得的酿酒酵母基因组原始位置突变ARO3为ARO3^D154N的菌株，三个产物的产量与2.2中构建的菌株产量相似。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 天津大学

<120> ARO3蛋白突变体及其应用

<130> MP21004434

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 370

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Phe Ile Lys Asn Asp His Ala Gly Asp Arg Lys Arg Leu Glu Asp

1 5 10 15

Trp Arg Ile Lys Gly Tyr Asp Pro Leu Thr Pro Pro Asp Leu Leu Gln

20 25 30

His Glu Phe Pro Ile Ser Ala Lys Gly Glu Glu Asn Ile Ile Lys Ala

35 40 45

Arg Asp Ser Val Cys Asp Ile Leu Asn Gly Lys Asp Asp Arg Leu Val

50 55 60

Ile Val Ile Gly Pro Cys Ser Leu His Asp Pro Lys Ala Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Tyr Ala Asp Arg Leu Ala Lys Ile Ser Glu Lys Leu Ser Lys Asp Leu

85 90 95

Leu Ile Ile Met Arg Ala Tyr Leu Glu Lys Pro Arg Thr Thr Val Gly

100 105 110

Trp Lys Gly Leu Ile Asn Asp Pro Asp Met Asn Asn Ser Phe Gln Ile

115 120 125

Asn Lys Gly Leu Arg Ile Ser Arg Glu Met Phe Ile Arg Leu Val Glu

130 135 140

Lys Leu Pro Ile Ala Gly Glu Met Leu Asn Thr Ile Ser Pro Gln Phe

145 150 155 160

Leu Ser Asp Cys Phe Ser Leu Gly Ala Ile Gly Ala Arg Thr Thr Glu

165 170 175

Ser Gln Leu His Arg Glu Leu Ala Ser Gly Leu Ser Phe Pro Ile Gly

180 185 190

Phe Lys Asn Gly Thr Asp Gly Gly Leu Gln Val Ala Ile Asp Ala Met

195 200 205

Arg Ala Ala Ala His Asp His Tyr Phe Leu Ser Val Thr Lys Pro Gly

210 215 220

Val Thr Ala Ile Val Gly Thr Glu Gly Asn Lys Asp Thr Phe Leu Ile

225 230 235 240

Leu Arg Gly Gly Lys Asn Gly Thr Asn Phe Asp Lys Glu Ser Val Gln

245 250 255

Asn Thr Lys Lys Gln Leu Glu Lys Ala Gly Leu Thr Asp Asp Ser Gln

260 265 270

Lys Arg Ile Met Ile Asp Cys Ser His Gly Asn Ser Asn Lys Asp Phe

275 280 285

Lys Asn Gln Pro Lys Val Ala Lys Cys Ile Tyr Asp Gln Leu Thr Glu

290 295 300

Gly Glu Asn Ser Leu Cys Gly Val Met Ile Glu Ser Asn Ile Asn Glu

305 310 315 320

Gly Arg Gln Asp Ile Pro Lys Glu Gly Gly Arg Glu Gly Leu Lys Tyr

325 330 335

Gly Cys Ser Val Thr Asp Ala Cys Ile Gly Trp Glu Thr Thr Glu Gln

340 345 350

Val Leu Glu Leu Leu Ala Glu Gly Val Arg Asn Arg Arg Lys Ala Leu

355 360 365

Lys Lys

370

<210> 2

<211> 370

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Phe Ile Lys Asn Asp His Ala Gly Asp Arg Lys Arg Leu Glu Asp

1 5 10 15

Trp Arg Ile Lys Gly Tyr Asp Pro Leu Thr Pro Pro Asp Leu Leu Gln

20 25 30

His Glu Phe Pro Ile Ser Ala Lys Gly Glu Glu Asn Ile Ile Lys Ala

35 40 45

Arg Asp Ser Val Cys Asp Ile Leu Asn Gly Lys Asp Asp Arg Leu Val

50 55 60

Ile Val Ile Gly Pro Cys Ser Leu His Asp Pro Lys Ala Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Tyr Ala Asp Arg Leu Ala Lys Ile Ser Glu Lys Leu Ser Lys Asp Leu

85 90 95

Leu Ile Ile Met Arg Ala Tyr Leu Glu Lys Pro Arg Thr Thr Val Gly

100 105 110

Trp Lys Gly Leu Ile Asn Asp Pro Asp Met Asn Asn Ser Phe Gln Ile

115 120 125

Asn Lys Gly Leu Arg Ile Ser Arg Glu Met Phe Ile Lys Leu Val Glu

130 135 140

Lys Leu Pro Ile Ala Gly Glu Met Leu Asn Thr Ile Ser Pro Gln Phe

145 150 155 160

Leu Ser Asp Cys Phe Ser Leu Gly Ala Ile Gly Ala Arg Thr Thr Glu

165 170 175

Ser Gln Leu His Arg Glu Leu Ala Ser Gly Leu Ser Phe Pro Ile Gly

180 185 190

Phe Lys Asn Gly Thr Asp Gly Gly Leu Gln Val Ala Ile Asp Ala Met

195 200 205

Arg Ala Ala Ala His Glu His Tyr Phe Leu Ser Val Thr Lys Pro Gly

210 215 220

Val Thr Ala Ile Val Gly Thr Glu Gly Asn Lys Asp Thr Phe Leu Ile

225 230 235 240

Leu Arg Gly Gly Lys Asn Gly Thr Asn Phe Asp Lys Glu Ser Val Gln

245 250 255

Asn Thr Lys Lys Gln Leu Glu Lys Ala Gly Leu Thr Asp Asp Ser Gln

260 265 270

Lys Arg Ile Met Ile Asp Cys Ser His Gly Asn Ser Asn Lys Asp Phe

275 280 285

Lys Asn Gln Pro Lys Val Ala Lys Cys Ile Tyr Asp Gln Leu Thr Glu

290 295 300

Gly Glu Asn Ser Leu Cys Gly Val Met Ile Glu Ser Asn Ile Asn Glu

305 310 315 320

Gly Arg Gln Asp Ile Pro Lys Glu Gly Gly Arg Glu Gly Leu Lys Tyr

325 330 335

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Val Leu Glu Leu Leu Ala Glu Gly Val Arg Asn Arg Arg Lys Ala Leu

355 360 365

Lys Lys

370

<210> 3

<211> 1113

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgttcatta aaaacgatca cgccggtgac aggaaacgct tggaagactg gagaatcaaa 60

ggttatgatc cattaacccc tccagatctg cttcaacatg aatttccaat ttcagccaaa 120

ggtgaggaaa acattatcaa ggcaagagac tccgtctgtg atattttgaa tggtaaagat 180

gatcgtttag ttatcgtgat cgggccatgt tccctacatg accccaaagc cgcttacgat 240

tacgctgaca gattggctaa aatttcagaa aagttgtcaa aagacttatt gattattatg 300

agagcgtatt tagaaaaacc aaggactacc gttggctgga aagggttgat taacgaccct 360

gatatgaata actcttttca aatcaataaa ggtctacgga tttcgagaga aatgttcata 420

agactggttg aaaaattacc cattgctggt gaaatgctga acaccatttc tccgcagttt 480

ttgagtgatt gtttctcctt gggtgccatc ggtgctagaa ctactgaatc ccaactgcac 540

agagaattag catccggtct atctttccct attggattta agaacggtac tgatggtggt 600

ttgcaagtcg ccatcgacgc tatgagagcc gctgcacatg atcattactt cctttctgtc 660

acaaagccag gtgtcactgc tatcgtgggc actgaaggta acaaggatac cttcctgatc 720

ttgagaggtg gtaagaacgg tactaacttt gacaaagaaa gtgttcaaaa tactaagaaa 780

caattagaaa aggccggttt gactgacgat tcacagaaaa gaatcatgat cgattgttca 840

cacgggaaca gtaataaaga tttcaagaac caaccgaagg ttgccaaatg catttatgac 900

caactgacgg aaggtgaaaa tagtctttgt ggtgttatga ttgagtccaa cataaatgaa 960

ggtagacaag atattcctaa agaaggtggc agagagggat tgaagtatgg ttgttctgta 1020

acggatgctt gtattggttg ggagaccacc gaacaggtat tggagctatt ggccgaaggt 1080

gttagaaaca gaagaaaagc cttgaagaaa taa 1113

<210> 4

<211> 1113

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgttcatta aaaacgatca cgccggtgac aggaaacgct tggaagactg gagaatcaaa 60

ggttatgatc cattaacccc tccagatctg cttcaacatg aatttccaat ttcagccaaa 120

ggtgaggaaa acattatcaa ggcaagagac tccgtctgtg atattttgaa tggtaaagat 180

gatcgtttag ttatcgtgat cgggccatgt tccctacatg accccaaagc cgcttacgat 240

tacgctgaca gattggctaa aatttcagaa aagttgtcaa aagacttatt gattattatg 300

agagcgtatt tagaaaaacc aaggactact gttggctgga aagggttgat taacgaccct 360

gatatgaata actcttttca aatcaataaa ggtctacgga tttcgagaga aatgttcata 420

aaactggttg aaaaattacc cattgctggt gagatgttga acaccatttc tccgcagttt 480

ttgagtgatt gtttctcctt gggtgccatc ggcgccagaa ctactgaatc ccaactgcac 540

agagaattag catccggtct atctttccct attggattta agaacggtac tgatggtggt 600

ttgcaagtcg ccatcgacgc tatgagagcc gctgcacatg aacattactt cctttctgtc 660

acaaagccag gtgtcactgc tatcgtgggc actgaaggta acaaggatac cttcctgatc 720

ttgagaggtg gtaagaacgg tactaacttt gacaaagaaa gtgttcaaaa tactaagaaa 780

cagttagaaa aggccggttt gactgatgat tcccagaaaa gaattatgat cgattgttcc 840

cacggcaaca gtaataaaga tttcaagaac caaccaaagg ttgccaaatg tatttatgac 900

cagctgacgg agggtgagaa tagtctctgt ggtgttatga ttgagtccaa cataaatgaa 960

ggtagacaag atattcccaa agaaggtggc agagagggat tgaagtatgg ttgttctgtt 1020

acggatgctt gtattggctg ggagtccacc gaacaggtat tggagctatt ggcagaaggt 1080

gttagaaaca gaagaaaggc cttgaaaaaa tag 1113

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acccattgct ggtgagatgt 20

<210> 6

<211> 130

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taaaggtcta cggatttcga gagaaatgtt cataagactg gttgaaaaat tacccattgc 60

tggtgaaatg ctgaacacca tttctccgca gtttttgagt gattgtttct ccttgggtgc 120

catcggtgct 130

<210> 7

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

catagcaatc taatctaagt tttaattaca aaatgttcat taaaaacgat cacgccggt 59

<210> 8

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gatctatcga tttcaattca attcaatcta ttttttcaag gcctttcttc tg 52

Claims

1.酵母ARO3蛋白的突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

2.编码权利要求1所述突变体的核酸。

3.根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.4所示。

4.权利要求1所述的突变体，或权利要求2或3所述的核酸，在制备代谢产物中的应用；所述代谢产物为莽草酸途径代谢产物或芳香族氨基酸衍生物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述代谢产物包括苯乙醇、色醇、酪醇、红景天苷或羟基酪醇中至少一种。

6.包含权利要求2或3所述的核酸的重组载体。

7.转化或转染权利要求6所述重组载体的宿主细胞；所述宿主细胞不包括植物细胞。

8.权利要求1所述的突变体的制备方法，其特征在于，包括，发酵权利要求7所述的宿主细胞，获得含有权利要求1所述的突变体的发酵液。

9.莽草酸途径代谢产物或芳香族氨基酸衍生物的制备方法，其特征在于，

包括：将底物与权利要求1所述的突变体或权利要求8所述制备方法制得的突变体混合，经孵育制得莽草酸途径代谢产物或芳香族氨基酸衍生物；

或包括：以含有底物的培养基对权利要求7所述的宿主细胞进行培养，获得含有莽草酸途径代谢产物或芳香族氨基酸衍生物的培养液。