本发明的实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明,以下实施例是对本发明的解释,本发明并不局限于以下实施例,实施例中未注明具体条件者,按常规条件或制造商建议的条件进行。
本发明提供的烟酰胺单核苷酸的制备方法可以是将所有原料及酶一并加入的一步投料方式也可以是分步投料方式,一步投料方式具有操作简单、反应时间短的优点,分步投料方式具有反应彻底、转化率高的优点,其具体实施过程如下:
一步投料方式:
将各原料溶解于水中配制底物溶液,该底物溶液的组成为1-150mM的烟酰胺、1-50mM的ATP、1-50mM的木糖、1-30mM的MgCl2、1-20mM的KCl、1-10mM的ZnCl2以及50-100mM的Tris-HCl缓冲液,调pH至6.5-8.5。然后向底物溶液中加入催化用的各种酶,各种酶的加入量分别为:烟酰胺磷酸核糖转移酶1-100g/L底物溶液,核糖磷酸焦磷酸激酶1-100g/L底物溶液,核糖-5-磷酸异构酶1-100g/L底物溶液,核酮糖-3-磷酸异构酶1-100g/L底物溶液,木酮糖激酶1-100g/L底物溶液,木糖异构酶1-100g/L底物溶液。搅拌均匀后进行反应,反应过程中持续搅拌(搅拌速度50rpm),控制反应温度为30-50℃,维持pH值为6.5-8.5。反应1-8h后即得烟酰胺单核苷酸粗产品溶液,再经过滤、纯化、干燥后即得烟酰胺单核苷酸成品。
分步投料方式:
将各原料溶解于水中配制底物溶液,该底物溶液的组成为1-50mM的ATP、1-50mM的木糖、1-30mM的MgCl2、1-20mM的KCl以及50-100mM的Tris-HCl缓冲液,调pH至6.5-8.5。然后向底物溶液中加入以下催化用酶:核糖磷酸焦磷酸激酶1-100g/L底物溶液,核糖-5-磷酸异构酶1-100g/L底物溶液,核酮糖-3-磷酸异构酶1-100g/L底物溶液,木酮糖激酶1-100g/L底物溶液,木糖异构酶1-100g/L底物溶液。搅拌均匀后进行反应,反应过程中持续搅拌(搅拌速度50rpm),控制反应温度为30-50℃,维持pH值为6.5-8.5。
待上述反应进行1-8h后,分离出反应液,并向反应液中加入1-100mM的烟酰胺、1-50mM的ZnCl2、50-100mM的Tris-HCl缓冲液以及烟酰胺磷酸核糖转移酶1-100g/L底物溶液,搅拌均匀后继续反应,反应过程中持续搅拌(搅拌速度50rpm),控制反应温度为30-50℃,维持pH值为6.5-8.5,再反应1-8h后即得烟酰胺单核苷酸粗产品溶液,再经过滤、纯化、干燥后即得烟酰胺单核苷酸成品。
以下实施例中所使用的酶,除烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体是从来自Meiothermus ruber DSM 1279的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶经人工诱导定点突变获得的之外,其余烟酰胺磷酸核糖转移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶、核糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-3-磷酸异构酶、木酮糖激酶以及木糖异构酶均是从市场上直接购入的酶冻干粉。
实施例1
烟酰胺单核苷酸的制备
向反应釜中加入底物溶液,含1mM的烟酰胺、1mM的ATP、1mM的木糖、1mM的MgCl2、1mM的KCl、1mM的ZnCl2以及50mM的Tris-HCl缓冲液,调pH至6.5-7.0。然后加入催化用的各种酶,各种酶的加入量为:烟酰胺磷酸核糖转移酶1g/L底物溶液,核糖磷酸焦磷酸激酶1g/L底物溶液,核糖-5-磷酸异构酶1g/L底物溶液,核酮糖-3-磷酸异构酶1g/L底物溶液,木酮糖激酶1g/L底物溶液,木糖异构酶1g/L底物溶液。搅拌均匀后进行反应,反应过程中持续搅拌(搅拌速度50rpm),控制反应温度为30℃,维持pH值为6.5-7.0。反应1h后即得烟酰胺单核苷酸粗产品溶液(含NMN0.5mM),再经过滤、纯化、干燥后即得烟酰胺单核苷酸。
实施例2
烟酰胺单核苷酸的制备
向反应釜中加入底物溶液,含30mM的ATP、30mM的木糖、20mM的MgCl2、10mM的KCl以及100mM的Tris-HCl缓冲液,调pH至7.5-8.0。然后加入以下催化用酶:核糖磷酸焦磷酸激酶6g/L底物溶液,核糖-5-磷酸异构酶10g/L底物溶液,核酮糖-3-磷酸异构酶11g/L底物溶液,木酮糖激酶10g/L底物溶液,木糖异构酶10g/L底物溶液。搅拌均匀后进行反应,反应过程中持续搅拌(搅拌速度50rpm),控制反应温度为35℃,维持pH值为7.5-8.0。
待上述反应进行4h后,分离出反应液,并将反应液送入另一反应釜中,再向反应液中加入60mM的烟酰胺、30mM的ZnCl2、100mM的Tris-HCl缓冲液以及烟酰胺磷酸核糖转移酶15g/L底物溶液,搅拌均匀后继续反应,反应过程中持续搅拌(搅拌速度50rpm),控制反应温度为35℃,维持pH值为7.5-8.0,再反应4h后即得烟酰胺单核苷酸粗产品溶液(含NMN12mM),再经过滤、纯化、干燥后即得烟酰胺单核苷酸成品。
实施例3
烟酰胺单核苷酸的制备
向反应釜中加入底物溶液,含25mM的ATP、50mM的木糖、15mM的MgCl2、10mM的KCl以及70mM的Tris-HCl缓冲液,调pH至7.0-7.5。然后加入以下催化用酶:核糖磷酸焦磷酸激酶20g/L底物溶液,核糖-5-磷酸异构酶35g/L底物溶液,核酮糖-3-磷酸异构酶35g/L底物溶液,木酮糖激酶35g/L底物溶液,木糖异构酶30g/L底物溶液。搅拌均匀后进行反应,反应过程中持续搅拌(搅拌速度50rpm),控制反应温度为40℃,维持pH值为7.0-7.5。
待上述反应进行3h后,分离出反应液,并将反应液送入另一反应釜中,再向反应液中加入50mM的烟酰胺、20mM的ZnCl2、70mM的Tris-HCl缓冲液以及烟酰胺磷酸核糖转移酶50g/L底物溶液,搅拌均匀后继续反应,反应过程中持续搅拌(搅拌速度50rpm),控制反应温度为40℃,维持pH值为7.5-8.0,再反应3h后即得烟酰胺单核苷酸粗产品溶液(含NMN12.4mM),再经过滤、纯化、干燥后即得烟酰胺单核苷酸成品。
实施例4
烟酰胺单核苷酸的制备
向反应釜中加入底物溶液,含150mM的烟酰胺、50mM的ATP、50mM的木糖、30mM的MgCl2、20mM的KCl、10mM的ZnCl2以及100mM的Tris-HCl缓冲液,调pH至8.0-8.5。然后向底物溶液中加入催化用的各种酶,各种酶的加入量分别为:烟酰胺磷酸核糖转移酶100g/L底物溶液,核糖磷酸焦磷酸激酶100g/L底物溶液,核糖-5-磷酸异构酶100g/L底物溶液,核酮糖-3-磷酸异构酶100g/L底物溶液,木酮糖激酶100g/L底物溶液,木糖异构酶100g/L底物溶液。搅拌均匀后进行反应,反应过程中持续搅拌(搅拌速度50rpm),控制反应温度为50℃,维持pH值为8.0-8.5。反应8h后即得烟酰胺单核苷酸粗产品溶液(含NMN22mM),再经过滤、纯化、干燥后即得烟酰胺单核苷酸成品。
实施例5
烟酰胺单核苷酸的制备
制备固定化酶:用洗酶缓冲液(0.02M Tris-HCl/0.001M EDTA,pH7.0溶液)分别将烟酰胺磷酸核糖转移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶、核糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-3-磷酸异构酶、木酮糖激酶以及木糖异构酶稀释至蛋白含量为5-10mg/ml,再将酶稀释液与PB溶液(2.0mol/L磷酸二氢钾,pH7.5)等体积混合,然后加入酶固定化载体环氧型LX-3000(50毫克酶/克载体),于摇床(转速150rpm)中25℃反应20小时。反应完成后用滤袋过滤,用洗酶缓冲液清洗5-6次,即分别得到固定化烟酰胺磷酸核糖转移酶、固定化核糖磷酸焦磷酸激酶、固定化核糖-5-磷酸异构酶、固定化核酮糖-3-磷酸异构酶、固定化木酮糖激酶以及固定化木糖异构酶。
向反应釜中加入底物溶液,含100mM的烟酰胺、30mM的ATP、30mM的木糖、12mM的MgCl2、10mM的KCl、10mM的ZnCl2、以及100mM的Tris-HCl缓冲液,调pH至7.0-7.5。然后加入催化用的各种酶,各种酶的加入量为:固定化烟酰胺磷酸核糖转移酶15g/L底物溶液,固定化核糖磷酸焦磷酸激酶6g/L底物溶液,固定化核糖-5-磷酸异构酶10g/L底物溶液,固定化核酮糖-3-磷酸异构酶11g/L底物溶液,固定化木酮糖激酶10g/L底物溶液,固定化木糖异构酶10g/L底物溶液。搅拌均匀后进行反应,反应过程中持续搅拌(搅拌速度50rpm),控制反应温度为37℃,维持pH值为7.0-7.5。反应6h后即得烟酰胺单核苷酸粗产品溶液(含NMN13.3mM),再经过滤、纯化、干燥后即得烟酰胺单核苷酸。
实施例6
烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的制备
本发明提供的方法中用到的人工诱导定点突变的烟酰胺磷酸核糖转移酶的制备过程大致为:首先构建含有亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶基因的载体质粒,然后设定定点突变的位点以及突变后的氨基酸种类,再合成适当的引物,以含亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶基因的载体质粒为模板,PCR扩增DNA片段、装配所扩增的DNA片段以及PCR扩增全长突变基因。然后将该全长突变基因克隆到适当的载体上并转化适当的宿主细胞,经培养筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的阳性克隆。最后从阳性克隆中提取质粒DNA,进行DNA序列测定分析,以确定引入的突变,在确定目的片段插入到载体上后,通过LB+卡那霉素培养基筛选,从而获得一系列具有高催化活性的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体。
在上述制备方法中,可采用任何适用的载体,例如:可以为原核表达载体,如pRSET和pES21等;可以为克隆载体,如pUC18/19和pBluscript-SK等。本发明优先选用pRSET-A为载体,载体的宿主细胞可以是包括大肠杆菌在内的原核细胞,也可以是包括酿酒酵母和毕赤巴斯德酵母在内的真核细胞。
一、含有亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶基因的载体质粒的构建
对基因库公布的来自Meiothermus ruber DSM 1279的亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶的基因序列(GenBank登录号:CP001743.1)进行全序列人工合成(由商业合成公司完成)。合成的产物经限制性内切酶NdeI和BamHI酶切后与经同样限制性内切酶NdeI和BamHI酶切的载体pRSET-A(源自Invitrogen,USA)连接,得质粒pRSET-nampt。经DNA测序,确定该被克隆的亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,其氨基酸序列如SEQID NO:2所示。
二、烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的制备
PCR扩增反应体系为:20mM Tris-HCl(pH 8.8),10mM KCl,10mM(NH4)2SO4,2mMMgSO4,0.1%Triton X-100,50mM dATP,50mM dTTP,50mM dCTP,50mM dGTP,1.5 U Pfu DNA聚合酶(Promega,USA),20ng DNA模板,以及400nM上游引物和400nM下游引物,用无菌水调反应体积至50微升。
PCR扩增反应条件为:95℃ 3分钟,35圈循环:95℃ 50秒、52℃ 30秒和72℃ 3分钟,最后72℃ 5分钟。
1、F180A突变体的制备
用如下引物对F180A-F:5′GTTCAAACTGCACGACGCGGGTGCTCGTGGTGTTTC 3′和F180A-R:5′GAAACACCACGAGCACCCGCGTCGTGCAGTTTGAAC 3′,以实施例6第一部分构建的质粒pRSET-nampt为模板,利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增F180A突变体基因,经1%琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物,再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例6第一部分),得到质粒pRSET-F180A。将质粒pRSET-F180A转化感受态细菌细胞E.coli BL21,在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆,从克隆中提取质粒pRSET-F180A的DNA,经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO:2所示的亲本氨基酸序列相比,F180A突变体的氨基酸序列在第180位点由Phe(F)突变为Ala(A),其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2、F180W突变体的制备
用如下引物对F180W-F:5′GTTCAAACTGCACGACTGGGGTGCTCGTGGTGTTTC 3′和F180W-R:5′GAAACACCACGAGCACCCCAGTCGTGCAGTTTGAAC 3′,以实施例6第一部分构建的质粒pRSET-nampt为模板,利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增F180W突变体基因,经1%琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物,再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例6第一部分),得到质粒pRSET-F180W。将质粒pRSET-F180W转化感受态细菌细胞E.coli BL21,在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆,从克隆中提取质粒pRSET-F180W的DNA,经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO:2所示的亲本氨基酸序列相比,F180W突变体的氨基酸序列在第180位点由Phe(F)突变为Trp(W)。
3、A182Y突变体的制备
用如下引物对A182Y-F:5′CAAACTGCACGACTTCGGTTATCGTGGTGTTTCTTCTCTG 3′和A182Y-R:5′CAGAGAAGAAACACCACGATAACCGAAGTCGTGCAGTTTG 3′,以实施例6第一部分构建的质粒pRSET-nampt为模板,利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增A182Y突变体基因,经1%琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物,再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例6第一部分),得到质粒pRSET-A182Y。将质粒pRSET-A182Y转化感受态细菌细胞E.coli BL21,在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆,从克隆中提取质粒pRSET-A182Y的DNA,经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO:2所示的亲本氨基酸序列相比,A182Y突变体的氨基酸序列在第182位点由Ala(A)突变为Tyr(Y)。
4、E231A突变体的制备
用如下引物对E231A-F:5′CTATCCCGGCTATGGCGCACTCTACCGTTAC 3′和E231A-R:5′GTAACGGTAGAGTGCGCCATAGCCGGGATAG 3′,以实施例6第一部分构建的质粒pRSET-nampt为模板,利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增E231A突变体基因,经1%琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物,再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例6第一部分),得到质粒pRSET-E231A。将质粒pRSET-E231A转化感受态细菌细胞E.coli BL21,在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆,从克隆中提取质粒pRSET-E231A的DNA,经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO:2所示的亲本氨基酸序列相比,E23lA突变体的氨基酸序列在第231位点由Glu(E)突变为Ala(A)。
5、E231Q突变体的制备
用如下引物对E231Q-F:5′CTCTATCCCGGCTATGCAGCACTCTACCGTTACC 3′和E231Q-R:5′GGTAACGGTAGAGTGCTGCATAGCCGGGATAGAG 3′,以实施例6第一部分构建的质粒pRSET-nampt为模板,利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增E231Q突变体基因,经1%琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物,再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例6第一部分),得到质粒pRSET-E231Q。将质粒pRSET-E231Q转化感受态细菌细胞E.coli BL21,在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆,从克隆中提取质粒pRSET-E231Q的DNA,经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO:2所示的亲本氨基酸序列相比,E231Q突变体的氨基酸序列在第231位点由Glu(E)突变为Gln(Q)。
6、D298A突变体的制备
用如下引物对D298A-F:5′TATCCGTCCGGCGTCTGGTGACCC 3′和D298A-R:5′GGGTCACCAGACGCCGGACGGATA 3′,以实施例6第一部分构建的质粒pRSET-nampt为模板,利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增D298A突变体基因,经1%琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物,再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例6第一部分),得到质粒pRSET-D298A。将质粒pRSET-D298A转化感受态细菌细胞E.coli BL21,在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆,从克隆中提取质粒pRSET-D298A的DNA,经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO:2所示的亲本氨基酸序列相比,D298A突变体的氨基酸序列在第298位点由Asp(D)突变为Ala(A)。
7、D298N突变体的制备
用如下引物对D298N-F:5′GTTGTTATCCGTCCGAATTCTGGTGACCCGCCG 3′和D298N-R:5′CGGCGGGTCACCAGAATTCGGACGGATAACAAC 3′,以实施例6第一部分构建的质粒pRSET-nampt为模板,利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增D298N突变体基因,经1%琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物,再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例6第一部分),得到质粒pRSET-D298N。将质粒pRSET-D298N转化感受态细菌细胞E.coli BL21,在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆,从克隆中提取质粒pRSET-D298N的DNA,经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO:2所示的亲本氨基酸序列相比,D298N突变体的氨基酸序列在第298位点由Asp(D)突变为Asn(N)。
8、D298E突变体的制备
用如下引物对D298E-F:5′GTTGTTATCCGTCCGGAATCTGGTGACCCGCCGTTC 3′和D298E-R:5′GAACGGCGGGTCACCAGATTCCGGACGGATAACAAC 3′,以实施例6第一部分构建的质粒pRSET-nampt为模板,利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增D298E突变体基因,经1%琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物,再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例6第一部分),得到质粒pRSET-D298E。将质粒pRSET-D298E转化感受态细菌细胞E.coli BL21,在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆,从克隆中提取质粒pRSET-D298E的DNA,经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO:2所示的亲本氨基酸序列相比,D298E突变体的氨基酸序列在第298位点由Asp(D)突变为Glu(E)。
9、D338N突变体的制备
用如下引物对D338N-F:5′GTTCGTGTTATCCAGGGTAATGGTGTTAACGCTGACTC 3′和D338N-R:5′GAGTCAGCGTTAACACCATTACCCTGGATAACACGAAC 3′,以实施例6第一部分构建的质粒pRSET-nampt为模板,利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增D338N突变体基因,经1%琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物,再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例6第一部分),得到质粒pRSET-D338N。将质粒pRSET-D338N转化感受态细菌细胞E.coli BL21,在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆,从克隆中提取质粒pRSET-D338N的DNA,经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO:2所示的亲本氨基酸序列相比,D338N突变体的氨基酸序列在第338位点由Asp(D)突变为Asn(N)。
10、D338E突变体的制备
用如下引物对D338E-F:5′GTTATCCAGGGTGAAGGTGTTAACGCTGAC3′和D338E-R:5′GTCAGCGTTAACACCTTCACCCTGGATAAC 3′,以实施例6第一部分构建的质粒pRSET-nampt为模板,利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增D338E突变体基因,经1%琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物,再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例6第一部分),得到质粒pRSET-D338E。将质粒pRSET-D338E转化感受态细菌细胞E.coli BL21,在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆,从克隆中提取质粒pRSET-D338E的DNA,经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO:2所示的亲本氨基酸序列相比,D338E突变体的氨基酸序列在第338位点由Asp(D)突变为Glu(E)。11、D377A突变体的制备
用如下引物对D377A-F:5′CACCCGCACCGTGCGACCCAGAAATTC 3′和D377A-R:5′GAATTTCTGGGTCGCACGGTGCGGGTG 3′,以实施例6第一部分构建的质粒pRSET-nampt为模板,利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增D377A突变体基因,经1%琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物,再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例6第一部分),得到质粒pRSET-D377A。将质粒pRSET-D377A转化感受态细菌细胞E.coli BL21,在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆,从克隆中提取质粒pRSET-D377A的DNA,经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO:2所示的亲本氨基酸序列相比,D377A突变体的氨基酸序列在第377位点由Asp(D)突变为Ala(A)。
12、D377N突变体的制备
用如下引物对D377N-F:5′GCAACACCCGCACCGTAATACCCAGAAATTCGCTC 3′和D377N-R:5′GAGCGAATTTCTGGGTATTACGGTGCGGGTGTTGC 3′,以实施例6第一部分构建的质粒pRSET-nampt为模板,利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增D377N突变体基因,经1%琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物,再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例6第一部分),得到质粒pRSET-D377N。将质粒pRSET-D377N转化感受态细菌细胞E.coli BL21,在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆,从克隆中提取质粒pRSET-D377N的DNA,经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO:2所示的亲本氨基酸序列相比,D377N突变体的氨基酸序列在第377位点由Asp(D)突变为Asn(N)。
13、D377E突变体的制备
用如下引物对D377E-F:5′CCCGCACCGTGAAACCCAGAAATTCG 3′和D377E-R:5′CGAATTTCTGGGTTTCACGGTGCGGG 3′,以实施例6第一部分构建的质粒pRSET-nampt为模板,利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增D377E突变体基因,经1%琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物,再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例6第一部分),得到质粒pRSET-D377E。将质粒pRSET-D377E转化感受态细菌细胞E.coli BL21,在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆,从克隆中提取质粒pRSET-D377E的DNA,经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO:2所示的亲本氨基酸序列相比,D377E突变体的氨基酸序列在第377位点由Asp(D)突变为Glu(E)。
14、E231Q/D338E突变体的制备
用如下引物对D338E-F:5′GTTATCCAGGGTGAAGGTGTTAACGCTGAC 3′和D338E-R:5′GTCAGCGTTAACACCTTCACCCTGGATAAC 3′,以实施例6第二部分的第5小节构建的质粒pRSET-E231Q为模板,利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增E231Q/D338E突变体基因,经1%琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物,再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例6第一部分),得到质粒pRSET-21。将质粒pRSET-21转化感受态细菌细胞E.coli BL21,在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆,从克隆中提取质粒pRSET-21的DNA,经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO:2所示的亲本氨基酸序列相比,E231Q/D338E突变体的氨基酸序列在第231位点由Glu(E)突变为Gln(Q)、在第338位点由Asp(D)突变为Glu(E)。
15、E231Q/D377E突变体的制备
用如下引物对D377E-F:5′CCCGCACCGTGAAACCCAGAAATTCG 3′和D377E-R:5′CGAATTTCTGGGTTTCACGGTGCGGG 3′,以实施例6第二部分的第5小节构建的质粒pRSET-E231Q为模板,利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增E231Q/D377E突变体基因,经1%琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物,再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例6第一部分),得到质粒pRSET-22。将质粒pRSET-22转化感受态细菌细胞E.coli BL21,在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆,从克隆中提取质粒pRSET-22的DNA,经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO:2所示的亲本氨基酸序列相比,E231Q/D377E突变体的氨基酸序列在第231位点由Glu(E)突变为Gln(Q)、在第377位点由Asp(D)突变为Glu(E)。
16、D338E/D377E突变体的制备
用如下引物对D377E-F:5′CCCGCACCGTGAAACCCAGAAATTCG 3′和D377E-R:5′CGAATTTCTGGGTTTCACGGTGCGGG 3′,以实施例6第二部分的第10小节构建的质粒pRSET-D338E为模板,利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增D338E/D377E突变体基因,经1%琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物,再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例6第一部分),得到质粒pRSET-23。将质粒pRSET-23转化感受态细菌细胞E.coli BL21,在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆,从克隆中提取质粒pRSET-23的DNA,经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO:2所示的亲本氨基酸序列相比,D338E/D377E突变体的氨基酸序列在第338位点由Asp(D)突变为Glu(E)、在第377位点由Asp(D)突变为Glu(E)。
17、E231Q/D338E/D377E突变体的制备
用如下引物对D377E-F:5′CCCGCACCGTGAAACCCAGAAATTCG 3′和D377E-R:5′CGAATTTCTGGGTTTCACGGTGCGGG 3′,以实施例6第二部分的第14小节构建的质粒pRSET-21为模板,利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增E231Q/D338E/D377E突变体基因,经1%琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物,再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例6第一部分),得到质粒pRSET-31。将质粒pRSET-31转化感受态细菌细胞E.coli BL21,在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆,从克隆中提取质粒pRSET-31的DNA,经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO:2所示的亲本氨基酸序列相比,E231Q/D338E/D377E突变体的氨基酸序列在第231位点由Glu(E)突变为Gln(Q)、在第338位点由Asp(D)突变为Glu(E)、在第377位点由Asp(D)突变为Glu(E)。
18、E231Q/D298A/D338E/D377E突变体的制备
用如下引物对D298A-F:5′TATCCGTCCGGCGTCTGGTGACCC 3′和D298A-R:5′GGGTCACCAGACGCCGGACGGATA 3′,以实施例6第二部分的第17小节构建的质粒pRSET-31为模板,利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增E231Q/D298A/D338E/D377E突变体基因,经1%琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物,再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例6第一部分),得到质粒pRSET-41。将质粒pRSET-41转化感受态细菌细胞E.coli BL21,在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆,从克隆中提取质粒pRSET-41的DNA,经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO:2所示的亲本氨基酸序列相比,E231Q/D298A/D338E/D377E突变体的氨基酸序列在第231位点由Glu(E)突变为Gln(Q)、在第298位点由Asp(D)突变为Ala(A)、在第338位点由Asp(D)突变为Glu(E)、在第377位点由Asp(D)突变为Glu(E)。
三、酶的提取
将含亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶基因的质粒pRSET-nampt以及含烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体基因的质粒pRSET-F180A、pRSET-F180W、pRSET-A182Y、pRSET-E231A、pRSET-E231Q、pRSET-D298A、pRSET-D298N、pRSET-D298E、pRSET-D338N、pRSET-D338E、pRSET-D377A、pRSET-D377N、pRSET-D377E、pRSET-21、pRSET-22、pRSET-23、pRSET-31以及pRSET-41分别转化感受态细菌细胞E.coli BL21,在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上37℃培养24小时。接种单个克隆于50毫升LB液体培养基(含50mg/L卡那霉素)中于30℃培养16-20小时。离心收集菌体,称量等同量菌体按照1∶4比例悬浮破菌液(pH 7.5)中。然后用超声波裂解细菌细胞。离心(4-10℃,12000rpm,10分钟)并收集上清液,即分别得到亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶以及一系列烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的上清蛋白溶液,可用于酶活性的测定以及烟酰胺单核苷酸的的生物催化制备。
四、酶活性的测定
配制底物溶液:含60mM的烟酰胺、25mM的PRPP、18mM的MgCl2、15mM的KCl和100mM的Tris buffer缓冲液,调pH至7.5。分别取底物溶液900微升各19份,然后分别加入100微升等浓度的的实施例6第三部分得到的亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶以及各烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的上清蛋白溶液,于37℃进行10分钟反应,加入100μL25%三氯乙酸终止反应。通过高效液相色谱仪(HPLC)测定反应液中烟酰胺单核苷酸(NMN)的含量,并计算每种酶的比酶活,以亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶的比酶活为参比100,亲本及各突变体的相对比活性如表1所示。
表1烟酰胺磷酸核糖转移酶的酶活
[表1]
酶的名称 |
相对比活性 |
亲本 |
100 |
F180A突变体 |
118 |
F180W突变体 |
122 |
A182Y突变体 |
187 |
E231A突变体 |
221 |
E231Q突变体 |
529 |
D298A突变体 |
236 |
D298N突变体 |
238 |
D298E突变体 |
149 |
D338N突变体 |
194 |
D338E突变体 |
516 |
D377A突变体 |
204 |
D377N突变体 |
279 |
D377E突变体 |
274 |
E231Q/D338E突变体 |
593 |
E231Q/D377E突变体 |
546 |
D338E/D377E突变体 |
601 |
E231Q/D338E/D377E突变体 |
654 |
E231Q/D298A/D338E/D377E突变体 |
691 |
五、烟酰胺单核苷酸的制备
向反应釜中加入底物溶液,含30mM的烟酰胺、20mM的ATP、30mM的木糖、12mM的MgCl2、10mM的KCl、10mM的ZnCl2、以及100mM的Tris-HCl缓冲液,调pH至7.0-7.5。然后加入催化用的各种酶,各种酶的加入量为:实施例6第三部分得到的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体(F180A)的上清蛋白溶液10ml/L底物溶液,核糖磷酸焦磷酸激酶6g/L底物溶液,核糖-5-磷酸异构酶10g/L底物溶液,核酮糖-3-磷酸异构酶11g/L底物溶液,木酮糖激酶10g/L底物溶液,木糖异构酶10g/L底物溶液。搅拌均匀后进行反应,反应过程中持续搅拌(搅拌速度50rpm),控制反应温度为37℃,维持pH值为7.0-7.5。反应6h后即得烟酰胺单核苷酸粗产品溶液(含NMN10mM),再经过滤、纯化、干燥后即得烟酰胺单核苷酸。
序列表
<110> 邦泰生物工程(深圳)有限公司
<120> 一种制备烟酰胺单核苷酸的方法1
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1392
<212> DNA
<213> 红色亚栖热菌(Meiothermus ruber DSM 1279)
<400> 1
atgaaaaccc tcaaccccca caacctcatc ctcaacaccg acagctacaa agccagtcac 60
tttgcccagt tccccaaagg catgacctat gccagttggt acatcgagag ccggggcggc 120
gactcgaatt ttgtgcgttt ctttggccta caggccttct taatcgagta cctcagcaaa 180
ggggtcagcc tggccgatgt ggaggaggcc caggaagttt tcctggccca cggcctgccc 240
ttccccacag aaggctggcg ctacatcgct caggacttag gagggcggct gccggtgcgc 300
atccgggccg tgcccgaggg taaggtggtt cccgtacaca accccctggt catcatcgag 360
agcaccgacc ccaaagtgcc ctggctgccg ggttggctcg agaccgcgct gctgcgggcg 420
gtctggtacc ccaccacggt ctgcacggtc tcctggggta tccgcaacac catcaaggag 480
tacctggaga aaaccgccga cgaccccgag gccgagctgc ccttcaagct gcacgacttt 540
ggcgcgcgcg gggtgagcag cctcgagagc gccgggctgg gcgggatggc ccacctggtg 600
aactttatgg gcaccgacac cgtcaccgcc ctgatctacg cccgcaacta ctacggggcc 660
gagatggccg gctacagcat cccggccatg gagcacagca ccgtgaccag ctttggccgc 720
accggcgagg cccaggccta ccgccagatg ctcgagacct ttgccaagcc gggggccctg 780
atggccatgg tgattgattc gtacaaccgc gagcacgccg tgggccagat tatcggcgaa 840
gaactgcgcg agctcatcca gcagtcgggg gccaccgtgg tcatccggcc cgactcgggc 900
gacccgccct tcgtggtgct gcgcaccgtg cagaccctcg aggccaaatt tggcgccacc 960
ctcaaccgca agggctacaa ggtgctgaac ggggtgcggg tcatccaggg cgatggggtg 1020
aacgccgact ccatccgcaa ggtgctgttt ttgctcgagc agtggggcta cagcgcctcc 1080
aacgtggcct tcggcatggg cggggccctc ttgcagcacc cccaccgcga tacccagaag 1140
ttcgcccaga agctgcacct ggtcacggtg aacggcgaga cctacggggt gggcaagagc 1200
ccggtggacg accccggcaa actctccaag aagggccgtc tggacgttat ccaggacgag 1260
cgcggcatcc gcacggtgga gctgccgctg gaggccgccc agccgcaccc ccagagcatc 1320
ctgcaaaccg tattcgagaa cgggtcgatt acccggcgct acacctggga agaggtgcgc 1380
aacaacgctt ag 1392
<210> 2
<211> 463
<212> PRT
<213> 红色亚栖热菌(Meiothermus ruber DSM 1279)
<400> 2
Met Lys Thr Leu Asn Pro His Asn Leu Ile Leu Asn Thr Asp Ser Tyr
1 5 10 15
Lys Ala Ser His Phe Ala Gln Phe Pro Lys Gly Met Thr Tyr Ala Ser
20 25 30
Trp Tyr Ile Glu Ser Arg Gly Gly Asp Ser Asn Phe Val Arg Phe Phe
35 40 45
Gly Leu Gln Ala Phe Leu Ile Glu Tyr Leu Ser Lys Gly Val Ser Leu
50 55 60
Ala Asp Val Glu Glu Ala Gln Glu Val Phe Leu Ala His Gly Leu Pro
65 70 75 80
Phe Pro Thr Glu Gly Trp Arg Tyr Ile Ala Gln Asp Leu Gly Gly Arg
85 90 95
Leu Pro Val Arg Ile Arg Ala Val Pro Glu Gly Lys Val Val Pro Val
100 105 110
His Asn Pro Leu Val Ile Ile Glu Ser Thr Asp Pro Lys Val Pro Trp
115 120 125
Leu Pro Gly Trp Leu Glu Thr Ala Leu Leu Arg Ala Val Trp Tyr Pro
130 135 140
Thr Thr Val Cys Thr Val Ser Trp Gly Ile Arg Asn Thr Ile Lys Glu
145 150 155 160
Tyr Leu Glu Lys Thr Ala Asp Asp Pro Glu Ala Glu Leu Pro Phe Lys
165 170 175
Leu His Asp Phe Gly Ala Arg Gly Val Ser Ser Leu Glu Ser Ala Gly
180 185 190
Leu Gly Gly Met Ala His Leu Val Asn Phe Met Gly Thr Asp Thr Val
195 200 205
Thr Ala Leu Ile Tyr Ala Arg Asn Tyr Tyr Gly Ala Glu Met Ala Gly
210 215 220
Tyr Ser Ile Pro Ala Met Glu His Ser Thr Val Thr Ser Phe Gly Arg
225 230 235 240
Thr Gly Glu Ala Gln Ala Tyr Arg Gln Met Leu Glu Thr Phe Ala Lys
245 250 255
Pro Gly Ala Leu Met Ala Met Val Ile Asp Ser Tyr Asn Arg Glu His
260 265 270
Ala Val Gly Gln Ile Ile Gly Glu Glu Leu Arg Glu Leu Ile Gln Gln
275 280 285
Ser Gly Ala Thr Val Val Ile Arg Pro Asp Ser Gly Asp Pro Pro Phe
290 295 300
Val Val Leu Arg Thr Val Gln Thr Leu Glu Ala Lys Phe Gly Ala Thr
305 310 315 320
Leu Asn Arg Lys Gly Tyr Lys Val Leu Asn Gly Val Arg Val Ile Gln
325 330 335
Gly Asp Gly Val Asn Ala Asp Ser Ile Arg Lys Val Leu Phe Leu Leu
340 345 350
Glu Gln Trp Gly Tyr Ser Ala Ser Asn Val Ala Phe Gly Met Gly Gly
355 360 365
Ala Leu Leu Gln His Pro His Arg Asp Thr Gln Lys Phe Ala Gln Lys
370 375 380
Leu His Leu Val Thr Val Asn Gly Glu Thr Tyr Gly Val Gly Lys Ser
385 390 395 400
Pro Val Asp Asp Pro Gly Lys Leu Ser Lys Lys Gly Arg Leu Asp Val
405 410 415
Ile Gln Asp Glu Arg Gly Ile Arg Thr Val Glu Leu Pro Leu Glu Ala
420 425 430
Ala Gln Pro His Pro Gln Ser Ile Leu Gln Thr Val Phe Glu Asn Gly
435 440 445
Ser Ile Thr Arg Arg Tyr Thr Trp Glu Glu Val Arg Asn Asn Ala
450 455 460
<210> 3
<211> 463
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 亲本氨基酸序列中第180位点的Phe突变为Ala
<400> 3
Met Lys Thr Leu Asn Pro His Asn Leu Ile Leu Asn Thr Asp Ser Tyr
1 5 10 15
Lys Ala Ser His Phe Ala Gln Phe Pro Lys Gly Met Thr Tyr Ala Ser
20 25 30
Trp Tyr Ile Glu Ser Arg Gly Gly Asp Ser Asn Phe Val Arg Phe Phe
35 40 45
Gly Leu Gln Ala Phe Leu Ile Glu Tyr Leu Ser Lys Gly Val Ser Leu
50 55 60
Ala Asp Val Glu Glu Ala Gln Glu Val Phe Leu Ala His Gly Leu Pro
65 70 75 80
Phe Pro Thr Glu Gly Trp Arg Tyr Ile Ala Gln Asp Leu Gly Gly Arg
85 90 95
Leu Pro Val Arg Ile Arg Ala Val Pro Glu Gly Lys Val Val Pro Val
100 105 110
His Asn Pro Leu Val Ile Ile Glu Ser Thr Asp Pro Lys Val Pro Trp
115 120 125
Leu Pro Gly Trp Leu Glu Thr Ala Leu Leu Arg Ala Val Trp Tyr Pro
130 135 140
Thr Thr Val Cys Thr Val Ser Trp Gly Ile Arg Asn Thr Ile Lys Glu
145 150 155 160
Tyr Leu Glu Lys Thr Ala Asp Asp Pro Glu Ala Glu Leu Pro Phe Lys
165 170 175
Leu His Asp Ala Gly Ala Arg Gly Val Ser Ser Leu Glu Ser Ala Gly
180 185 190
Leu Gly Gly Met Ala His Leu Val Asn Phe Met Gly Thr Asp Thr Val
195 200 205
Thr Ala Leu Ile Tyr Ala Arg Asn Tyr Tyr Gly Ala Glu Met Ala Gly
210 215 220
Tyr Ser Ile Pro Ala Met Glu His Ser Thr Val Thr Ser Phe Gly Arg
225 230 235 240
Thr Gly Glu Ala Gln Ala Tyr Arg Gln Met Leu Glu Thr Phe Ala Lys
245 250 255
Pro Gly Ala Leu Met Ala Met Val Ile Asp Ser Tyr Asn Arg Glu His
260 265 270
Ala Val Gly Gln Ile Ile Gly Glu Glu Leu Arg Glu Leu Ile Gln Gln
275 280 285
Ser Gly Ala Thr Val Val Ile Arg Pro Asp Ser Gly Asp Pro Pro Phe
290 295 300
Val Val Leu Arg Thr Val Gln Thr Leu Glu Ala Lys Phe Gly Ala Thr
305 310 315 320
Leu Asn Arg Lys Gly Tyr Lys Val Leu Asn Gly Val Arg Val Ile Gln
325 330 335
Gly Asp Gly Val Asn Ala Asp Ser Ile Arg Lys Val Leu Phe Leu Leu
340 345 350
Glu Gln Trp Gly Tyr Ser Ala Ser Asn Val Ala Phe Gly Met Gly Gly
355 360 365
Ala Leu Leu Gln His Pro His Arg Asp Thr Gln Lys Phe Ala Gln Lys
370 375 380
Leu His Leu Val Thr Val Asn Gly Glu Thr Tyr Gly Val Gly Lys Ser
385 390 395 400
Pro Val Asp Asp Pro Gly Lys Leu Ser Lys Lys Gly Arg Leu Asp Val
405 410 415
Ile Gln Asp Glu Arg Gly Ile Arg Thr Val Glu Leu Pro Leu Glu Ala
420 425 430
Ala Gln Pro His Pro Gln Ser Ile Leu Gln Thr Val Phe Glu Asn Gly
435 440 445
Ser Ile Thr Arg Arg Tyr Thr Trp Glu Glu Val Arg Asn Asn Ala
450 455 460