CN108026517B - 一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其应用 - Google Patents

一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其应用，涉及一种通过基因定点突变的方法人工获得的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其应用。目的在于解决现有烟酰胺磷酸核糖转移酶的催化活性较低、工业应用价值较低的问题，提供了一系列烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，以及相应的核苷酸序列、表达载体和活体细胞，这些突变体以烟酰胺和PRPP为底物的酶催化活性是其亲本的1.2‑6.9倍，可应用在制备烟酰胺单核苷酸的工艺中。

Description

一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学与生物技术领域，特别涉及一种通过基因定点突变的方法人工获得的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其应用。
背景技术
烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nicotinamide phosphoribosyltransferase，缩写成Nampt)又名内脏脂肪素或前B细胞克隆增强因子PBEF，是哺乳动物生命活动中不可或缺的蛋白，在组织中普遍分布，主要存在于人的脂肪组织、肝、肌肉和骨髓中。
目前认为Nampt主要有3种功能：一是具酶活性的烟酰胺磷酸核糖转移酶功能，能够催化烟酰胺和5′-磷酸核糖基-1′-焦磷酸(PRPP)转变为烟酰胺单核苷酸(NMN)和焦磷酸，NMN继而被烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(Nmnat)转化为细胞内必需的能量物质烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，哺乳动物细胞中80％的NAD由该生物合成途径合成，而Nampt又是该途径的限速酶，因而调控着细胞内NAD的水平；二是作为前B细胞克隆增强因子(PBEF)，由淋巴细胞分泌，协调白介素7(IL-7)和干细胞因子(SCF)，刺激前B细胞的形成；三是作为脂肪细胞分泌的脂肪因子，参与多种生物学功能。2005年Fukuhara等发现Nampt能够通过与胰岛素受体直接相互作用激活胰岛素受体信号，因其在内脏脂肪细胞中高表达，所以将其命名为Visfatin(内脏脂肪素)。
随着人们对NMN药用和保健效果认知的增加，市场上对NMN的需求量与日俱增，而目前生产NMN的最绿色环保无公害的方法是用Nampt催化烟酰胺和5′-磷酸核糖基-1′-焦磷酸(PRPP)转变为NMN的生物催化方法。但是由于现有的野生型Nampt的酶活较低，将其应用于大工业化催化生产NMN时产率较低，导致生产成本过高，产品缺乏市场竞争力，严重制约了NMN的生物催化技术的工业化应用。
因此，提高Nampt的催化活力是降低NMN的生物催化合成成本、提高Nampt的工业应用价值、促进生物催化技术在NMN工业化生产中的应用的关键因素。
技术问题
针对上述背景技术中提到的现有烟酰胺磷酸核糖转移酶的催化活性较低、工业应用价值较低的问题，本发明的目的在于提供一种催化活性高于现有野生型亲本的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，该突变体可高效催化烟酰胺和PRPP转变为NMN，极大地降低了工业上应用生物催化技术生产NMN的成本，具有较高的工业应用价值。
问题的解决方案
技术解决方案
为实现上述目的，发明人对核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶的基因进行定点突变，PCR扩增后插入适当的载体，随后在LB培养基上筛选，从而获得了一系列具有高催化活性的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体。因此，本发明提供了一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，其特征在于所述突变体为如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的蛋白质，
(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸并且以烟酰胺和PRPP为底物具有比氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的亲本高的烟酰胺磷酸核糖转移酶催化活性的由(a)衍生的蛋白质。
本发明中的亲本是指来自Meiothermus ruber DSM 1279的烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列SEQ ID NO：2所示。
优选地，所述突变体与如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列相比在选自至少一个下述位点处具有至少一个突变：第180位、第182位、第231位、第298位、第338位以及第377位。
更优选地，所述突变体具有至少一个下述突变：F180A、F180W、A182Y、E231A、E231Q、D298A、D298N、D298E、D338N、D338E、D377A、D377N以及D377E。
本发明还提供了一种核苷酸序列，该核苷酸序列编码上述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体。
本发明还提供了一种表达载体，该表达载体包含上述核苷酸序列。
本发明还提供了一种活体细胞，该活体细胞中导入了上述核苷酸序列，并且能够表达分泌上述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体。
本发明还提供了上述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的应用，其特征在于：将所述突变体应用在制备烟酰胺单核苷酸的工艺中，所述工艺可以是生物催化工艺也可以是发酵工艺。
上述制备烟酰胺单核苷酸(NMN)的生物催化工艺具体是指用生物酶催化底物转化成NMN的工艺，其中的生物酶是本发明的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体或者是本发明的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体和一种或者多种其他酶的联合使用，其中的底物可以是PRPP和烟酰胺，也可以是能够转化成PRPP或者烟酰胺的前体物质，例如：
以烟酰胺和PRPP为原料，在本发明的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的催化作用下制备NMN；
以烟酰胺、ATP和木糖为原料，在本发明的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体、核糖磷酸焦磷酸激酶、核糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-3-磷酸异构酶、木酮糖激酶以及木糖异构酶的催化作用下制备NMN；
以烟酰胺、ATP和核糖为原料，在本发明的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体、核糖磷酸焦磷酸激酶以及核糖激酶的催化作用下制备NMN；
以烟酰胺、焦磷酸或其盐和AMP为原料，在本发明的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体和腺嘌呤磷酸核糖转移酶的催化作用下制备NMN；
以烟酰胺、ATP和AMP为原料，在本发明的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体、核糖磷酸焦磷酸激酶以及AMP核苷酶的催化作用下制备NMN；
以烟酰胺、焦磷酸或其盐和肌苷酸或其盐为原料，在本发明的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶以及黄嘌呤氧化酶的催化作用下制备NMN。
优选地，本发明的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的使用形式为酶液、酶冻干粉、含酶细胞、固定化酶或者固定化含酶细胞。
发明的有益效果
有益效果
与现有的野生型烟酰胺磷酸核糖转移酶相比，本发明提供的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的酶活力大大提高，经酶活测定，以烟酰胺和PRPP为底物，本发明提供的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的酶催化活性是亲本的1.2-6.9倍，如此高的催化活性使其可以未经纯化以粗酶形式使用，或者只须部分纯化，这就使得应用本发明提供的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体催化生产NMN的成本大大降低，具有较高的市场竞争力，能够满足将NMN的生物催化方法应用于大规模工业化生产的需求。
发明实施例
本发明的实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释，本发明并不局限于以下实施例，实施例中未注明具体条件者，按常规条件或制造商建议的条件进行。
本发明提供的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的制备过程大致为：首先构建含有亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶基因的载体质粒，然后设定定点突变的位点以及突变后的氨基酸种类，再合成适当的引物，以含亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶基因的载体质粒为模板，PCR扩增DNA片段、装配所扩增的DNA片段以及PCR扩增全长突变基因。然后将该全长突变基因克隆到适当的载体上并转化适当的宿主细胞，经培养筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的阳性克隆。最后从阳性克隆中提取质粒DNA，进行DNA序列测定分析，以确定引入的突变，在确定目的片段插入到载体上后，通过LB+卡那霉素培养基筛选，从而获得一系列具有高催化活性的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体。
在上述制备方法中，可采用任何适用的载体，例如：可以为原核表达载体，如pRSET和pES21等；可以为克隆载体，如pUC18/19和pBluscript-SK等。本发明优先选用pRSET-A为载体，载体的宿主细胞可以是包括大肠杆菌在内的原核细胞，也可以是包括酿酒酵母和毕赤巴斯德酵母在内的真核细胞。
以下实施例中所使用的酶，除烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体是从来自Meiothermus ruber DSM 1279的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶经人工诱导定点突变获得的之外，其余的酶均是从市场上直接购入的酶冻干粉。
实施例1
含有亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶基因的载体质粒的构建
对基因库公布的来自Meiothermus ruber DSM 1279的亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶的基因序列(GenBank登录号：CP001743.1)进行全序列人工合成(由商业合成公司完成)。合成的产物经限制性内切酶NdeI和BamHI酶切后与经同样限制性内切酶NdeI和BamHI酶切的载体pRSET-A(源自Invitrogen，USA)连接，得质粒pRSET-nampt。经DNA测序，确定该被克隆的亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其氨基酸序列如SEQID NO：2所示。
实施例2
烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的制备
PCR扩增反应体系为：20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mMMgSO4，0.1％Triton X-100，50mM dATP，50mM dTTP，50mM dCTP，50mM dGTP，1.5U Pfu DNA聚合酶(Promega，USA)，20ng DNA模板，以及400nM上游引物和400nM下游引物，用无菌水调反应体积至50微升。
PCR扩增反应条件为：95℃3分钟，35圈循环：95℃50秒、52℃30秒和72℃3分钟，最后72℃5分钟。
1、F180A突变体的制备
用如下引物对F180A-F：5′GTTCAAACTGCACGACGCGGGTGCTCGTGGTGTTTC 3′和F180A-R：5′GAAACACCACGAGCACCCGCGTCGTGCAGTTTGAAC 3′，以实施例1构建的质粒pRSET-nampt为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增F180A突变体基因，经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物，再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例1)，得到质粒pRSET-F180A。将质粒pRSET-F180A转化感受态细菌细胞E.coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆，从克隆中提取质粒pRSET-F180A的DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO：2所示的亲本氨基酸序列相比，F180A突变体的氨基酸序列在第180位点由P he(F)突变为Ala(A)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
2、F180W突变体的制备
用如下引物对F180W-F：5′GTTCAAACTGCACGACTGGGGTGCTCGTGGTGTTTC 3′和F180W-R：5′GAAACACCACGAGCACCCCAGTCGTGCAGTTTGAAC 3′，以实施例1构建的质粒pRSET-nampt为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增F180W突变体基因，经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物，再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例1)，得到质粒pRSET-F180W。将质粒pRSET-F180W转化感受态细菌细胞E.coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆，从克隆中提取质粒pRSET-F180W的DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO：2所示的亲本氨基酸序列相比，F180W突变体的氨基酸序列在第180位点由Phe(F)突变为Trp(W)。
3、A182Y突变体的制备
用如下引物对A182Y-F：5′CAAACTGCACGACTTCGGTTATCGTGGTGTTTCTTCTCTG 3′和A182Y-R：5′CAGAGAAGAAACACCACGATAACCGAAGTCGTGCAGTTTG 3′，以实施例1构建的质粒pRSET-nampt为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增A182Y突变体基因，经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物，再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例1)，得到质粒pRSET-A182Y。将质粒pRSET-A182Y转化感受态细菌细胞E.coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆，从克隆中提取质粒pRSET-A182Y的DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO：2所示的亲本氨基酸序列相比，A182Y突变体的氨基酸序列在第182位点由Ala(A)突变为Tyr(Y)。
4、E231A突变体的制备
用如下引物对E231A-F：5′CTATCCCGGCTATGGCGCACTCTACCGTTAC 3′和E231A-R：5′GTAACGGTAGAGTGCGCCATAGCCGGGATAG 3′，以实施例1构建的质粒pRSET-nampt为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增E231A突变体基因，经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物，再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例1)，得到质粒pRSET-E231A。将质粒pRSET-E231A转化感受态细菌细胞E.coliBL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆，从克隆中提取质粒pRSET-E231A的DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO：2所示的亲本氨基酸序列相比，E231A突变体的氨基酸序列在第231位点由Glu(E)突变为Ala(A)。
5、E231Q突变体的制备
用如下引物对E231Q-F：5′CTCTATCCCGGCTATGCAGCACTCTACCGTTACC 3′和E231Q-R：5′GGTAACGGTAGAGTGCTGCATAGCCGGGATAGAG 3′，以实施例1构建的质粒pRSET-nampt为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增E231Q突变体基因，经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物，再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例1)，得到质粒pRSET-E231Q。将质粒pRSET-E231Q转化感受态细菌细胞E.coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆，从克隆中提取质粒pRSET-E231Q的DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO：2所示的亲本氨基酸序列相比，E231Q突变体的氨基酸序列在第231位点由Glu(E)突变为Gln(Q)。
6、D298A突变体的制备
用如下引物对D298A-F：5′TATCCGTCCGGCGTCTGGTGACCC 3′和D298A-R：5′GGGTCACCAGACGCCGGACGGATA 3′，以实施例1构建的质粒pRSET-nampt为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增D298A突变体基因，经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物，再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例1)，得到质粒pRSET-D298A。将质粒pRSET-D298A转化感受态细菌细胞E.coli BL21，在Luriabroth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆，从克隆中提取质粒pRSET-D298A的DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO：2所示的亲本氨基酸序列相比，D298A突变体的氨基酸序列在第298位点由Asp(D)突变为Ala(A)。
7、D298N突变体的制备
用如下引物对D298N-F：5′GTTGTTATCCGTCCGAATTCTGGTGACCCGCCG3′和D298N-R：5′CGGCGGGTCACCAGAATTCGGACGGATAACAAC 3′，以实施例1构建的质粒pRSET-nampt为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增D298N突变体基因，经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物，再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例1)，得到质粒pRSET-D298N。将质粒pRSET-D298N转化感受态细菌细胞E.coliBL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆，从克隆中提取质粒pRSET-D298N的DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO：2所示的亲本氨基酸序列相比，D298N突变体的氨基酸序列在第298位点由Asp(D)突变为Asn(N)。
8、D298E突变体的制备
用如下引物对D298E-F：5′GTTGTTATCCGTCCGGAATCTGGTGACCCGCCGTTC 3′和D298E-R：5′GAACGGCGGGTCACCAGATTCCGGACGGATAACAAC 3′，以实施例1构建的质粒pRSET-nampt为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增D298E突变体基因，经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物，再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例1)，得到质粒pRSET-D298E。将质粒pRSET-D298E转化感受态细菌细胞E.coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆，从克隆中提取质粒pRSET-D298E的DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO：2所示的亲本氨基酸序列相比，D298E突变体的氨基酸序列在第298位点由Asp(D)突变为Glu(E)。
9、D338N突变体的制备
用如下引物对D338N-F：5′GTTCGTGTTATCCAGGGTAATGGTGTTAACGCTGACTC 3′和D338N-R：5′GAGTCAGCGTTAACACCATTACCCTGGATAACACGAAC 3′，以实施例1构建的质粒pRSET-nampt为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增D338N突变体基因，经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物，再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例1)，得到质粒pRSET-D338N。将质粒pRSET-D338N转化感受态细菌细胞E.coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆，从克隆中提取质粒pRSET-D338N的DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO：2所示的亲本氨基酸序列相比，D338N突变体的氨基酸序列在第338位点由Asp(D)突变为Asn(N)。
10、D338E突变体的制备
用如下引物对D338E-F：5′GTTATCCAGGGTGAAGGTGTTAACGCTGAC 3′和D338E-R：5′GTCAGCGTTAACACCTTCACCCTGGATAAC 3′，以实施例1构建的质粒pRSET-nampt为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增D338E突变体基因，经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物，再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例1)，得到质粒pRSET-D338E。将质粒pRSET-D338E转化感受态细菌细胞E.coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆，从克隆中提取质粒pRSET-D338E的DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQID NO：2所示的亲本氨基酸序列相比，D338E突变体的氨基酸序列在第338位点由Asp(D)突变为Glu(E)。
11、D377A突变体的制备
用如下引物对D377A-F：5′CACCCGCACCGTGCGACCCAGAAATTC 3′和D377A-R：5′GAATTTCTGGGTCGCACGGTGCGGGTG 3′，以实施例1构建的质粒pRSET-nampt为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增D377A突变体基因，经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物，再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例1)，得到质粒pRSET-D377A。将质粒pRSET-D377A转化感受态细菌细胞E.coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆，从克隆中提取质粒pRSET-D377A的DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ IDNO：2所示的亲本氨基酸序列相比，D377A突变体的氨基酸序列在第377位点由Asp(D)突变为Ala(A)。
12、D377N突变体的制备
用如下引物对D377N-F：5′GCAACACCCGCACCGTAATACCCAGAAATTCGCTC 3′和D377N-R：5′GAGCGAATTTCTGGGTATTACGGTGCGGGTGTTGC 3′，以实施例1构建的质粒pRSET-nampt为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增D377N突变体基因，经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物，再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例1)，得到质粒pRSET-D377N。将质粒pRSET-D377N转化感受态细菌细胞E.coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆，从克隆中提取质粒pRSET-D377N的DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO：2所示的亲本氨基酸序列相比，D377N突变体的氨基酸序列在第377位点由Asp(D)突变为Asn(N)。
13、D377E突变体的制备
用如下引物对D377E-F：5′CCCGCACCGTGAAACCCAGAAATTCG 3′和D377E-R：5′CGAATTTCTGGGTTTCACGGTGCGGG 3′，以实施例1构建的质粒pRSET-nampt为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增D377E突变体基因，经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物，再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例1)，得到质粒pRSET-D377E。将质粒pRSET-D377E转化感受态细菌细胞E.coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆，从克隆中提取质粒pRSET-D377E的DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ IDNO：2所示的亲本氨基酸序列相比，D377E突变体的氨基酸序列在第377位点由Asp(D)突变为Glu(E)。
14、E231Q/D338E突变体的制备
用如下引物对D338E-F：5′GTTATCCAGGGTGAAGGTGTTAACGCTGAC 3′和D338E-R：5′GTCAGCGTTAACACCTTCACCCTGGATAAC 3′，以实施例2中的第5部分构建的质粒pRSET-E231Q为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增E231Q/D338E突变体基因，经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物，再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例1)，得到质粒pRSET-21。将质粒pRSET-21转化感受态细菌细胞E.coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆，从克隆中提取质粒pRSET-21的DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO：2所示的亲本氨基酸序列相比，E231Q/D338E突变体的氨基酸序列在第231位点由Glu(E)突变为Gln(Q)、在第338位点由Asp(D)突变为Glu(E)。
15、E231Q/D377E突变体的制备
用如下引物对D377E-F：5′CCCGCACCGTGAAACCCAGAAATTCG 3′和D377E-R：5′CGAATTTCTGGGTTTCACGGTGCGGG 3′，以实施例2中的第5部分构建的质粒pRSET-E231Q为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增E231Q/D377E突变体基因，经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物，再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例1)，得到质粒pRSET-22。将质粒pRSET-22转化感受态细菌细胞E.coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆，从克隆中提取质粒pRSET-22的DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO：2所示的亲本氨基酸序列相比，E231Q/D377E突变体的氨基酸序列在第231位点由Glu(E)突变为Gln(Q)、在第377位点由Asp(D)突变为Glu(E)。
16、D338E/D377E突变体的制备
用如下引物对D377E-F：5′CCCGCACCGTGAAACCCAGAAATTCG 3′和D377E-R：5′CGAATTTCTGGGTTTCACGGTGCGGG 3′，以实施例2中的第10部分构建的质粒pRSET-D338E为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增D338E/D377E突变体基因，经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物，再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例1)，得到质粒pRSET-23。将质粒pRSET-23转化感受态细菌细胞E.coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆，从克隆中提取质粒pRSET-23的DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO：2所示的亲本氨基酸序列相比，D338E/D377E突变体的氨基酸序列在第338位点由Asp(D)突变为Glu(E)、在第377位点由Asp(D)突变为Glu(E)。
17、E231Q/D338E/D377E突变体的制备
用如下引物对D377E-F：5′CCCGCACCGTGAAACCCAGAAATTCG 3′和D377E-R：5′CGAATTTCTGGGTTTCACGGTGCGGG 3′，以实施例2中的第14部分构建的质粒pRSET-21为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增E231Q/D338E/D377E突变体基因，经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物，再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例1)，得到质粒pRSET-31。将质粒pRSET-31转化感受态细菌细胞E.coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆，从克隆中提取质粒pRSET-31的DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO：2所示的亲本氨基酸序列相比，E231Q/D338E/D377E突变体的氨基酸序列在第231位点由Glu(E)突变为Gln(Q)、在第338位点由Asp(D)突变为Glu(E)、在第377位点由Asp(D)突变为Glu(E)。
18、E231Q/D298A/D338E/D377E突变体的制备
用如下引物对D298A-F：5′TATCCGTCCGGCGTCTGGTGACCC 3′和D298A-R：5′GGGTCACCAGACGCCGGACGGATA 3′，以实施例2中的第17部分构建的质粒pRSET-31为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增E231Q/D298A/D338E/D377E突变体基因，经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物，再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例1)，得到质粒pRSET-41。将质粒pRSET-41转化感受态细菌细胞E.coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆，从克隆中提取质粒pRSET-41的DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO：2所示的亲本氨基酸序列相比，E231Q/D298A/D338E/D377E突变体的氨基酸序列在第231位点由Glu(E)突变为Gln(Q)、在第298位点由Asp(D)突变为Ala(A)、在第338位点由Asp(D)突变为Glu(E)、在第377位点由Asp(D)突变为Glu(E)。
实施例3
酶的提取
将含亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶基因的质粒pRSET-nampt以及含烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体基因的质粒pRSET-F180A、pRSET-F180W、pRSET-A182Y、pRSET-E231A、pRSET-E231Q、pRSET-D298A、pRSET-D298N、pRSET-D298E、pRSET-D338N、pRSET-D338E、pRSET-D377A、pRSET-D377N、pRSET-D377E、pRSET-21、pRSET-22、pRSET-23、pRSET-31以及pRSET-41分别转化感受态细菌细胞E.coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上37℃培养24小时。接种单个克隆于50毫升LB液体培养基(含50mg/L卡那霉素)中于30℃培养16-20小时。离心收集菌体，称量等同量菌体按照1∶4比例悬浮破菌液(pH 7.5)中。然后用超声波裂解细菌细胞。离心(4-10℃，12000rpm，10分钟)并收集上清液，即分别得到亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶以及一系列烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的上清蛋白溶液，可用于酶活性的测定以及烟酰胺单核苷酸的的生物催化制备。
实施例4
酶活性的测定
配制底物溶液：含60mM的烟酰胺、25mM的PRPP、18mM的MgCl2、15mM的KCl和100mM的Tris buffer缓冲液，调pH至7.5。分别取底物溶液900微升各19份，然后分别加入100微升等浓度的实施例3得到的亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶以及各烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的上清蛋白溶液，于37℃进行10分钟反应，加入100μL25％三氯乙酸终止反应。通过高效液相色谱仪(HPLC)测定反应液中烟酰胺单核苷酸(NMN)的含量，并计算每种酶的比酶活，以亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶的比酶活为参比100，亲本及各突变体的相对比活性如表1所示。
表1烟酰胺磷酸核糖转移酶的酶活
[表1]
酶的名称 相对比活性
亲本 100
F180A突变体 118
F180W突变体 122
A182Y突变体 187
E231A突变体 221
E231Q突变体 529
D298A突变体 236
D298N突变体 238
D298E突变体 149
D338N突变体 194
D338E突变体 516
D377A突变体 204
D377N突变体 279
D377E突变体 274
E231Q/D338E突变体 593
E231Q/D377E突变体 546
D338E/D377E突变体 601
E231Q/D338E/D377E突变体 654
E231Q/D298A/D338E/D377E突变体 691
实施例5
烟酰胺单核苷酸的制备
向反应釜中加入底物溶液，含30mM的烟酰胺、20mM的ATP、30mM的木糖、12mM的MgCl2、10mM的KCl、10mM的ZnCl2、以及100mM的Tris-HCl缓冲液，调pH至7.0-7.5。然后加入催化用的各种酶，各种酶的加入量为：实施例3得到的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体(F180A)的上清蛋白溶液10ml/L底物溶液，核糖磷酸焦磷酸激酶6g/L底物溶液，核糖-5-磷酸异构酶10g/L底物溶液，核酮糖-3-磷酸异构酶11g/L底物溶液，木酮糖激酶10g/L底物溶液，木糖异构酶10g/L底物溶液。搅拌均匀后进行反应，反应过程中持续搅拌(搅拌速度50rpm)，控制反应温度为37℃，维持pH值为7.0-7.5。反应6h后即得烟酰胺单核苷酸粗产品溶液(含NMN10mM)，再经过滤、纯化、干燥后即得烟酰胺单核苷酸。
实施例6
烟酰胺单核苷酸的制备
向反应釜中加入底物溶液，含30mM的烟酰胺、20mM的ATP、30mM的核糖、15mM的MgCl2、15mM的KCl以及100mM的Tris-HCl缓冲液，调pH至7.0-7.5。然后向底物溶液中加入催化用的各种酶，各种酶的加入量分别为：实施例6第三部分得到的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体(F180A)的上清蛋白溶液10ml/L底物溶液，核糖磷酸焦磷酸激酶20g/L底物溶液，核糖激酶20g/L底物溶液。搅拌均匀后进行反应，反应过程中持续搅拌(搅拌速度50rpm)，控制反应温度为37℃，维持pH值为7.0-7.5。反应4h后即得烟酰胺单核苷酸粗产品溶液(含NMN10mM)，再经过滤、纯化、干燥后即得烟酰胺单核苷酸成品。
实施例7
烟酰胺单核苷酸的制备
向反应釜中加入底物溶液，含75mM的烟酰胺、75mM的焦磷酸二钠、50mM的AMP、15mM的MgCl2、10mM的KCl以及100mM的Tris-HCl缓冲液，调pH至7.0-7.5。然后加入以下催化用酶：实施例6第三部分得到的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体(F180A)的上清蛋白溶液10ml/L底物溶液，腺嘌呤磷酸核糖转移酶20g/L底物溶液。搅拌均匀后进行反应，反应过程中持续搅拌(搅拌速度50rpm)，控制反应温度为37℃，维持pH值为7.0-8.0。反应5h后即得烟酰胺单核苷酸粗产品溶液(含NMN49.6mM)，再经过滤、纯化、干燥后即得烟酰胺单核苷酸成品。
实施例8
烟酰胺单核苷酸的制备
向反应釜中加入底物溶液，含60mM的烟酰胺、10mM的ATP、20mM的AMP、15mM的MgCl2、15mM的KCl以及100mM的Tris-HCl缓冲液，调pH至7.0-7.5。然后向底物溶液中加入催化用的各种酶，各种酶的加入量分别为：实施例6第三部分得到的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体(F180A)的上清蛋白溶液10ml/L底物溶液，核糖磷酸焦磷酸激酶15g/L底物溶液，AMP核苷酶15g/L底物溶液。搅拌均匀后进行反应，反应过程中持续搅拌(搅拌速度50rpm)，控制反应温度为37℃，维持pH值为7.0-7.5。反应3h后即得烟酰胺单核苷酸粗产品溶液(含NMN9.8mM)，再经过滤、纯化、干燥后即得烟酰胺单核苷酸成品。
实施例9
烟酰胺单核苷酸的制备
向反应釜中加入底物溶液，含60mM的烟酰胺、30mM的焦磷酸二钠、20mM的肌苷酸二钠、20mM的MgCl2、20mM的ZnCl2、35mM的亚硫酸氢钠以及100mM的Tris-HCl缓冲液，调pH至7.0-7.5。然后向底物溶液中加入催化用的各种酶，各种酶的加入量分别为：实施例6第三部分得到的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体(F180A)的上清蛋白溶液10ml/L底物溶液，次黄嘌呤磷酸核糖转移酶10g/L底物溶液，黄嘌呤氧化酶20g/L底物溶液。搅拌均匀后进行反应，反应过程中持续搅拌(搅拌速度50rpm)，控制反应温度为37℃，维持pH值为7.0-7.5。反应5h后即得烟酰胺单核苷酸粗产品溶液(含NMN19.8mM)，再经过滤、纯化、干燥后即得烟酰胺单核苷酸成品。
序列表
<110> 邦泰生物工程（深圳）有限公司
<120> 一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1392
<212> DNA
<213> 红色亚栖热菌（Meiothermus ruber DSM 1279）
<400> 1
atgaaaaccc tcaaccccca caacctcatc ctcaacaccg acagctacaa agccagtcac 60
tttgcccagt tccccaaagg catgacctat gccagttggt acatcgagag ccggggcggc 120
gactcgaatt ttgtgcgttt ctttggccta caggccttct taatcgagta cctcagcaaa 180
ggggtcagcc tggccgatgt ggaggaggcc caggaagttt tcctggccca cggcctgccc 240
ttccccacag aaggctggcg ctacatcgct caggacttag gagggcggct gccggtgcgc 300
atccgggccg tgcccgaggg taaggtggtt cccgtacaca accccctggt catcatcgag 360
agcaccgacc ccaaagtgcc ctggctgccg ggttggctcg agaccgcgct gctgcgggcg 420
gtctggtacc ccaccacggt ctgcacggtc tcctggggta tccgcaacac catcaaggag 480
tacctggaga aaaccgccga cgaccccgag gccgagctgc ccttcaagct gcacgacttt 540
ggcgcgcgcg gggtgagcag cctcgagagc gccgggctgg gcgggatggc ccacctggtg 600
aactttatgg gcaccgacac cgtcaccgcc ctgatctacg cccgcaacta ctacggggcc 660
gagatggccg gctacagcat cccggccatg gagcacagca ccgtgaccag ctttggccgc 720
accggcgagg cccaggccta ccgccagatg ctcgagacct ttgccaagcc gggggccctg 780
atggccatgg tgattgattc gtacaaccgc gagcacgccg tgggccagat tatcggcgaa 840
gaactgcgcg agctcatcca gcagtcgggg gccaccgtgg tcatccggcc cgactcgggc 900
gacccgccct tcgtggtgct gcgcaccgtg cagaccctcg aggccaaatt tggcgccacc 960
ctcaaccgca agggctacaa ggtgctgaac ggggtgcggg tcatccaggg cgatggggtg 1020
aacgccgact ccatccgcaa ggtgctgttt ttgctcgagc agtggggcta cagcgcctcc 1080
aacgtggcct tcggcatggg cggggccctc ttgcagcacc cccaccgcga tacccagaag 1140
ttcgcccaga agctgcacct ggtcacggtg aacggcgaga cctacggggt gggcaagagc 1200
ccggtggacg accccggcaa actctccaag aagggccgtc tggacgttat ccaggacgag 1260
cgcggcatcc gcacggtgga gctgccgctg gaggccgccc agccgcaccc ccagagcatc 1320
ctgcaaaccg tattcgagaa cgggtcgatt acccggcgct acacctggga agaggtgcgc 1380
aacaacgctt ag 1392
<210> 2
<211> 463
<212> PRT
<213> 红色亚栖热菌（Meiothermus ruber DSM 1279）
<400> 2
Met Lys Thr Leu Asn Pro His Asn Leu Ile Leu Asn Thr Asp Ser Tyr
1 5 10 15
Lys Ala Ser His Phe Ala Gln Phe Pro Lys Gly Met Thr Tyr Ala Ser
20 25 30
Trp Tyr Ile Glu Ser Arg Gly Gly Asp Ser Asn Phe Val Arg Phe Phe
35 40 45
Gly Leu Gln Ala Phe Leu Ile Glu Tyr Leu Ser Lys Gly Val Ser Leu
50 55 60
Ala Asp Val Glu Glu Ala Gln Glu Val Phe Leu Ala His Gly Leu Pro
65 70 75 80
Phe Pro Thr Glu Gly Trp Arg Tyr Ile Ala Gln Asp Leu Gly Gly Arg
85 90 95
Leu Pro Val Arg Ile Arg Ala Val Pro Glu Gly Lys Val Val Pro Val
100 105 110
His Asn Pro Leu Val Ile Ile Glu Ser Thr Asp Pro Lys Val Pro Trp
115 120 125
Leu Pro Gly Trp Leu Glu Thr Ala Leu Leu Arg Ala Val Trp Tyr Pro
130 135 140
Thr Thr Val Cys Thr Val Ser Trp Gly Ile Arg Asn Thr Ile Lys Glu
145 150 155 160
Tyr Leu Glu Lys Thr Ala Asp Asp Pro Glu Ala Glu Leu Pro Phe Lys
165 170 175
Leu His Asp Phe Gly Ala Arg Gly Val Ser Ser Leu Glu Ser Ala Gly
180 185 190
Leu Gly Gly Met Ala His Leu Val Asn Phe Met Gly Thr Asp Thr Val
195 200 205
Thr Ala Leu Ile Tyr Ala Arg Asn Tyr Tyr Gly Ala Glu Met Ala Gly
210 215 220
Tyr Ser Ile Pro Ala Met Glu His Ser Thr Val Thr Ser Phe Gly Arg
225 230 235 240
Thr Gly Glu Ala Gln Ala Tyr Arg Gln Met Leu Glu Thr Phe Ala Lys
245 250 255
Pro Gly Ala Leu Met Ala Met Val Ile Asp Ser Tyr Asn Arg Glu His
260 265 270
Ala Val Gly Gln Ile Ile Gly Glu Glu Leu Arg Glu Leu Ile Gln Gln
275 280 285
Ser Gly Ala Thr Val Val Ile Arg Pro Asp Ser Gly Asp Pro Pro Phe
290 295 300
Val Val Leu Arg Thr Val Gln Thr Leu Glu Ala Lys Phe Gly Ala Thr
305 310 315 320
Leu Asn Arg Lys Gly Tyr Lys Val Leu Asn Gly Val Arg Val Ile Gln
325 330 335
Gly Asp Gly Val Asn Ala Asp Ser Ile Arg Lys Val Leu Phe Leu Leu
340 345 350
Glu Gln Trp Gly Tyr Ser Ala Ser Asn Val Ala Phe Gly Met Gly Gly
355 360 365
Ala Leu Leu Gln His Pro His Arg Asp Thr Gln Lys Phe Ala Gln Lys
370 375 380
Leu His Leu Val Thr Val Asn Gly Glu Thr Tyr Gly Val Gly Lys Ser
385 390 395 400
Pro Val Asp Asp Pro Gly Lys Leu Ser Lys Lys Gly Arg Leu Asp Val
405 410 415
Ile Gln Asp Glu Arg Gly Ile Arg Thr Val Glu Leu Pro Leu Glu Ala
420 425 430
Ala Gln Pro His Pro Gln Ser Ile Leu Gln Thr Val Phe Glu Asn Gly
435 440 445
Ser Ile Thr Arg Arg Tyr Thr Trp Glu Glu Val Arg Asn Asn Ala
450 455 460
<210> 3
<211> 463
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 亲本氨基酸序列中第180位点的Phe突变为Ala
<400> 3
Met Lys Thr Leu Asn Pro His Asn Leu Ile Leu Asn Thr Asp Ser Tyr
1 5 10 15
Lys Ala Ser His Phe Ala Gln Phe Pro Lys Gly Met Thr Tyr Ala Ser
20 25 30
Trp Tyr Ile Glu Ser Arg Gly Gly Asp Ser Asn Phe Val Arg Phe Phe
35 40 45
Gly Leu Gln Ala Phe Leu Ile Glu Tyr Leu Ser Lys Gly Val Ser Leu
50 55 60
Ala Asp Val Glu Glu Ala Gln Glu Val Phe Leu Ala His Gly Leu Pro
65 70 75 80
Phe Pro Thr Glu Gly Trp Arg Tyr Ile Ala Gln Asp Leu Gly Gly Arg
85 90 95
Leu Pro Val Arg Ile Arg Ala Val Pro Glu Gly Lys Val Val Pro Val
100 105 110
His Asn Pro Leu Val Ile Ile Glu Ser Thr Asp Pro Lys Val Pro Trp
115 120 125
Leu Pro Gly Trp Leu Glu Thr Ala Leu Leu Arg Ala Val Trp Tyr Pro
130 135 140
Thr Thr Val Cys Thr Val Ser Trp Gly Ile Arg Asn Thr Ile Lys Glu
145 150 155 160
Tyr Leu Glu Lys Thr Ala Asp Asp Pro Glu Ala Glu Leu Pro Phe Lys
165 170 175
Leu His Asp Ala Gly Ala Arg Gly Val Ser Ser Leu Glu Ser Ala Gly
180 185 190
Leu Gly Gly Met Ala His Leu Val Asn Phe Met Gly Thr Asp Thr Val
195 200 205
Thr Ala Leu Ile Tyr Ala Arg Asn Tyr Tyr Gly Ala Glu Met Ala Gly
210 215 220
Tyr Ser Ile Pro Ala Met Glu His Ser Thr Val Thr Ser Phe Gly Arg
225 230 235 240
Thr Gly Glu Ala Gln Ala Tyr Arg Gln Met Leu Glu Thr Phe Ala Lys
245 250 255
Pro Gly Ala Leu Met Ala Met Val Ile Asp Ser Tyr Asn Arg Glu His
260 265 270
Ala Val Gly Gln Ile Ile Gly Glu Glu Leu Arg Glu Leu Ile Gln Gln
275 280 285
Ser Gly Ala Thr Val Val Ile Arg Pro Asp Ser Gly Asp Pro Pro Phe
290 295 300
Val Val Leu Arg Thr Val Gln Thr Leu Glu Ala Lys Phe Gly Ala Thr
305 310 315 320
Leu Asn Arg Lys Gly Tyr Lys Val Leu Asn Gly Val Arg Val Ile Gln
325 330 335
Gly Asp Gly Val Asn Ala Asp Ser Ile Arg Lys Val Leu Phe Leu Leu
340 345 350
Glu Gln Trp Gly Tyr Ser Ala Ser Asn Val Ala Phe Gly Met Gly Gly
355 360 365
Ala Leu Leu Gln His Pro His Arg Asp Thr Gln Lys Phe Ala Gln Lys
370 375 380
Leu His Leu Val Thr Val Asn Gly Glu Thr Tyr Gly Val Gly Lys Ser
385 390 395 400
Pro Val Asp Asp Pro Gly Lys Leu Ser Lys Lys Gly Arg Leu Asp Val
405 410 415
Ile Gln Asp Glu Arg Gly Ile Arg Thr Val Glu Leu Pro Leu Glu Ala
420 425 430
Ala Gln Pro His Pro Gln Ser Ile Leu Gln Thr Val Phe Glu Asn Gly
435 440 445
Ser Ile Thr Arg Arg Tyr Thr Trp Glu Glu Val Arg Asn Asn Ala
450 455 460

Claims (8)

1.一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，其特征在于，与如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列相比，所述突变体具有至少一个下述突变：F180A、F180W、A182Y、E231A、E231Q、D298A、D298N、D298E、D338N、D338E、D377A、D377N以及D377E。
2.一种核苷酸序列，其特征在于：所述核苷酸序列编码权利要求1所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体。
3.一种表达载体，其特征在于：所述表达载体包含权利要求2所述的核苷酸序列。
4.一种活体细胞，其特征在于：所述活体细胞中导入了权利要求2所述的核苷酸序列，并且能够表达分泌权利要求1所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体。
5.权利要求1所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的应用，其特征在于：将所述突变体应用在制备烟酰胺单核苷酸的工艺中。
6.根据权利要求5所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的应用，其特征在于：所述突变体的使用形式为酶液、酶冻干粉、含酶细胞、固定化酶或者固定化含酶细胞。
7.根据权利要求5所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的应用，其特征在于：所述工艺为生物催化工艺。
8.根据权利要求5所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的应用，其特征在于：所述工艺为发酵工艺。
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