CN103961691A

CN103961691A - 尼克酰胺磷酸核糖转移酶在制备神经保护药物中的用途

Info

Publication number: CN103961691A
Application number: CN201310041957.6A
Authority: CN
Inventors: 高艳琴; 曹国栋; 邢娟; 景崝; 陈俊
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2013-02-03
Filing date: 2013-02-03
Publication date: 2014-08-06

Abstract

本发明属制药领域，涉及尼克酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）在制备神经保护及康复药物中的用途，本发明实验显示NAMPT重组蛋白能透过血脑屏障，显著减小缺血性脑损伤体积，并减轻缺血性脑后的白质损伤；显著改善缺血性脑损伤后长期行为学；通过上调血管再生相关因子增强大脑缺氧后的血管再生及大脑缺氧后的神经元再生，促进损伤后神经功能的重建；通过介导少突胶质细胞再生、减轻局部溶血卵磷脂的脱髓鞘作用，促进白质损伤后的修复，加强损伤后神经功能的重建。结果显示，NAMPT重组蛋白在治疗脑中风、创伤性脑损伤和多发性硬化症药物中具有长期的神经保护作用，可作为神经保护药物用于治疗脑中风所致的急、慢性损害。

Description

尼克酰胺磷酸核糖转移酶在制备神经保护药物中的用途

技术领域：

本发明属制药领域，涉及尼克酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）的新的医药用途。具体涉及NAMPT尼克酰胺磷酸核糖转移酶在制备神经保护及康复药物中的用途。尤其是在制备治疗中枢神经系统疾病药物中的用途。

背景技术

2012年中国卫生部组办的中国卒中大会指出：中风尤其是缺血性脑中风已经成为我国发病率最高的疾病。而迄今为止，临床上唯一有效的治疗药物就是溶栓治疗（tPA），但实践显示tPA的应用非常有限，其原因是tPA有严格的治疗窗口，只有在中风后3小时内静脉注射才有效。因此，临床上只有不到3%的病人能被施于tPA治疗。因此，开发具有神经保护和神经功能恢复的有效药物是治疗缺血性脑中风的当务之急。目前，采用提高血管再生和神经再生以获得神经功能恢复的治疗方法在中风治疗研究领域中得到关注，其原因是由于这些疗法表现出很高的疗效和延长治疗时间窗。

尼克酰胺磷酸核糖转移酶（Nicotinamide phosphoribosyltransferase,NAMPT）是NAD生物合成的限速酶，是ATP的主要来源。NAMPT在能量代谢中发挥了重要的作用，除了调节能量代谢，的研究还发现NAMPT具有如下功能：增加内皮细胞的增值，抑制凋亡，调节血管张力和促进自噬等。研究显示，在哺乳动物中，NAMPT蛋白既在细胞内存在（iNAMPT）又在细胞外中存在（eNAMPT），其中，细胞内NAMPT作为NAD生物合成酶的作用已经被证明，而细胞外的NAMPT的功能迄今仍然未知。eNAMPT没有分泌信号肽，但在一些细胞中还是能通过非经典的分泌机制进入细胞外空间或者血液比如脂肪细胞、肝细胞、巨噬细胞和白细胞。eNAMPT被报道可以作为细胞因子增强前体B细胞的增值，并且可以在急性慢性炎性疾病如败血症、急性肺损伤、心肌梗死、糖尿病和关节炎中以旁分泌的形式介导炎症反应。但是，神经细胞是否外分泌eNAMPT以及eNAMPT在中枢神经系统中的作用尚未见报道。本申请的发明人之前的研究显示eNAMPT出现在中枢神经系统中，进一步的研究发现iNAMPT并没有发生变化，但是eNAMPT的表达在缺血后明显的升高，暗示eNAMPT可能与脑保护作用相关。另外，研究还发现NAMPT重组蛋白可以通过血脑屏障并且显著减小中风模型动物的梗死面积。因此，在大脑缺血的条件下，存在于细胞外的NAMPT是一种重要的神经保护分子，也暗示了NAMPT蛋白可能是一种新的可用于临床治疗脑缺血的治疗策略。

虽然NAMPT作为NAD生物合成的重要调节因子，在基因敲除、转基因及慢病毒介导的NAMPT过表达的动物中，其被证明具有脑保护作用，然而，由于转基因技术无法用于临床，而慢病毒用于中枢神经系统具有明显的缺点，如只能作用于特定脑区，以及形成潜在的插入性突变。因此本发明的申请人拟提供NAMPT在治疗中风药物中的新用途。

发明内容：

本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供尼克酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）的新的医药用途。具体涉及NAMPT尼克酰胺磷酸核糖转移酶在制备神经保护及康复药物中的用途，尤其是在制备治疗中枢神经系统疾病药物中的用途。

本发明采用蛋白重组技术合成了NAMPT，对NAMPT对抗缺血性脑损伤的神经保护作用作了全面评估，同时对于NAMPT蛋白经外周给药（静脉注射或腹腔注射）可以通过血脑屏障以及可能涉及作用靶点作了试验验证，实验结果为神经保护药物的开发提供更多的理论依据和新的研究思路，可进一步用于临床，为TBI治疗提供一个新的药物选择。

本发明使用真核表达质粒表达NAMPT蛋白，并使用叶酸脱氢酶-甲氨蝶呤选择系统，在CHO细胞系中进行NAMPT重组蛋白的合成，获得NAMPT重组蛋白。

本发明经体外OGD模型（氧糖剥夺模型）和小鼠大脑中动脉线拴整体模型试验，结果显示，制得的NAMPT重组蛋白（5μg/ml）在体外OGD模型（氧糖剥夺模型）中可以对抗神经细胞的死亡，并对抗OGD和AMPA神经毒性介导的少突角质细胞的死亡；NAMPT重组蛋白能透过血脑屏障，显著减小缺血性脑损伤体积，并显著减轻缺血性脑损伤后的白质损伤；NAMPT重组蛋白可以改善缺血性脑损伤后长期行为学；NAMPT重组蛋白通过上调血管再生相关因子增强大脑缺氧后的血管再生，并增强大脑缺氧后的神经元再生，促进损伤后神经功能的重建；NAMPT通过介导少突胶质细胞再生、减轻局部溶血卵磷脂的脱髓鞘作用，促进白质损伤后的修复，加强了损伤后神经功能的重建，试验表明所述NAMPT重组蛋白具有明确抗脑损伤的神经保护作用，尤其是具有长期的神经保护作用，可进一步制备抗中枢神经系统损伤药物。用于临床治疗包括脑中风所致的急、慢性损害、创伤性脑损伤和多发性硬化症的中枢神经系统损伤以及神经功能康复治疗。

本发明所述NAMPT重组蛋白制备的药剂更进一步可用于治疗由作用于脑底或脊柱的物理力，局部缺血中风、呼吸停止、心跳停止、脑血栓形成或栓塞、AIDS所致神经障碍、大脑出血、脑脊髓炎、脑积水、脑感染、震荡或颅内压升高所引起的创伤性脑损伤、和/或用于治疗所述病症的后遗症。

本发明中，腹腔注射NAMPT重组蛋白（5mg/kg）可通过血脑屏障，表明临床应用时可直接从外周静脉给药。

本发明的优点是：

1，合成了NAMPT重组蛋白，并证实提纯的NAMPT蛋白经外周给药（静脉注射或腹腔注射）可以通过血脑屏障进入大脑并且产生明显的神经保护作用，尤其是，所述的NAMPT重组蛋白不需要载体系统就可以通过血脑屏障，使得NAMPT重组蛋白体可以通过全身给药用于中风的治疗；

2，更重要的是，本发明实验证实所述的重组NAMPT重组蛋白不仅可以保护大脑灰质，也可以保护大脑白质，而白质的保护作用无论是在动物实验还是在临床试验中鲜有报道；

3，所述的重组NAMPT重组蛋白在治疗缺血性中风的同时，还可以治疗其他的中枢神经系统疾病，如多发性硬化；

4、所述的重组NAMPT重组蛋白还具有刺激或增强血管再生、神经再生和髓鞘再生的作用，有利于中风以及其他神经损伤后神经的修复。

5、所述的重组NAMPT重组蛋白同时具有短期保护作用和长期促进神经修复作用有助于中风病人的康复，可用于制备治疗各种神经系统疾病的药物制剂。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

附图说明：

图1：NAMPT过表达质粒示意图，

其中，NAMPT cDNA片段的5’端接入IgKappa链的分泌信号肽，3’末端接入his6标签，然后插入二氢叶酸脱氢酶扩增表达质粒。

图2：NAMPT蛋白减少OGD和NMDA介导的细胞死亡，

其中，原代培养的神经元使用NAMPT蛋白（5μg/ml）预处理2小时后，给予60分钟OGD（A-C）或200uM NMDA（D和E）处理，24小时后用Hoechst染色（A，B，D）和LDH释放（C和E）分析细胞死亡情况；^*p<0.05,^**p<0.01与单独OGD处理或单独NMDA处理相比较），数据用平均值±标准误表示。

图3：NAMPT蛋白降低OGD和AMPA介导的少突角质细胞的死亡，

其中，经过或未经过NAMPT重组蛋白（5μg/ml）处理的原代培养的少突角质细胞进行60分钟OGD或25μM AMPA处理，24小时后用Hoechest染色和LDH释放检测细胞死亡，A，OGD后少突胶质细胞核的形态，红色箭头表示凋亡小体，黄色箭头表示收缩的核；OGD（A-C）或AMPA（D和E）后Hoechst染色定量分析（B和D）和LDH释放（C和E）；^*p<0.05与单独OGD处理相比；^#p<0.05与单独AMPA处理相比，数据用平均值±标准误表示。

图4NAMPT重组蛋白可通过血脑屏障，

其中显示，注射NAMPT重组蛋白6小时后大鼠脑脊液中NAMPT含量的ELISA分析结果，^**p<0.01与注射PBS相比。

图5NAMPT重组蛋白可以明显的减小中风后脑损伤体积，

其中显示，小鼠60分钟MCAO后立即注射NAMPT重组蛋白(5mg/公斤体重)，A，MCAO后72小时后TTC染色图例，白色为脑梗塞区域；B，TTC染色定量脑梗塞体积统计图（p=0.02与PBS组比较）。

图6：NAMPT蛋白可以减轻脑缺血所致白质损伤，

其中显示，A，Luxol fast blue染色显示经PBS（上图）或NAMPT（下图）处理后对侧和同侧纹状体髓鞘的区别；B，Luxol fast blue染色的定量分析；数据为同侧蓝色区域与对侧蓝色区域的比值，^**p<0.01。

图7：NAMPT治疗改善了小鼠脑缺血后行为学缺失，

其中显示，A，NAMPT处理的小鼠转角实验的结果，记录向左旋转的和向右旋转的次数，数据为10次旋转中向左旋转的次数，空白组，PBS处理组为对照；B，NAMPT处理的小鼠转棒实验的结果，记录小鼠在转棒上停留的时间，数据为实验时的时长占手术前时长的百分比，空白组，PBS处理组为对照，每一组动物N=8，^**p<0.01，NAMPT组和PBS组比较，^##p<0.01NAMPT组和空白组比较。

图8：NAMPT蛋白可以增强中风后的血管再生作用，

其中显示，A，MCAO七天后空白组，PBS处理组和NAMPT处理组小鼠坏死周边区番茄红-lectin和BrdU的共标情况；B，高倍镜下lectin/BrdU的双标情况，双标的微血管表现为黄色；C，MCAO7天后坏死周边区血管数量的定量分析，数据为每平方毫米血管的数量；D，MCAO7天后坏死周边区血管内皮BrdU表达的定量分析；^*p<0.05,^**p<0.01,^***p<0.001与空白组比较;^##p<0.01与PBS处理组比较。

图9：NAMPT在大脑缺氧后促进血管发生的因子上调，

其中显示，A，PCR阵列（RT²Profiler^TM PCR Array Mouse Angiogenesis,Qiagen）分析中风后血管发生相关因子的变化；B，western blot分析血管发生相关因子的蛋白表达；C，western blot半定量统计图；3只动物/每样本；^*p<0.05与PBS处理组相比。

图10：NAMPT增加脑缺血后SVZ区神经前体细胞的增值并取代纹状体损伤的神经元，其中显示，A，MCAO2周后SVZ区BrdU染色；C，MCAO2周后BrdU和NeuN在同侧纹状体周边区的共标情况，注意到BrdU阳性区域在NAMPT处理后明显扩大，白色箭头所示纹状体中的BrdU和NeuN双标细胞；B和D，SVZ区BrdU阳性细胞和纹状体中BrdU和NeuN双标细胞的定量分析；^**p<0.01，与PBS组比较。

图11：NAMPT介导和增强少突胶质细胞的发生，

其中显示，A，原代OPCs培养中PDGF和FGF清除后使用NAMPT处理（5μg/ml），5天后使用MBP染色（绿色）检测分化情况，细胞核使用Hoechst染色，蓝色箭头显示凋亡的细胞核；B，60分钟MCAO小鼠七天后同侧纹状体BrdU和NG2双标情况，细胞核用Hoechst染色显示，白色箭头线是NG2阳性细胞，红色箭头显示BrdU和NG2双标细胞；C，BrdU和APC在同侧纹状体的双标情况，黄色箭头表示BrdU和APC双阳性细胞，^#p<0.05与空白组比较，^*p<0.05与单独MCAO比较；D和E，缺血后NG2阳性、NG2和BrdU双阳性细胞，以及APC阳性、APC和BrdU双阳性细胞的定量分析，^#p<0.05与空白组比较，^*p<0.05与单独MCAO比较。

图12：NAMPT蛋白完全阻断溶血卵磷脂介导的脱髓鞘作用，

其中显示，通过立体定位注射将溶血卵磷脂（0.7μl溶于1%盐水）注射于胼胝体区，并给予PBS或NAMPT处理,7天后胼胝体区MBP染色；立体定位注射参数：前囟前2.3mm，旁开0.6mm，深度1.2mm，箭头所指区域为溶血卵磷脂注射区域，CC：胼胝体。

图13：NAMPT重组蛋白无降低血糖以及致炎副作用，

其中，A，NAMPT注射后的血糖水平，使用ACCU-CHEKAviva检测来自尾经脉的血液，PBS组为对照；B，颅内MPO在NAMPT注射后的活性，MCAO3天后坏死旁区脑组织作为阳性对照，PBS注射组作为对照。

具体实施方式

实施例1

1、实验材料和方法

1.1NAMPT重组蛋白的合成

由于糖基化是NAMPT蛋白分泌的必经途径，因此，本发明使用真核表达质粒表达NAMPT蛋白，并使用二氢叶酸脱氢酶-甲氨蝶呤系统在CHO细胞系中进行选择性扩增。为了增加NAMPT蛋白在培养基中的浓度，本实施例中将Ig Kappa链的分泌信号肽接在NAMPT的N端，将His6标签接在NAMPT的C端用于提纯分离，合成的cDNA中插入含二氢叶酸脱氢酶表达质粒系统（plgK-NAMPT-His6），最后将此载体转染入无二氢叶酸脱氢酶的中国仓鼠细胞系DG44（DHFR-/-），使用α-MEM培养基+10%无核苷胎牛血清进行培养，加入浓度从小到大的甲氨蝶呤（5Nm~20nM）进行选择性扩增，最后，使用Ni-NTA超流柱从含有过表达NAMPT的DG44细胞的培养基中提纯得NAMPT重组蛋白。

1.2原代神经元和少突胶质细胞培养的氧糖剥夺模型(oxygen and glucose deprivation,OGD）

1.2.1原代神经元培养：使用胎龄17天的胎鼠，取大脑皮层组织，胰酶消化法分散单细胞悬液，按1×10⁵个活细胞/cm²的密度接种至3.5cm口径的培养皿，以后每三天更换一次培养液（Neurobasal+B27），每次半量换液，连续培养至接种后10~11天时使用。神经元原代培养物使用兔抗大鼠神经元特异性微管相关蛋白MAP-2的多克隆抗体检测，使用FITC标记的羊抗兔Ig G的第二抗体，鉴定神经元的纯度（~97%）。

1.2.2原代少突胶质细胞培养：细胞培养方法参照Arai K的描述。取新生(P1-2)SD大鼠，取大脑皮质，剪成1mm³左右的组织块，消化结合物理吹打，制成单细胞悬液，接种于包被多聚赖氨酸的培养瓶中，用含20%的胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM液培养7～10天。在37°C用220rpm振摇1小时以除小胶质细胞，而后换液振摇过夜。收集过夜的上清，接种于未包被的培养皿上1小时，以贴壁去除星形细胞和小胶质细胞。收集未贴壁细胞，接种于包被多聚赖氨酸的培养皿中，让其在含有谷酰胺、1%青霉素/链霉素、10ng／ml PDGF,10ng／ml FGF、2％B27的Neurobasal培养基中生长4天，这时的少突胶质细胞祖细胞可以进行分组实验。为了将少突胶质细胞祖细胞分化为成熟的少突胶质细胞，将培养基换为含有1%青霉素/链霉素、10ng／mlCNTF、15nM T3和2％B27的DMEM液。

1.2.3OGD模型：更换无糖DMEM培养液后置于缺氧箱中，精确控制充气时间和流量，向缺氧箱中分阶段充入含有5%CO₂的N₂、H₂和CO₂混合气，使缺氧箱中最终的氧分压低于0.2%，关闭缺氧箱，将缺氧箱置于37℃孵育箱中孵育不同时间（60min、90min、120min）后，打开缺氧箱，培养皿中全量更换为正常的Neurobasal+B27神经元培养液，37℃正常培养24小时后进行细胞存活率测定。

1.3实验动物与分组

动物实验均按照美国NIH指导的实验动物使用和维护章程在美国匹兹堡大学实验动物饲养和使用委员会管理下进行。

8-10周龄雄性C57/BL6小鼠（Jackson Laboratory,Bar Harbor,Maine USA）进行NAMPT安全性检测（5只）；8-10周龄雄性C57/BL6小鼠（Jackson Laboratory,Bar Harbor,Maine USA）行MCAO手术，术前动物随机分为三组，分别为假手术组（sham组）、腹腔给与生理盐水对照组（Vehicle组）和腹腔给与NAMPT治疗组（NAMPT组），每组42只分别进行行为学测评（12只）、组织学染色（3天8只；7d8只;14d8只）、取脑组织提取蛋白（3天6只）；8周龄雄性C57/BL6小鼠局部注射溶血卵磷脂分为两组：腹腔给与生理盐水对照组（Vehicle组，6只）和腹腔给与NAMPT治疗组（NAMPT组,6只），7天后取脑片用于组织学染色；此外，由于小鼠没有足够多的脑脊液用于ELISA分析，采用SD大鼠进行NAMPT透过血脑屏障检测以及SD大鼠胎鼠10只用于原代神经元和原代少突胶质细胞培养。

1.4大脑中动脉线拴（MCAO）模型制备

采用颈内动脉尼龙线线栓法建立大脑中动脉栓塞的动物模型，在异氟烷麻醉下，呼吸机机控呼吸，潮气量2-4ml、呼吸频率45-55次/min，吸呼比为1：1，根据手术进程调整异氟烷浓度在1-2%，采用气体监测仪续监测呼末氧分压、二氧化碳分压、异氟烷浓度及氧浓度等参数，待动物对疼痛刺激无反应时，取颈部正中切口切开皮肤，分离皮下组织、左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉及翼腭动脉，结扎翼腭动脉、颈外动脉分支（甲状腺上动脉）及其远心端，近心端留置一根缝线并打一松的结，用动脉夹暂时阻断颈总动脉，靠近颈外动脉远心端结扎处剪一小口，放入线栓，将预留的线结打紧，在剪口处离断颈外动脉，沿颈外动脉、颈内动脉进线栓直至遇阻力为止，一般置入深度为8-9mm（从颈外动脉与颈内动脉分叉处算起），松开动脉夹，缝合切口，待动物自主呼吸恢复良好后，拔除气管导管，放回笼中，自由饮食。术中动物体温用肛温探头连续监测，并维持动物肛温在37±0.5℃。

围缺血期检测动物的脑血流、血气、体温等生理参数。结果显示，假手术组与MCAO组的血气、体温等生理指标无显著差异。MCAO组置入线栓后的rCBF下降17.454±4.280%（相对于基础值的百分比），在实验过程中sham组动物肢体活动自如，无神经功能缺损症状，MCAO组在置入线拴时小鼠清醒后，采用行为学观察，若出现对侧肢体无力，行走时打转，伸展对侧前肢不完全，提尾倒立时身体弯向对侧，前肢下垂。重者瘫痪，身体明显倾斜，头偏向对侧，不能自发行走，说明造模成功。

1.5TTC（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC）染色检测脑梗塞体积

再灌注72h后，动物CO₂麻醉下常规处理，制备冠状切面1mm厚脑片，置于2％TTC溶液中，在37℃水浴中避光孵育5min，待显色后置于4％多聚甲醛溶液中固定，。线粒体过氧化氢酶可氧化TTC，使存活组织呈深红色，坏死组织不着色呈苍白色，。固定24h后数码相机拍照，输入计算机，用图像处理软件(Image Tool)对其不显色部分分析，计算其梗塞灶体积。1.6神经功能评估

1.6.1转角试验（corner test）

将小鼠放在呈30°角的两块木板间之间有一小缝鼓励小鼠进入这个转角，将小鼠面朝转角放置于去转角的半路上，当小鼠走进转角时，两边的触须会碰到木板，此时小鼠会向前或向上移，最后会向左或向右转回，脑缺血小鼠会优先向非损伤侧转回，每次实验重复10次，

记录下向右的次数。

1.6.2转棒试验（rotarod test）

将小鼠置于转棒上，逐渐增加旋转速度至10.01RPM，记录小鼠在转棒上停留的时间，以动物在转棒上停留的时间作图。

1.7免疫组织化学

免疫组织化学染色采用25μm厚度脑片的漂浮法染色，PBST洗涤脑片3次后加一抗过夜，再用PBST洗涤3次后加二抗(荧光抗体)室温2小时。

1.8蛋白质印迹(Westernblot)

用改良Lowry法进行蛋白定量，取各样本40μg蛋白质进行SDS-PAGE电泳分离蛋白，电转移法将蛋白质转移到PVDF膜，室温下5％脱脂奶粉封闭2h；TBST洗涤3次，加入相应的一抗孵育（4℃过夜）；经TTBS充分洗涤后，在膜的正面滴加含有二抗（羊抗兔IgG/HRP或羊抗小鼠IgG/HRP）的封闭液，室温摇床反应2h。取出滤膜，经TBST溶液充分漂洗后，ECL法显影，采用Bio-Rad图像成像仪进行拍照，Quantity One图像分析软件进行定量分析。1.9聚合酶链式反应阵列（PCR-array）

24h,从大脑皮层组织中提取总RNA，将上述提取的总RNA反转录成单链cDNA。按照RT²Profiler^TM PCR Array Mouse Angiogenesis的使用说明，利用Bio-rad公司的CFX96Touch定量PCR检测系统检测血管再生相关基因RNA的表达情况。脑缺血前后基因表达变化>1.5倍为显著性差异。

1.10数据处理及统计分析

用Origin7.5统计软件分析处理数据，以均数±标准误表示。单因数方差分析(onewayANOVA)比较各组之间的差异，两两比较用Scheffé法，P<0.05为显著性界值。

2、结果显示

2.1NAMPT重组蛋白的合成

构建了NAMPT重组蛋白真核表达质粒，如图1所示，将Ig Kappa链的分泌信号肽接在NAMPT的N端，将His6标签接在NAMPT的C端用于提纯分离，合成好的cDNA插入二氢叶酸脱氢酶系统（plgK-NAMPT-His6），以便于NAMPT cDNA在甲氨蝶呤中扩增，载体被转染入无二氢叶酸脱氢酶的中国仓鼠细胞系DG44后，用α-MEM培养基+10%无核苷胎牛血清进行培养，加入甲氨蝶呤进行扩增筛选,浓度从5nM逐渐加到20uM，最后，使用Ni-NTA超流柱从NAMPT过表达细胞的培养基中提纯NAMPT重组蛋白，得到超纯度的分泌型NAMPT重组蛋白。

2.2离体损伤模型证明NAMPT重组蛋白具有神经保护作用

脑缺血选择性地诱导外分泌型NAMPT，暗示了外分泌型NAMPT可能在大脑缺血中发挥了重要的作用，表明:无论是内源性的表达还是外源性的注射,只要NAMPT位于细胞外间隙,就能发挥保护作用；如图2和图3所示，使用原代培养的神经元（图2）和少突胶质细胞（图3）的离体缺血模型证明外源给予的NAMPT具有显著的神经保护作用。

2.2.1NAMPT在体外OGD模型中可以对抗神经细胞的死亡

在体外实验中，原代培养的神经元事先用NAMPT重组蛋白（5μg/ml）处理，然后给予OGD60分钟或用200μM NMDA处理20分钟，处理后的神经元再次放于含有NAMPT的培养基中继续培养24小时，用Hoechst染色以及测定LDH释放来分析细胞死亡，结果显示，NAMPT可以显著的减少OGD（图2A-C）或NMDA介导（图2D和E）的细胞凋亡和坏死。2.2.2NAMPT可以对抗OGD和AMPA神经毒性介导的少突角质细胞的死亡

为了确认NAMPT是否具有少突胶质细胞的保护作用，经过或未经过NAMPT蛋白处理的原代的少突胶质细胞，用OGD或AMPA处理细胞24小时后，用Hoechst染色和测定LDH释放分析细胞死亡情况，结果显示，NAMPT预处理可以显著的抑制OGD介导的少突角质细胞的凋亡（图3A和B）和坏死（图3C），同样，NAMPT处理显著的降低AMPA介导的凋亡和坏死（图3D和E）。

2.3NAMPT重组蛋白可通过血脑屏障

NAMPT能通过血脑屏障，本发明给大鼠腹腔注射NAMPT重组蛋白,检测NAMPT是否可以通过血脑屏障，将NAMPT重组蛋白以5mg/公斤体重注入大鼠腹腔，用NAMPT ELISA试剂盒检测注射后不同时间内脑脊液中NAMPT的含量，如图4所示，与注射PBS的动物比，注射NAMPT蛋白后动物脑脊液中NAMPT的含量显著提高，在6小时后提高了5.3倍（p<0.01），显示NAMPT重组蛋白能通过血脑屏障。

2.4整体脑缺血模型证明了NAMPT重组蛋白具有神经保护作用

2.4.1NAMPT可以明显的减小脑中风损伤后的脑梗塞体积

在证明了外周给予NAMPT可以通过血脑屏障到达大脑的基础上，验证外周给予的NAMPT具有大脑缺血损伤的保护作用，给C57BL/6小鼠行60分钟大脑中动脉梗死术，并在再通后给予腹腔注射NAMPT(5mg/kg)，72小时后进行TTC染色确定梗死面积大小，如图5所示，外周给予NAMPT的动物的脑梗死面积减小了38.9%（p=0.02与PBS组比较）。

2.4.2NAMPT重组蛋白可以减轻中风后的白质损伤

在缺血损伤后，NAMPT在纹状体纤维区和胼胝体会有显著的升高，提示NAMPT在该区域的高表达可能与白质保护作用有关；本发明检测了NAMPT蛋白处理后白质损伤情况，luxol fast blue染色显示缺血后髓鞘在纹状体纤维上的表达明显减少，表现为蓝色区域的淡染和缩小，尔NAMPT蛋白处理后髓鞘染色明显增加（^**p<0.01与PBS组比较），提示NAMPT重组蛋白可以减轻脑缺血所致的白质脱髓鞘损伤。

2.5NAMPT可以改善脑中风损伤后长期行为学

进行了行为学检测验证NAMPT在组织学上的保护效应能转化为行为学上的改善：小鼠行60分钟MCAO，并在再灌注时、2天、4天、6天后进行NAMPT蛋白（5mg/kg）腹腔注射，使用转角测试和转棒测试检测行为学，结果显示，NAMPT蛋白治疗可以显著的改善行为学功能，表现为较少的向损伤侧旋转（图7A），并在转棒上停留较长的时间（图7B）。

2.6NAMPT可以增强了脑中风后的神经血管重建

在正常成年脑内，存在的神经血管微环境（neurovascular niche）将神经再生和血管再生紧密联系在一起，这样的微环境形成和血管化的刺激对脑卒中后的新生神经元的存活至关重要；另外，相互联系的神经再生和血管再生与星形胶质细胞和少突胶质细胞相互作用，在脑内构建有利于神经突生长和髓鞘形成的微环境。随着对神经元和血管的生理性相互作用及其对脑卒中后的内源性修复反应的重要性的认识的加深，脑中风治疗的研究将不再局限于单个细胞类型的靶向治疗，而是转移到如何在损伤脑组织中构建完整的“神经血管单元”（neurovascularunits），从而促进脑卒中后的功能恢复。本发明实验证实了在中枢神经系统中,NAMPT具有血管再生和神经再生作用。

2.5.1NAMPT增强了脑中风损伤后的血管再生

为了研究NAMPT处理后的动物血管密度的增加是来源于旧血管的再通还是新生血管的再生，本发明注射BrdU（50mg/kg，腹腔注射，每天1次，注射7天）以便于追踪新生的细胞，在缺血7天后使用BrdU和番茄红-lectin双标，即可标记内皮细胞的增殖及活跃的血管发生；血管功能的测定使用番茄红-lectin经心脏灌注（麻醉前5分钟），只有在连通的血管的内皮细胞上才可以被lectin所标记。坏死周边区通常被认为可作为治疗靶点的区域，通过计数血管密度(单位面积内血管的数量)便可知道该区域的血管再生情况；只进行MCAO的小鼠其坏死周边区血管密度明显的下降（图8A中），而NAMPT处理后，其血管密度显著上升（图8A右），如图8B所示，与PBS组相比，NAMPT处理后的小鼠番茄红-lectin和BrdU共标的细胞的数量明显上升。有意义的是，对侧半脑中血管上BrdU阳性的细胞NAMPT处理后的动物也明显的增多（图8D）这也就意味着在正常状态下NAMPT可以促进大脑血管内皮细胞的再生，但总的数目并没有发生显著的变化（图8C）；试验数据显示了NAMPT处理可以明显的增强大脑缺血损伤后的血管再生作用。

2.5.2NAMPT上调了脑中风损伤后的血管再生相关因子

为了进一步研究NAMPT促进中风后血管再生的原因，本发明使用PCR阵列（RT²Profiler^TM PCR Array Mouse Angiogenesis,Qiagen）分析了中风后血管发生相关因子的变化，动物行60分钟MCAO后用NAMPT蛋白或PBS处理，3天后处死，从坏死周边区脑组织提取mRNA后用PCR阵列进行分析基因的变化，如图9A所示，一些与血管再生相关的因子明显上调，包括VEGF、AKT、MMP-2、MMP-9和eNOS，为了验证这些因子的变化，用westernblot分析了这些蛋白的表达，结果与PCR阵列一致（图9B和C）。

2.5.3NAMPT增强了脑中风损伤后的神经元再生

为了研究NAMPT是否可以增加神经再生作用，60分钟MCAO后，立刻以及第2、4、6天后给予腹腔内注射NAMPT，同时从第2天开始注射BrdU，每天1次，共注射7次,第14天处死，BrdU可以用于显示前体细胞的分裂，使用BrdU和NeuN这个成熟神经元的标志双标，即可显示新生的神经元是否迁移至纹状体梗死周边区，与PBS处理组相比SVZ区BrdU阳性的细胞在NAMPT组中明显升高，说明NAMPT蛋白处理增强了神经前体细胞在SVZ区的增值（图10A和B）；同样，NAMPT增强了未成熟的神经前体细胞像向侧纹状体的迁移，在这里它们将分化为成熟的神经元（图10C和D），这些数据说明NAMTP可以有效地增加神经嵌体细胞的增值，促使它们向损伤区迁移并分化为成熟神经元。

2.7NAMPT蛋白促进了脑中风损伤后的髓鞘形成

本发明在体外和体内验证了NAMPT可以介导和增强少突胶质细胞发生，为了验证NAMPT是否在体外可以促使原代的少突胶质细胞前体细胞（OPCs）向成熟少突胶质细胞分化，本实施例使用含有PDGF和bFGF的基础培养基（BDM）培养OPCs，PDGF和FGF的清除会导致大约40~50%的细胞凋亡，并且促使一部分OPCs分化，表达MBP（图11A，左），有意义的是NAMPT蛋白可以显著的抑制PDGF和FGF清除所致的细胞凋亡，同时显著地诱导OPCs分化；本实施例同时使用MCAO模型检测了NAMPT蛋白是否在体内具有促进少突胶质细胞发生的效应，在体内试验中，BrdU用于标记新生的细胞，以NG2(少突胶质细胞标记)和APC(成熟少突胶质细胞标记)标记少突胶质细胞，缺血可以诱导纹状体NG2细胞数量,而NAMPT处理以后NG2阳性和NG2/BrdU双标的细胞的数量显著增加（图11B和D），同样，APC阳性细胞和APC/BrdU双阳性细胞的增加反映了NAMPT可以增强OPCs的成熟。

2.8NAMPT减轻了多发性硬化所致的局部脱髓鞘作用

NAMPT对大脑缺血所致的白质损伤有佷强的保护作用,因此NAMPT可能对其它中枢神经系统疾病所致的白质损伤也有保护作用，为了验证这一点，本实施例中向8周龄小鼠胼胝体立体定位注射溶血卵磷脂，用于局部的脱髓鞘，在注射后立刻、第2天、第4天和第6天注射NAMPT蛋白（5mg/kg）。7天后处死动物，使用MBP染色观察髓鞘损伤情况，如图12所示，PBS处理的动物中溶血卵磷脂注射的部位导致轴突损伤和脱髓鞘，但是在NAMPT处理的动物轴突损伤和脱髓鞘完全消失，表明NAMPT具有对抗溶血卵磷脂的脱髓鞘的作用，该实验结果强烈的支持了NAMPT用于治疗多发性硬化的转化医学价值。

Claims

1.尼克酰胺磷酸核糖转移酶在制备治疗中枢神经系统疾病药物中的用途，所述的尼克酰胺磷酸核糖转移酶为NAMPT重组蛋白。

2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的治疗中枢神经系统疾病药物是治疗脑中风、创伤性脑损伤所引起的脑损伤的急性药物。

3.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的治疗中枢神经系统疾病药物是神经保护及神经功能康复药物。

4.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的中枢神经系统疾病是多发性硬化症。

5.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的中枢神经系统疾病是由于脑底或脊柱的物理力，局部缺血中风、呼吸停止、心跳停止、脑血栓形成或栓塞、AIDS所致神经障碍、大脑出血、脑脊髓炎、脑积水、脑感染、震荡或颅内压升高所引起的创伤性脑损伤、和/或所述病症的后遗症。

6.按权利要求1-6所述的任一的用途，其特征在于，所述药物以无菌注射剂或滴注液形式使用。