CN103732240B - G-csf二聚体在制备治疗神经退行性疾病药物中的应用 - Google Patents

G-csf二聚体在制备治疗神经退行性疾病药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了G-CSF二聚体在制备治疗神经退行性疾病药物中的应用。本发明使用G-CSF二聚体分子，能够显著增加PD模型动物黑质多巴胺能神经元的数量，提高多巴胺能神经元的功能。此外，G-CSF二聚体分子能够显著减少海马区神经元细胞的凋亡，改善AD模型大鼠学习记忆能力。本发明的二聚体G-CSF的血清半衰期延长，有效阻止神经元的丢失，从而能够更有效地治疗神经退行性疾病。

Description

G-CSF二聚体在制备治疗神经退行性疾病药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物和医药技术领域。更具体地，本发明涉及一种新型的G-CSF二聚体及其在治疗神经退行性疾病中的用途。
背景技术
人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是一个含有204个氨基酸组成并含有30个氨基酸信号肽的糖蛋白。成熟的G-CSF蛋白被分泌到细胞外不含信号肽由174个氨基酸构成,分子量为18–20kDa。人体主要由单核细胞，成纤维细胞和内皮细胞分泌。
G-CSF在生物体内主要发挥三大生物学功能：1.作用于嗜中性粒前体细胞和骨髓干细胞。驱动嗜中性粒细胞的分化、增殖和成熟。2.激活成熟的嗜中性细胞参与免疫反应。3.协同其他血液生长因子，如StemCellFactor，Flt-3配体，GM-CSF发挥造血功能。
G-CSF的受体已证实主要存在于骨髓造血干细胞Sca+Lin-Th1low，前体细胞CD34+，以及定向分化的嗜中性粒前体细胞(committedgranulocyteprecursor)和成熟的嗜中性粒细胞。人促嗜中性粒细胞刺激生长因子受体(G-CSFReceptor，G-CSFR)是一个单链的，对G-CSF有高亲合力的特异性受体，含有812个氨基酸。
Tamada等人获得G-CSF:G-CSFR复合物的晶体结构，并进行了2.8埃衍射分析(PNAS，2008，Vol.103:3135-3140)，结果显示，G-CSF:G-CSFR复合物是以2：2比例存在，即2个配体和2个受体结合的状态存在。每一个G-CSF分子结合一个受体分子，当两个都结合了G-CSF配体的受体，相互靠近相互作用而形成2:2二聚体时，G-CSF受体的羧基端才能激活下游的信号分子JAK2(Janustyrosinekinase)。JAK2再通过激活STAT3启动转录基因，而刺激细胞增殖。
2003年SchabitzW.R等报道(Stroke，2003，34:745-751)重组人G-CSF对神经细胞在缺血性动物模型中具有保护功能。2006年，Shyu等报道(CMAJ，2006，174:927-933)在急性中风病人治疗中，每天注射重组人G-CSF连续5天，显示一定疗效。皮下给药后，G-CSF在大鼠体内的半衰约2hr，经皮下注射人体时，半衰期只有3.5hr，因此，病人需每天注射药物，影响病人的生活质量。
神经退行性疾病(neurodegenerativedisease)是大脑和脊髓的神经元细胞丧失的状态，是一种慢性、进行性神经系统疾病，主要包括阿尔茨海默氏病(Alzhemier’sdisease,AD)、帕金森氏病(Parkinson’sdisease,PD)、亨廷顿舞蹈病(Huntingtondisease)、肌萎缩侧索硬化症(amyotrophiclateralsclerosis)，脊髓肌萎缩病(spinalmuscularatrophy)、脊髓小脑共济失调(spinalcerebellarataxias)等，其共同特征是发生神经元的退行性病变和凋亡，导致病人行为异常和功能障碍，引起过早死亡的神经性疾病。神经退行性疾病的发病机制尚不清楚，至今还没有有效的方法和药物来防治，现有治疗方法包括，通过服用或静脉注射补充人大脑神经元匮乏的物质治疗PD，如左旋多巴，但是，左旋多巴并不能有效的控制PD的自然病变过程，不能影响多巴胺能神经元的变性速度，还具有不良的副作用，如开关现象和运动障碍，其治疗作用也只能维持两年左右，长期使用还可损害神经元，加上神经元的凋亡；针对AD脑内乙酰胆碱不足，用胆碱酯酶抑制剂提高其浓度，该方法同样不能控制疾病的发展。
目前，治疗帕金森症疾病的药物多数用于减轻症状，如使用多巴胺替代物（左旋多巴或多巴胺激动剂），其中，左旋多巴（L-DOPA）作为多巴胺合成前体补充脑内多巴胺，是目前最常用且最有效的PD治疗药物，但长期使用该药物易出现疗效降低和严重的副作用，甚至可能发生“开-关”现象。另外，阻止多巴胺能神经元细胞的丢失也是治疗PD的主要策略之一，目前研究最多的为神经营养因子（neurotrophicfactor,GDNF），但在临床试验中GDNF未显示出药效且具有一系列的副作用如恶心、厌食、体重下降等（Neurology,2003,69:69-73）。G-CSF用于治疗帕金森症疾病也有报道，但不论在PD动物模型中还是临床试验中，G-CSF的给药剂量均很高，疗效作用慢，给药频率高，给药周期长，易降低患者的依从性，非常不利于病人使用。
然而，本领域迫切需要开发更有效的治疗神经退行性疾病的药物。
发明内容
本发明的目的就是一种更有效的治疗神经退行性疾病的药物及其制法和用途。
在本发明的第一方面，提供集落刺激因子G-CSF的二聚体在制备治疗或预防神经退行性疾病的组合物中的用途。
所述神经退行性疾病选自：帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩侧索硬化病，脊髓肌萎缩病、原发性侧索硬化病，脊髓小脑共济失调。
所述集落刺激因子G-CSF的二聚体为人集落刺激因子G-CSF二聚体。
根据本发明，所述集落刺激因子G-CSF二聚体的结构如式I所示：
M1-L-M2式I
式中，
M1是人集落刺激因子G-CSF的第一单体；
M2是人集落刺激因子G-CSF的第二单体；
L是位于所述的第一单体和第二单体之间的，将所述第一单体和第二单体连接在一起的接头元件，
其中，所述的G-CSF二聚体保持了G-CSF的生物活性，并且其血清半衰期是所述第一单体或第二单体的血清半衰期的2倍以上。
进一步地，所述的接头元件L选自下组：
(i)3-50个氨基酸的短肽；
(ii)式II所示的多肽元件：
-Z-Y-Z-式II
式中，
Y为载体蛋白；
Z为无、或1-30个氨基酸的短肽；
“-”为化学键或共价键，更佳地，“-”为肽键。
在另一优选例中，所述人集落刺激因子G-CSF的二聚体的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。
在另一优选例中，所述的第一单体和第二单体是相同的。所述的第一单体和第二单体的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示。
根据本发明，所述人集落刺激因子G-CSF的二聚体的氨基酸由两个G-CSF-Fc复合物(G-CSF-Fc复合物即为带Fc片段的G-CSF单体)构成。优选的，所述G-CSF-Fc复合物的氨基酸序列如SEQIDNO:2～7所示。
在另一优选例中，所述集落刺激因子G-CSF的二聚体采用以下步骤制备：
(a)采用包含编码G-CSF-Fc复合物的DNA序列的表达载体转化哺乳动物细胞，其中，所述DNA序列如SEQIDNO:10或SEQIDNO:9所示；
(b)培养所述哺乳动物细胞，使其表达G-CSF-Fc复合物和G-CSF二聚体；和
(c)分离纯化所述G-CSF二聚体；
其中，所述G-CSF二聚体包含两个G-CSF-Fc复合物，所述G-CSF-Fc复合物的氨基酸序列如SEQIDNO:2～7所示。
根据本发明，所述组合物为药物组合物、保健品组合物或食品组合物。
所述的药物组合物为固体制剂或液体制剂。
所述的药物组合物含有：0.01-99wt%集落刺激因子G-CSF的二聚体和药理上可以接受的赋形剂或载体。
所述的赋形剂或载体选自：纤维素及其衍生物、明胶、滑石、固体润滑剂、硫酸钙、植物油、多元醇、乳化剂、润湿剂、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水。
在另一优选例中，所述的含G-CSF二聚体的药物用于提高纹状体内多巴胺的浓度；防止多巴胺能神经纤维的丢失；和/或防止多巴胺能神经元的丢失。
在本发明的第二个方面，提供一种治疗神经退行性疾病的药物，含有作为活性成分的集落刺激因子G-CSF二聚体。
所述神经退行性疾病选自：帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩侧索硬化病，脊髓肌萎缩病、原发性侧索硬化病，脊髓小脑共济失调。
所述集落刺激因子G-CSF的二聚体为人集落刺激因子G-CSF二聚体。
所述的药物含有：0.01-99wt%人集落刺激因子G-CSF的二聚体和余量的药理上可以接受的赋形剂或载体。
所述集落刺激因子G-CSF二聚体的结构如式I所示：
M1-L-M2式I
式中，
M1是人集落刺激因子G-CSF的第一单体；
M2是人集落刺激因子G-CSF的第二单体；
L是位于所述的第一单体和第二单体之间的，将所述第一单体和第二单体连接在一起的接头元件，
其中，所述的G-CSF二聚体保持了G-CSF的生物活性，并且其血清半衰期是所述第一单体或第二单体的血清半衰期的2倍以上。
在本发明的第三个方面，提供一种治疗神经退行性疾病的方法，包括步骤：
给需要治疗的对象施用集落刺激因子G-CSF的二聚体。
所述神经退行性疾病选自：帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩侧索硬化病，脊髓肌萎缩病、原发性侧索硬化病，脊髓小脑共济失调。
在另一优选例中，所述的对象包括哺乳动物(如人)。
本发明使用G-CSF二聚体分子，能够显著增加PD模型动物纹状体内多巴胺的浓度，显著抑制多巴胺能神经纤维的丢失，能够显著增加PD模型动物黑质多巴胺能神经元的数量，提高多巴胺能神经元的功能。此外，G-CSF二聚体分子能够显著改善AD模型大鼠学习记忆能力，保护神经元，减少海马区神经元细胞的凋亡，减轻痴呆的症状。本发明的二聚体G-CSF的血清半衰期延长，有效阻止神经元的丢失，从而能够更有效地治疗神经退行性疾病。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了本发明一种G-CSF二聚体的示意图。其中，“-”表示连接肽，G-CSF椭圆形表示G-CSF单体。
图2a和图2b显示了本发明一种G-CSF二聚体的示意图。其中，“-”表示氨基酸连接肽，G-CSF椭圆形表示G-CSF单体，图2a中标记为“C”的椭圆形表示载体蛋白，并且G-CSF位于载体蛋白的N-末端，图2b中显示两个Fc通过二硫键配对。
图3a和图3b显示了本发明一种G-CSF二聚体的示意图。其中，“-”表示氨基酸连接肽，G-CSF椭圆形表示G-CSF单体，图3a中标记为“C”的椭圆形表示载体蛋白，并且G-CSF位于载体蛋白的C-末端，图3b中显示两个Fc通过二硫键配对。
图4显示了小鼠纹状体多巴胺浓度的变化。
图5A显示了小鼠纹状体TH阳性神经纤维免疫组化染色图片。
图5B显示了小鼠纹状体TH阳性神经纤维免疫组化光密度值。
图6A显示了小鼠黑质致密部TH阳性神经元免疫组化染色图片。
图6B显示了小鼠黑质致密部TH阳性细胞计数分析结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次制备了一种G-CSF二聚体，并意外发现：通过本发明的G-CSF二聚体，能够延长体内半衰期，改善药物的动力学，减少注射频率；显著增强体内药物活性，减轻神经退行性疾病的症状，促进神经退行性疾病的恢复。在此基础上，完成了本发明。
G-CSF二聚体
本发明的G-CSF二聚体的结构如式I所示。
M1-L-M2式I
式中，
M1是人集落刺激因子G-CSF的第一单体；
M2是人集落刺激因子G-CSF的第二单体；
L是位于所述的第一单体和第二单体之间的，将所述第一单体和第二单体连接在一起的接头元件，
其中，所述的G-CSF二聚体保持了G-CSF的生物活性，并且其血清半衰期是所述第一单体或第二单体的血清半衰期的2倍以上。
所述的生物活性包括：
(a).作用于嗜中性粒前体细胞和骨髓干细胞，驱动嗜中性粒细胞分化、增殖和成熟；
(b)激活成熟的嗜中性细胞参与免疫反应。
在另一实施方式中，所述第一单体和第二单体是相同的，所述第一单体和第二单体的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示。
在另一实施方式中，所述的接头元件L选自下组：
(i)3-50个氨基酸的短肽；
(ii)式II所示的多肽元件：
-Z-Y-Z-式II
式中，
Y为载体蛋白；
Z为无、或1-30个氨基酸的短肽；
“-”为化学键或共价键，更佳地“-”为肽键。
G-CSF二聚体代表性的结构如图1-3中所示。其中，载体蛋白包括(但并不限于)：人IgG(1,2,3,4)的Fc片段、或人白蛋白(albumin)。
G-CSF位于可用载体蛋白的C-末端，也可用位于载体蛋白的N-末端。
如本文所用，术语“连接肽”(linker)是指位于G-CSF单体和G-CSF单体之间的、起连接作用的短肽。连接肽的长度没有特别限制。连接肽的长度通常为5-50个氨基酸。通常，连接肽不影响或不显著影响G-CSF单体和G-CSF单体形成正确的折叠和空间构象。一些连接肽的例子包括(但并不限于)：
较佳地，所述的连接肽具有选自下组的氨基酸序列：
(a)疏水性氨基酸Gly和Pro构成的3-15个氨基酸序列，例如Gly-Pro-Gly-Pro-Gly-Pro;或者由Gly和Ser构成的3-20个氨基酸序列，如GSGG。
(b)多克隆位点所编码的氨基酸序列。该序列通常为5-20个，较佳地10-20个氨基酸，其例子包括(但并不限于)：TGLQPTRGIDDITSPVD；
(c)来自于G-CSF单体之外的蛋白的氨基酸序列，例如来自于IgG或白蛋白的氨基酸序列；
(d)由(a)、(b)和(c)组合形成的氨基酸序列。
一种优选的连接肽是GSGGGSGGGGSGGGGS(SEQIDNO:1中第175-190位)。
一种优选的连接肽是ASTKGP(SEQIDNO:4中第175-180位)。
此外，在融合蛋白的N端或C末端还可添加其他不影响G-CSF单体活性的氨基酸序列。较佳地，这些添加的氨基酸序列有利于表达(如信号肽)，有利于纯化(如6×His序列、酿酒酵母α-因子信号肽切割位点(Glu-Lys-Arg)，或可促进融合蛋白的活性。
序列说明
SEQIDNO:1为G-CSF二聚体的一种序列，结构如图1所示，其中第1-174位为G-CSF单体，第175-190位为连接肽，第191-364位为另一G-CSF单体。
SEQIDNO:2为构成G-CSF二聚体的带有Fc片段的G-CSF单体的序列，其中第1-174位为G-CSF单体，第175-190位为连接肽，第191-418位为人IgG2的Fc片段。如图2所示，二个带有Fc片段的G-CSF单体，通过Fc的二硫健配对作用构成二聚体。
SEQIDNO:3为构成G-CSF二聚体的带有Fc片段的G-CSF单体的序列，其中第245-418位为G-CSF单体，第229-244位为连接肽，第1-228位为人IgG2的Fc片段。二个带有Fc片段的G-CSF单体，通过Fc的二硫健配对作用构成二聚体。
SEQIDNO:4为构成G-CSF二聚体的带有Fc片段的G-CSF单体的序列，其中第1-174位为G-CSF单体，第175-180位为连接肽，第181-403位为人IgG2的Fc片段。二个带有Fc片段的G-CSF单体，通过Fc的二硫健配对作用构成二聚体。
SEQIDNO:5为构成G-CSF二聚体的带有Fc片段的G-CSF单体的序列，其中第230-403位为G-CSF，第224-229位为连接肽，第1-223位为人IgG2的Fc片段。二个带有Fc片段的G-CSF单体，通过Fc的二硫健配对作用构成二聚体。
SEQIDNO:6为构成G-CSF二聚体的带有Fc片段的G-CSF单体的序列，其中第1-174位为G-CSF，第175-190位为连接肽，第191-413位为人IgG2的Fc片段。二个带有Fc片段的G-CSF单体，通过Fc的二硫健配对作用构成二聚体。
SEQIDNO:7为构成G-CSF二聚体的带有Fc片段的G-CSF单体的序列，其中第240-413位为G-CSF，第224-239位为连接肽，第1-223位为人IgG2的Fc片段。二个带有Fc片段的G-CSF单体，通过Fc的二硫健配对作用构成二聚体。
SEQIDNO:9为SEQIDNO:2的cDNA序列。
SEQIDNO:10为SEQIDNO:6的cDNA序列。
本发明提供的G-CSF二聚体，与具有相同摩尔G-CSF分子浓度条件下（G-CSF二聚体浓度为0.1～1000ng/mL，优选的为1-100ng/mL；G-CSF单体浓度为0.04～400ng/ml,优选的为0.4～40ng/mL）G-CSF单体相比，对MPP+诱导的PC12细胞的保护作用更明显；具有更强的激活多巴胺能神经元STAT3的生物学活性；能显著改善MPTP诱导的动物行为学异常；能显著提高MPTP诱导的动物纹状体多巴胺的浓度；可以明显抑制MPTP诱导的多巴胺能神经元的大量丢失；具有更强的激活海马神经元STAT3的生物学活性；抑制Aβ诱导所致的PC12细胞的凋亡；改善AD模型动物的学习记忆能力。
制备方法
编码本发明G-CSF二聚体或融合蛋白的DNA序列，可以全部人工合成。也可用PCR扩增或合成的方法获得G-CSF第一单体和/或G-CSF第二单体的编码DNA序列，然后将其拼接在一起，形成编码本发明融合蛋白的DNA序列。
为了提高宿主细胞的表达量，可以对G-CSF二聚体编码序列进行改造，例如采用宿主细胞偏好的密码子，消除不利于基因转录及翻译的序列。在本发明的一个实施例中，就采用哺乳动物细胞偏好的密码子，并采用计算机DNA软件对G-CSF二聚体基因进行检测，排除在基因中不利于基因转录及翻译的序列，包括内含子剪切位点，转录终止序列等。
在获得了编码本发明新融合蛋白的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的新的融合蛋白。
如本文所用，术语“载体”包括质粒、粘粒、表达载体、克隆载体、病毒载体等。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA;如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列;如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞等。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，更佳地是哺乳动物细胞。
在获得转化的宿主细胞后，可在适合表达本发明融合蛋白的条件下培养该细胞，从而表达出融合蛋白。然后再分离出表达的融合蛋白。
在一实施例中，本发明的G-CSF二聚体的制备方法包括：
(a)采用包含编码G-CSF-Fc复合物的DNA序列的表达载体转化哺乳动物细胞，其中，所述DNA序列如SEQIDNO:10或SEQIDNO:9所示；
(b)培养所述哺乳动物细胞，使其表达G-CSF-Fc复合物和G-CSF二聚体；和
(c)分离纯化所述G-CSF二聚体；
其中，所述G-CSF二聚体包含两个G-CSF-Fc复合物，所述G-CSF-Fc复合物的氨基酸序列如SEQIDNO:2～7所示。
药物组合物和施用方法
由于本发明G-CSF二聚体具有优异的血清半衰期，因此本发明G-CSF二聚体以及含有本发明G-CSF二聚体为主要活性成分的药物组合物可用于治疗神经损伤疾病；以及保护神经元。其中，所述的神经损伤疾病选自下组：帕金森氏病(PD)、阿尔茨海默氏病(AD)、亨廷顿舞蹈病(HD)、肌萎缩侧索硬化病(ALS)，脊髓肌萎缩病(SMA)、原发性侧索硬化病(PLS)，脊髓小脑共济失调(SCA)。
本发明提及的疾病包括那些伴有神经退行性病变的疾病，尽管神经疾病可以使各种原因引起的以及可以在各种部位或神经中出现，但是本发明的治疗药物引起的受损神经本身的修复和功能的改善提示本发明的治疗药物在治疗和改善不同类型的神经退行性的疾病是有效的。本发明所指的神经疾病包括，但不仅限于，帕金森氏病(PD)、阿尔茨海默氏病(AD)、亨廷顿舞蹈病(HD)、肌萎缩侧索硬化病(ALS)，脊髓肌萎缩病(SMA)、原发性侧索硬化病(PLS)，脊髓小脑共济失调(SCA)脊髓小脑变性、脑硬化、纹状体黑质变性、脊髓性肌萎缩(SMA)、Friedreich共济失调，淀粉样变、亚急性脊髓视神经病(SMON)，以及涉及一种治疗这些疾病的方法，和在生产用于治疗这些疾病的治疗药物中的用途。
通过适当的施用方法将本发明的治疗药物医用到合适的施用部位，施用部位的选择依赖于治疗的疾病和治疗的症状。例如，对于那些主要伴有大脑退行性的疾病，将本发明的治疗药物施用到大脑中；对于那些具有局灶性的纹状体退行性的疾病，可以将药物施用到纹状体，对于那些具有全身性神经退行性的疾病，可以全身施用。优选的施用方式是诸如注射的合适方法。优选的将本发明的药物施用到神经退行性发生的部位，以及动脉、静脉或皮下注射。
本发明的药物组合物包含安全、有效量范围内的本发明G-CSF二聚体及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全、有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。安全、有效量根据治疗对象的年龄、病情、疗程等具体情况来确定。通常，药物组合物含有1-1000mg本发明G-CSF二聚体/剂，较佳地0.05-300mg本发明G-CSF二聚体/剂，更佳地，含有0.3-200mg本发明G-CSF二聚体/剂。
“药理上可以接受的赋形剂或载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能与本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药理上可以接受的赋形剂或载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂()、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
施用本发明G-CSF二聚体时，可以口服、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、局部给药。用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
用于局部给药的本发明G-CSF二聚体的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。
本发明G-CSF二聚体可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明G-CSF二聚体适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，每次给药剂量通常为0.01～300mg，优选0.5～100mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要优点在于：
1.更强的体内生物半衰期。
2.显著提高PD模型动物纹状体中多巴胺的浓度，显著抑制PD模型动物纹状体多巴胺能神经纤维的丢失和黑质多巴胺能神经元的丢失，提高多巴胺能神经元的功能。
3.显著抑制海马区神经元细胞的凋亡，改善AD模型动物的学习记忆能力。
4.在神经退行性疾病中具有显著的神经保护作用，有效治疗神经退行性疾病。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1G-CSF二聚体的制备
本发明的G-CSF二聚体由SEQIDNO:1构成，或由选自SEQIDNOs:2-7的G-CSF-Fc复合物形成如附图1-3的二聚体。制备方法如下：
a.G-CSF二聚体表达细胞株的构建
采用全基因合成G-CSF-Fc复合物的cDNA序列(如SEQIDNO:10或SEQIDNO:9所示)，将人G-CSF单体的基因与IgG2的Fc基因片段连接，5’引入HindIII位点，以及哺乳动物细胞表达所需要的元件如Kozak序列和信号肽序列，3’端引入EcoRI位点，克隆到pUC19质粒，命名为pG-CSF-Fc，转化E.coliTG1。用HindIII和EcoRI酶切pUC19质粒，回收约1400bp的G-CSF-IgG2Fc片段，与经HindIII和EcoRI酶切后的pcDNA3(Invitrogen)表达质粒相连接，构建表达质粒pEX-G-CSF-Fc。表达质粒pEX-G-CSF-Fc经线性化，纯化，电穿孔转化CHO细胞，筛选，ELISA法检测表达量，筛选出蛋白产量较高的细胞株，冻存细胞，制备细胞库。
根据上述的方法可构建含有编码SEQIDNOs:2-7cDNA序列的表达质粒，通过线性化转染CHO细胞，表达G-CSF二聚体，ELISA法检测表达量，筛选出蛋白产量较高的细胞株，并制备细胞库。
b.细胞规模培养
从细胞库取一支细胞(～1x107cells/ml)，复苏于10cm培养皿，培养于10mL基础培养基，37℃,5%CO2培养24hr。
种子扩增：将10mL培养物传代至30-40mL培养基中，培养至细胞浓度达1.0-1.5x106cells/mL且存活率≥90%时，逐级扩大至300-400mL培养基中，置于摇瓶中37℃,5%CO2.培养，转速120rpm。
细胞罐中扩增(3L-10L)：细胞浓度达1.0–3.0x106cells/mL且存活率≥90%时，将300-400mL培养物接种至3-10L细胞罐中培养，培养基pH控制在6.8，溶解氧约50%，转速65-100rpm。
细胞罐生产(30-100L)：3L-10L细胞罐中的细胞浓度达1.0–3.0x106cells/ml且存活率≥90%时，将3-10L细胞罐中的培养物接种至30-100L细胞罐，培养基pH控制在6.8，溶解氧约50%，转速65-100rpm，培养12-48hr开始控制培养基中的葡萄糖浓度(<1g/L)，采用补料培养。
c.G-CSF二聚体的分离纯化
细胞罐中培养结束后，收集细胞上清(含有G-CSF-Fc复合物、G-CSF二聚体、G-CSF-Fc多聚体及代谢物)，细胞上清收集后经过滤、多级凝胶层析纯化，例如，rProteinASepharoseFF(GEHealthcare,cat#17-1279-04)捕获，用50mM柠檬酸/柠檬酸钠，0.2MNaCl,pH3.7-3.8的缓冲液洗脱，得到纯度>90%的G-CSF二聚体，接下来采用CaptoAdhere层析，用50mMNaAc/HAC,0.2MNaCl,pH4.5-5.0的缓冲液洗脱，再用SPSepharoseFF(GEHeathcareCat#17-0729-04)，10mMPB(pH6.0±0.1)缓冲液平衡，10mMPB,0.2MNaCl(pH7.2±0.1)洗脱液，洗脱液经低pH除病毒，过滤等，最终获得G-CSF二聚体。
分离纯化的G-CSF二聚体的纯度>95%(采用反向HPLC分析)，分子量为47±5Kd(采用还原型SDS-PAGE分析)，O糖基化占整个分子量的2-10%，等电点为5.8-6.8，紫外吸收光谱为280nm。G-CSF二聚体在体外能激活M-NFS-60细胞的STAT3，刺激M-NFS-60细胞的增殖(ED50为0.1-10ng/mL)。
实施例2G-CSF二聚体体内半衰期
大鼠皮下单次注射G-CSF二聚体(二聚体由二个序列如SEQIDNO:3所示的G-CSF-Fc复合物构成)100μg/kg，药代动力学参数如下表1所示(n=6)。单体G-CSF在大鼠的半衰期约2小时。
表1药代动力学参数
实施例3G-CSF二聚体在人体内的药代动力学
24个健康受试者随机分成4组，分别为30、60、120、240ug/kg剂量组，给予G-CSF二聚体(二聚体由二个序列如SEQIDNO:6所示的G-CSF-Fc复合物构成)剂量分别为30、60、120、240ug/kg，单次给药，于给药后0.5,1,2,4,8,16,24,36,48,72,96小时,第6(120hrs),7,9,11,13,和15天，采血分离血清冻存于-70℃冰箱。采用ELISA法检测血药浓度(ELISA,QuantikinehumanG-CSFELISAkit,R&DSystem,Inc.Minneapolis,Min,Cat:PDCS50)。检测结果采用非房室模型分析药代动力学参数(软件WinNonlinv5.2,PharsightCorporation,USA)，结果如下表2所示。
表2药代动力学参数
另外，在该项临床研究中，G-CSF二聚体显示出了良好的安全性和耐受性。
实施例4G-CSF二聚体对MPP+诱导的PC12细胞神经毒性的保护作用
PC12细胞是一种大鼠嗜铬细胞瘤细胞系，体外培养能合成、代谢、传递多巴胺，可作为体外模型筛选具有活性的化合物。
实验将PC12细胞按40000个/孔种于96孔板，培养基成分：DMEM，10%马血清+5%FCS，1%Penicillin-Streptomycin。MPP+(Sigma)加入至30～3000μm终浓度，分别加入G-CSF至0.4ng/mL、4ng/mL、40ng/mL,G-CSF二聚体至1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL。培养24hr后，采用荧光细胞存活分析(Fluorimetriccellviabilityassay)。结果表明，MPP+处理后，PC12细胞的存活率随着MPP浓度的提高而降低，在相同MPP作用浓度时，相同摩尔G-CSF分子浓度下，G-CSF二聚体对PC12细胞的保护作用明显优于G-CSF单体。
PC12细胞按40000个/孔种于96孔板，培养基成分：DMEM，10%马血清+5%FCS，1%Penicillin-Streptomycin。MPP+(Sigma)加入至1～100μm终浓度，分别加入G-CSF单体至0.4ng/mL、4ng/mL、40ng/mL,G-CSF二聚体至1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL。培养24hr后，免疫组化检测酪氨酸羟化酶(TH)，黑质TH阳性细胞计数。结果表明，G-CSF二聚体处理组，黑质TH阳性细胞数明显多于G-CSF处理组。在相同摩尔G-CSF分子浓度条件下，G-CSF二聚体对PC12细胞的保护作用明显优于G-CSF单体。
G-CSF单体与G-CSF二聚体(选自序列如SEQIDNO:2-7所示的G-CSF-Fc复合物构成的G-CSF二聚体)的分子量比值为约1:5,1摩尔G-CSF二聚体包含2摩尔G-CSF单体分子，因此，在相同摩尔G-CSF分子时，G-CSF单体与G-CSF二聚体的质量比为约1:2.5,即0.4ng/mL的G-CSF单体所含的G-CSF分子摩尔浓度相当于1ng/mLG-CSF二聚体所含的G-CSF分子摩尔浓度；4ng/mL的G-CSF单体所含的G-CSF分子摩尔浓度相当于10ng/mLG-CSF二聚体所含的G-CSF分子摩尔浓度；40ng/mL的G-CSF单体所含的G-CSF分子摩尔浓度相当于100ng/mLG-CSF二聚体所含的G-CSF分子摩尔浓度。
实施例5G-CSF二聚体对多巴胺能神经元细胞STAT3的激活作用
取孕14天SD大鼠的胎鼠的全脑放入预冷的D-Hanks液中，在解剖显微镜下取黑质，剪碎成1mm3大小，加入10mL0.125%胰酶，并放入37℃孵箱内消化15min，随后吸出组织转移到装有预冷的DMEM＋10%FBS的离心管内终止消化,用移液枪吹打数次，静置后取上清并吸到另一支离心管内。重复上述步骤2～3次。用无血清神经元基础培养基neurobasal(invitrogen，货号：21103049)+无血清添加剂B27(invitrogen，货号：17504044)培养8天，每2天换液一次。培养至第八天，分别用不同浓度G-CSF二聚体(G-CSF-D)和G-CSF单体(G-CSF二聚体的终浓度：1、10、100ng/mL；G-CSF的终浓度：0.4、4、40ng/mL)处理神经元15分钟(SchneiderAetal..JClinInvest2005,115(8):2083-2098)。将培养基完全吸出，细胞用PBS洗两遍，按照细胞裂解液使用说明步骤裂解细胞。用细胞裂解液(CellSignalingTechnology，货号：9803；主要成分：20mMTris-HCl(pH7.5)，150mMNaCl，1mMNa2EDTA，1mMEGTA，1%Triton，2.5mMsodiumpyrophosphate，1mMbeta-glycerophosphate，1mMNa3VO4，1μg/mlleupeptin，1mMPMSF)冰上裂解细胞20分钟，用细胞刮子刮取细胞。收集细胞裂解液，12000rpm，4℃离心10分钟。吸取上清，测定蛋白浓度。另取100μl的上清用STAT3[pY705]ELISA试剂盒(invitrogen，货号：KH00481)检测STAT磷酸化水平变化。
在相同摩尔数G-CSF分子浓度下，G-CSF二聚体(G-CSF-D)与G-CSF单体相比，二聚体的G-CSF具有更强的激活多巴胺能神经元STAT3的生物学活性。
实施例6G-CSF二聚体对MPTP诱导的动物PD模型的治疗作用
1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢毗啶(MPTP)，可以特异性的损伤多巴胺能神经元，使黑质多巴胺能神经元大量丢失，出现类似帕金森氏病的症状。
实验选取C57/BL6J小鼠，雄性，20～22g，12-14周，动物饲养于室温24±2℃的环境中，维持光-暗12小时循环交替，给以充足的饲料，自由饮水。
50只小鼠随机分成5组，每组10只，分别为溶剂对照组、MPTP模型组、MPTP+G-CSF40μg/kg组、MPTP+GCSF-D40μg/kg组、MPTP+GCSF-D100μg/kg组，其中GCSF-D为由选自序列如SEQIDNO:2-7所示的G-CSF-Fc复合物构成的G-CSF二聚体。
MPTP以30mg/kg的剂量腹腔注射，连续给予5天，恢复一天后(从第7天起)MPTP+G-CSF40μg/kg组按G-CSF40μg/kg皮下注射给药，每天给药G-CSF，每天一次，连续5天，即从第7～11天；MPTP+GCSF-D40μg/kg组按40μg/kg皮下注射给药，于第7、9天分别给药GCSF-D一次；MPTP+GCSF-D100μg/kg组按100μg/kg皮下注射给药，于第7、9天分别给药GCSF-D一次；溶剂对照组给予等体积的生理盐水。
第12天对动物进行以下评价。
a.PD小鼠的行为学评价
在本实验于MPTP末次给药后第10天进行行为学检测。方法：爬杆法(poletest)用于检测PD中典型行为学症状—运动徐缓(Matsuuraetal.,1997;Arakietal.,2001;Katoetal.,2004)。
将小鼠头向上轻柔的放在粗糙的杆顶(直径8mm，高55cm)。小鼠从头向上调整至头完全向下的时间记录为T-turn(timetoturn)，小鼠从向下运动至四肢全部到达杆底的时间记录为T-LA(locomotionactivitytime),超过30s按照30s记录。每只小鼠重复检测5次取平均值。
结果表明，G-CSF二聚体能显著改善MPTP诱导的小鼠行为学异常，而且，在同摩尔G-CSF分子的浓度下，G-CSF二聚体显示出比G-CSF更好的效果。
b.检测纹状体内多巴胺的浓度
方法：小鼠断头处死，将纹状体取出称重后装在1.5ml的离心管中，并立即置于碎冰中。样本每10mg加入300μl冰水浴中的样品处理液(0.2M高氯酸、0.2mM焦亚硫酸钠、0.01%EDTA-2Na,同时含有0.3μMDHBA作为内标)。以上混合液使用超声仪超声粉碎，随后将其在4℃下10,000g离心20min。取其上清液并用0.22μM水相滤膜过滤，采用高效液相色谱法检测纹状体多巴胺的浓度。
结果表明，G-CSF二聚体能显著提高MPTP诱导的小鼠纹状体多巴胺的浓度，而且，在同摩尔G-CSF分子的浓度下，G-CSF二聚体显示出比G-CSF更好的效果，具有显著性差异。
c.黑质内多巴胺能神经元的情况观察
方法：10%水合氯醛麻醉，4%多聚甲醛灌流后取脑。4%多聚甲醛后固定24h，再将样本转入10%，20%，30%的蔗糖溶液中梯度脱水至样本沉底，在-20℃冰冻切片机中做中脑与纹状体部位冠状切片，小鼠脑切片厚度为20μm。TH为多巴胺能能神经元的特异性标记。一抗为单克隆小鼠抗TH(1:1000,CHEMICON)，与纹状体和中脑部位的脑片4℃共同孵育过夜，PBS洗三遍后用生物素化二抗，室温孵育1h。SABC复合物室温孵育1h。DAB显色，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。黑质TH阳性细胞计数，纹状体TH阳性染色光密度扫描。
结果表明，G-CSF二聚体可以明显保护MPTP诱导的多巴胺能神经元的大量丢失，而且，在同摩尔G-CSF分子的浓度下，G-CSF二聚体显示出比G-CSF更好的效果，具有显著性差异。
实施例7G-CSF二聚体对海马神经元细胞STAT3的激活作用
取孕17天SD大鼠的胎鼠的全脑放入预冷的D-Hanks液中，在解剖显微镜下取海马。剪碎成1mm3大小，加入10mL0.125%胰酶，并放入37℃孵箱内消化15min，随后吸出组织转移到装有预冷的DMEM＋10%FBS的离心管内终止消化,用移液枪吹打数次，静置后取上清并吸到另一支离心管内。重复上述步骤2～3次。用无血清神经元基础培养基neurobasal(invitrogen，货号：21103049)+无血清添加剂B27(invitrogen，货号：17504044)培养8天，每2天换液一次。培养至第八天，分别用不同浓度G-CSF二聚体(由两个选自序列如SEQIDNO:2-7所示的G-CSF-Fc复合物构成)和G-CSF(G-CSF二聚体的终浓度：1、10、100ng/mL；G-CSF单体的终浓度：0.4、4、40ng/mL)处理神经元15分钟(SchneiderAetal..JClinInvest2005,115(8):2083-2098)。将培养基完全吸出，细胞用PBS洗两遍，按照细胞裂解液使用说明步骤裂解细胞。用细胞裂解液(CellSignalingTechnology，货号：9803；主要成分：20mMTris-HCl(pH7.5)，150mMNaCl，1mMNa2EDTA，1mMEGTA，1%Triton，2.5mMsodiumpyrophosphate，1mMbeta-glycerophosphate，1mMNa3VO4，1μg/mlleupeptin，1mMPMSF)冰上裂解细胞20分钟，用细胞刮子刮取细胞。收集细胞裂解液，12000rpm，4℃离心10分钟。吸取上清，测定蛋白浓度。另取100μl的上清用STAT3[pY705]ELISA试剂盒(invitrogen，货号：KH00481)检测STAT磷酸化水平变化。
在相同摩尔数G-CSF分子浓度下，G-CSF二聚体(G-CSF-D)与G-CSF单体相比，二聚体的G-CSF具有更强的激活海马神经元STAT3的生物学活性。
实施例8G-CSF二聚体对Aβ诱导的PC12细胞凋亡的保护作用
PC12细胞用神经因此(NGF)诱导后可长出突起，具有神经细胞特性，Aβ(β淀粉样蛋白)诱导PC12细胞凋亡可以体外模拟AD模型。
将PC12细胞培养于基础培养基(DMEM，10%FCS，1%Penicillin-Streptomycin)，胰酶消化，重悬于含NGF50ng/mL的培养基中，细胞浓度调整为2X104cells/孔加入96孔板，于37℃，5%CO2培养箱中培养24hr。加入Aβ至终浓度1-100μmol/L，分别用不同浓度的G-CSF单体和G-CSF-D(GCSF-D为由选自序列如SEQIDNO:2-7所示的G-CSF-Fc复合物构成的G-CSF二聚体)处理，G-CSF单体的终浓度分别为0.4、4、40ng/mL,G-CSF-D的终浓度分别为1、10、100ng/mL,模型孔加入等体积的PBS，阴性对照孔不加Aβ，继续培养24hr。Hochest染色观察细胞形态学，或MTT法检测PC12细胞的增殖。
与阴性对照孔相比，模型孔的PC12细胞细胞核荧光染色明显不均匀，可见到细胞凋亡引起的致密浓染的高荧光细胞核，G-CSF单体和G-CSF二聚体处理的PC12细胞细胞核荧光染色均匀，未见到明显的致密浓染的高荧光细胞核。G-CSF二聚体能抑制NGF分化后Aβ诱导所致的PC12细胞的凋亡，保护神经细胞。
实施例9G-CSF二聚体对Aβ诱导的动物AD模型的治疗作用
SD大鼠雄性，180～220g，动物饲养于室温24±2℃的环境中，维持光-暗12小时循环交替，给以充足的饲料，自由饮水。
50只大鼠随机分成6组，分别为溶剂对照组、Aβ模型组、Aβ+G-CSF40μg/kg组、Aβ+GCSF-D40μg/kg组、Aβ+GCSF-D100μg/kg组，每组10只。其中，GCSF-D为由选自序列如SEQIDNO:2-7所示的G-CSF-Fc复合物构成。
实验大鼠用1%戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉后，固定头部，备皮消毒，沿颅顶中线作2cm切口，分离骨膜暴露头骨，于前囟向后3.0mm，中线左右各旁开2.2mm，用牙科钻打开颅骨，垂直进微量进样器针2.8mm，模型组和各药物处理组将5μlAβ1-40(β淀粉样蛋白)(2μg/μl)溶液注入，假手术组注射5ul生理盐水。
动物造模后第3天开始给药，Aβ+G-CSF40μg/kg组按G-CSF40μg/kg皮下注射给药G-CSF，每天给药，连续5天；Aβ+GCSF-D40μg/kg组按40ug/kg皮下注射给药，于第3、5天分别给药GCSF-D一次；Aβ+GCSF-D100μg/kg组按100μg/kg皮下注射给药GCSF-D，于第3、5天分别给药一次；溶剂对照组给予等体积的生理盐水。
第10天进行Morris水迷宫行为测试行为学。
行为学测试完成后，10%水合氯醛麻醉，4%多聚甲醛灌流后取脑。4%多聚甲醛后固定24h，再将样本转入10%，20%，30%的蔗糖溶液中梯度脱水至样本沉底，在-20℃冰冻切片机中做海马部位冠状切片，切片厚度为20μm。NeuN(神经元核抗原)为神经元的特异性标记物，一抗与海马部位的脑片4℃共同孵育过夜，PBS洗三遍后用生物素化二抗，室温孵育1h。SABC复合物室温孵育1h。DAB显色，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。海马NeuN阳性细胞计数。
G-CSF处理组和G-CSF二聚体处理组均能改善模型大鼠的学习巩固和再现能力。与假手术组比较，模型组大鼠海马区NeuN阳性神经元细胞数表达降低。与模型组比较，G-CSF处理组和G-CSF二聚体处理组NeuN阳性神经元细胞数均有升高，与G-CSF单体处理组比较，G-CSF二聚体处理组(100μg/kg)NeuN阳性神经元细胞数明显升高。
实施例10G-CSF二聚体对MPTP诱导的PD动物模型的治疗作用
1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢毗啶（MPTP），可以特异性的损伤多巴胺能神经元，使黑质多巴胺能神经元大量丢失，从而出现类似帕金森氏病（PD）的症状。酪氨酸羟化酶（TH）是多巴胺能神经元的特异性标记，可以用于定量检测黑质多巴胺能神经元的数量。
实验选取雄性C57/BL6J小鼠，22～30g，12-14周，随机分成4组，分别为：
MPTP+G-CSF-D30μg/kg组：以30mg/kg的剂量腹腔注射MPTP，连续给予5天，动物恢复一天后（即从第7天起）按30μg/kg皮下注射给予G-CSF-D，分别于第7、9、11天分别给药一次；
MPTP+G-CSF-D100μg/kg组：以30mg/kg的剂量腹腔注射MPTP，连续给予5天，动物恢复一天后（即从第7天起）按100μg/kg皮下注射给予G-CSF-D，分别于第7、9、11天分别给药一次；
MPTP模型组：以30mg/kg的剂量腹腔注射MPTP，连续给予5天，动物恢复一天后，从第7天起给予等体积的溶剂（0.5%鼠血清/PBS）；
正常对照组：给予等体积的生理盐水，连续给予5天，动物恢复一天后，从第7天起给予等体积的溶剂（0.5%鼠血清/PBS）。
所述G-CSF二聚体（G-CSF-D）由二个序列如SEQIDNO:6所示的G-CSF-Fc构成。
第12天处死动物，检测纹状体内多巴胺浓度、观察纹状体内多巴胺能神经纤维与黑质内多巴胺能神经元的情况。
a.检测纹状体内多巴胺的浓度
方法：小鼠断头处死，将纹状体取出称重后装在1.5ml的离心管中，并立即置于碎冰中。样本每10mg加入300μl冰水浴中的样品处理液（0.2M高氯酸、0.2mM焦亚硫酸钠、0.01%EDTA-2Na，同时含有0.3μMDHBA作为内标）。以上混合液使用超声仪超声粉碎，随后将其在4℃下10,000g离心20min。取其上清液并用0.22μM水相滤膜过滤，采用高效液相色谱法检测纹状体多巴胺的浓度。
结果如图4所示，小鼠连续5天注射MPTP后，纹状体中多巴胺的浓度的大幅度下降，使用G-CSF二聚体治疗可以剂量依赖的提高纹状体多巴胺的浓度。
结果表明，与正常对照组相比，MPTP可以引起纹状体中多巴胺的浓度的大幅度下降（###p﹤0.001）。G-CSF二聚体能显著抑制MPTP诱导的小鼠纹状体多巴胺的含量降低，提高纹状体中多巴胺的浓度。而且，G-CSF二聚体给药组显示出剂量依赖关系，与MPTP模型组相比均具有显著性差异（*p﹤0.05）。
b.纹状体内多巴胺能神经纤维与黑质内多巴胺能神经元的情况观察
方法：10%水合氯醛麻醉，4%多聚甲醛灌流后取脑。4%多聚甲醛后固定24h，再将样本转入10%，20%，30%的蔗糖溶液中梯度脱水至样本沉底，在－20℃冰冻切片机中做纹状体与中脑部位冠状切片，小鼠脑切片厚度为20μm，TH免疫组化分析。一抗为单克隆小鼠抗TH抗体（1:1000,Sigma），与纹状体和中脑部位的脑片4℃共同孵育过夜，PBS洗三遍后用生物素化二抗(羊抗鼠)，室温孵育1h。SABC复合物室温孵育1h。DAB显色，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。进行纹状体TH阳性染色光密度扫描，黑质致密部TH阳性细胞计数等测试。
结果如图5A、图5B、图6A和图6B所示:
图5A显示了小鼠纹状体TH阳性神经纤维免疫组化染色图片。小鼠连续5天注射MPTP后，纹状体TH阳性神经纤维的密度降低，使用G-CSF二聚体治疗可以剂量依赖的增加TH阳性神经纤维数量，可见G-CSF二聚体对MPTP诱导的多巴胺能神经纤维的丢失有显著保护作用。
图5B显示了小鼠纹状体TH阳性神经纤维免疫组化光密度值。结果说明，MPTP可以引起纹状体TH阳性神经纤维的密度的大幅度下降（###p﹤0.001）。而G-CSF二聚体可以明显抑制MPTP诱导的纹状体TH阳性神经纤维的密度减少。G-CSF二聚体给药组显示出剂量依赖关系，与MPTP模型组相比均具有显著性差异（*p﹤0.05）。
图6A显示了小鼠黑质致密部TH阳性神经元免疫组化染色图片。小鼠连续5天注射MPTP后，黑质致密部TH阳性神经元大量丢失，使用G-CSF二聚体治疗可以恢复TH阳性神经元数量，可见G-CSF二聚体对MPTP诱导的多巴胺能神经元的大量丢失有显著保护作用。
图6B显示了小鼠黑质致密部TH阳性细胞计数分析结果。与正常对照组相比，连续5天注射MPTP后，黑质致密部TH阳性神经元的数量显著减少（###p﹤0.001），大约为正常对照组的49%，说明MPTP导致黑质内多巴胺能神经元的大量丢失。而G-CSF二聚体组可以明显抑制MPTP诱导的黑质致密部TH阳性神经元数量的丢失，可剂量依赖地增加黑质TH-阳性细胞数。G-CSF二聚体给药组显示出剂量依赖关系，与MPTP模型组相比均具有显著性差异（***p﹤0.001），G-CSF二聚体30μg/kg剂量组黑质内TH阳性多巴胺神经元大约为正常对照组的86%，G-CSF二聚体100μg/kg剂量组黑质内TH阳性多巴胺神经元大约为正常对照组的99%，相当于正常对照组的水平。
可见，G-CSF二聚体可以明显保护MPTP诱导的多巴胺能神经纤维的丢失，还可以明显保护MPTP诱导的多巴胺能神经元的大量丢失。
对比例1G-CSF单体对MPTP诱导的PD动物模型的治疗作用
实验方法(参见US7723302)：对小鼠以30mg/kg腹腔注射MPTP，连续给予5天，获得PD小鼠模型；动物恢复一天后给予250μg/kgG-CSF（Neupogen，Amgen），连续给药7天，最后一次给药后（即给药结束后）的不同时间观察黑质致密部TH阳性多巴胺能神经元的数量。
模型组：第一次给药前的黑质致密部TH阳性多巴胺能神经元的数量。
正常组：未注射MPTP的小鼠。
给药结束后第1、7、14天黑质致密部TH阳性多巴胺能神经元大约分别恢复至正常组的70%、80%、77%。
讨论：
如实施例10所述，本发明的G-CSF二聚体，每次以30μg/kg或100μg/kg的剂量，间断性地给药三次后，在结束给药后的第1天，30μg/kg组、100μg/kg组中黑质内多巴胺TH阳性神经元分别大约恢复至正常对照组的86%、99%。尤其是，100μg/kg组，在给药结束后的第1天，其TH阳性多巴胺能神经元基本完全恢复至正常对照组水平。
而对比例1中,即使采用250μg/kg剂量的G-CSF，连续给药7天，在结束给药后的第1天，TH阳性多巴胺能神经元也仅仅只能恢复至正常组的70％。
从总给药剂量上看：G-CSF二聚体100μg/kg组的总给药剂量为300μg，对比例1中G-CSF单体的总给药剂量为1750μg。
从G-CSF单体摩尔分子浓度来看：G-CSF单体与G-CSF二聚体的分子量比值约为1:5，因此，本发明的G-CSF二聚体100μg/kg组中，G-CSF单体摩尔分子浓度仅为对比例1的1/15。
可见，采用本发明所述的G-CSF二聚体，在治疗过程中，给药剂量更低，疗效更好、更快，且给药频率低，非常有利于提高患者的依从性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.集落刺激因子G-CSF二聚体在制备治疗或预防神经退行性疾病的组合物中的用途；
所述集落刺激因子G-CSF二聚体的结构如式I所示：
M1-L-M2式I
式中，
M1是人集落刺激因子G-CSF的第一单体；
M2是人集落刺激因子G-CSF的第二单体；
L是位于所述的第一单体和第二单体之间的，将所述第一单体和第二单体连接在一起的接头元件，
其中，所述的G-CSF二聚体保持了G-CSF的生物活性，并且其血清半衰期是所述第一单体或第二单体的血清半衰期的2倍以上；
所述的接头元件L的结构如式II所示的多肽元件：
-Z-Y-Z-式II
式中，
Y为载体蛋白，且所述载体蛋白是人IgG的Fc片段；
Z为无、或1-30个氨基酸的短肽；
其中，“-”为肽键，
且所述G-CSF二聚体由两个G-CSF-Fc复合物构成。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述神经退行性疾病选自：帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩侧索硬化病，脊髓肌萎缩病、原发性侧索硬化病，脊髓小脑共济失调。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述神经退行性疾病是帕金森氏病。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述载体蛋白是人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4的Fc片段。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述G-CSF二聚体的氨基酸由两个G-CSF-Fc复合物构成，所述G-CSF-Fc复合物的氨基酸序列选自SEQIDNO:2～7。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述G-CSF二聚体的氨基酸由两个G-CSF-Fc复合物构成，所述G-CSF-Fc复合物的氨基酸序列是SEQIDNO:6。
7.如权利要求5或6所述的用途，其特征在于，所述G-CSF-Fc复合物通过Fc的二硫键配对作用构成二聚体。
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