LT2010012A - Granulocitus stimuliuojančio baltymo linijiniai oligomerai su prailginta in vivo gyvavimo trukme - Google Patents

Abstract

Išradime pateikiami rekombinantinio baltymo - granulocitų kolonijas stimuliuojančio faktoriaus (G-CSF), struktūriniai variantai, linijiniai oligomerai, gauti genetiniu būdu, kurie pasižymi naujomis farmakodinaminėmis ir farmakokinetinėmis savybėmis,tokiomis kaip prailgintu gyvavimu (cirkuliacija) kraujo plazmoje bei ilgesniu biologinio poveikio išlaikymu lyginant su monomeriniu baltymu. Atskleidžiami struktūriniai bei technologiniai ypatumai, leidžiantys gauti pagerintų terapinių savybių rekombinantinius baltymus, kuriuos galima pritaikyti biofarmacinėje pramonėje ir medicinoje.

Description

1

GRANULOCITUS STIMULIUOJANČIO BALTYMO LINIJINIAI OLIGOMERAI SU PRAILGINTA IN VIVO GYVAVIMO TRUKME 5 Išradimo sritis Šis išradimas priskirtinas biotechnologijos sričiai. Jis atskleidžia rekombinantinio granulocitus stimuliuojančio baltymo, tokio kaip granulocitų kolonijas stimuliuojančio faktoriaus (G-ČSF), struktūrinius variantus, būtent linijinius dimerus, pasižyminčius naujomis farmakodinaminėmis ir farmakokinetinėmis savybėmis, o svarbiausia - prailgintu gyvavimu 10 (cirkuliacija) kraujo plazmoje, lyginant su natūraliu monomeriniu baltymu. Išradimo technikos lygis

Rekombinantinės DNR metodais gaunamų, terapinės paskirties baltymų naudojimas per pastaruosius kelis dešimtmečius pasiekė naujas aukštumas. Jų pagrindu gaminamų 15 biofarmacinių produktų (eritropoetino - EPO, žmogaus augimo hormono - hGH, interferono -IFN, insulino, granulocitų (makrofago) kolonijas stimuliuojančių faktorių - G-CSF arba GM-CSF, folikulas stimuliuojančio faktoriaus - FSH, trombopoetino - TPO, trombolitikų) metinės pasaulinės gamybos apimtys jau viršija dešimtis milijardų dolerių ir toliau didėja. Biotechnologijos pažanga skatina tobulinti rinkoje esančių inovacinių (dar vadinamų pirmos 20 kartos) baltyminių produktų efektyvumą, saugumą ir pateikimo ligoniui būdus. Aktyviai kuriami sekančios (antros ir trečios) kartos biofarmaciniai produktai, kurių išskirtinis bruožas - prailgintas (prolonguotas) terapinis veikimas in vivo. Prolonguoto veikimo vaistinės formos, kuriuose veiklioji medžiaga yra chemiškai arba genetiškai modifikuoti terapiniai baltymai su prailgintu cirkuliacijos in vivo laiku turi akivaizdžių pranašumų. Tokios prolonguoto veikimo 25 vaistinės formos injekuojamos pacientui ne kasdien kaip įprastinės, o vieną kartą per savaitę ar mėnesį. Tai suteikia pacientui nepalyginamai daugiau saugumo garantijų ir patogumų. Bendru atveju baltymo pasišalinimo greitį galima lėtinti didinant baltymo molekulinę masę arba jos neigiamą krūvį. Taigi baltymo gyvavimo in vivo trukmė bendru atveju gali būti keičiama dviem baltymo struktūros keitimo būdais: a) didinant terapinio baltymo molekulę: tai 30 gali būti pasiekiama konjuguojant baltymo molekules su polimerines prigimties molekulėmis arba konjuguojant baltymą (chemiškai arba genetiniu būdu) su kitu neaktyviu baltyminiu partneriu, kuris pasižymi ilgesne gyvenimo trukme nei tikslinis baltymas, b) keičiant terapinės paskirties baltymo struktūrą: tai gali būti pasiekiama papildomai prijungiant angliavandenių struktūras glikozilinimo pagalba (in vivo arba in vitro), kuris gali būti atliekamas tiek cheminiu, 35 tiek ir genetiniu būdais. 2

Yra žinomi cheminio modifikavimo būdai siekiant išgauti terapinių baltymų prolongavimo efektus. Pastarieji gali būti konjuguojami su polietilenglikoliais, dekstranais, kitais angliavandeniais arba susiuvami su kitais baltymais. Labiausiai išvystytas ir aktyviai patentuotas (tarp kitų WO 2004/083242 A1, 2004) cheminio modifikavimo būdas yra 5 pegilinimas (polietilenglikolio, sutrumpintai - PEG vienos arba kelių grandinių prijungimas). Pagrindinis pegilinimo trūkumas susiveda į dažnai stebimą ženklų modifikuojamo baltymo biologinio aktyvumo kritimą, daugiausia dėl PEG molekulės pakankamai didelio hidrodinaminio skersmens, kas gali sukelti erdvinius trikdžius baltymo sąveikai su receptoriumi. 10 Tikslinio baltymo molekulės dydis (erdvinis tūris) ir gyvavimo in vivo puslaikis gali būti pakeliamas ne tiktai jį konjuguojant su polimerais (PEG, dekstranu ir pan.), bet ir su kitais didesnio molekulinio dydžio baltymais -„nešikliais“, pavyzdžiui, su serumo albuminu. [Poznansky M. J., In vitro and in vivo activity of soluble cross-linked uricase-albumin polymers: a model for enzyme therapy. Life Sci. 1979 vol. 24(2), p. 153-158]. 15 Cheminiai susiuvimo metodai leidžia kurti prolonguoto veikimo terapinius baltymus naudojant įvairius baltyminius partnerius, tame tarpe ir specifinius antikūnus. Yra žinomi keli chemiškai susiūti imunomolekulių dariniai (šiuo atveju monokloniniai antikūnai - Mak), pavyzdžiui, doksorubicino-Mak ir kalichemicino-Mak konjugatai yra l-os fazės klinikiniuose tyrimuose [Sievers E.L. et ai., Selective ablation of acute myeloid leukemia using antibody-targeted 20 chemotherapy: a phase I study of an anti-CD33 calicheamicin immunoconjugate. Blood, vol. 93(11): p. 3678-84, 1999],

Pastaruoju metu analogiškos konstrukcijos yra kuriamos, suliejant tikslinį baltymą (angį. fusion protein) su jo partneriu, pasitelkus rekombinantinės DNR techniką. Skirtingai nuo 25 cheminio, genetinis sulieto baltymo gavimo būdas įgalina gauti atsikartojančios kokybės produktus, kas itin svarbu pateikiant juos tolimesniems klinikiniams tyrimams. Tačiau bet koks tikslinio baltymo modifikavimas gali sukelti dalinį jo biologinės funkcijos/aktyvumo praradimą arba iššaukti nepageidaujamus imuninio atsako reiškinius.

Tikslinio baltymo partnerių ratas sulietuose konstrukcijose paprastai apima: 30 a) imunoglobulinų domenus: mažiausio dydžio imunoglobulinų dalys - tai viengrandžiai variabilūs antikūnų fragmentai (scFv), kurie gali būti ekspresuojami daugelyje sistemų kaip VL - VH poros, susiūtos tarpusavyje su dirbtiniais linkeriais Gly/Ser. Suliejant citokinus arba baltymus toksinus su scFv yra gaunami terapinės paskirties immunocitokinai ir imunotoksinai. Kai kurie imunotoksinai - kaip pvz., anti-Tac (Fv)-PE 38 buvo panaudoti 35 klinikoje gydant vėžiu sergančius ligonius, kuriems kitos terapijos buvo neveiksmingos [Kreitman R.J. et ai, Phase I trial of recombinantimmunotoxin anti-Tac(Fv)-PE38 (LMB-2) in patients with hematologic malignancies. J. Ciin. Oncol. 2000;18:1614-36]. Toksiškumas ir 3 imunogeniškumas riboja platesnį tokių sulietų produktų taikymą terapijoje. Pastarųjų nepageidaujamų reiškinių sumažinimui tikslinis baltymas tokioje sulietoje formoje papildomai pegilinamas per Lys liekanos amino grupę arba įvedant Cys liekaną taškinės mutacijos pagalba. Tokį metodinį sprendimą kompanija Bolder BioTechnology panaudojo, kuriant prolonguoto veikimo G-CSF, augimo hormono, EPO bei IFN imunosulietas konstrukcijas su taškiniu specifiniu pegilinimu. b) žmogaus ir kitus gyvulinės kilmės albuminus: 1992 m. prancūzų mokslininkų grupė parodė, kad cheminis augimo hormono ir albumino konjugatas pasižymi lėtesniu išvedimo in vivo greičiu, ir netrukus paskelbė apie rekombinantinio CD4-albumino sulieto baltymo ekspresiją (Lu H., et ai., FEBS Lett., 1994) Kluveromyces mielėse. Tokiu būdu tirpaus CD4 išvedimo puslaikis buvo padidintas beveik 140 kartų. Ta pati mokslininkų grupė pasiekė šiose mielėse efektyvią urokinazės tipo plazminogeno aktyvatoriaus ir žmogaus albumino sulieto baltymo sekreciją. Human Genome Sciences ir CoGenesys kompanijos paskelbė apie sukurtas prolonguoto veikimo terapinių baltymų - EPO, hGH, G-CSF, IFN alfa formas, genetiškai suliejant tikslinius baltymus su žmogaus albuminu, bei jų pateikimą klinikinėms studijoms.

Alternatyvus tikslinio baltymo cheminio prijungimo arba genetinio suliejimo su albuminu metodui yra prolongavimo efekto generavimas, priverčiant tikslinį baltymą tapti in vivo specifiniu albumino ligandu. Taip cheminio konjugavimo keliu polistirolio ir maleino rūgšties kopolimeras, prijungtas prie superoksid-dismutazės (SOD), suteikėjai sugebėjimą specifiškai rištis su albuminu in vivo. To išdavoje, SOD pasišalinimas iš žiurkių organizmo pailgėjo nuo 4 min. iki 6 vai. [Inoue M. et ai, Synthesis of a superoxide dismutase derivative that circulates bound to albumin and accumulates in tissues vvhose pH is decreased, Biochemistry, 1989, 28(16), p. 6619-6624],

Sukurtos modifikavimo technologijos, siekiant prailginti baltymų buvimo in vivo trukmę, buvo išbandytos eilei terapinės paskirties baltymų, tačiau tik nedaugelis jų pateko į rinką. Tai Amgen korporacijos sukurtas prolonguoto veikimo EPO - Aranesp (papildomas glikozilinimas) ir G-CSF - Neulasta (pegilintas G-CSF), bei Roche ir Schering-Plough pegilinti interferonai alfa 2a - Pegasys ir alfa-2b - PEG-Intron’as.

Esamos technologijos ir metodiniai sprendimai siekiant prailginti terapinių baltymų gyvavimo trukmę turi keletą joms būdingų trūkumų. Baltymo molekulės dydžio (tūrio) didinimas, jungiant polimerus arba kitus baltymus, sukuria pakankamai didelės masės galutinį darinį, kuriame tikslinis baltymas gan dažnai gali prarasti (pilnai arba dalinai) sugebėjimą specifiškai sąveikoti su ląstelės receptoriumi, taip netekdamas savo biologinio efektyvumo. Kuo mažesnis tikslinis baltymas, tuo ši problema darosi rimtesnė. Šiai dienai sėkmingi bandymai pasiekti su pakankamai dideliais terapiniais baltymais. Tačiau net ir tokiu atveju modifikuoto baltymo biologinis aktyvumas yra ženkliai žemesnis, lyginant su intaktiniu nemodifikuotu 4 baltymu, dėl ko vaistinėse dozėse tokio modifikuoto darinio kiekis turi viršyti nemodifikuoto baltymo kiekį.

Papildomo glikozilinimo atveju (t.y. įvedant naujus, gamtoje nesutinkamus glikozilinimo taikinius baltymo aminorūgščių sekoje) technologiniai sprendimai dažniausiai reikalauja 5 baltymo genetinės struktūros pokyčių, pavyzdžiui, taškinių mutacijų įvedimo. Tokia modifikuoto baltymo struktūra jau yra naujas darinys, dažnai sukeliantis netikėtas pašalines reakcijas ir toksinius reiškinius.

Patentinėje literatūroje pateikiama nedaug medžiagos apie linijinių multimerinių baltymų 10 struktūras. Patente EP1334127 (A1) yra paminėta apie multimerinių baltymų (daugiausiai citokinų, tarp jų ir G-CSF) kovalentinio sujungimo galimybę bei papildomos polimerinės grandinės (PEG ar kitos kilmės) prijungimą prie multimerinio baltymo. Šis patentas nepateikia informacijos apie linkerinės sekos įtaką multimerinio baltymo biologiniam aktyvumui. 15 Patentinė paraiška VVO9206116 (A1) atskleidžia heterodimerinių rekombinantinių baltymų galimybes skatinti hemapoetinių ląstelių mieloidinę ankstyvąją ir vėlyvąją diferenciaciją. Pirmoji molekulė gali būti IL-3 ar GM-CSF, antroji - EPO, G-CSF, IL-5 ar M-CSF.

Patentinė paraiška WO0103737 (A1) atskleidžia sulietų baltymų, sudarytų iš citokino ar augimo faktoriaus, sulieto su imunoglobulino domenu (pvz. IgG) gavimo galimybę ir savybes. 20 Yra žinoma [Paige A.G. et ai. “Prolonged circulation of recombinant human granulocyte- colony stimulating factor by covalent linkage to albumin through a heterobifunctional polyethylene glycol” Pharm. Res. 1995, 12(12):1883-8] apie prailgintą rhG-CSF cirkuliaciją, kai šis baltymas kovalentiškai surištas su serumo albuminu per heterobifunkcinį agentą maleimido-karboksilpolietilenglikolį. Panaši idėja suliejant augimo hormono ir albumino 25 molekules atskleista ir Poznansky straipsnyje [Poznansky M. J. et ai. “Grovvth hormone- albumin conjugates. Reduced renal toxicity and altered plasma clearance.” FEBS Lett. Oct. 24, 1988; 239(1):18-22].

Granulocitų kolonijas stimuliuojančio faktorius (G-CSF) struktūrinių variantų (linijinių oligomerų), pasižyminčių prailgintu gyvavimu kraujo plazmoje aprašymo patentinėje ir 30 nepatentinėje literatūroje nėra rasta.

Kaip seka iš pateikto technikos lygio aprašymo, egzistuojančių baltyminių preparatų terapinis poveikis dažnai yra trumpalaikis ir reikalauja papildomų baltymo porcijų, nes organizme cirkuliuojantys baltymai greitai yra degraduojami ir netenka savo terapinio poveikio. 35 Ankstesni būdai prailginti baltyminės molekulės veikimo laiką didinant jų molekulinę masę siūlo prijungti prie terapinio baltymo molekulės nebaltymines sekas (pvz. polietilenglikolį) arba kitus baltymus (pvz. albuminą), neturinčius terapinio poveikio, tačiau tai dažniausiai 5 žymiai sumažina terapinės molekulės aktyvumą. Todėl aktualu būtų surasti būdą prailginti terapinį poveikį, oligomerizuojant to paties terapinio baltymo molekules. Tai leistų ne tik padidinti baltymo molekulinę masę (kas, matyt, yra vienas iš svarbių veiksnių didinant jo stabilumą in vivo), bet ir išlaikyti arba pagerinti biologinį naujos struktūros baltymo aktyvumą, 5 lyginant su anksčiau žinomais, t.y. baltymo terapinio poveikio prailginimo tikslai reikalauja sukonstruoti ir išgryninti tokį aktyvų baltymą, kuris, išlikdamas stabilus in vivo ilgesnį laiką turėtų struktūrą išlaikančią terapinio baltymo biologinį aktyvumą.

Tokiu būdu, šio išradimo tikslas yra sukonstruoti naujas polipeptidų struktūras antros kartos terapinės paskirties baltymams, tokiems kaip G-CSF, su jų kryptingai in vivo reguliuojama 10 (prailginta) gyvavimo trukme ir biologiniu aktyvumu, genetiškai formuojant norimo ilgio homo-multimerines baltymo formas, ir sukurti jų pagrindu biofarmacinius preparatus su prailginta cirkuliacijos in vivo trukme.

Konkrečiau, vienas iš šio išradimo uždavinių buvo sukurti efektyvią linijinio G-CSF dimero struktūrą leidžiančią gauti biologiškai aktyvų baltymą kurio gyvavimo in vivo trukmė yra 15 didesnė nei monomerinio baltymo. Išradimo esmė

Minėti tikslai pasiekiami, realizuojant siūlomo išradimo apibrėžties 1-5 punktų visumą. Šis išradimas apima linijinius oligomerinius rekombinantinius baltymus, sudarytus iš to paties 20 baltymo genetiškai sujungtų monomerų, kur monomeras yra granulocitus stimuliuojantis baltymas, ir monomerai sujungti linkerine amino rūgščių seka.

Optimaliame šio išradimo variante granulocitus stimuliuojantis baltymas yra granulocitų kolonijas stimuliuojantis faktorius G-CSF ir monomerų skaičius yra du. Optimali linkerinė seka pagal siūlomą išradimą yra pasirinkta iš amino rūgščių sekų grupės, susidedančios iš 25 (S-G4)n. kur n=2-7 ir SGLEA-(EAAAK)m -ALEA-(EAAAK)m -ALEGS, kur m=2-8. Šis išradimas apima linijinius oligomerinius baltymus, pasižyminčius biologiniu aktyvumu bei prailgintu cirkuliacijos laiku in vivo.

Kitas šio išradimo objektas yra farmacinė kompozicija, apimanti veiksmingą kiekį aukščiau minėto linijinio oligomerinio baltymo, optimaliai linijinio G-CSF dimero, ir farmaciniu požiūriu 30 priimtiną nešiklį ir/arba pagalbines medžiagas.

Brėžiniu aprašymas

Fig. 1 pavaizduota dimerinio G-CSF analizė Western blot metodu, panaudojant monokloninius antikūnus prieš G-CSF. Linkerių sekos atskleistos toliau 1 lentelėje. 35 Takeliai: 1,5-1 pg monomerinio G-CSF redukuotomis sąlygomis, redukuotomis ir neredukuotomis sąlygomis, atitinkamai; 6 2, 6 - 1 pg dimerinio G-CSF baltymo su linkeriu La, redukuotomis ir neredukuotomis sąlygomis, atitinkamai; 3, 7 - 1 pg dimerinio G-CSF baltymo su linkeriu L5, redukuotomis ir neredukuotomis sąlygomis, atitinkamai; 5 4, 8 - 1 pg dimerinio G-CSF baltymo su linkeriu L7, redukuotomis ir neredukuotomis sąlygomis, atitinkamai; K - molekulinės masės standartai (Fermentas #SM671), nuo gelio apačios: 15, 25, 35, 40, 55, 70, 100 kDa.

Fig. 2 pavaizduota dimerinio G-CSF-L5 atvirkščių fazių aukšto slėgio efektyvi chromatografija )0 (RP-HPLC), naudojant C4 (Hi-Pore RP-304, 250x4.6 mm, 300 A, “Bio-Rad”, JAV) atvirkščių fazių kolonėlę. Eliuavimui naudoti tirpalai A (0.1% trifluoracto rūgšties (TFA) vandeninis tirpalas) ir B (TFA-vanduo-acetonitrilas 0.1:9.9:90), komponentų koncentracija tirpaluose išreikšta tūrio procentais. Baltymų smailės detektuojamos esant 215 nm. Baltymo smailė buvo identifikuota pagal sulaikymo laiką tR, o šios baltymo formos kiekis tiriamame pavyzdyje 15 nustatytas, suintegravus chromatogramos duomenis.

Fig. 3 pavaizduotas dimerinio G-CSF baltymo koncentracijos kitimas žiurkių kraujo serume po baltymų injekcijos (500pg/kg) po oda. A - dGCSF-L5 ir kontrolinis Neupogen™ mėginys; B - dGCSF-L5, dGCSF-L7 dGCSF-La, kontrolinis Neupogen™ mėginys ir buferis (placebo, be baltymų), naudotas dimerinių baltymų saugojimui. 20 Fig.4 pavaizduotas dimerinių G-CSF baltymų poveikis iri vivo pagal kraujo neutrofilų skaičiaus kitimą po baltymo injekcijos (500pg/kg) žiurkėms po oda. Kontroliniai mėginiai Neupogen™ ir buferis (placebo, be baltymų), naudotas dimerinių baltymų saugojimui.

Detalus išradimo aprašymas 25 Pagrindinis šio išradimo objektas yra linijiniai oligomeriniai rekombinantiniai baltymai, kurių pavyzdžiais yra penkios naujos linijinio dimerinio G-CSF struktūros, kurios rodo ilgesnius gyvavimo in vivo (serume) laikus bei panašų arba aukštesnį biologinį aktyvumą (neutrofilų proliferaciją) lyginant su kontroliniu monomeriniu baltymu. Šio išradimo linijinius oligomerus galima gauti, naudojant visą eilę ląstelių kolonijas 30 stimuliuojančių citokinų, tokių kaip: G-CSF (granulocitų kolonijas stimuliuojantis faktorius), GM-CSF (granulocitus ir makrofagus stimuliuojantis faktorius), M-CSF (makrofagus stimuliuojantis faktorius). Genetiniu būdu sukonstruoto linijinio oligomero sudėtyje gali būti tiek lyginis monomerų skaičius, tiek ir nelyginis. Išradime taip pat aprašoma, kaip buvo gauti dimerinio baltymo dGCSF struktūriniai variantai, 35 pasižymintys biologiniu aktyvumo bei prailgintu gyvavimo serume laiku. Pagrindiniai dimerinio G-CSF (dGCSF) paruošimo ir testavimo etapai pagal šį išradimą apima tokias stadijas: 7 - genetinės konstrukcijos gavimas bei baltymą produkuojančio bakterinio kamieno sukonstravimas; - baltymo biosintezė, gryninimas ir renatūracija; - in vitro biologinio aktyvumo granulocitų proliferacijos testavimas; 5 - in vivo gyvavimo laiko kinetikos testavimas; - in vivo biologinio poveikio (neutrofilų proliferacija) testavimas. G-CSF geno linijiniai dimerai buvo sukonstruoti, polimerazinės grandininės reakcijos (PGR) pagalba sujungiant dvi vieno geno kopijas per linkerinę seką į vieną DNR fragmentą, kuris 10 buvo klonuotas į ekspresijos plazmidę pET21b ir kamieną E. coli BL21(DE3). Buvo gautos tokios rekombinantinių baltymų konstrukcijos; dGCSF-L2, L3, L5, L7, La, kur dvi G-CSF molekulės yra sujungtos linkerinėmis sekomis, sudarytomis iš aminorūgščių, pateiktų lentelėje 1: 1 lentelė 15 Dimerinio G-CSF (dGCSF) linkerių sekos

Linkeris Aminorūgščių seka Aminorūgščių skaičius L2 (SG4)-(SG4)-S 11 L3 (SG4)-(SG4)-(SG4)-S 16 L5 (SG4)-(SG4)-(SG4)-(SG4)-(SG4)-S 26 L7 (SG4)-(SG4)-(SG4)-(SG4)-(SG4)-(SG4)-(SG4)-S 36 La SGLEA-(EAAAK)4 -ALEA-(EAAAK)4 -alegs 54

Visų genetinių konstrukcijų DNR sekos buvo patikrintos, nustatant pirminę nukleotidinę seką kuri atitiko numatytą dimerinę seką koduojančią rekombinantinius baltymus sudarytus iš 20 linijinių būdu išdėstytų G-CSF baltymo monomerinių elementų, sujungtų tarpusavyje aukščiau pateiktais linkerinias jungtukais (monomerus jungiančiomis sekomis). Pastarieji buvo parinkti pagal didėjantį ilgį nuo dviejų iki septynių nestruktūrizuotų SGGGG elementų (Ln), arba struktūrizuoto linkerio La (su alfa-spiraliniais domenais). La linkerinė amino rūgščių seka, per kurią yra sujungti linijiniai oligomerai, turi alfa-spiralinius domenus EAAAK, 25 kurių skaičius gali varijuoti nuo dviejų iki aštuonių. Tokia aminorūgščių seka buvo parinkta, norint išlaikyti specifinę linkerio struktūrą su alfa-spiraliniais elementais, kurie periodiškai pasikartoja. Tiek trumpesnės linkerinės sekos (m=2), tiek ir ilgesnės sekos (m=8) sudaro tuos pačius alfa-spiralinius elementus ir suteikia analogišką struktūrą monomerus jungiančiai sekai. 8

Dimerinių baltymų struktūra, kaip minėta, buvo patvirtinta keliais nepriklausomais metodais: nustatyta baltymus koduojanti geno seka (visais atvejais nustatyta seka atitiko numatytą dimerinio baltymo seką, 2 lentelė). 2 lentelė 5 Dimerinių baltymų amino rūgščių seka ir molekulinė masė

Dimerinis baltymas Molekulinė masė kDa Pilna aminorūgščių seka Linkerinė seka dGCSF-L3 38,55 MTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQ GDGAALQEKLCATYKLCHPEELVLLG HSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQ LHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLD TLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPAL QPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVAS HLQSFLEVSYRVLRHLAQPSGGGGG SGGGGSGGGGSTPLGPASSLPQSFL LKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYK LCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPS QALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQAL EGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQ QMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAF QRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRH LAQP SGGGGGSGG GGSGGGGS dGCSF-L5 39,12 MTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQ GDGAALQEKLCATYKLCHPEELVLLG HSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQ LHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLD TLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPAL QPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVAS HLQSFLEVSYRVLRHLAQPSGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSTPL GPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGA ALQEKLCATYKLCHPEELVLLGHSLGI PWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGL FLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLD VADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQ GAMPAFASAFQRRAGGyLVASHLQS FLEVSYRVLRHLAOP SGGGGSGGG GSGGGGSGG GGSGGGGS dGCSF-L7 39,75 MTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQ GDGAALOEKLCATYKLCHPEELVLLG HSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQ LHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLD TLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPAL QPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVAS HLQSFLEVSYRVLRHLAQPSGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGG GSGGGGSTPLGPASSLPQSFLLKCLE QVRKIQGDGAALQEKLCATYKLCHPE ELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLA GCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPEL GPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELG MAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGG VLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP SGGGGSGGG GSGGGGSGG GGSGGGGSG GGGSGGGGS 9 dGCSF-La 42,52

MTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQ GDGAALOEKLCATYKLCHPEELVLLG HSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQ LHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLD TLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPAL QPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVAS HLQSFLEVSYRVLRHLAQPSGLEAEA AAKEAAAKEAAAKEAAAKALEAEAAA KEAAAKEAAAKEAAAKALEGSTPLGP ASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAAL OEKLCATYKLCHPEELVLLGHSLGIP WAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLF LYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDV ADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQG AMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFL EVSYRVLRHLAQP

SGLEAEAAAKE AAAKEAAAKEA AAKALEAEAAA KEAAAKEAAAK EAAAKALEGS

Dimerinio baltymo molekulinė masė buvo įvertinta pagal SDS-PAGE judrumą ir palyginta su apskaičiuota molekuline mase (visais atvejais dimerų molekulinės masės atitinka teorinį judrumą SDS-PAGE redukuotomis sąlygomis). Imunoblotingo rezultatai patvirtina dimerinių 5 baltymų struktūrą įvertinus sąveiką su G-CSF specifiniais antikūnais (Fig. 1). Dimerinių baltymų aktyvią struktūrą patvirtina specifinio biologinio aktyvumo nustatymas in vivo testu (Fig. 4) bei in vitro proliferacijos testu, naudojant pelės mieloidinės leukemijos ląstelių liniją G-NFS-60, nustatant naujai gautų baltyminių struktūrų biologinį aktyvumą (3 lentelė, 3 pavyzdys). 10 Farmacinė kompozicija linijinių oligomerinių baltymų pagal šį išradimą pagrindu gali savo sudėtyje turėti vieną arba kelis tokių komponentų: - nešiklį, kuris gali būti polihidroksiliai alkoholiai (pvz. manitolis, sorbitolis), įvairūs monosacharidai (pvz. gliukozė), disacharidai (pvz. sacharozė); - buferinę substanciją reikiamos pH reikšmės palaikymui (pvz. acetatas, fosfatas, TRIS, 15 HEPES); - druskų priedus kompozicijos izotoniškumui palaikyti (pvz. natrio chloridas); - detergentą apsaugantį nuo baltymo degradacijos skystis-oras skiriamoje riboje, (pvz. polisorbatas 80, polisorbatas 20, įvairūs Pluronic tipo junginiai); - stabilizatorių, tokį kaip polietilenglikoliai, polivinilpirolidonai, aminorūgštys (pvz. L-20 metioninas, L-argininas, L-histindinas, L-glutationo rūgštis, L-asparagino rūgštis); - chelatuojantį agentą tokį kaip EDTA, EGTA, IDA; - antimikrobinį agentą (pvz. benzolo darinius, tokį kaip krezolas, benzilo alkoholis); - SH agentą (pvz. gliutationas, cisteinas, acetilcisteinas); - kitas tinkamas pagalbines medžiagas. 10 Išradimo įgyvendinimo pavyzdžiai

Toliau pateikiami išradimo įgyvendinimo konkretūs pavyzdžiai. Šie pavyzdžiai ne apriboja, o . tik iliustruoja išradimo apimtį. 5 1 pavyzdys

Dimerinio G-CSF baltymo biosintezė

Dimerinio G-CSF producentas E. coli BL21 (DE3) p21 GCSF/L5/GCSF [V. Chmeliauskaitė, R. Mikšytė, V. Lukša, E. Zareckaja, G. Žvirblis, Overexpression study of human colony stimulating factors in Escherichia coli. 2. Overexpression of human granulocyte colony 10 stimulating factor. Biologija, 1996, Nr.2, p. 15-18 ir kt.] buvo auginamas 2L kolbose ir/arba fermentatoriuje (Sartorius AG, 5L darbinio tūrio fermentatorius). Terpė buvo naudojama 45,12g M9 druskos, 20g mielių ekstrakto, 80 ml 20% gliukozės, 8 mMM MgS04, 4 ml ampicilino 100mg/ml. Fermentatoriuje reguliuojami parametrai: temperatūra 37°C; pH 6,8 (pridedama rūgšties arba šarmo), aeracija (p02 25-30%; 1,0-1,31/min, 02 koncentracija ir 15 maišymo intensyvumas). Atskirai buvo registruojamas kultūros optinis tankis, kuris parodo priaugintos biomasės kiekį. Tikslinio baltymo sintezė indukuojama induktoriumi IPTG (izopropil-beta-D-tiogalaktopiranozidas). Indukcija vykdoma su IPTG (galutinė koncentracija 100 mM) esant 1.2 o.v. optiniam tankiui. Biomasės išeiga 30,31g šlapios biomasės, t.y. 8,6 g sauso svorio iš 1 L kultūrinio skysčio. 20 2 pavyzdys

Dimerinio baltymo gryninimas renatūruojant tirpale

Dimerinio G-CSF baltymo intarpinių kūnelių išskyrimas atliktas tokiu būdu: 10 g E. coli biomasės homogenizuojama 100 ml 0.1 M Tris-HCI, pH 7.0, esant 5 mM EDTA. Į 25 homogenizatą pridedama 0.1 g lizocimo, 0.1 ml Triton Χ-100, 1.0 ml 100 mM fenilmetilsulfonilfluorido (PMSF) ir 0.7 ml 2-merkaptoetanolio. Homogenizatas maišomas 30 min. kambario temperatūroje, veikiamas ultragarsu ledo vonioje ir centrifuguojamas 24,500 g 25 min. Skystis nupilamas, nuosėdos du kartus plaunamos, homogenizuojant 100 ml 1 M NaCI, 0.1% Tween 80 tirpale ir vieną kartą - 100 ml distiliuoto vandens. Po kiekvieno 30 homogenizavimo gauta suspensija buvo centrifuguojama 25 min. esant 24500 g.

Dimerinio G-CSF oksidacinės renatūracijos iš intarpinių kūnelių tirpale metodika: 1.7 g dimerinio G-CSF intarpinių kūnelių tirpinama 80 ml 7 M guanidino hidrochlorido (GuHCI) tirpale 10 mM Tris-HCI buferyje, pH 7.0, maišant per naktį 4°C temperatūroje. Intarpinių kūnelių tirpalas centrifuguojamas 40,000 g 25 min. Supematantas praskiedžiamas 10 mM 35 Tris-HCI buferiu (pH 7.0) iki 1 mg/ml baltymo koncentracijos (pagal Bradfordą), 6 M GuHCI, pridedama CuS04 tirpalo iki 20 μΜ koncentracijos ir maišoma 1 vai. kambario temperatūroje. Po to įpilama EDTA tirpalo iki 10 mM koncentracijos ir HCI tirpalu privedamas pH iki 5.4.

Baltymo tirpalas centrifuguojamas 25 min. esant 40,000 g. Apie 145 ml baltymo tirpalo užnešama į C 26/100 kolonėlę (2.6 * 100 cm, „Pharmacia“, Uppsala, Švedija), užpildytą 500 ml sorbento Sephadex G-25 Medium ir nupusiausvyrintą 25 mM Tris-maleino rūgšties-NaOH buferiu, pH 6.5, 0.25 M Na2S04. Baltymo užnešimas ir eliuavimas 25 mM Tris-maleino 5 rūgšties -NaOH buferiu, pH 6.5, 0.25 M Na2S04, atliekamas esant 30 cm/val. tėkmės greičiui. Tikslinį baltymą turinčios eliuato frakcijos sujungiamos ir centrifuguojamos 40,000 g 25 min. Dimerinio G-CSF tirpalas po chromatografijos per Sephadex G-25 Medium gryninamas metalų chelatinės chromatografijos metodu, panaudojant sorbentą Sepharose CL-6B su kovalentiškai prijungtu dažu Geltonu ŠA 2KT-Cu(ll). C 16/20 kolonėlė (1.6 * 20 cm, 10 „Pharmacia“, Uppsala, Švedija) užpildoma 20 ml šio sorbento ir nupusiausvyrinama 25 mM Tris-maleino rūgšties-NaOH buferiu, pH 6.5, 0.25 M Na2S04. Į kolonėlę įvedama 120 ml baltymo tirpalo (koncentracija 0.30 mg/ml pagal Bradfordą), ir kolonėlė plaunama 5 tūriais pradinio buferio. Baltymas desorbuojamas, laipsniškai didinant imidazolo koncentraciją kolonėlėje nuo 0 iki 300 mM. Chromatografijos metu eliuento tėkmės greitis buvo 45 cm/val. I5 Frakcijos iš imidazolo gradiento, turinčios daugiausia tikslinio baltymo, apjungiamos ir dializuojamos prieš 25 mM Na-acetatinį buferį, pH 5.4, 4°C temperatūroje. Dimerinis G-CSF toliau grynintas jonų mainų chromatografijos metodu. 31 ml baltymo tirpalo (koncentracija pagal Bradfordą 0.13 mg/ml) įvedama į C 10/10 kolonėlę (1.0 * 10 cm, „Pharmacia“, Uppsala, Švedija), užpildytą 4 ml sorbento SP-Sepharose ir nupusiausvyrintą 25 mM Na-20 acetatiniu buferiu, pH 5.4. Kolonėlė praplaunama 5 tūriais šio buferio, ir baltymas desorbuojamas laipsniškai didinant NaCI koncentraciją nuo 0 iki 500 mM. Chromatografijos metu eliuento tėkmės greitis 45 cm/val. Tikslinio baltymo frakcijos sujungiamos ir dializuojamos 4°C temperatūroje prieš 10 mM Na-acetatinį buferį, pH 4.0. Baltymo tirpalas po dializės centrifuguojamas ir filtruojamas per 0.22 pm sterilų filtrą. Chromatografijos metu 25 buvo stebimas eliuato optinis tankis ties 280 nm, panaudojant detektorių UV-1 („Pharmacia“, Uppsala, Švedija). Baltymo koncentracija eliuato frakcijose nustatyta Bradfordo metodu (Bradford, 1976). Identifikaciniu testu naudojamas Western blot metodas, panaudojant monokloninius antikūnus prieš G-CSF (Fig.1). Išgryninto baltymo kokybė tikrinama atvirkščių fazių aukšto slėgio efektyvios chromatografijos metodu (RP-HPLC) (Fig.2). 30 3 pavyzdys dGCSF biologinio aktyvumo nustatymas, naudojant jautrios ląstelių linijos proliferacijos testą

Rekombinantinio dimerinio G-CSF baltymo biologinis aktyvumas nustatomas, naudojant 35 pelės mieloidinės leukemijos liniją G-NFS-60 [Weinstein Y, Ihle JN, Lavų S, Reddy EP, Truncation of the c-myb gene by retroviral integration in an interleukin 3-dependent myeloid leukemija cell line. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, vol. 83, p. 5010-5014]. Aktyvus G-CSF 12 baltymas skatina šios ląstelių linijos proliferaciją po sąveikos su G-CSF receptoriumi ant šių ląstelių paviršiaus. Dimerinio G-CSF biologinio aktyvumo nustatymui ląstelės G-NFS-60 kultivuojamos 96 šulinėlių plokštelėse 48-72 vai., pridėjus į augimo terpę skirtingus kiekius (0,1-10 ng/ml) tiriamojo GCSF baltymo pavyzdžio. Kontrolei naudojamas G-CSF vaistas 5 Neupogen™ (veiklioji medžiaga Filgrastim), kurio biologinis aktyvumas yra žinomas. Ląstelių proliferacija įvertinama kolorimetriniu metodu, naudojant MTS dažą. Gyvų ląstelių skaičius yra tiesiogiai proporcingas G-CSF biologiniam aktyvumui. Dimerinio G-CSF baltymo biologinio aktyvumo duomenys pateikti 3 lentelėje.

Gauti rezultatai leidžia teigti, kad naudojant išradime pateikiamas baltymo struktūras bei 10 gryninimo metodikas gaunamas biologiškai aktyvus dimerinis G-CSF baltymas. 3 lentelė

Dimerinio GCSF (dGCSF) pavyzdžių biologinis aktyvumas

Nr. Preparatas Biologinis aktyvumas TV/ml TV/mg 1. dGCSF L3 3,7-106 2,3-107 2. dGCSF-L5 21,7-106 1,57-107 3. dGCSF-L7 10,8-106 2,16-10' 4. dGCSF-La 7,05-106 3,064-10' 15 4 pavyzdys

Farmakokinetinis dGCSF kiekio kraujo serume tyrimas

Farmakokinetiniam rekombinantinių baltymų vertinimui eksperimentiniai gyvūnai (Wistar žiurkės) buvo suskirstyti į grupes, kiekvienoje iš jų buvo po 4-5 žiurkes. Tiriamieji ir kontroliniai baltymai buvo sušvirkšti po oda. Naudotos tokios tiriamojo rekombinantinio 20 baltymo kiekis skaičiuojant gyvūno kūno svoriui: nuo 100 iki 1100 pg/kg. Kontrolei naudotas preparatas Neupogen™ (Filgrastim) tomis pačiomis baltymo koncentracijomis, skaičiuojant gyvūno kūno svoriui. Rekombinantinio baltymo koncentracijos testavimui kraujo serumas iš gyvūnų buvo rinktas po 3, 6, 12 ir 18 valandų po poveikio tiriamaisiais ar kontroliniais baltymais. Tuo tikslu iš žiurkės uodegos venos buvo paimta apie 0,8-1,0 ml kraujo, kuris 1 -25 1,5 vai. inkubuotas kambario temperatūroje, po to 12 vai. - šaldytuve (+4°C). Serumo atskyrimui mėginiai buvo centrifuguoti 15 min. 1500 aps./min. kambario temperatūroje, iš kiekvieno mėgintuvėlio serumas surinktas į 2-3 sterilius mėgintuvėlius ir užšaldytas šaldiklyje (-80°C). Kraujo serumas buvo testuotas pagal gamintojo instrukciją naudojant R&D kompanijos žmogaus G-CSF baltymo nustatymo rinkinius DuoSet, skirtus kraujo serumo 30 analizei ELISA metodu. Rezultatai yra pateikti Fig. 3. 13 5 pavyzdys

Farmakokinetinis dGCSF biologinio poveikio tyrimas

Farmakokinetiniam rekombinantinių baltymų vertinimui eksperimentiniai gyvūnai (VVistar žiurkės) buvo suskirstyti į grupes, kiekvienoje iš jų buvo po 4-5 žiurkes. Tiriamieji ir kontroliniai baltymai buvo sušvirkšti po oda. Naudotos tokios tiriamojo rekombinantinio baltymo kiekis skaičiuojant gyvūno kūno svoriui: nuo 100 iki 1100 ųg/kg. Kontrolei naudotas preparatas Neupogen™ (Filgrastim) tomis pačiomis baltymo koncentracijomis skaičiuojant gyvūno kūno svoriui. Rekombinantinio baltymo koncentracijos testavimui kraujo serumas iš gyvūnų buvo rinktas po 24, 48, 72, 96 valandų po poveikio tiriamaisiais ar kontroliniais baltymais. Buvo atlikti gyvūnų kraujo tyrimai, panaudojant kraujo analizatorių Hemavet 950. Buvo stebimas farmakodinaminis rekombinantinių baltymų poveikis analizuojant kraujo neutrofilų (granulocitų) skaičiaus pokyčius prieš ir po rekombinantinio baltymo injekcijos. Tam iš žiurkės uodegos venos buvo paimta po 20 pi kraujo, kuris sumaišytas su 5 μΙ 7,5 % EDTA, inkubuota 10 min. ir analizuota minėtu aparatu. Rezultatai yra pateikti Fig. 4, iš kurių darome išvadą, kad dimerinio baltymo poveikis (neutrofilų skaičiaus padidėjimas) viršija kontrolinį. Iš pateiktų pavyzdžių darytina išvadą, kad testuotos dimerinio GCSF baltymo struktūros turi biologinį aktyvumą in vitro ir in vivo panašų arba didesnį nei kontrolinis monomerinis G-CSF baltymas (Neupogen™), be to naujos G-CSF baltymo formos pasižymi vertingomis farmakokinetinėmis savybėmis, tokiomis kaip prailgintu gyvavimo laiku eksperimentinių gyvūnų kraujyje, lyginant su kontroliniu monomeriniu G-CSF baltymu (Neupogen™). Naujų terapinių baltymų farmakokinetinis profilis ženkliai skiriasi nuo kontrolės: dimerinio baltymo gyvavimas kraujo serume padidėja mažiausiai šešiomis vai. (Fig.3) lyginant su kontroliniu monomeriniu baltymu, be to biologinis dimerinių baltymų poveikis didinant neutrofilų skaičių tęsiasi iki 72 vai., kai kontrolinio preparato veikimas pastebimas iki 48 vai. po injekcijos (Fig.4).

Claims (5)

14 IŠRADIMO APIBRĖŽTIS 1. Linijiniai oligomeriniai rekombinantiniai baltymai, sudaryti iš to paties baltymo genetiškai sujungtų monomerų, kur monomeras yra granulocitus stimuliuojantis baltymas, ir monomerai sujungti linkerine aminorūgščiųseka.

2. Linijiniai oligomeriniai baltymai pagal 1 punktą, kur granulocitus stimuliuojantis baltymas yra granulocitų kolonijas stimuliuojantis faktorius G-CSF ir monomerų skaičius yra du.

3. Linijiniai oligomeriniai baltymai pagal 1 arba 2 punktą, kur linkerinė seka yra pasirinkta iš aminorūgščių sekų grupės, susidedančios iš (S-G4)n-S, kur n=2-7 ir SGLEA-(EAAAK)m -ALEA-(EAAAK)m -ALEGS, kur m=2-8.

4. Linijiniai oligomeriniai baltymai pagal bet kurį iš ankstesnių punktų, pasižymintys prailgintu gyvavimo laiku in vivo.

5. Farmacinė kompozicija, apimanti veiksmingą kiekį linijinio oligomerinio baltymo pagal bet kurį iš ankstesnių punktų, optimaliai linijinio G-CSF dimero, ir farmaciniu požiūriu priimtiną nešiklį ir/arba pagalbines medžiagas.