NO872227L - Tumornekrosefaktorformulering. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en kjemisk modifisering av tumornekrosefaktor TNF som endrer og forbedrer de kjemiske og/eller fysiologiske egenskaper derav.

Human-TNF er et 157-aminosyreprotein inneholdende to cystein-rester, én i posisjon 69 og den andre i posisjon 101. TNF ble først beskrevet av Carswell et al.,"Proe. Nati. Acad. Sei."

(USA), 1975, 72:3666, og har vist seg å være cytotoksisk selektiv mot neoplastiske celler. TNF er videre renset fra cellekultur av Matthews et al., "Brit. J. Cancer", 1981, 44:418 (fra mononukleær fagocyter avledet fra BCG-injiserte kaniner) og av Mannel et al., "Infect. Immun." (1980), 30:523; (1981), 33:156 (fra kulturer av makrofaganriket peritoneal eksudatceller fra BCG-injiserte mus). Sekvensen som koder TNF, produsert av humanpromyelocytisk leukemicelle-linje HL-60, ATCC Deposit No. CCL240 er klonet og eksprimen-tert i E. coli. Se PCT US85/01921 og PCT US/02381.

Bruken av polypeptider i sirkulatoriske systemer for å fremstille en spesiell fysiologisk respons er velkjent i medisinen. En begrensning til den potensielle terapeutiske fordel oppnådd fra den kliniske bruk av polypeptider er deres evne å gi en immunrespons i det sirkulatoriske system. Denne immunrespons kan forårsakes av aggregater i materialet før injisering som beskrevet av R. Uling (1970), "J. Clin. Endrocr.", 31, 679-688, W. Moore (1978), "J. Clin. Endrocrinol. Metab.", 46, 20-27 og W. Moore og P. Leppert (1980)", J. Clin. Endrocrinol. Metab".,, 51, 691-697. Denne respons involverer produksjon av antistoffer mot polypeptidene i det sirkulatoriske system inn i hvilket de injiseres. Denne anti-stoffproduksjon kan redusere eller eliminere den ønskede biologiske funksjon for polypeptidet, enkelte ganger ved å forårsake redusert oppholdstid i det sirkulatoriske system (redusert halveringstid) eller ved å modifisere molekylet via antistoff-polypeptidinteraksjon.

Modifikasjon av disse potensielt brukbare terapeutiske polypeptider slik at immunresponsen ødelegges eller i det minste reduseres mens det fremdeles opprettholder de ønskede fysiologiske aktiviteter ville tillate bruken av disse polypeptider i pattedyrsirkulatoriske systemer uten de ovenfor nevnte mangler. I tillegg, og på grunn av den økede halveringstid for det sirkulerende polypeptid ville mindre mengder av polypeptidet være nødvendig for den ønskede terapeutiske virkning enn det som til nå har vært mulig.

Problemene med immunogenitet og kort halveringstid i sirkula-sjonen som nevnt ovenfor samt andre uønskede egenskaper for visse proteiner er vel erkjent og forskjellige modifikasjoner av polypeptider har vært foretatt for å løse problemene. Dette inkluderer modifiseringen av proteiner med i det vesentlige rettkjedede polymerer slik som polyetylenglykol, PEG, eller polypropylenglykol, PPG. F.eks. beskriver US-PS 4.261.973 konjugering av immunogene allergenmolekyler med ikke-immunogene vannoppløselige polymerer slik som PEG for å redusere allergenets immunogenitet. US-PS 4.301.144 beskriver konjugering av hemoglobin til PEG, PPG, en kopolymer av etylenglykol og propylenglykol, eller etere, estere eller dehydratiserte produkter av slike polymerer for å øke den oksygenbærende evne for hemoglobinmolekylet. EP-publikasjon 98.110 beskriver at kobling av et polypeptid eller et glykoprotein til en polyoksyetylen-polyoksypropylenkopolymer øker lengden av den fysiologiske aktivitet. Fortrinnsvis er polypeptidet eller glykoproteinet et enzym eller nativ interferon som er vannoppløselige. US-PS 4.179.337 beskriver kobling av vannoppløselige polypeptider slik som enzymer og insulin til PEG eller PPG for å redusere immunogeniteten for polypeptidet mens man bibeholder en vesentlig andel av den ønskede fysiologiske aktivitet. US-PS 4.002.531 beskriver en forskjellig metode for kobling av enzymer til PEG via et aldehydderivat.

US-PS 4.055.635 beskriver farmasøytiske preparater som omfatter et vannoppløselig kompleks av et proteolytisk enzym bundet kovalent til et polymermateriale slik som polysak-karider.

US-PS 3.960.830 beskriver peptider bundet til en polyalkylen-glykolpolymer slik som polyetylenglykol.

US-PS 4.088.538 beskriver et reversibelt oppløselig enzyma-tisk aktivt polymerenzymprodukt omfattende et enzymkovalent bundet til en organisk polymer slik som polyetylenglykol.

US-PS 4.415.665 beskriver en fremgangsmåte for kobling av en organisk ligand inneholdende minst én primær eller sekundær aminogruppe, minst én tiolgruppe og/eller minst én aromatisk hydroksygruppe (beskrevet i kolonne 3, linje 19-36) til en polymerbærer med minst én hydroksylgruppe (beskrevet i kolonne 2, linje 42-66).

US-PS 4.495.285 beskriver en ikke-immunogen plasminogenakti-vator hvis aminosyresidekjeder er koblet til en polyalkylen-glykol via et koblingsmiddel.

US-PS 4.412.989 beskriver et oksygenbærende materiale inneholdende hemoglobin eller et derivat derav, kovalent koblet via en amidbinding til polyetylen- eller polypropylenglykol .

US-PS 4.496.689 beskriver et kovalent forbundet kompleks av a-l-proteinaseinhibi tor med en polymer slik som PEG eller metoksypolyetylenglykoler.

US-P 3.619.371 beskriver en polymermatriks med en biologisk aktiv substans kjemisk bundet dertil.

US-PS 3.788.948 beskriver bruken av organiske cyanatforbind-elser for å binde proteiner til polymerer.

US-PS 3.876.501 beskriver aktivering av vannoppløselige karbohydrater med cyanogenbromid for å forbedre bindingen til enzymer og andre proteiner.

US-PS 4.055.635 beskriver farmasøytiske preparater av et proteolytisk enzym kovalent bundet til et polymermateriale.

EP-PS 152.847 beskriver et enzymkonjugatpreparat omfattende et enzymkonjugat, et kalsiumsalt og et polyetylenglykol.

JP-publikasjon 57192435 beskriver modifiserte polypeptider der alle, eller en del, av aminogruppene er substituert med en polyetoksyldel. DE-PS 2312615 beskriver kobling av polymerer til forbindelsene inneholdende hydroksy- eller aminogrupper.

EP-PS 147.761 beskriver et kovalent konjugat av a-l-proteina-seinhibitor og vannoppløselig polymer der polymeren kan være polyetylenglykol.

US-PS 4.414.147 beskriver at man kan gjøre interferon mindre hydrofobt ved å konjugere det til et anhydrid av en dikarbok-sylsyre slik som polyetylenravsyreanhydrid.

EP-PS 154.316 beskriver kjemisk modifiserte lymfokiner inneholdende PEG bundet direkte til minst én primær aminogruppe av et lymfokin slik som a-, p- eller gammainterferon eller interleukin-2.

I tillegg til disse patenter og publikasjoner diskuterer diverse artikler konseptet med anvendelse av aktivert PEG eller PPG som modif iseringsmiddel for proteiner slik som enzymer, IgG og albumin. F.eks. beskriver ' Inada et al. "Biochem and Biophys. Res. Comm.", 122, 845-850 (1984) modifisering av vannoppløselig lipoproteinlipase for å gjøre den oppløselig i organiske oppløsningsmidler slik som benzen ved bruk av cyanursyreklorid som koblingsmiddel med PEG. Takahashi et al., "Biochem. and Biophys. Res. Comm.", 121, 261-265 (1984) beskriver modifisering av peperrotperoksydase ved bruk av cyanursyrekloridtirazin med PEG for å gjøre det vannoppløselige enzym aktivt og oppløselig i benzen. Suzuki et al., "Biochem. Biophys. Acta", 788, 248-255 (1984) beskriver undertrykkelse av aggregering av IgG ved bruk av cyanursyrekloridaktiverte PEG. Abuchowski et al., "Cancer Biochem. Biophys.", 7, 175-186 (1984) angir at modifisering av asparaginaser fra E. coli og Vibrio succinogenes ved bruk av PEG som er aktivert med suksinimidylsuksinat øker halveringstiden og reduserer proteinenes immunogenitet. Davis et al., "Biomedical Polymers", (New York: Academic Press, 1980), s. 441-451 beskriver at enzymer som vanligvis er uoppløselige kan oppløseliggjøres med PEG-forbindelse uten ytterligere detaljer. Diverse andre artikler diskuterer modifisering av enzymer slik som urikase, streptokinase, katalase, araginase og asparaginase med PEG, aktivert av suksinimidylsuksinat eller cyanursyreklorid for å øke halveringstiden og å redusere proteinets immunogenitet.

Ingen av disse referanser beskriver imidlertid hvordan man skal benytte en polymermodifiseringsprosess for å øke den biologiske aktivitet og TNF's farmokinetika.

I henhold til dette tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en modifisering av TNF for å bibeholde dens biologiske aktivitet og potensielt å øke den fysiologiske halveringstid derav og å redusere immunogeniteten ved å redusere eller eliminere aggrigering av proteinet eller ved å maskere antigenedeterminanter. Det er også tatt sikte på at den forlengede halveringstid av det modifiserte TNF, relateres til proteinets effektivitet.

Mere spesielt er foreliggende oppfinnelse rettet mot et farmasøytisk preparat omfattende et ikke-toksisk, inert, farmasøytisk akseptabelt vandig bærermedium hvori det er oppløst biologisk aktivt TNF, kovalent konjugert til en vannoppløselig polymer valgt blant polyetylenglykolpolymerer og polyoksyetylerte polyoler, hvori polyetylenglykolpolymeren er usubstituert eller substituert i en ende med en alkylgruppe, og polyolen er usubstituert.

Fortrinnsvis er polymeren usubstituert polyetylenglykol, PEG, eller monometyl , PEG, mPEG, og er koblet til TNF via en amidbinding som dannes fra 4-hydroksy-3-nitrobenzensulfonat-esteren eller N-hydroksysuksinimidesteren av en PEG- eller mPEG-karboksylsyre.

Et annet trekk ved oppfinnelsen ligger i en fremgangsmåte for fremstilling av et farmasøytisk preparat og som omfatter: a) å fremstille en vannoppløselig polymer med minst én terminal reaktiv gruppe der polymeren er valgt blant polyetylenglykolpolymerer og polyoksyetylerte polyoler idet polyetylenglykolpolymeren er usubstituert eller substituert i en ende med en alkylgruppe og polyolen er usubstituert; b) å omsette biologisk aktivt TNF med den reaktive gruppe av polymeren for å tilveiebringe biologisk aktivt, selektivt

konjugert TNF; og

c) å formulere nevnte TNF i et ikke-toksisk, inert farma-søytisk akseptabelt vandig bærermedium.

Det nevnte TNF kan oppnås fra vevkulturer eller ved rekombi-nantteknikker og fra en hvilken som helst pattedyrkilde slik som f.eks. mus, rotte, kanin, primater, svin og mennesker. Fortrinnsvis oppnås slikt protein fra en humankilde og er helst rekombinant human-TNF.

Det her nevnte TNF kan oppnås i rekombinant form som beskrevet av Pennica et al., "Nature", (1984) 312: 724-729; Yamada et al., "J. Biotechnology", (1985) 3: 141-153; Wang et al., "Science" (1985) 228: 149-154; Shirai et al., "Nature", (London), (1985) 313: 803-806; EP-PS 155.549, EP-PS 158.286, EP-PS 168.214 samt PCT US85/01921. Rekombinant kanin-TNF kan oppnås som beskrevet i EP-PS 146.026 og EP-PS 148.311.

Kloning av human-TNF med 151 og 155 aminosyrer (2 og 6 mindre enn den native form) er beskrevet i EP-PS 155.549 og human-TNF på 155 aminosyrer er beskrevet i EP-PS 158.286 tilsvarende GB-PS 2.158.829A. Kloning av natur-TNF med 157 aminosyrer og forskjellige modifiserte former (muteiner) derav, er beskrevet i EP-PS 168.214 og PCT US85/01921.

Fortrinnsvis er det her beskrevne TNF et human-TNF-mutein hvori de første 8 aminosyrerester er utelatt, ved bruk av den prosedyre som er beskrevet i PCT W086/02381 eller dette TNF er et cysteinfattig mutein, fremstilt på samme måte som beskrevet i US-PS 4.518.584.

Den nøyaktige kjemiske struktur for det her nevnte TNF vil avhenge av et antall faktorer. Da ioniserbare amino- og karboksylgrupper er tilstede i molekylet, kan en spesiell form av TNF oppnås som et surt eller basisk salt eller i nøytral form. Alle slike preparater bibeholder sin bioaktivitet når de anbringes i egnede omgivelsesbetingelser og er også inkludert under definisjonen av TNF slik den her gis. Videre kan den primære aminosyresekvens til dette TNF forbedres ved derivatisering ved bruk av sukkerdeler (glyko-sylering) eller ved andre supplementære molekyler slik som lipider, fosfat, acetylgrupper o.l., mere generelt ved konjugering med sakkarider. Visse aspekter ved en slik forbedring gjennomføres via posttranslasjonell behandlings-systemer i den produserende vert; andre slike modifiseringer kan gjennomføres in vitro. I ethvert tilfelle er slike modifiseringer inkludert i den her gitte definisjon av TNF sålenge bioaktiviteten til TNF ikke ødelegges. Det er selvfølgelig forventet at slike modifiseringer kvantitativt eller kvalitativt påvirker bioaktiviteten, enten ved å forbedre eller redusere aktiviteten til TNF i forskjellige analyser.

Uttrykket "selektivt konjugert" slik det her benyttes for anvendelse på TNF henviser til TNF som er kovalent bundet via en av sine aminosyrerester. Mens restene kan være hvilke som helst rekative aminosyrer på proteinet, slik som en eller to cysteiner eller den N-terminale aminosyregruppe, er den reaktive aminosyre fortrinnsvis lycin som er bundet til en reaktiv gruppe av den aktiverte polymer via sin frie c-aminogruppe, eller glutamin- eller aspartinsyre som er bundet til polymeren via en amidbinding.

Polymeren hvortil TNF er bundet, er en homopolymer eller kopolymer av PEG eller er en polyoksyetylert polyol, forut-satt i alle tilfeller at polymeren er oppløselig i vann ved romtemperatur. Eksempler på kopolymerer inkluderer f.eks. kopolymerer av etylenglykol og propylenglykol, eller av etylen og maleinsyreanhydrid. Eksempler på polyoksyetylerte polyoler inkluderer f.eks. polyoksyetylert glyserol, polyoksyetylert sorbitol, polyoksyetylert glukose o.l. Fortrinnsvis er PEG-polymeren en homopolymer og den polyoksylerte polyol polyoksylert glyserol.

Glyserolskjelettet til polyoksyetylert glyserol er det samme skjelett som opptrer naturlig hos f. eks. mennesker og dyr som mono-, di- og triglyserider. Derfor vil denne forgrening ikke nødvendigvis sees som et fremmed stoff i legemet.

Polymeren behøver ikke å ha noen spesiell molekylvekt, men det er foretrukket at molekylvekten er mellom ca. 300 og 100.000 og helst mellom 3050 og 40.000, avhengig f.eks. av det spesielle benyttede protein.

Fortrinnsvis er PEG-polymeren usubstituert , men den kan også være substituert i en ende med en alkylgruppe. Fortrinnsvis er alkylgruppen C1_4-alkylgruppe, og aller helst en metyl-gruppe. Fortrinnsvis er polymeren en usubstituert homopolymer av PEG, eller en monometylsubstituert homopolymer av PEG, og har en molekylvekt fra ca. 350 til 40.000.

Dette TNF er konjugert via en terminalreaktiv gruppe på polymeren. Polymeren med den eller de reaktive grupper kalles her aktivert polymer. Den reaktive gruppe reagerer selektivt med frie amino- eller andre reaktive grupper på TNF. Da reaksjonen av reaktiv gruppe med for mange aktive grupper på TNF ikke kan være mulig for å unngå fullstendighet, anbefales det at generelt fra ca. 1 til 10 mol og fortrinnsvis 1 til 5 mol aktivert polymer pr. mol TNF, avhengig av TNF-konsentra-sjonen, benyttes. Den ultimate mengde som benyttes er en avveining for å opprettholde optimal aktivitet mens man samtidig hvis mulig optimaliserer halveringstiden for proteinet. Fortrinnsvis bibeholdes minst ca. 10, helst ca. 25, aller helst 50 og selvfølgelig hvis mulig 100$ av den biologiske aktivitet til prorteinet.

Den kovalente modifiseringsreaksjon kan skje på en hvilken som helst egnet måte som generelt benyttes for å omsette biologisk aktive stoffer med inerte polymerer, fortrinnsvis ved ca. pH 5-9, hvis de reaktive grupper på TNF er lysingrup-per. Generelt involverer prosessen fremstilling av en aktivert polymer (med minst én temrinal hydroksylgruppe) med etterfølgende omsetning av TNF med aktivert polymer for å fremstille det modifiserte TNF som er egnet for formuleringen .

Den ovenfor angitte modifiseringsreaksjon kan gjennomføres ved forskjellige metoder som kan involvere ett eller flere trinn. Eksempler på egnede monifiserende midler som kan benyttes for å fremstille den aktiverte polymer i en en-tr innsreaksj on inkluderer cyanursyreklorid (2,4,6-tirklor-S-triazin) og cyanursyrefluorid.

I en foretrukket utførelsesform skjer modidf iseringsmodif ika-sjonen i to trinn der polymeren først omsettes med et syreanhydrid slik som ravsyre- eller glytarsyreanhydrid for derved å danne en karboksylsyre, og denne så omsettes med en forbindelse istand til å reagere med karboksylsyren for å danne en aktivert polymer med en reaktiv estergruppe som er istand til å reagere med proteinet. Eksempler på slike forbindelser inkluderer N-hydroksysuksininimid, 4-hydroksy-3-ni trobenzensulfonsyre o.l., og fortrinnsvis benyttes N-hydroksysuksinimid eller 4-hydroksy-3-nitrobenzensulfonsyre . F.eks. kan monometylsubstituert PEG omsettes ved forhøyede temperaturer, fortrinnsvis 100 til 110°C i fire timer, med glutarsyreanhydrid. Monometyl PEG-glutarsyren som således er fremstilt omsettes så med en hydroksysuksinimid i nærvær av et karbodiimidreagens slik som dicykloheksyl- eller isopro-pylkarbodiimid for derved å oppnå den aktiverte polymer, metoksypolyetylenglykol-N-suksinimidylglutarat, som så kan omsettes med TNF. Denne metode er beskrevet i detalj av Abuchowski et al., "Cancer Biochem. Biophys.", 7, 175-186

(1984). I et annet eksempel kan monometylsubstituert PEG omsettes med glutarsyreanhydrid fulgt av omsetning med 4-hydroksy-3-nitrobenzensulfonsyre (HNSA) i nærvær av dicykloheksylkarbodiimid for derved å gi den aktiverte polymer. HNSA er beskrevet av Bhatnagar et al., "Peptides: Synthesis-Structure-Function, Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium", Rich. et al. (Pierce Chemical Co., Rockford IL, 1981), s. 97-100 og Nitecki et al., "High-Thecnology Route to Virus Vaccines" (American Soiciety for Microbiology; 1986) med tittel "Novel AGent for Coupling Synthetic Peptides to Carriers and Its Application".

Da esterbindinger kjemisk og fysiologisk er mindre stabile enn amidbindinger, kan det være foretrukket å benytte kjemiske transformasjoner 1 koblingsreaksjonen som så gir karboksylsyrer eller amidsyrer uten samtidig dannelse av estere.

Det således modifiserte TNF formuleres så i et ikke-toksisk inert farmasøytisk aksepterbart vandig bærermedium, fortrinnsvis ved en pH-verdi på ca. 3-8 og helst 6-8. For in vi tro-anvendelser er administreringsmetodene og formuleringen ikke kritiske. Vandige formuleringer som er kompatible med kulturer- eller perfusjonsmediet vil vanligvis benyttes. Benyttet in vivo for terapi vil det sterile produkt bestå av en blanding av TNF oppløst i en vandig buffer i en mengde osm gir en farmasøytisk aksepterbar pH-verdi når blandingen rekonstitueres. En vannoppløselig bærer slik som mannitol kan eventuelt tilsettes til mediet.

Doseringsnivået for protein i formuleringen vil avhenge av de in vivo-effektivitetsdata som oppnås etter preklinisk prøving og vil hovedsakelig avhenge av sluttanvendelsen.

Hvis formuleringen lyofiliseres kan lyofiliserte blanding rekonstitueres ved injisering i ampullen av en konvensjonell parenteral vandig injeksjon slik som f.eks. destillert vann.

Den rekonstituerte formulering som beskrives som angitt ovenfor er egnet for parenteral administrering til mennesker eller andre pattedyr i terapeutisk aktive mengder (dvs. mengder som eliminerer eller reduserer pasientens patologiske tilstand for derved å gi terapi, dvs. å drepe neoplastiske celler.

Dosen og doseringsplanen for dette TNF vil f.eks. avhenge av medikamentets farmakokinetika, arten av sykdom, dette TNF' s karakteristika, pasienten og pasientens historie. F.eks. er forskjellige modifiserte TNF-proteiner forventet å ha forskjellige farmakokinetiske og terapeutiske egenskaper som er fordelaktige for forksjellige administreringsveier. Et lengevirkende medikament behøver kun å administreres 3-4 dager hver uke, enkelte sågar én gang pr. to uker. Klarings-hastigheten kan varieres for å gi ultimatfleksibilitet for tilpasning til det spesielle behov som foreligger ved f.eks. å endre polymertype og polymerstørrelse.

I de følgende eksempler som illustrerer oppfinnelsen er alle deler og prosentandeler på vektbasis hvis ikke annet er sagt, alle temperaturer er gitt i grader Celsius.

EKSEMPEL I

Fremstilling av PEG-ylert TNF.®

A. Fremstilling av PEG-ester.

En lineær, monometylsubstituert ester av PEG med molekylvekt 5000 ble oppnådd ved først å omsette monometyl PEG-500 som er kommersielt tilgjengelig med glutarsyreanhydrid ved 100-llOcC i 4 timer ved en metode tilsvarende den til Abuschowski et al., "Cancer Biochem. Biophys.",, 7, 175-186 (1984). Den resulterende PEG-glurtarsyre ble omsatt med en hydroksysuksinimid i nærvær av dicykloheksylkarbodiimid som beskrevet i detalj av Abuchowski et al., på side 176. Det resulterende produkt er monometoksypolyetylenglykol N-suksinimidylglutarat, heretter kalt PEG** .

I et alternativt trinn og ved en tilsvarende metode kan monometoksypolyetylenglykol N-suksinimidylsuksinat fremstilles ved bruk av ravsyreanhydrid i stedet for glutarsyreanhydrid. I en tredje og tilsvarende metode kan en PEG-karboksylsyreester HNSA fremstilles ved å benytte HNSA i stedet for en hydroksysuksinimid. Dette sistnevnte esterpreparat er beskrevet av Bhatnagar et al., supra og av Nitecki et al., supra. PEG karboksylsyreester-HNSA kan benyttes osm det aktiverte PEG i prosedyrene som beskrives i dette eksempel.

B. Kobling av PEG<*>til TNF.

Et mute in av human TNF med de første 8 aminosyrer utelatt fra N-terminus ble fremstilt som følger. TNF ble indusert fra generelt tilgjengelige HL-60-celler og ble renset og sekven-sert. Deretter ble en intronfri sekvens som kodet human-TNF fremstilt ved å produsere anriket mRNA, og konstruere et cDNA-bibliotek, og selektere en probe og probing av bibliote-ket for å gjenvinne sekvensen. Deretter ble et ATG-startkodon innført umiddelbart foran GTC-sekvensen som kodet N-terminalt valin i det nature protein ved sete-rettet mutagense. Kloner ble valgt og strenger ligerte inn i eksprimeringsvektorer for å oppnå prokariotisk eksprimerinmg av muteinet. Muteinet ble deretter renset ved kolonnerensing ved bruk av en hvilken som helst standard renseteknikk og gjenvunnet i rensebufferen.

Til 1 mg av TNF-muteinet i 0,5 ml 50 mM natriumfosfat, pH 8,2 ble det tilsatt nypreparert vandig PEG<*>i molforhold fra 1 til 50 pr. mol TNF og tilstrekkelig 50 mM boratbuffer, pH 9,0, til å gi et sluttvolum på 1 ml. PEG<*>ble oppløst til 100 mg pr. ml i kold 10 mM natriumfosfat, pH 7,0. Etter grundig blanding skred reaksjonen frem ved 23° C i 30 minutter. Reaksjonen ble gjort ferdig i løpet av 30 minutter og PEH<*->TNF var klar for yttelrigere behandling.

C. Rensing av modifisert TNF.

Ved bruk av DEAE ionebyttekromatografi ble forksjellige former av PEGylert TNF separert fra ikkemodifisert TNF. En prøve på 1 mg TNF, modifisert med et fem gangers molart overskudd av PEG<*>ble ført til kolonnen. Man kjørte en lieær gradient på 0-200 mM natriumklorid i 30 minutter ved 1,0 ml/min. på en 7,5 mm x 7,5 cm TSK DEAE-5-PW-kolonne. Bufferen var 10 mM trisk°°lor id pH 8,2. Mengder av frakonene ble analysert på TNF-bioaktivitet som beksrevet under eksempel

IIB.

PEGEKSEMBEINF.

Karakterisering av PEG-ylert TNF

A. Størrelseskarakterisering av modifiserte TNF-produkter.

Fraksjonene fra DEAE-kolonnen ble analysert på en SDS-PAGE ( 15%,, ikke-rduserende) gel. Før påføring på gleen ble fraksjonene blandet med konsentrert SDS prøvebuffer. Deretter ble 2,5 pm protein fylt på et gelspor og eléktroforesert i ca. 1,5 time ved 35 milliampere. Gelene ble flekket og så avflekket.

Den siste eluerende topp fra ionebyttekolonnen viste seg å være ikke-modifisert TNF ved SDS-PAGE. Den bestod av monomere det monomere TNF-bånd med molekylvekt 15.000. De tidligere elueringstopper fra ionebyttingen inneholdt en viss andel høyere molekylvektsbånd, sett på SDS-PAGE. Disse bånd var TNF-monomeren konjugert med ett, to elelr flere molekyler PE<*>. De relative andeler qav ikke-modifisert TNF-monomer i forhold til modifiserte monomerer sank jo tidligere toppene eluerte fra kolonnen. Dvs. at de tidligere eluerte topper var sterkere modifisert med PEG. Andelen TNF som var modifisert med to eller tre PEG" var også høyest i de første elueringstopper .

B. Bioaktivitet for PEG-ylert TNF som en funksjon av modifi Fraksjoner fra den tidligere nevnte DEAE kolonneseparering av TNF, modifisert med fem gangers molart overskudd av PEG<*>ble analysert ved L-929 TNF cytotoksybioanalyse som beskrevet nedenfor.

Dette system er en forbedret, hensiktsmessig in vitroanalyse som tillater hurtig måling av TNF-aktiviteten. Korrelasjo9ns-graden med in vivo-tumornekrose avvnalysen i e hhenhold til Carswell et al., "Proe. Nati. Acad,. Sei (USA),(1975 ), 72: 3666, supra, er, på det nuværende tidspunkt, ukjent; da den imidlertid spesifikt benytter urintumorceller antas korrela-sjonen å være høy. Proteinet som kalles lymfotoksin i EP0-publikasjon 0100641 gir også aktiviteten i denne analyse. Analysen tilsvarer i konsept det som er beskrevet i US-PS 4.457.916, som benytter murin L-M celler og metylenblåflek-king. Imidlertid er L-929-analysen her vist å korrelere (for HL-60-avledet TNF) med humantumorcellelinjecytotoksysitet.

I L-929-analysesystemet blir L-929-celler preparert overnat-ten som monosjikt i mikrotiterplater. Undersøkelsesprøvene fortynnes to ganger på tvers av flaten, UV-bestråles og tilsettes så til de preparerte monosjikt. Kulturmedia i brønnene bringes så til 1 pg/ml aktinomycin D. Platene tillates inkubering i 18 timer ved 37" C og platene bedømmes visuelt under mikroskopet. Hver brønn gis en 25, 50, 75 eller 100$ angivelse som signifikerer graden av celledød i brønnen. En enhet TNF-aktivitet defineres som den resiproke verdi av fortynningen ved hvilken 50$ avlivning skjer.

Resultatene av L-929-analysene av DEAE-kolonne-f raks j onene er vist i tabell I. Fraksjonene 48-58 er modifisert TNF og fraksjon 60 er ikke-modifisert TNF. Resultatene antyder at det PEG-ylerte TNF i fraksjonene 56-58 har den samme spesifikke aktivitet som ikke-modifissert TNF. Sterkere PEG-ylerte former av TNF, fraksjonene 48-54, viuser redusert spesifikk aktivitet. Det aktive PEG-TNF Inneholder omtrent like mengder ikke-modifiserte TNF-monomerer og mono-PEG-ylerte monomerer, bestemt ved SDS-PAGE. Da TNF er en dimer er mest sannsynlig de aktive arter en mono-PEG-TNF-monomer, kombinert med en ikke-modifisert monomer. Kombinasjonen av to modifiserte monomerer (fraksjonene 52-54) er så og si 2-10 ganger mindre aktive enn det ikke.-modifiserte TNF.

Når reaksjonen utføres som beskrevet I eksempel I ved bruk av 5 mol PEG<*>pr. mol TNF, hadde det ikke-fraksjonerte TNF en spesifikk aktivitet på 20$ i forhold til ikke-modifisert TNF; ved 10 gangers overskkudd av PEG<*>var det 1$ tilbake av den spesifikke aktivitet. C. Farmakokinetika for PEG-ylert TNF sammenlignet med ikke-modifisert TNF.

Det er antatt at de aktive TNF-arter har en lengere halveringstid enn ikke-modifisert TNF ved injeksjon i mus.

EKSEMPEL III

Fremstilling av PEG-ylert TNFmed

2000 molekylvekts-PEG.

Et TNF-derivat av PEG med molekylvekt 2000 ble preparert ved den generelle metode som er beskrevet i eksempel I ved bruk av PEG 2000. Det resulterende derivat var biologisk aktivt.

EKSEMPEL IV

Fremstilling av TNF modifisert med polyokyetylert glyserol, POG,

(Forventede resultater)

A. Fremstilling av aktivert POG-TNF.

Polyoksyetylert glyserol, POG, med molekylvekt 5000, ble syntetisert for kunder av Polysciences.

Til 10 g POG ble det satt 2,28 g glutarsyreannhydr id, dette tilsvarer et ti gangers overskudd i forhold til POG. Blandingen ble omrørt i 2 timer ved 110° C og så avkjølt. Det hele ble oppløst 1 20 ml HCCI3og helt langsomt i 500 ml eter under heftig omrøring. Produktet ble samlet og skyllet med eter for derved å oppnå 90$ POG-glutaratprodukt. Dette produikt ble omsatt med N-hydroksysuksinimid som beskrevet i eksempel I.A, hvorved man oppnådde det aktive ester POG-glutaryl-N-jhydrorksysuksinimid, POG<*>. Det er antatt at det TNF som er beskrevet i eksempel TB kan omsettes med POG<**>ved romtemperatur under betingelser som generelt beskrevet i eksempel IB. Reaksjonsblandingen kan så påføres på en separat kolonne for rensing og fraksjonene kan analyseres på hjomogenitet med SDS-PAGE og på bioaktivitet som beskrevet i eksempel HB.

Som en oppsummering tilveiebringer oppfinnelsen et farmasøy-tisk preparat hvori biologisk aktivt TNF-protein selektivt konjugerer til en polymer av PEG eller en polyoksyetylert polyol.

Claims (10)

1. Farmasøytisk preparat omfattende et ikke-toksisk, inert, farmasøytisk aksepterbart vandigbærermedium hvori det er oppløst en biologisk aktiv, selektivt konjugert tumornekrosefaktor TNF, karakterisert ved at TNF kovalent er konjugert til en vannoppløselig polymer valgt blant polyetylenglykolpolymerer og polyoksyetylerte polyoler, og at polyetylenglykolpolymeren er usubstituert eller substituert i en ende med en alkylgruppe og atpolyolen er usubstituert.

2. Preparat iføgle krav 1, karakterisert ved at polymeren er en homopolymer og har en molekylvekt på ca.

300 til 100.000.

3. Preparat ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at polymeren er konjugert til TNF via 4-hydroksy-3-nitrobenzensulfonatesteren eller N-hydroksysuksinimidesteren av en karboksylsyre av polymeren.

4 . Preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3, karakterisert ved at homopolymeren enten er en homopolymer valgt blant ikke-substituert polyetylenglykol eller monometylpolyetylenglykol, eller en polyoksyetylert glyserol, og at TNF er human rekombinant TNF eller et mutein derav.

5. Fremgangsmåte for fremstilling av et farmasøytisk preparat, karakterisert ved at den omfatter: a) fremstilling av en vannoppløselig polymer med minst én terminal reaktiv gruppe der polymeren er valgt blant poly etylenglykolpolymerer og polyoksyetylerte polyoler, at polyetylenglykolpolymeren er usubstituert eller substituert i en ende med en alkylgruppe og at polyolen er usubstituert; b) omsetning av biologisk aktiv tumornekrosefaktor TNF med den reaktive gruppe i polymeren for å tilveiebringe et biologisk aktivt, selektivt konjugert TNF, og c) å formulere dette TNF i et ikke-toksisk, inert, farmasøytisk aksepterbart vandig bærermedium.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at polymeren har en molekylvekt på ca. 300 til 100.000 og at nevnte TNF formuleres ved pH 6-8.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 5 edller 6, karakterisert ved at trinn (a) omfatter å omsette polymeren med et syreanhydrid for derved å danne en karboksyl syre, og å omsette karboksylsyren med en forbindelse istand til å reagere med syren for derved å danne den aktiverte polymer med en reaktiv estergruppe.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at syreanhydridet er glutarsyreanhydrid og at forbindelsen som er istand til å reagere med syren i nærvær av et karbodiimid er N-hydroksysuksinimid eller 4-hydroksy-3-nitrobenzensulfonsyre.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at den reaktive gruppe reagerer med en lysinrest på nevnte TNF og at trinn (b) gjennomføres ved én pH-verdi på ca. 8-10.

10. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 5-9, karakterisert ved at nevnte TNF er humanre-kombinant TNF eller et mutein derav, og at polymeren enten er en homopolymer valgt blant usubstituerte polyetylenglykol eller monometylpolyetylenglykol, elelr en polyoksyetylert glyserol.