DE3936777A1 - Quervernetzte tumor-nekrose-faktoren - Google Patents

Quervernetzte tumor-nekrose-faktoren

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft quervernetzte Tumor-Nekrose-Faktoren, deren Herstellung sowie deren Verwendung zur Bekämpfung von Krankheiten.
Tumor-Nekrose-Faktor α (TNFα) ist ein bekanntes Protein, welches in vielen biologischen Vorgängen eine Rolle spielt (Proc. Natl. Acad. Sci USA 72, 3666 (1975), Ann. Rev. Biochem. 57, 505 (1988)). Ähnliches gilt für das strukturell sehr ähnliche Lymphotoxin (TNFβ) (Nature 312, 721 (1984)).
Die räumliche Struktur von TNFα ist bekannt (Nature 338, 225 (1989)). Danach ist TNFα ein aus drei identischen Untereinheiten symmetrisch auf­ gebautes Protein. Dieses Trimere ist die biologisch aktive Form des TNFα (J. Biol. Chem. 262, 6951 (1987)).
Entsprechendes gilt für den TNFß.
Es ist weiter bekannt, daß man Proteine mit einer Reihe von Reagentien, die mit Aminogruppen, Sulfhydrylgruppen oder aromatischen Gruppen der Protein kovalente Bindungen eingehen können, vernetzen kann (Tac H. Ji "Bifunctional Reagents" in Methods Enzymol. 91, Academic Press 1983 New York, Seiten 580-612). Hierbei entstehen jedoch wenig definierte Substanzgemische.
Es wurde nun gefunden, daß man durch Einhaltung bestimmter Reaktions­ bedingungen molekular einheitliche vernetzte TNF-Derivate erhält, die gegenüber dem unveränderten TNF verbesserte Eigenschaften besitzen.
Gegenstand der Erfindung sind kovalent vernetzte Derivate des Tumor-Nekrose-Faktors, dadurch gekennzeichnet,
  • - daß sie durch Reaktion des Tumor-Nekrose-Faktors mit aminogruppen­ wirksamen multifunktionellen Vernetzungsmolekülen hergestellt sind
  • - daß sie die drei gleichen Untereinheiten des Tumar-Nekrose-Faktors zu einem Molekül verknüpft enthalten
  • - daß sie chemisch definierte und weitgehend homogene Produkte dar­ stellen.
Unter dem Begriff "Tumor-Nekrose-Faktoren" sind TNFα, TNFβ sowie Derivate dieser beiden Substanzen zu verstehen, die sich von diesen durch Aus­ tausch, Deletion oder Addition einer oder mehrerer Aminosäuren unter­ scheiden, ohne daß sich die cytotoxischen Eigenschaften wesentlich ver­ schlechtern. Bevorzugt sind Derivate des TNFα.
Die einzelnen Tumor-Nekrose-Faktor-Ketten sind im N-terminalen Bereich miteinander vernetzt. Bevorzugt ist dabei die Verknüpfung zwischen der Aminogruppe der N-terminalen Aminosäure der 1. Kette der Aminogruppe am nächsten stehenden Lysinrest der 2. Kette von N-Terminus aus betrachtet (z. B. Lys11 bei TNFα).
Analog sind auch die Verknüpfungen zwischen der 2. und 3. Kette sowie der 3. und 1. Kette.
In der Regel sind jeweils alle drei Ketten miteinander vernetzt.
Die quervernetzten Tumor-Nekrose-Faktoren werden hergestellt, indem man den Tumor-Nekrose-Faktor mit einem Verknüpfungsreagenz umsetzt.
Als Verknüpfungsreagentien eignen sich Verbindungen, die als Quervernetzer eingesetzt werden können und die Querverbindungen mit einer Kettenlänge von 2 bis 10 Brückenatomen bilden.
Als solche sind zu nennen: Dimethyladipinimidate × 2 HCl (DMA), Dimethyl­ pimelinidate × 2 HCl (DMP), Dimethylsuberimidate × 2 HCl (DMS), Dimethyl­ -3,3′-dithiobispropionimidate × 2 HCl (DTBP), Disuccinimidylsuberate (DSS), Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS), Dithiobis(succinimidylpropionate (DSP), 3,3′-Dithiobis(sulfosuccinimidylpropionate) (DTSSP), Ethylenglycol­ bis(succinimidylsuccinale) (EGS), Ethylenglycolbis(sulfosuccinimidyl­ succinate) (Sulfo-EGS), Disuccinimidyltartrat (DST), Disulfosuccinimidyl­ tratrat (Sulfo-DST), Bis(2-(succinimidooxycarbonyloxy)ethyl)sulfon (BSOCOES), Bis(2-(sulfosuccinimidooxycarbonyloxy)ethyl)sulfon (Sulfo-BSOCOES) und 4,4′-Diisothiocyano-2,2′-disulfonicacidstilbene (DIDS). Nähere Angaben zu diesen Reagentien finden sich im "Handbook and General Catalog" der Firme Pierce (1989) auf den Seiten 286-295.
Besonders geeignet für die Verkettung der Tumor-Nekrose-Faktor-Moleküle sind eine Glutardialdehydlösung und eine BS-Lösung.
Die Verkettung wird in einem Puffer bei einem pH-Wert von 7-11, vorzugs­ weise 8-9, vorgenommen. Als Puffer eignen sich alle üblichen Puffer, die keine Aminogruppe enthalten. Die Puffer sind in der Regel 0,001-1molar, vorzugsweise 0,02 bis 0,1molar.
Die Konzentration an Tumor-Nekrose-Faktor im Umsetzungsgemisch liegt bei 0,01 bis 10, vorzugsweise 0,4 bis 0,6 mg/ml. Der Verknüpfungsreagenz wird im Überschuß verwendet. Normal beträgt die Menge 0,01-1 mg/ml, vorzugs­ weise 0,05-0,1 mg/ml.
Die Reaktionszeit liegt zwischen 10 min und 24 h, in der Regel zwischen 30 min und 5 h. Die Reaktionstemperatur liegt zwischen 4 und 50°C, vor­ zugsweise bei Raumtemperatur.
Es empfiehlt sich, die Umsetzung in Gegenwart eines Detergenz durchzu­ führen. Als Detergentien eignen sich alle üblichen, wie z. B. ®Tween 80, ®Triton usw. Die Menge liegt bei 0,001 bis 0,1%, vorzugsweise etwa 0,05%.
Nach Ende der Umsetzung wird überschüssiges Verknüpfungsreagenz mit einem Amin, vorzugsweise Ethanolamin, zerstört.
Die neuen Verbindungen lassen sich gegen Krebserkrankungen einsetzen und zeichnen sich dabei durch eine hohe Cytotoxizität und eine günstige Halbwertszeit aus. Sie eignen sich auch zur Behandlung von Ascites.
Beispiel 1 Umsetzung von TNFα mit Glutardialdehyd (GDA)
1400 ml einer 0,5 mg/ml TNFα enthaltenden wäßrigen Pufferlösung (50 mM Natriumphosphat, pH 8,5) wurden 10 min im Vakuum entgast und anschließend mit Argon begast. Zu der so erhaltenen Lösung wurden unter Rühren bei Raumtemperatur in einer Argon-Atmosphäre 40,8 µl 25%ige Glutardialde­ hydlösung gegeben und der Reaktionsansatz 3 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde überschüssiger Glutardialdehyd durch Zugabe von 50 µl Ethanolamin inaktiviert und 1 h bei Raumtemperatur nachgerührt. Der Reaktionsansatz wurde danach mit 10%iger Essigsäure auf pH 4,5 ein­ gestellt.
Die Reinigung des entstandenen Produkts (TNFα-GDA) erfolgte durch Chromatographie an S-Sepharose® (Fa. Pharmacia). Dazu wurde eine mit S-Sepharose® gefüllte Säule (⌀=5 cm, l=5 cm) mit 300 ml 20 mM Natrium­ acetatpuffer pH 4,75 äquilibriert. Nach Auftragen des Reaktionsansatzes wurde mit weiteren 400 ml des Äquilibrierpuffers nachgewaschen. Das Reaktionsprodukt (TNFα-GDA) wurde durch Elution der Säule mit 75 ml eines 20 mM Natriumphosphatpuffers pH 8,0 gewonnen.
Beispiel 2 Charakterisierung des Reaktionsproduktes TNFα-GDA aus Beispiel 1 a) Proteinkonzentration
Die Proteinkonzentration des Produkts aus Beispiel 1 wurde nach der Methode von Lowry (D.H. Lowry et al., J. Biol. Chem., 193, 265-275 (1951)) zu 0,98 mg gegen BSA als Standard bestimmt.
b) SDS-Polyacrylamidgelektrophorese (SDS-PAGE)
In einer 15%igen SDS-PAGE wurde das Molekulargewicht des Reaktions­ produkts im Vergleich mit Standardproteinen bestimmt. Das Hauptprodukt hat ein Molekulargewicht von ca. 52 KD, was einem vernetzten trimeren TNF entspricht.
c) Vergleichendes Peptide-mapping
TNFα und TNFα-GDA wurden unter exakt gleichen Bedingungen mit Pepsin bei pH 2,0 in Phosphatpuffer (Substrat-Enzym-Gewichtsverhältnis 20 : 1) 24 h bei 37°C proteolysiert.
Die entstehenden Gemische wurden über eine RP-Vydac C18-Säule mit einem Gradienten von 0,1% TFA in H2O nach 0,1% TFA in Acetolnitril vergleichend durch HPLC analysiert (UV-Detektion bei 210 nm).
Der Vergleich der beiden Chromatogramme (Fig. 1) zeigte die durch die Vernetzung veränderten Peptide an. Die Peptidmuster sind nahezu identisch bis auf die Peptide (1) und (2), die nach der Vernetzungs­ reaktion in b fehlen.
Aus der Primärstruktur dieser Peptide läßt sich die Verknüpfung der TNF-Peptidketten wie folgt ableiten:
NH2-Val1 (1. Kette)-GDA-NH2-Lys11 (2. Kette),
NH2-Val1 (2. Kette)-GDA-NH2-Lys11 (3. Kette),
NH2-Val1 (3. Kette)-GDA-NH2-Lys11 (1. Kette).
Beispiel 3 Selektive Vernetzung von Δ25-Lymphtoxin (Δ25-TNF-β) mit Glutardialdehyd
Δ25-Lymphotoxin ist ein Mutein des Lymphotoxins, in dem N-terminal die ersten 25 Aminosäuren fehlen.
15 mg Δ25-Lymphotoxin gelöst in 140 mM NaCl, 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 8,5 wurden unter Vakuum entgast und anschließend mit Argon begast. Zu dieser Lösung werden unter Rühren 1 ml 25%ige Glutardialdehydlösung gegeben und 3 h gerührt.
Überschüssiges Glutardialdehyd wurde durch Zugabe von 1,2µl Ethanolamin und 1 h Nachrühren inaktiviert.
Beispiel 4 Selektive Vernetzung des TNF α-Muteins, MurT3-TNF, mit Glutardialdehyd
MurT3-TNF ist ein Mutein des TNFα, bei dem folgende Aminosäurereste ausgetauscht sind: Asn30→Ser, Arg31→Gln, Ile136→Leu, Asp140→Lys. 5 mg MurT3-TNF gelöst in 140 mM NaCl, 20 mM Natriumphosphatpuffer werden analog Beispiel A mit Glutardialdehyd umgesetzt.
Beispiel 5 Selektive Vernetzung von TNFα mit Bis(sulfosuccinimidyl)suberat (BS)
1 mg TNFα, gelöst in 1,5 ml 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 8,5 werden mit 96 µl einer 10 mg/ml-Lösung von BS (Fa. Piera) in demselben Puffer ver­ setzt und die Reaktionslösung 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird mit 50 µl einer 1%igen Ethanolaminlösung versetzt und 1 h bei Raumtemperatur stehen gelassen.
Das Reaktionsprodukt, kovalent vernetzter trimerer TNFα, kann durch SDS-Polyacrylamidgelektrophorese bei ∼ 52 000 Dalton in der Färbung mit Comassie-blau sichtbar gemacht werden. Fig. 2 zeigt das Ergebnis der Elektrophorese. Die Spur 1 zeigt die Auftrennung eines Proteingemischs, das als Molekulargewichtsstandard dient. Die Spur zeigt das Verhalten des Reaktionsprodukts.

Claims (5)

1. Kovalent vernetzte Derivate des Tumor-Nekrose-Faktors, dadurch gekennzeichnet,
  • - daß sie durch Reaktion des Tumor-Nekrose-Faktors mit aminogruppenwirksamen multifunktionellen Vernetzungsmolekülen hergestellt sind
  • - daß sie die drei gleichen Untereinheiten des Tumor-Nekrose-Faktors zu einem Molekül verknüpft enthalten
  • - daß sie chemisch definierte und weitgehend homogene Produkte darstellen.
2. Kovalent vernetzte Derivate des Tumor-Nekrose-Faktors β gemäß Anspruch 1.
3. Kovalent vernetzte Derivate des Tumor-Nekrose-Faktors β gemäß Anspruch 1.
4. Kovalent vernetzte Derivate von Muteinen des Tumor-Nekrose-Faktors α bzw. β gemäß Anspruch 1.
5. Kovalent vernetzte Derivate von Tumor-Nekrose-Faktor α und β und deren Muteinen zur Verwendung bei der Bekämpfung von Krankheiten.
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