DE69836222T2

DE69836222T2 - Modifizierter tumor-nekrosefaktor

Info

Publication number: DE69836222T2
Application number: DE69836222T
Authority: DE
Inventors: A. Mike Lexington CLARK
Original assignee: Phoenix Pharmacologics Inc
Current assignee: Polaris Group Taiwan
Priority date: 1997-01-15
Filing date: 1998-01-15
Publication date: 2007-11-15
Anticipated expiration: 2018-01-16
Also published as: CN1243444A; ES2275300T3; AU725133B2; US7785579B2; EP1007082A1; JP4295831B2; CA2277757C; US20060222626A1; WO1998031383A1; EP1007082B1; DE69836222D1; CN1168495C; CA2277757A1; AU6241098A; EP1007082A4; DK1007082T3; JP2001511784A; ATE342729T1

Description

Die Erfindung betrifft inter alia einen mit Polyethylenglycol modifizierten Tumor-Nekrosefaktor mit einem Molekulargewicht im Bereich von 20.000 bis 40.000 und die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge des modifizierten TNF zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Tumoren.
Malignes Melanom (Stadium 3) ist eine tödliche Krankheit, die die meisten Patienten innerhalb von einem Jahr nach Diagnose tötet. Die Melanom-Inzidenz nimmtsteigt in den USA schnell zu und ist in anderen Ländern, wie Australien, sogar noch höher. Wirksame Behandlungen für Patienten, die an Melanom leiden, werden dringend benötigt.
Nierenkrebs tötet derzeit jedes Jahr in den USA ungefähr 13.000 Individuen. Diese Form von Krebs wird häufig erst entdeckt, wenn sie weit fortgeschritten ist. Die einzige Form der Behandlung, die die Prognose eines Patienten signifikant beeinflusst, ist die operative Resektion des befallenen Organs. Da dieser Typ von Krebs sehr stark metastasierend ist, ist die vollständige Entfernung sämtliche Metastasen leider schwer, wenn nicht sogar unmöglich.
Darmkrebs ist eine der häufigsten Formen von Krebs und tötet derzeit jedes Jahr in den USA ungefähr 140.000 Individuen. Obwohl eine große Anzahl von traditionellen chemotherapeutischen Arzneimitteln, die zur Behandlung dieser Krankheit entwickelt wurden, vorhanden ist, hat sich das Langzeitüberleben (definiert als der Prozentsatz von Patienten, die fünf Jahre oder länger überleben) in den letzten vier Jahrzehnten nicht signifikant verändert. Außerdem sind alle traditionell entwickelten chemotherapeutischen Arzneimittel stark toxisch, weisen schädliche und oft tödliche Nebenwirkungen auf und sind teuer. Eine kurative nichttoxische Behandlung für diese Krankheit wird dringend benötigt.
Ein Kennzeichen von Melanomen, Nieren- und Darmtumoren besteht darin, dass diese Tumore gegen traditionelle Chemotherapien schnell Resistenz entwickeln. Obwohl Pa tienten anfangs auf die chemotherapeutische Behandlung ansprechen können, entwickeln sich die arzneimittelresistenten Tumore schnell und töten schließlich den Patienten. Ein alternativer Weg zur Behandlung dieser Tumore bestünde in der Identifizierung einer "Achilles-Ferse" in den Tumoren und in der Entwicklung von Therapien, die dieses Ziel selektiv behandeln würden. Ein solches potentielles Ziel wurde bereits identifiziert. Insbesondere wurde festgestellt, dass alle drei dieser Typen von Tumoren jeweils eine ausgiebige Vaskularisation der Metastasen erfordern, damit die Krebse wachsen. Darum würde man vorhersagen, dass ein therapeutisches Mittel, das die Vaskularisation dieser Tumore hemmt, ein hervorragendes Mittel zur Behandlung dieser Tumore bereitstellen würde.
Der Tumor-Nekrosefaktor (TNF) ist eines von vielen Zytokinen, die eine Gruppe verschiedener, von Leukozyten und verwandten Zellen produzierter Proteine mit immunstimulierender Aktivität darstellen. TNF wurde ursprünglich aufgrund seiner Fähigkeit benannt, Tumornekrose auszulösen. Es gibt mindestens zwei verschiedene Mechanismen, von denen angenommen wird, dass TNF durch sie Tumore abtötet. Der erste besteht in einer direkten Wirkung auf den Tumor selbst. Alternativ kann TNF selektiv die Vaskularisation von Tumoren unterbinden. In einem frühen Manuskript, das TNF beschreibt, berichteten Carswell und Old, dass die METH-A-Tumorzellen in vitro gegen TNF vollständig resistent waren. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72: 3666–3670 (1975). Allerdings waren METH-A-Tumore in Mäusen gegenüber TNF in vivo äußerst empfindlich. Es wurde angenommen, dass dies darauf beruht, dass TNF die Vaskularisation dieser Tumore selektiv unterbindet. Später wurde gezeigt, dass von einigen Tumoren ein bisher unidentifizierter Faktor freigesetzt wird, der die normalen Gefäß-Endothelzellen in unmittelbarer Nähe zu ihnen gegenüber dem TNF-Abtöten empfindlich macht. Kurz gesagt, tötet TNF diese Tumore nicht durch direktes Abtöten der Tumorzellen, sondern durch Abtöten der normalen Gefäß-Endothelzellen, die die Blutgefäße auskleiden, die den Tumor mit Blut, Sauerstoff und anderen Nährstoffen, die zum Leben und Wachsen notwendig sind, versorgen.
Leider versuchten frühe klinische Studien, TNF als direktes tumorizides Mittel zu entwickeln. Bei Anwendung auf diese Weise mussten hohe Dosen von TNF injiziert werden, da es schnell (in weniger als 20 Minuten) aus Zirkulation verschwindet. Außerdem lösten diese hohen Dosen von TNF "Schock"-artige Symptome auf, die durch einen star ken Abfall im Blutdruck gekennzeichnet waren. Ein alternativer Weg der Verwendung von TNF bestünde in der Formulierung, derart, dass es in der Zirkulation verbleibt. Dadurch hätte TNF mehr Zeit zur Wechselwirkung mit der Vaskulatur des Tumors und ausreichend Zeit, die Blutzufuhr zu dem Tumor zu unterbinden.
Mehrere andere therapeutische Proteine wurden bereits mit Polyethylenglycol (PEG) formuliert, sodass sie länger zirkulieren und in der Vaskulatur verbleiben. Diese Proteine umfassen Asparaginase, Adenosindeaminase und Superoxiddismutase. Siehe beispielsweise Harras J.M. in "Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biochemical Applications", Plenum Press (1992). Eine Gruppe von japanischen Forschern hat bereits berichtet, dass TNF mit bestimmtem PEG formuliert werden könnte und dass das resultierende Material eine wesentlich verbesserte zirkulierende Halbwertszeit und eine größere Antitumoraktivität hatte. Tsutsumi Y. et al., Jap. J. Cancer Res., 85:9–12 (1994); Tsutsumi Y. et al., Jap. J. Cancer Res., 85:1185–1188 (1994); Tsutsumi Y. et al., Jap. J. Cancer Res., 87: 1078–1085 (1997). Diese Forscher verwendeten nur PEG mit einem Molekulargewicht von 5.000, das über einen Succinimidylsuccinatlinker (-binder) an primäre Amine am TNF gekoppelt war.
Es wurde nun überraschend gefunden, dass das Modifizieren von TNF mit Polyethylenglycol (PEG) mit einer Molekülmasse mit einer ungefähren durchschnittlichen Masse im Bereich von 20.000 bis 40.000, vorzugsweise im Bereich von 20.000 bis 30.000, die zirkulierende Halbwertszeit des TNF wesentlich erhöht und auch die tumorizide Aktivität des TNF verbessert. Beispielsweise wurde die Serum-Halbwertszeit von TNF durch eine solche Modifikation von so wenig wie 20 Minuten auf bis zu 15 Tagen erhöht, und die Antitumor-ED50 wurde von so viel wie 1.000 bis 3.000 IU bis auf so wenig wie 10 bis 50 IU herabgesetzt. Als Ergebnis der Modifikation können geringere Dosen des TNF verabreicht werden, um Tumore wirksam, mit weniger begleitenden nachteiligen Nebenwirkungen für den Patienten zu behandeln.
Die Erfindung betrifft darum den modifizierten TNF, wobei die Modifikation das kovalente Binden an den TNF, entweder direkt oder über ein biokompatibles Verknüpfungsmittel, von einem oder mehreren PEG-Molekülen mit einer Molekülmasse mit einer ungefähren durchschnittlichen Masse im Bereich von 20.000 bis 40.000 umfasst. Der TNF wird mit fünf bis zwölf der PEG-Moleküle, vorzugsweise mit etwa fünf bis neun PEG-Molekülen, modifiziert.
Die Erfindung betrifft auch eine Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge des modifizierten TNF zur Zubereitung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung eines an einem Tumor leidenden Patienten.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Erhöhung der zirkulierenden Halbwertszeit von TNF, das die Modifizierung des TNF durch kovalente Bindung an zwischen etwa fünf und zwölf PEG-Moleküle umfasst, die eine Molekülmasse mit einer ungefähren durchschnittlichen Masse im Bereich von 20.000 und 40.000 aufweisen.
1 ist ein Graph, der die zirkulierende Halbwertszeit in Maus-Serum von nativem TNF-α (nicht ausgefüllte Kreise), SS 5.000 MW PEG-TNF-α (ausgefüllte Kreise) und von 20.000 MW PEG-TNF-α (nicht ausgefüllte Dreiecke) beschreibt.
2 ist ein Graph, der die zirkulierende Halbwertszeit in Maus-Serum von nativem TNF-α (nicht ausgefüllte Kreise), SS 5.000 MW PEG-TNF-α (ausgefüllte Kreise), SS 12.000 MW PEG-TNF-α (ausgefüllte Dreiecke), SS-20.000 MW PEG-TNF-α (nicht ausgefüllte Dreiecke), NHS 12.000 MW PEG-TNF-α (ausgefüllte Quadrate) und NHS 20.000 MW PEG-TNF-α (ausgefüllte Quadrate) beschreibt.
"Tumor-Nekrosefaktor" oder "TNF", wie hier verwendet, umfasst entweder natürliches Protein, wie isoliertes Human- oder Maus-TNF-Protein, oder Protein, das unter Verwendung von Rekombinationstechnik hergestellt wurde, wie rekombinanter muriner TNF und rekombinanter humaner TNF. Obwohl das TNF-α-Protein bevorzugt wird, umfasst der Begriff "TNF" auch TNF-β-Protein. Die Begriffe umfassen auch TNF-Proteine, die durch Deletion oder Veränderung von Aminosäuren mutiert wurden, ohne die biologische Aktivität signifikant zu beeinträchtigen (z. B. werden als nicht einschränkende Beispiele die Aminosäuren 212–220 deletiert oder Lysin bei 248, 592, 508 zu Alanin verändert).
"Polyethylenglycol" oder "PEG" bezieht sich auf Gemische von Kondensationspolymeren von Ethylenoxid und Wasser in einer verzweigten oder geraden Kette, die durch die allgemeine Formel H(OCH₂CH₂)_nOH dargestellt ist. "Polyethylenglycol" oder "PEG" wird in Kombination mit einem numerischen Suffix verwendet, um die Molekülmasse mit einer ungefähren durchschnittlichen Masse davon anzugeben. Beispielsweise bezieht sich PEG 5.000 auf Polyethylenglycol mit einer Molekülmasse mit einer ungefähren durchschnittlichen Masse von etwa 5.000; PEG 12.000 bezieht sich auf Polyethylenglycol mit einer Molekülmasse mit einer ungefähren durchschnittlichen Masse von etwa 12.000; und PEG 20.000 bezieht sich auf Polyethylenglycol mit einer Molekülmasse mit einer ungefähren durchschnittlichen Masse von etwa 20.000. Solche Polyethylenglycole sind aus mehreren kommerziellen Quellen erhältlich und werden routinemäßig, wie vorstehend angegeben, durch ihre Molekülmasse mit einer durchschnittlichen Masse bezeichnet.
"Melanom" kann ein maligner oder benigner Tumor sein, der aus dem melanozytischen System der Haut oder anderer Organe entsteht, einschließlich Mundhöhle, Ösophagus, Analkanal, Vagina, Leptomeninx und/oder Augen-Bindehäute. Der Begriff "Melanom" umfasst beispielsweise das akral-lentiginöse Melanom, das amelanotische Melanom, das benigne juvenile Melanom, das Lentigo-maligna-Melanom, das maligne Melanom, das noduläre Melanom, das subunguale Melanom und das sich oberflächlich ausbreitende Melanom.
"Patient" bezieht sich auf ein Tier, vorzugsweise einen Säuger, stärker bevorzugt auf einen Menschen.
"Biokompatibel" bezieht sich auf Materialien oder Verbindungen, die im Allgemeinen für die biologischen Funktionen nicht schädlich sind, und die nicht zu einem unakzeptablen Toxizitätsgrad, einschließlich allergener Zustände und Krankheitszustände, führen.
"Zirkulierende Halbwertszeit" bezieht sich auf die Zeitdauer nach Injektion des modifizierten TNF-α bei einem Patienten, bis eine Menge des TNF durch Clearance auf Spiegel von der Hälfte des ursprünglichen Peak-Serumspiegels entfernt wurde. Die zirkulierende Halbwertszeit kann in jeder relevanten Spezies, einschließlich Menschen oder Mäuse, bestimmt werden.
"Kovalent gebunden" wie hier verwendet, bezieht sich auf eine kovalente Bindung, die das TNF-Protein mit dem PEG-Molekül entweder direkt oder über einen Linker (Binder) verknüpft.
Erfindungsgemäß ist TNF mit Polyethylenglycol mit einer Molekülmasse mit einer ungefähren durchschnittlichen Masse im Bereich von 20.000 bis 40.000, vorzugsweise im Bereich von 20.000 bis 30.000, verknüpft. Im Allgemeinen ist Polyethylenglycol mit einer Molekülmasse mit einer ungefähren durchschnittlichen Masse von 30.000 oder mehr schwer aufzulösen, und die Ausbeuten des formulierten Produkts sind im Allgemeinen reduziert. Das Polyethylenglycol kann verzweigt oder geradkettig sein, ist allerdings vorzugsweise geradkettig.
Die Polyethylenglycole können über biokompatible Verknüpfungsgruppen an den TNF gebunden sein. Wie hier wie vorstehend besprochen, bedeutet "biokompatibel", dass die Verbindung oder Gruppe nicht toxisch ist und in vitro oder in vivo verwendet werden kann, ohne dass Verletzung, Krankheit, Erkrankung oder Tod hervorgerufen wird. PEG kann an die Verknüpfungsgruppe beispielsweise über eine Etherbindung, eine Esterbindung, eine Thiolbindung oder eine Amidbindung gebunden sein. Geeignete biokompatible Verknüpfungsgruppen umfassen beispielsweise eine Estergruppe, eine Amidgruppe, eine Imidgruppe, ein Carbamatgruppe, eine Carboxylgruppe, eine Hydroxylgruppe, ein Kohlenhydrat, eine Maleimidgruppe (einschließlich beispielsweise Succinimidylsuccinat (SS), Succinimidylpropionat (SPA), Succinimidylcarboxymethylat (SCM), Succinimidylsuccinamid (SSA) oder N-Hydroxysuccinimid (NHS), eine Epoxidgruppe, eine Oxycarbonylimidazolgruppe (einschließlich beispielsweise Nitrophenylcarbonat (NPC) oder Trichlorphenylcarbonat (TPC)), eine Trisylatgruppe, eine Aldehydgruppe, eine Isocyanatgruppe, eine Vinylsulfongruppe, eine Tyrosingruppe, eine Cysteingruppe, eine Histidingruppe oder ein primäres Amin. Vorzugsweise ist die biokompatible Verknüpfungsgruppe eine Estergruppe und/oder eine Maleimidgruppe und bindet das TNF-Protein über ein primäres Amin an den TNF. Stärker bevorzugt ist die Verknüpfungsgruppe SS, SPA, SCM, SSA oder NHS; wobei SS besonders bevorzugt ist.
Alternativ kann der TNF direkt (das heißt ohne eine Verknüpfungsgruppe) über eine Aminogruppe, eine Sulfhydrylgruppe, eine Hydroxylgruppe oder eine Carboxylgruppe an PEG gekoppelt sein.
Verfahren zum kovalenten Binden von TNF an PEG, direkt oder über eine biokompatible Verknüpfungsgruppe, sind aus der Technik bekannt, wie beispielsweise bei Harras J.M. in "Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biochemical Applications", Plenum Press (1992) beschrieben, wovon die Offenbarung hier durch Bezugnahme mit eingeschlossen ist. Es ist bevorzugt, dass das TNF-Protein an fünf bis zwölf PEG-Moleküle kovalent gebunden ist. Verfahren zur Bestimmung der Anzahl von an das Protein gebundenen PEG-Molekülen sind aus der Technik bekannt, beispielsweise Habeeb A.F.S.A., Anal. Biochem., 14: 328–339 (1966); Harras J.M., supra., hier durch Bezugnahme eingeschlossen. Die Anzahl von an TNF gebundenen PEG-Molekülen variiert je nach verwendeter Verknüpfungsgruppe, Reaktionsdauer und Molverhältnissen von TNF und PEG, die bei der Umsetzung eingesetzt werden.
Ein Fachmann erkennt, dass der erfindungsgemäß modifizierte TNF auf eine Anzahl von Wegen verabreicht werden kann, beispielsweise oral, intranasal, intraperitoneal, parenteral, intravenös, intralymphatikal, intratumoral, intramuskulär, interstitiell, intraarteriell, subkutan, intraokular, intrasynovial, transepithelial und transdermal. Eine therapeutisch wirksame Menge einer der modifizierten erfindungsgemäßen Verbindungen ist eine Menge, die zur Hemmung des Tumorwachstums wirksam ist, und diese Menge kann je nach Verabreichungsverfahren variieren. Im Allgemeinen sollten wirksame Dosen im Bereich von etwa 0,001 bis 0,1 mg/kg einmal wöchentlich liegen. Der modifizierte TNF kann mit pharmazeutisch verträglichen Trägern und Verdünnungsmitteln, wie aus der Technik bekannt, formuliert werden. Beispielsweise kann der modifizierte TNF zur intravenösen Verabreichung mit einer Phosphat-gepufferten Salzlösung oder jeder anderen geeigneten, den Fachleuten bekannten Lösung vor der Injektion gemischt werden. Tests haben gezeigt, dass der modifizierte TNF bei der Behandlung von Melanom, Darmkrebs-, Nierenkrebs- und Brustkrebstumoren besonders wirksam ist.
Die Erfindung wird weiterhin in den folgenden Beispielen erläutert, die zu Erläuterungszwecken und nicht zur Einschränkung des Umfangs der vorliegenden Erfindung gedacht sind.
TNF, der in den nachstehend beschriebenen Experimenten verwendet wird, stammte von der Maus und vom Menschen. Der humane TNF (gesamtes Protein) wurde in E. coli produziert, und der murine TNF ebenso wie humane TNF-Mutanten wurden in Pichea pastoris produziert. Rekombinanter TNF wurde in E. coli oder Pichea unter Anwendung von Verfahren entsprechend denjenigen, die bei Pennica D. et al., Nature, 312: 724–729 (1981); Streekishna K. et al., Biochemistry, 28: 4117–4125 (1989) beschrieben sind, produziert. Der Maus-TNF wurde in E. coli und Pichea produziert.
Beispiel 1
Spezifische Aktivität von TNF-α
Vor der Pegylierung wurde der reife Gewebe-Nekrosefaktor (TNF-α) (humane Rekombinante) unter Verwendung eines 1929 Zytotoxizitätstests, wie nachstehend beschrieben, getestet. Die spezifische Aktivität des TNF-α betrug 10⁶ I.U. Units pro Milligramm. Die Densitometrie eines SDS-PAGE-Gels zeigte, dass das Material zu 99 % rein war.
Das Material (1 ml bei 16,8 mg/ml, bestimmt durch das Verfahren von Bradford M.M., Anal. Biochem., 72: 248–254 (1976) mit einem Rinderserumalbumin-(BSA)-Standard, Modifikation nach Peterson) wurde unter Verwendung eines 3.000 kDa Ausschluss-Centricon auf ungefähr 0,1 ml konzentriert. Dieses Material wurde anschließend mit 100 mM Phosphatpuffer, pH 8,0 auf 4 ml verdünnt und auf 0,1 ml rekonzentriert. Diese Verfahrensweise wurde zweimal wiederholt, und das resultierende Material wurde schließlich in einem Gesamtvolumen von 1 ml des gleichen Puffers gesammelt.
Anschließend wurde die Proteinkonzentration durch das Verfahren von Bradford, vorstehend, bestimmt. BSA wurde als Standard verwendet, und es wurden etwa 0,6 mg Protein gewonnen.
Pegylierung
Die PEGylierungsreaktionen wurden unter Verwendung der allgemeinen bei Harras J.M., vorstehend zitiert, beschriebenen Verfahren durchgeführt. Zu TNF (1 mg/ml in 100 mm Phosphatpuffer, pH 7,2–7,5) wurde das SS-PEG oder NHS-PEG? in einem 10- bis 50-fachen molaren Überschuss zugesetzt und 1 Stunde bei Raumtemperatur gemischt. Der spezifische pH-Wert und das spezifische verwendete Molverhältnis variierten je nach Reaktivität des PEG und mussten empirisch bestimmt werden. Der PEG-TNF wurde von nicht umgesetztem PEG und von TNF-α durch Ultrafiltration unter Verwendung eines 100 kDa Ausschlussfilters abgetrennt. Bei jeder der Modifikationen, auf die in diesem Beispiel Bezug genommen wurde, wurde der TNF mit fünf bis neun Molekülen PEG modifiziert.
Die Reinheit des PEG-TNF wurde durch SDS-PAGE bewertet, und der Prozentsatz an primären Aminen, die durch diese Verfahrensweise modifiziert wurden, wurde unter Verwendung von Flosecamin bestimmt, wie von S.J. Stocks (Anal. Biochem. 154: 232 (1986)) beschrieben. Die SDS-PAGE-Ergebnisse zeigten, dass nach der Pegylierung sehr wenig, falls überhaupt, nativer TNF-α in der Präparation zurückblieb.
In vitro Aktivierung des PEG-TNF-α
Der PEG-TNF-α wurde auf die zytotoxische in vitro Aktivität unter Verwendung des 1-929-Zytotoxizitätstests überprüft, der nach der nachstehend ausgeführten Verfahrensweise durchgeführt wurde, mit der Ausnahme, dass die Durchgangsanzahl der Zellen unbekannt war. Die spezifische Aktivität des TNF-α-Ausgangsmaterials betrug 1,5 × 10⁶ Einheiten/mg oder etwa die Hälfte der ursprünglichen spezifischen Aktivitätsmessung. Die Unterschiede in der spezifischen Aktivität wurden der Verwendung einer unterschiedlichen Proteinbestimmungsmethode und der unbekannten Durchgangsanzahl der Zellen zugeschrieben.
Die spezifische Aktivität des SS 5.000 MW PEG-TNF-α betrug 0,7 × 10⁶ Einheiten/mg oder etwa die Hälfte der spezifischen Aktivität des nativen Materials. Die spezifische Aktivität des SS-20.000 MW PEG-TNF-α betrug 0,8 × 10⁶ Einheiten/mg, ein Wert entsprechend dem SS 5.000 MW PEG-TNF-α.
Lethalität des PEG-TNF-α
Als Screening wurde zwei C57 b16 Mäusen (weiblich, 20–25 g) intraperitoneal (i.p.) entweder nativer TNF-α oder SS-PEG-TNF-α injiziert, und das Überleben der Tiere wurde dokumentiert. Die eingesetzten Dosen waren 1.000, 5.000 und 10.000 Aktivitätseinheiten.
Mit dem nativen TNF-α wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

10.000 I.U. – beide Mäuse waren am nächsten Morgen tot
5.000 I.U. – eine Maus war am nächsten Morgen tot; die zweite Maus in offensichtlichem Stress (Haare zerzaust und bewegungsarm) und nach 2 Tagen tot
1.000 I.U. – eine Maus war am nächsten Morgen tot; die zweite Maus unter Stress (Haare zerzaust und bewegungsarm) und nach 2 Tagen in einem solchen schlechten Zustand, dass sie getötet wurde

Mit dem SS-PEG-TNF-α blieben sämtliche Mäuse bei allen Dosen für die nächsten beiden Wochen nach der Injektion bei guter Gesundheit. Das Verhalten war normal ebenso wie Fressen und Trinken. Es bestand keine Veränderung in der Behaarung (das Fell war nicht zerzaust). Sämtliche Mäuse wurden 15 Tage nach der Injektion getötet.
Bestimmung der Serum-Halbwertszeit von PEG-TNF-α
Ein ELISA-Test auf humanes TNF, erhalten von Genzyme, wurde verwendet. Der Testsatz wurde wie vom Hersteller empfohlen eingesetzt. Den Mäusen wurde entweder TNF-α oder PEG-α (100 Einheiten) i.p. injiziert, und ungefähr 25 μl Serum wurden aus retroorbitalen Blutungen zu den in 1 angegebenen Zeiten gesammelt. Insgesamt befanden sich 5 Mäuse (weiblich, C57 b16 Mäuse, 20–25 g) in jeder Gruppe.
Der native TNF-α (nicht ausgefüllte Kreise) wurde sehr schnell ausgeschieden, und der einzige Datenpunkt oberhalb der Grundlinie war 30 Minuten nach Injektion.
Der SS 5.000 MW PEG-TNF-α (ausgefüllte Kreise) besaß eine Halbwertszeit von etwa 4 Tagen. Die Halbwertszeit von 20.000 MW PEG-TNF-α (nicht ausgefüllte Dreiecke) betrug > 15 Tage.
Dieses Experiment wurde unter Verwendung der vorstehend aufgeführten Behandlungsgruppen wiederholt, und die Ergebnisse wurden in 2 dargestellt: nativer TNF-α (nicht ausgefüllte Kreise); SS 5.000 MW PEG-TNF-α (ausgefüllte Dreiecke); SS 20.000 MW PEG-TNF-α (nicht ausgefüllte Dreiecke); NHS 12.000 MW PEG-TNF-α (ausgefüllte Quadrate). Die Serum-Halbwertszeit für die verschiedenen Behandlungsgruppen betrug > 15 Tage für NHS 20.000 MW PEG-TNF-α und für SS 20.000 MW PEG-TNF-α; ungefähr 4 Tage für SS 5.000 MW PEG-TNF-α; ungefähr 6 Tage für SS 12.000 MW PEG-TNF-α; ungefähr 8 Tage für NHS 12.000 MW PEG-TNF-α; und für den nativen TNF-α 30 Minuten nach Injektion. Zusammenfassend zeigte jeder PEG-TNF-α eine viel längere Halbwertszeit als der native TNF-α; allerdings besaßen der NHS 20.000 MW PEG-TNF-α und der SS 20.000 MW PEG-TNF-α wesentlich längere Halbwertszeiten (> 15 Tage) als der mit niedermolekularem PEG modifizierte TNF-α.
Antitumor-Aktivität des PEG-TNF-α
Das B16-Melanom-Modell wurde verwendet. C57 b16 Mäusen (weiblich, 20–25 g) wurden 1 Million B16-Zellen s.q. über die Flanke injiziert. Die Tumore wurden eine Woche lang vor Beginn der Behandlung wachsen gelassen. Jede Behandlungsgruppe bestand aus 5 Mäusen.
Die Behandlungsgruppen umfassten: Phosphatpufferkontrolle (pH 7,5), nativer TNF-α (10 I.U. und 100 I.U.) in Phosphatpuffer (pH 7,5) und SS-PEG-TNF-α (10 I.U., 100 I.U. und 1000 I.U.) in Phosphatpuffer (pH 7,5). Den Mäusen wurde 0,1 ml einmal wöchentlich am Tag 7, Tag 14 und Tag 21 i.p. injiziert. Das Überleben der Tiere wurde dokumentiert.
Nach Woche 2 (eine Woche nach der ersten Behandlung) waren die Tumore in den Kontrolltieren gut sichtbar. Keines der SS-PEG-TNF-α-behandelten Tiere schien anscheinend wachsende Tumore aufzuweisen.
Am Tag 22 wurden die in Tabelle 1 dargestellten Ergebnisse erhalten: Tabelle 1
Nach 180 Tagen wurden die in Tabelle 2 dargestellten Ergebnisse erhalten. Tabelle 2
Die Ergebnisse zeigen, dass die Modifikation von TNF mit PEG nicht nur die Lethalität des TNF reduziert, sondern dass der mit PEG modifizierte TNF mit einem Molekulargewicht von ungefähr 20.000 überraschend verbesserte zirkulierende Halbwertszeiten aufwies und eine überraschenderweise wesentlich verbesserte Antitumor-Aktivität aufwies.
Diese Ergebnisse sind aus einer Anzahl von Gründen überraschend. Es bestand keine Möglichkeit vorherzusagen, dass das Modifizieren von TNF mit hochmolekularem PEG die zirkulierende Halbwertszeit des TNF erhöhen würde. In der Tat kann die Clearance-Rate von Proteinen im Allgemeinen nicht auf der Grundlage ihres Molekulargewichts vorhergesagt werden. Dass die Modifikation von TNF mit hochmolekularem PEG die tumorizide Aktivität des TNF nicht nur vermindert, sondern in der Tat verstärkt, ist hinsichtlich der zusätzlichen sterischen Hinderung, die erwartungsgemäß aufgrund des hochmolekularen Modifizierers hervorgerufen wird, überraschend. Weiterhin würde noch vorhergesagt werden, dass der modifizierte TNF aufgrund seiner verbesserten zirkulierenden Halbwertszeit auch toxischer als der native TNF ist, was nicht der Fall war.
Das Folgende ist eine Beschreibung des in diesem Beispiel verwendeten Zytotoxizitätstests.
A. Materialien

L929-Fibroblasten, ATCC-Nr. CCL1 NCTC Klon 929.
Dulbecco's Modified Essential Medium (DM EM)
Fötales Rinderserum (GIBCO Laborstories, Grand Island, NY, Nr. 16000–010)
HEPES Puffer 1 M in Normaler Salzlösung (BioWhittaker, Inc., Nr. 17–737E)
Gentamicinsulfat (BioWhittaker, Inc., Nr. 17–518Z)
Trypsin-EDTA 1X (GIBCO Laborstories, Nr. 25300–021)
Trypsin Blue Stain (GIBCO Laborstories, Nr. 15250–012)
Gewebekulturflaschen 150 cm², 75 cm², 25 cm² (Corning, Inc., Corning, NY, Nr. 25120, Nr. 25110, Nr. 25100)
96-Well-Kulturplatten, flachbödig (Corning Inc., Nr. 25861)
12-Kanal-Pipettierer (Titertek)
Sterile Spitzen für Pipettierer (Intermountain Scientific Corp., Bountiful, UT, Nr. P3250-8)
Sterilreagensspeicher (Costar Corp., Cambridge, MA, Nr. 4870)
Rekombinanter Humaner Tumor-Nekrosefaktor-α (TNF-α) (im Haus hergestellt)
Rinderalbumin, 10% in IMEM (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN, Nr. 652237)
Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS)
Dulbecco's Phosphat-gepufferte Salzlösung (D PBS) (GIBCO Laborstories, Nr. 310-4190)
Mikrotiterplattenleser (Molecular Devices Corp., Menlo Park, CA, Emax)

B. Propagation von L929-Fibroblasten:

1. Erhalten der Fibroblasten durch zweimal wöchentliches Umsetzen in DMEM/10 % FBS wie folgt. Ansaugen des Mediums aus der Flasche, Belassen der anhaftenden Zellen. Waschen des Zell-Monolayers mit 5 ml Trypsin-EDTA und Absaugen des Trypsin-EDTA. 1 bis 2 Minuten Inkubieren bei 37 °C. Zugabe von 15 ml DMEM/FBS, um den Monolager abzuwaschen und die enzymatische Aktivität des Trypsins zu stoppen.
2. Zählen der Zellen und Bewertung der Lebensfähigkeit durch Trypan Blau Ausschluss. Überimpfen von 30 ml DMEM/FMS ohne Antibiotika in eine T75 Flasche mit 1 × 10⁶ Zellen. Inkubieren in einem mit 5 % CO₂ befeuchteten Inkubator bei 37 °C.
3. Für den Test: Überimpfen von 60 ml DMEM/FBS in eine T150-Flasche von 2 × 10⁶ Zellen. 3 bis 4 Tage Inkubieren der Flasche, bis sich die Zellen der Konfluenz nähern (80–90 %).

C. TNF-α in vitro Zytotoxizitätstest
Tag 1: Präparation der Zellen

1. Trypsinisieren der Zellen und Verdünnen mit DMEM/FBS bis zu einer Endkonzentration von 1,22 × 10⁶ Zellen/ml. Zusatz von Gentamicinsulfat bis auf eine Endkonzentration von 50 μg/ml. Eine Zellanzahl von 2 × 10⁶ Zellen ist für jede Platte erforderlich, und aus einer T150-Flasche können 1,75–2 × 10⁷ Zellen erwartet werden.
2. Ausstreichen der L929-Fibroblasten durch Zugabe von 150 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung einer flachbödigen 96-Well-Gewebekulturplatte. Inkubieren über Nacht bei 37 °C in einem mit 5 % CO₂ befeuchteten Inkubator.

Tag 2: Zugabe der Proben

1. Unter Verwendung eines Invertmikroskops wurde die Konfluenz von jeder Vertiefung vor dem Fortfahren überprüft. Jede Vertiefung muss gleichwertig konfluent sein, damit der Test reproduzierbar ist. Die äußeren Vertiefungen der Platte werden aufgrund des ungleichmäßigen Wachstums der Zellen in diesen Vertiefungen nicht für die Testberechnungen verwendet. Die Zellen müssen für die beste Empfindlichkeit 75 bis 90 konfluent sein. Bei zunehmender Durchgangsanzahl der Zellen nehmen die Stunden pro Verdoppelung der Zellen ab. Die Zellanzahl/Vertiefung kann entsprechend eingestellt werden, um die korrekte Konfluenz zu erhalten.
2. Herstellen von TNF-α Standard-Arbeitslösung. Halten bei 4 °C bis zum Gebrauch.
3. Zugabe von 150 μl der TNF-Arbeitslösung zu der ersten Vertiefung der Spalten 2 und 3. Zugabe von 150 μl Probe zu der ersten Vertiefung der Spalten 4 bis 10. Zugabe von DMEM/FBS/Gentamicin zu den Spalten 1, 11 und 12. Herstellen von seriellen Zweifachverdünnungen durch Mischen des Inhalts der ersten Vertiefungen und Überführen von 150 μl in die zweiten Vertiefungen der Spalten unter Verwendung eines 12-Kanal-Pipettierers. Schließlich Mischen des Inhalts der 8. Vertiefungen (Reihe H) und Verwerfen von 150 μl aus jeder Vertiefung. Dann sollten sämtliche Vertiefungen 150 μl enthalten.
4. 20 Stunden Inkubieren der Platten in einem mit 5 % CO₂ befeuchteten Inkubator bei 37 °C.

Tag 3:
Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch Zugabe von 20 μl 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) (25 mg/ml in Phosphat-gepufferter Salzlösung, pH 7,4) zu jeder Vertiefung der Kulturplatte und 4 Stunden Inkubieren der Kulturen bei 37 °C bestimmt. Nach dieser Zeit wurden die Kulturüberstände verworfen, und jeder Vertiefung wurden 150 μl DMSO zugesetzt. Die Extinktion jeder Vertiefung bei 570 nm wurde unter Verwendung eines Mikrotiterplattenlesers bestimmt. Es wird davon ausgegangen, dass Vertiefungen, die eine A₅₄₀ am nächsten zu 50 % des arithmetischen Mittels der Kontrolle zeigen, 50 % Lysis (1 Einheit) der L929-Zellen darstellen.
D. LÖSUNGEN
TNF-α-Standard (10 μg)
Auftauen von gefrorenem TNF-α-Standard auf Eis. Aliquotieren in Cryoröhrchen mit Schraubkappen bei 2 μg/Röhrchen und Lagern bei –80 °C.
TNF-α-Standard-Stammlosung (256 ng/ml)
Einem Röhrchen (2 μg) mit TNF-α-Standard werden 7,81 ml 1 % Albumin in D-PBS/Gentamicin zugesetzt. Aliquotieren in 1-ml-Röhrchen und Halten bei 4 °C. Die Lösung wird typischerweise 6 Monate lang verwendet.
TNF-α-Arbeitslösung (0,8 ng/ml)
Für zwei Platten werden 3,12 μl Stammlösung zu 997 μl DMEM/FBS/Gentamicin gegeben. (Die Standardlösung wird in der ersten Vertiefung der Multiwellplatte auf eine Endkonzentration von 0,4 ng/ml 1:2 verdünnt.) Halten bei 4 °C bis zum Gebrauch.
Phosphat-gepufferte Salzlösung, 1 l (PBS, 1x)
Auflösen von 0,2 g KCl, 0,2 g KH₂PO₄, 8 g NaCl und 1,14 g Na₂HPO₄ in 900 ml Wasser. Einstellen des pH-Wertes auf 7,4 q. s. bis auf 1 l. Autoklavieren.
Beispiel 2
Zusätzliche Proben von humanem rekombinantem TNF, der mit PEG modifiziert wurde, wurden hergestellt (nach den allgemeinen Verfahren, die von Harras, supra, beschrieben sind) und auf ihre Serum-Halbwertszeit und Retention der spezifischen Aktivität getestet. In jedem Fall wurde der TNF mit etwa fünf bis neun Molekülen PEG modifiziert. Die Meßwerte (Tabelle 3) zeigen überraschend, dass der mit PEG eines ungefähren Molekulargewichts von etwa 10.000 bis 40.000, vorzugsweise von etwa 20.000 bis 30.000 modifizierte TNF eine wesentlich verbesserte Serum-Halbwertszeit aufweist, während eine hohe spezifische Aktivität beibehalten wird.
Die Serum-Halbwertszeit für die verschiedenen TNF-Formulierungen wurde unter Verwendung von ELISA-Tests, die von Genzyme (Cambridge, MA) erhalten wurden, wie vom Hersteller vorgeschlagen, bestimmt. Serumproben wurden aus dem retroorbitalen Plexus unter Verwendung von heparinisierten 50-μl-Kapillarröhrchen gesammelt. Eine Vor-Behandlungs-Blutprobe wurde unmittelbar vor i.v. der Injektion der TNF- oder PEG-TNF-Formulierungen gesammelt. Zusätzliche Blutproben wurden 30 Minuten, 24 Stunden sowie 3, 7, 12 und 15 Tage nach der Behandlung gesammelt. Die Proben wurden zentrifugiert, und der resultierende Überstand wurde bis zur Testung tiefgefroren bei –20 °C gelagert. Tabelle 3
Beispiel 3
Zusätzliche Proben von PEG-modifiziertem humanem rekombinantem TNF wurden hergestellt und auf die Serum-Halbwertszeit und die spezifische Aktivitätsretention getestet. Die in Tabelle 4 dargestellten Daten zeigen, dass Halbwertszeit und spezifische Aktivität in Abhängigkeit von dem verwendeten Linker variieren können. Tabelle 4
Beispiel 4
Zusätzliche Tests wurden durchgeführt, um die Auswirkung von PEG-modifiziertem rekombinantem humanem TNF auf Mäuse zu bewerten, denen verschiedene Varietäten von Tumorzellen injiziert wurden. Der bei diesen Tests verwendete TNF wurde mit SS-PEG 20000 nach einem Verfahren modifiziert, wie bei Harras, supra, beschrieben. Mäusen wurden 1 × 10⁶ Tumorzellen injiziert und 2 Wochen später das PEG-TNF einmal wöchentlich 3 Wochen lang i.p. injiziert. Die Heilung wurde als der Prozentsatz an Tieren definiert, die fünfmal länger überlebten als unbehandelte Tiere. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt und zeigen, dass der erfindungsgemäß modifizierte TNF bei der Behandlung von Melanom-, Nieren-, Darm- und Brusttumoren wirksam ist. Tabelle 5
Beispiel 5
Tests wurden zur Bewertung des TNF aus einer Vielzahl von Quellen, modifiziert mit PEG, durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt. Tabelle 6

Claims

Modifizierter TNF (Tumor-Nekrosefaktor), der den TNF an zwischen etwa fünf und zwölf PEG Moleküle, die eine Molekülmasse mit einer ungefähren durchschnittlichen Masse im Bereich von 20.000 und 40.000 aufweisen, kovalent gebunden umfasst.
Modifizierter TNF nach Anspruch 1, wobei das PEG eine Molekülmasse mit einer ungefähren durchschnittlichen Masse im Bereich von 20.000 und 30.000 aufweist.
Modifizierter TNF nach Anspruch 1, wobei das PEG an den TNF durch einen biologisch verträglichen Binder kovalent gebunden ist.
Modifizierter TNF nach Anspruch 1, wobei der Binder N-Hydroxysuccinimidylsuccinat ist.
Modifizierter TNF nach Anspruch 1, wobei der Binder N-Succinimidylpropionat ist.
Modifizierter TNF nach Anspruch 1, wobei der TNF an etwa fünf bis neun PEG Moleküle kovalent gebunden ist.
Modifizierter TNF nach Anspruch 1, wobei der TNF an die PEG Moleküle durch Primäramine auf dem TNF kovalent gebunden ist.
Modifizierter TNF nach Anspruch 1, wobei der TNF der TNF-α ist.
Modifizierter TNF nach Anspruch 1, wobei der TNF ein isolierter humaner TNF ist.
Modifizierter TNF nach Anspruch 1, wobei der TNF ein rekombinanter humaner TNF ist.
Verfahren zur Steigerung der zirkulierenden Halbwertszeit des TNF, das die Modifizierung des TNF durch kovalente Bindung an zwischen etwa fünf und zwölf PEG Moleküle umfasst, die eine Molekülmasse mit einer ungefähren durchschnittlichen Masse im Bereich von 20.000 und 40.000 aufweisen.
Verfahren zur Steigerung der Anti-Tumor Aktivität des TNF, das die Modifizierung des TNF durch kovalente Bindung an zwischen etwa fünf und zwölf PEG Moleküle umfasst, die eine Molekülmasse mit einer ungefähren durchschnittlichen Masse im Bereich von 20.000 und 40.000 aufweisen.
Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge des modifizierten TNF nach Anspruch 1 für die Zubereitung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung eines an einem Tumor leidenden Patienten.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei der Tumor Hautkrebs ist.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei der Tumor Dickdarmkrebs ist.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei der Tumor Nierenkrebs ist.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei der Tumor Brustkrebs ist.