PL215157B1 - Wyizolowana urykaza, zawierajaca ja kompozycja farmaceutyczna, kodujacy ja wyizolowany kwas nukleinowy, zawierajacy go wektor i obejmujaca ten wektor komórka gospodarza oraz sposoby wytwarzania urykazy oraz zawierajacej urykaze kompozycji farmaceutycznej - Google Patents

Wyizolowana urykaza, zawierajaca ja kompozycja farmaceutyczna, kodujacy ja wyizolowany kwas nukleinowy, zawierajacy go wektor i obejmujaca ten wektor komórka gospodarza oraz sposoby wytwarzania urykazy oraz zawierajacej urykaze kompozycji farmaceutycznej

Info

Publication number
PL215157B1
PL215157B1 PL384263A PL38426306A PL215157B1 PL 215157 B1 PL215157 B1 PL 215157B1 PL 384263 A PL384263 A PL 384263A PL 38426306 A PL38426306 A PL 38426306A PL 215157 B1 PL215157 B1 PL 215157B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
uricase
lys
val
thr
much
Prior art date
Application number
PL384263A
Other languages
English (en)
Other versions
PL384263A1 (pl
Inventor
Jacob Hartman
Simona Mendelovitz
Original Assignee
Savient Pharmaceuticals
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Savient Pharmaceuticals filed Critical Savient Pharmaceuticals
Publication of PL384263A1 publication Critical patent/PL384263A1/pl
Publication of PL215157B1 publication Critical patent/PL215157B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/44—Oxidoreductases (1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0044—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7)
    • C12N9/0046—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y107/00—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7)
    • C12Y107/03—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
    • C12Y107/03003—Factor-independent urate hydroxylase (1.7.3.3), i.e. uricase

Description

Opis wynalazku
Niniejsze zgłoszenie zastrzega pierwszeństwo i odnosi się do tymczasowego zgłoszenia USA, nr seryjny 60/670,541, złożonego 11 kwietnia, 2005, którego ujawnienie włącza się niniejszym jako odnośnik literaturowy.
Niniejszy wynalazek dotyczy modyfikowanych genetycznie białek o zdolności rozkładu kwasu moczowego. Bardziej konkretnie, wynalazek dotyczy wyizolowanej urykazy, zawierającej ją kompozycji farmaceutycznej, kodującego ją wyizolowanego kwasu nukleinowego, zawierającego go wektora i obejmującej ten wektor komórki gospodarza oraz sposobów wytwarzania urykazy oraz zawierającej urykazę kompozycji farmaceutycznej.
Terminy oksydaza moczanowa i urykaza stosuje się w niniejszym opisie wymiennie. Oksydazy moczanowe (urykazy E.C. 1.7.3.3) są enzymami, które katalizują utlenianie kwasu moczowego do bardziej rozpuszczalnego produktu, alantoiny, metabolitu puryny, który jest łatwiej wydalany. Organizmy ludzkie nie wytwarzają enzymatycznie aktywnej urykazy na skutek kilku mutacji w genie urykazy, nabytych w trakcie ewolucji wyższych naczelnych. Wu, X, i wsp., (1992) J Mol Evol 34:78-84, włączone tu w całości jako odniesienie. W konsekwencji, u wrażliwych osobników, nadmierne stężenia kwasu moczowego we krwi (hiperurykemia) mogą prowadzić do bolesnego zapalenia stawów (dna), zniekształcających złogów moczanu (guzki dnawe) i niewydolności nerek. U niektórych dotkniętych osobników, dostępne leki, takie jak allopurinol (inhibitor syntezy kwasu moczowego), dają ograniczone do czasu leczenia efekty uboczne i nie łagodzą odpowiednio tych stanów. Hande, KR, i wsp., (1984) Am J Med 76:47-56; Fam, AG, (1990) Bailliere's Clin Rheumatol 4:177-192, każdy włączony tu w całości jako odniesienie. Zastrzyki z urykazy mogą zmniejszyć hiperurykemię i hiperurykozurię co najmniej przejściowo. Ponieważ urykaza jest dla ludzi białkiem obcym, nawet pierwsze wstrzyknięcie niezmodyfikowanego białka z Aspergillus flavus indukuje reakcje anafilaktyczne u kilku procent leczonych pacjentów (Pui, C-H, i wsp., (1997) Leukemia 11:1813-1816, włączony niniejszym w całości jako odnośnik literaturowy) i odpowiedzi immunologiczne ograniczają jej przydatność do długotrwałego lub przerywanego leczenia. Donadio, D, i wsp., (1981) Nouv Presse Med 10:711-712; Leaustic, M, i wsp., (1983) Rev Rhum Mal Osteoartic 50:553-554, każda publikacja włączona niniejszym jako odnośnik literaturowy.
Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie nowych skróconych zmutowanych rekombinowanych białek o zwiększonej stabilności strukturalnej.
Niniejszy wynalazek dostarcza zmutowanej rekombinowanej urykazy z grupy składającej się z urykazy składającej się z sekwencji aminokwasowej przedstawionej na SEK NR ID: 7, urykazy składającej się z sekwencji aminokwasowej przedstawionej na SEK NR ID: 8, urykazy składającej się z sekwencji aminokwasowej przedstawionej na SEK NR ID: 12 i urykazy składającej się z sekwencji aminokwasowej przedstawionej na SEK NR ID: 13.
Innym celem niniejszego wynalazku jest opracowanie sposobów metabolizowania kwasu moczowego obejmujących nowe rekombinowane białko urykazy mające aktywność rozkładania kwasu moczowego. Aktywność rozkładania kwasu moczowego jest tu stosowana w znaczeniu enzymatycznego przekształcania kwasu moczowego do alantoiny.
Zgodnie z korzystną postacią wykonania wynalazku urykaza według wynalazku jest urykazą PEG-ylowaną.
W jednym z praktycznych wykonań urykaza obejmuje sekwencję aminokwasową od pozycji 8 do pozycji 287 przedstawioną na SEK NR ID: 7 lub SEK NR ID: 12. Niniejszy opis ujawnia również urykazy obejmujące sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEK NR ID: 8 lub SEK NR ID: 13. W jednym z kolejnych wykonań urykaza obejmuje aminokońcowy aminokwas, którym jest alanina, glicyna, prolina, seryna lub treonina. W jeszcze innym konkretnym wykonaniu aminokońcowym aminokwasem jest metionina.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest wyizolowany kwas nukleinowy obejmujący sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje urykazę według wynalazku. Korzystnie, sekwencja kwasu nukleinowego jest połączona funkcjonalnie z heterologicznym promotorem, szczególnie korzystnie promotorem osmB.
Wynalazek dostarcza również wektor zbudowany z kwasu nukleinowego, który obejmuje kwas nukleinowy kodujący urykazę według wynalazku.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest komórka gospodarza obejmująca wektor według wynalazku.
PL 215 157 B1
Wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania urykazy, obejmującego etap hodowania komórki gospodarza według wynalazku w warunkach, w których sekwencja kwasu nukleinowego ulega ekspresji w komórce gospodarza, oraz etap izolowania wyrażonej urykazy.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca:
(a) wyizolowaną urykazę obejmującą sekwencję aminokwasową SEK. NR ID. 7 lub sekwencję aminokwasową SEK. NR ID. 8; oraz (b) dopuszczalny farmaceutycznie nośnik;
przy czym urykaza jest skoniugowana z polimerem.
W korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku polimer jest wybrany z grupy składającej się z glikolu polietylenowego, dekstranu, glikolu polipropylenowego, hydroksypropylometylocelulozy, karboksymetylocelulozy, poliwinylopirolidonu, alkoholu poliwinylowego, szczególnie korzystnie kompozycja obejmuje od 2 do 12 cząsteczek glikolu polietylenowego na każdą podjednostkę urykazy.
W korzystnej postaci wykonania kompozycja farmaceutyczna według wynalazku obejmuje od 3 do 10 cząsteczek glikolu polietylenowego na każdą podjednostkę urykazy.
W innej korzystnej postaci wykonania w kompozycji farmaceutycznej według wynalazku każda cząsteczka glikolu polietylenowego ma ciężar cząsteczkowy w zakresie od 1 kD do 100 kD, korzystniej każda cząsteczka glikolu polietylenowego ma ciężar cząsteczkowy w zakresie od 1 kD do 50 kD, szczególnie korzystnie każda cząsteczka glikolu polietylenowego ma ciężar cząsteczkowy w zakresie od 5 kD do 20 kD, a najkorzystniej - każda cząsteczka glikolu polietylenowego ma ciężar cząsteczkowy wynoszący około 10 kD.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zmniejszania poziomów kwasu moczowego w płynach biologicznych u wymagającego tego osobnika obejmujący:
(a) wytwarzanie koniugatu urykazy o sekwencji aminokwasowej SEK. NR ID. 7 lub o sekwencji aminokwasowej SEK. NR ID. 8 z polimerem; oraz (b) dodawanie koniugatu urykazy do dopuszczalnego farmaceutycznie nośnika.
W korzystnej postaci wykonania sposobu według wynalazku płynem biologicznym jest krew.
W innej korzystnej realizacji sposobu polimer jest wybrany z grupy składającej się z glikolu polietylenowego, dekstranu, glikolu polipropylenowego, hydroksypropylometylocelulozy, karboksymetylocelulozy, poliwinylopirolidonu, alkoholu poliwinylowego.
Niniejszy wynalazek opisano poniżej bardzo szczegółowo i zilustrowano na Rysunku, na którym na Figurze 1 przedstawiona jest struktura plazmidu pOUR-P^N-ks-1. Numery obok miejsc restrykcyjnych wskazują na pozycję nukleotydową względem miejsca HaeII, oznaczonego jako 1. Miejsca restrykcyjne, które zostały utracone w czasie klonowania są zaznaczone nawiasami.
Na Figurze 2 przedstawiono DNA i wydedukowaną sekwencję aminokwasową urykazy Pig-KS-ΔΝ (odpowiednio, SEK NR ID: 9 i SEK NR ID: 7). Numeracja aminokwasów na Fig. 2 odnosi się do pełnej sekwencji urykazy świni. Po reszcie inicjacyjnej metioniny, treonina zastępuje kwas asparag inowy 7 w sekwencji urykazy świni. Wskazane są miejsca restrykcyjne, które są stosowane w różnych etapach subklonowania. Nie podlegająca translacji sekwencja 3' jest zaznaczona małymi literami. Kodon stop dla translacji jest zaznaczony gwiazdką.
Na Figurze 3 przedstawiono wzajemne dopasowanie wydedukowanych sekwencji aminokwasowych różnych rekombinowanych sekwencji urykazy, świni (SEK NR ID: 11), PBC-ANC (SEK NR ID: 12) i Pig-KS-ΔΝ (SEK NR ID: 7). Gwiazdki wskazują pozycje, w których występują różnice aminokwasowe w Pig-KS-ΔΝ w porównaniu z opublikowaną sekwencją urykazy świni; kółka wskazują pozycje, w których występują różnice aminokwasowe w Pig-KS-ΔΝ w porównaniu do PBC-ANC. Linie przerywane wskazują delecję aminokwasową.
Na Figurze 4 przedstawiono SDS-PAGE dla urykazy świni i wysoce oczyszczonych wariantów urykazy wytwarzanych według przykładów 1-3. Data wytworzenia (miesiąc/rok) i odpowiedni numer ścieżki dla każdej próbki jest wskazany w legendzie poniżej. Na osi Y są zaznaczone masy cząsteczkowe markerów, a na górze rysunku zaznaczone są numery ścieżek. Ścieżki są następujące: Ścieżka 1 markery mas cząsteczkowego; Ścieżka 2 - Pig-KS-ΔΝ (7/98); Ścieżka 3 - Pig (9/98); Ścieżka 4 - Pig KS (6/99); Ścieżka 5 - Pig KS (6/99); Ścieżka 6 - Pig-ΔΝ (6/99); Ścieżka 7 - Pig KS-ΔΝ (7/99); Ścieżka 8 Pig KS-ΔΝ (8/99).
Na Figurze 5 przedstawiono profile farmakokinetyczne PEGylowanej (9x10 kD) urykazy Pig-KS-ΔΝ u szczurów po wstrzyknięciu IM (domięśniowym), SC (podskórnym) i IV (dożylnym), określane przez śledzenie aktywności enzymatycznej w próbkach krwi. Aktywność enzymatyczną urykazy
PL 215 157 B1 w próbkach osocza, które zbiera się we wskazanych punktach czasowych, określa się stosując test kolorymetryczny. Wartości aktywności (mAU = jednostki miliabsorbancji) reprezentują szybkość reakcji enzymatycznej na 1 μΐ próbki osocza. Biodostępność (ilość leku osiągająca układ krążenia w stosunku do zastrzyku IV) wstrzykniętej urykazy obliczono z obszaru pod krzywą na wykresie.
Na Figurze 6 przedstawiono profile farmakokinetyczne PEGylowanej (9x10 kD) urykazy Pig-KSΔΝ u królików po wstrzyknięciu IM (domięśniowym), SC (podskórnym) i IV (dożylnym), określane przez śledzenie aktywności enzymatycznej w próbkach krwi. Aktywność enzymatyczną urykazy w próbkach osocza, które zbiera się we wskazanych punktach czasowych, określa się stosując test kolorymetryczny. Wartości aktywności (mAU = jednostki miliabsorbancji) reprezentują szybkość reakcji enzymatycznej na 1 μΐ próbki osocza. Biodostępność (ilość leku osiągająca układ krążenia w stosunku do zastrzyku IV) wstrzykniętej urykazy obliczono z obszaru pod krzywą na wykresie.
Na Figurze 7 przedstawiono profile farmakokinetyczne PEGylowanej (9x10 kD) urykazy Pig-KS-ΔΝ u psów po wstrzyknięciu IM (domięśniowym), SC (podskórnym) i IV (dożylnym), określone przez śledzenie aktywności enzymatycznej w próbkach krwi. Aktywność enzymatyczną urykazy w próbkach osocza, które zbiera się we wskazanych punktach czasowych, określa się stosując test kolorymetryczny. Wartości aktywności (mAU = jednostki miliabsorbancji) reprezentują szybkość reakcji enzymatycznej na 1 μΐ próbki osocza. Biodostępność (ilość leku osiągająca układ krążenia w stosunku do zastrzyku IV) wstrzykniętej urykazy obliczono z obszaru pod krzywą na wykresie.
na Figurze 8 przedstawiono profile farmakokinetyczne PEGylowanej (9x10 kD) urykazy Pig-KS-ΔΝ u świń po wstrzyknięciu IM (domięśniowym), SC (podskórnym) i IV (dożylnym), określone przez śledzenie aktywności enzymatycznej w próbkach krwi. Aktywność enzymatyczną urykazy w próbkach osocza, które zbiera się we wskazanych punktach czasowych, określa się stosując test kolorymetryczny. Wartości aktywności (mAU = jednostki miliabsorbancji) reprezentują szybkość reakcji enzymatycznej na 1 μl próbki osocza. Biodostępność (ilość leku osiągająca układ krążenia w stosunku do zastrzyku IV) wstrzykniętej urykazy obliczono z obszaru pod krzywą na wykresie.
Szczegółowy opis wynalazku
Wcześniejsze badania pokazały, że wówczas, gdy uzyskuje się znaczące zmniejszenie immunogenności i/lub antygenowości urykazy przez PEGylację, wiąże się to nieodmiennie z istotną utratą zdolności rozkładania kwasu moczowego. Bezpieczeństwo, wygoda i relacja pomiędzy kosztami a skutecznością biofarmaceutyków, na wszystko to niekorzystny wpływ ma zmniejszenie ich mocy i w rezultacie potrzeba zwiększania podawanej dawki. A zatem, w dziedzinie istnieje zapotrzebowanie na bezpieczne i skuteczne alternatywne sposoby zmniejszania podniesionych poziomów kwasu moczowego w płynach ciała, włączając w to krew. Niniejszy wynalazek dotyczy zmutowanej rekombinowanej urykazy zawierającej sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEK NR ID: 7, SEK NR ID: 8, SEK NR ID: 12 lub SEK NR ID: 13.
Stosowane w niniejszym opisie określenie „urykaza obejmuje poszczególne podjednostki białka, jak również, o ile nie zaznaczono inaczej, tetrametr.
W konkretnym wykonaniu, urykaza obejmuje amino-końcową metioninę. Metionina ta może zostać usunięta przez potranslacyjną modyfikację. W pewnych wykonaniach, amino-końcowa metionina może zostać usunięta po wytworzeniu urykazy. W konkretnym wykonaniu metioninę usuwa się z zastosowaniem endogennej bakteryjnej aminopeptydazy. Przedostatni aminokwas może być tym aminokwasem, który umożliwia usunięcie N-końcowej metioniny przez bakteryjną aminopeptydazę metioninową (MAP). Aminokwasami umożliwiającymi najbardziej kompletne usunięcie N-końcowej metioniny są alanina, glicyna, prolina, seryna i treonina. W konkretnym wykonaniu urykaza zawiera dwa amino-końcowe aminokwasy, przy czym dwa amino-końcowe aminokwasy to metionina, po której następuje aminokwas wybrany z grupy składającej się z alaniny, glicyny, proliny, seryny i treoniny.
W pewnych konkretnych wykonaniach urykaza jest wyizolowana i oczyszczona.
W niniejszym opisie ujawniono sposób wytwarzania sekwencji kwasu nukleinowego kodującego urykazę, obejmujący modyfikację sekwencji kwasu nukleinowego kodującego urykazę technikami PCR (od ang. Polymerase Chain Reaction, reakcja łańcuchowa polimerazy). Dla specjalisty w dziedzinie będzie oczywistym, że pożądaną sekwencję kwasu nukleinowego otrzymuje się przez PCR przy zastosowaniu syntetycznych starterów oligonukleotydowych, które są komplementarne do regionów docelowego DNA (jeden dla każdej nici), który ma podlegać amplifikacji. Startery dodaje się do docelowego DNA (nie musi być czysty) w obecności nadmiaru deoksynukleotydów i polimerazy Taq, termostabilnej polimerazy DNA. W serii (typowo 30) cykli temperaturowych, docelowy DNA jest wielokrotnie: denaturowany (około 90°C), łączony ze starterami (typowo w 50-60°C) i nić potomna jest wyPL 215 157 B1 dłużana ze starterów (72°C). Jako że nici potomne same działają jako matryce do kolejnych cykli, fragmenty DNA pasujące do obydwu starterów są powielane wykładniczo, a nie liniowo.
Jednym z przedmiotów niniejszego wynalazku jest sposób wytwarzania zmutowanej rekombinowanej urykazy, obejmujący transfekowanie komórki gospodarza wektorem, która to komórka gospodarza wyraża urykazę, izolowanie zmutowanej rekombinowanej urykazy z komórki gospodarza, izolowanie oczyszczonej zmutowanej rekombinowanej urykazy, na przykład przez zastosowanie technik chromatograficznych i oczyszczanie zmutowanej rekombinowanej urykazy. Przykładowo, urykazę można wywarzać zgodnie ze sposobami opisanymi w publikacji międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr WO 00/08196 i zgłoszenia USA nr 60/095,489, włączonymi niniejszym w całości jako odnośniki literaturowe.
W korzystnym wykonaniu komórkę gospodarza traktuje się tak, aby wywołać ekspresję zmutowanej rekombinowanej urykazy. Dla specjalisty w dziedzinie będzie oczywistym, że transfekcję komórek wektorem zwykle uzyskuje się stosując DNA wytrącony jonami wapniowymi, jakkolwiek można zastosować rozmaite inne metody (np. elektroporację).
Urykazę można wyizolować i/lub oczyścić stosując dowolne metody znane specjalistom w dziedzinie. Wyrażane polipeptydy według wynalazku izoluje się zazwyczaj w postaci zasadniczo czystej. Pożądane jest, jeżeli polipeptydy izoluje się do czystości wynoszącej co najmniej 80% wagowo, w szczególności co najmniej 95% wagowo, a zwłaszcza do czystości co najmniej 99%. Zasadniczo, taki stopień czystości można uzyskać na przykład standardowymi technikami frakcjonowania siarczanem amonu, elektroforezy SDS-PAGE i chromatografii powinowactwa. Korzystne jest, jeżeli urykazę izoluje się z zastosowaniem kationowego czynnika powierzchniowo czynnego na przykład chlorku cetylopirydynowego (CPC) zgodnie z metodą opisaną w rozpatrywanym jednocześnie zgłoszeniu patentowym USA, złożonym 11 kwietnia, 2005 o numerze zgłoszenia 60/670,520 i numerze nadanym przez rzecznika 103864.146644, zatytułowanym „Oczyszczanie białek przy zastosowaniu kationowych czynników powierzchniowo czynnych, włączonym tu w całości jako odniesienie.
W jednym z wykonań wynalazku, wektor jest pod kontrolą promotora wrażliwego na ciśnienie osmotyczne. Promotorem jest region DNA, do którego wiąże się polimeraza RNA przed zapoczątkowaniem transkrypcji DNA do RNA. Promotor wrażliwy na ciśnienie osmotyczne rozpoczyna transkrypcję na skutek zwiększonego ciśnienia osmotycznego wyczuwanego przez komórkę.
Urykaza według wynalazku obejmuje urykazę, która jest połączona z polimerem, na przykład urykazę połączoną z glikolem polietylenowym, tj. urykazę PEGylowaną.
W innym wykonaniu wynalazku, dostarczona jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca urykazę. W jednym z wykonań kompozycją jest roztwór urykazy. W korzystnym wykonaniu wynalazku roztwór jest jałowy i odpowiedni do zastrzyku. W jednym z wykonań taka kompozycja zawiera urykazę jako roztwór w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. W jednym z przykładowych wykonań kompozycja jest dostarczona w fiolce, ewentualnie mająca gumowe zamknięcie do zastrzyków. W konkretnych wykonaniach, kompozycja zawiera urykazę w roztworze w stężeniu od 2 do 16 miligramów urykazy na mililitr roztworu, od 4 do 12 miligramów na mililitr lub od 6 do 10 miligramów na mililitr. W korzystnym wykonaniu kompozycja zawiera urykazę w stężeniu 8 miligramów na mililitr. Korzystne jest, jeżeli masę urykazy mierzy się w odniesieniu do masy białka.
Sposoby skutecznego podawania kompozycji według wynalazku mogą być określone przez specjalistę w tej dziedzinie. Przydatne wskaźniki do badania skuteczności danego trybu są znane specjalistom w tej dziedzinie. Przykłady takich wskaźników obejmują normalizację albo obniżenie poziomów kwasu moczowego w osoczu (PUA, od ang. plasma uric acid) i obniżenie lub utrzymywanie się PUA do 6,8 mg/dl lub mniej, korzystnie 6 mg/dl lub mniej. W korzystnym wykonaniu osobnik leczony kompozycją według wynalazku ma PUA wynoszący 6 mg/ml lub mniej przez co najmniej 70%, co najmniej 80% lub co najmniej 90% całego okresu leczenia. Przykładowo, korzystne jest, jeżeli osobnik w trakcie 24 tygodni leczenia ma PUA wynoszący 6 mg/ml lub mniej przez co najmniej 80% 24-tygodniowego okresu leczenia tj. co najmniej przez czas równy ilości czasu w 134,4 dniach (24 tygodnie x 7 dni/tydzień x 0,8 = 134,4 dni).
W konkretnym wykonaniu, 0,5 do 24 mg urykazy w roztworze podaje się raz na 2 do 4 tygodni. Urykazę można podawać dowolną z dróg znanych specjaliście w dziedzinie, na przykład dożylnie, domięśniowo lub podskórnie. Przy podawaniu dożylnym korzystne jest podawanie 0,5 mg do 12 mg urykazy. Przy podawaniu podskórnym korzystne jest podawanie 4 do 24 mg urykazy. W korzystnym wykonaniu urykazę podaje się przez wlew dożylny przez okres 30 do 240 minut. W jednym z wykonań, 8 mg urykazy podaje się co dwa tygodnie. W konkretnym wykonaniu, wlew można przeprowadzić
PL 215 157 B1 przy użyciu 100 do 500 ml roztworu soli fizjologicznej. W jednym z wykonań 8 mg urykazy w roztworze podaje się przez okres 120 minut co dwa tygodnie albo co cztery tygodnie. Jest pożądanym, aby urykazę rozpuszczać w 250 ml roztworu soli fizjologicznej do wlewu. W pewnych wykonaniach, podawanie urykazy następuje w okresie leczenia trwającym 3 miesiące, 6 miesięcy, 8 miesięcy lub 12 miesięcy. W innych wykonaniach okresem leczenia jest 12 tygodni, 24 tygodnie, 36 tygodni lub 48 tygodni. W konkretnym wykonaniu, okres leczenia obejmuje dłuższy okres czasu np. 2 lata lub dłużej, aż do końca życia leczonego osobnika. Dodatkowo, można zastosować wielokrotne okresy leczenia oddzielone od siebie czasem bez leczenia, np. 6 miesięcy leczenia, po którym następują 3 miesiące bez leczenia, a następnie 6 dodatkowych miesięcy leczenia itd.
W niektórych wykonaniach związki przeciwzapalne można podawać profilaktycznie dla wyeliminowania albo zmniejszenia występowania reakcji na wlew na skutek podawania urykazy. W jednym z wykonań wraz z kompozycją podaje się również co najmniej jeden kortykosteroid, co najmniej jedną antyhistaminę, co najmniej jeden NSAID albo ich kombinację. Przydatne kortykosteroidy obejmują betametazon, budesonid, kortyzon, deksametazon, hydrokortyzon, metyloprednizolon, prednizolon, prednizon i triamcynolon. Przydatne NSAID obejmują ibuprofen, indometacynę, naproksen, aspirynę, acetominofen, celekoksib i waldekoksib. Przydatne antyhistaminy obejmują azatadynę, bromofeniraminę, cetyryzynę, chlorfeniraminę, klemastin, cyproheptadynę, desloratadynę, dekschlorfeniraminę, dimenhydrynat, difenhydraminę, doksylaminę, feksofenadynę, hydroksyzynę, Ioratadynę i fenindaminę.
W jednym wykonaniu, antyhistaminą jest feksofenadyna, NSAIDem jest acetaminofen, a kortykosteroidem jest hydrokortyzon i/lub prednizolon. Korzystne jest, jeżeli kombinację wszystkich trzech (niekoniecznie jednocześnie) podaje się przed wlewem roztworu urykazy. W korzystnym wykonaniu NSAID i antyhistaminę podaje się doustnie 1 do 4 godzin przed wlewem urykazy. Odpowiednia dawka feksofenadyny obejmuje około 30 do około 180 mg, około 40 do około 150 mg, około 50 do około 120 mg, około 60 do około 90 mg, około 60 mg, korzystnie, 60 mg. Odpowiednia dawka acetaminofenu obejmuje około 500 do około 1500 mg, około 700 do około 1200 mg, około 800 do około 1100 mg, około 1000 mg, korzystnie 1000 mg. Odpowiednia dawka hydrokortyzonu obejmuje około 100 do około 500 mg, około 150 do około 300 mg, około 200 mg, korzystnie 200 mg. W jednym z wykonań, antyhistaminą nie jest difenhydramina. W innym wykonaniu NSAIDem nie jest acetaminofen. W korzystnym wykonaniu 60 mg feksofenadyny podaje się doustnie noc przed wlewem urykazy; 60 mg feksofenadyny i 1000 mg acetaminofenu podaje się doustnie następnego dnia rano, a na koniec, 200 mg hydrokortyzonu podaje się tuż przed wlewem roztworu urykazy. W jednym z wykonań, prednizon podaje się w przeddzień, korzystnie wieczorem przed podaniem urykazy. Odpowiednia dawka prednizonu obejmuje 5 do 50 mg, korzystnie 20 mg. W niektórych wykonaniach te działania profilaktyczne stosuje się wobec osobników otrzymujących albo mających otrzymywać peptydy terapeutyczne inne niż urykaza, gdzie inne terapeutyczne peptydy są PEGylowane lub niePEGylowane.
W pewnym wykonaniu wynalazku kompozycja farmaceutyczna zawiera urykazę połączoną z polimerem i zmodyfikowana urykaza zachowuje aktywność rozkładania kwasu moczowego. W korzystnym wykonaniu urykazą jest urykaza PEGylowana.
W pewnym wykonaniu wynalazku kompozycja farmaceutyczna zawiera urykazę, która została zmodyfikowana przez połączenie z polimerem i zmodyfikowana urykaza zachowuje aktywność rozkładania kwasu moczowego. W konkretnym wykonaniu koniugaty polimer-urykaza są wytwarzane jak opisano w międzynarodowej publikacji patentowej nr WO 01/59078 i zgłoszeniu USA nr 09/501730, włączonych tu w całości jako odniesienie.
W jednym z wykonań wynalazku, polimer jest wybrany z grupy składającej się z glikolu polietylenowego, dekstranu, glikolu polipropylenowego, hydroksypropylometylocelulozy, karboksymetylocelulozy, poliwinylopirolidonu i alkoholu poliwinylowego. W korzystnym wykonaniu polimerem jest glikol polietylenowy, a urykazą jest urykaza PEGylowana.
W praktycznych korzystnych wykonaniach wynalazku kompozycja zawiera 2-12 cząsteczek polimeru na każdą podjednostkę urykazy, korzystnie 3 do 10 cząsteczek polimeru na podjednostkę. Korzystnie, w pewnym wykonaniu wynalazku każda cząsteczka polimeru ma masę cząsteczkową między około 1 kD i około 100 kD.
W innym korzystnym wykonaniu wynalazku każda cząsteczka polimeru ma masę cząsteczkową między około 1 kD i około 50 kD. W korzystnym wykonaniu wynalazku każda cząsteczka polimeru ma masę cząsteczkową między około 5 kD i około 20 kD, około 8 kD a około 15 kD, około 10 kD a 12 kD, korzystnie, około 10 kD. W korzystnym wykonaniu każda cząsteczka polimeru ma masę cząsteczkową
PL 215 157 B1 między około 5 kD i około 20 kD. W szczególnie korzystnym wykonaniu każda cząsteczka polimeru ma masę cząsteczkową 10 kD.
W pewnym wykonaniu wynalazku kompozycja jest odpowiednia do powtarzanego podawania kompozycji.
Wynalazek ten dostarcza sposobów metabolizowania kwasu moczowego przez urykazę.
Wynalazek niniejszy dotyczy również zastosowania kompozycji urykazy do zmniejszania poziomów kwasu moczowego w płynie biologicznym.
W pewnym wykonaniu wynalazku kompozycję urykazy stosuje się do zmniejszania poziomów kwasu moczowego w płynie biologicznym obejmującym krew.
Dostarczone są również nowe cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące urykazę według wynalazku. Manipulacje, które prowadzą do ich wytwarzania są dobrze znane specjaliście w dziedzinie.
Przykładowo, sekwencje kwasów nukleinowych urykazy można modyfikować przy zastosowaniu licznych strategii znanych w dziedzinie (Maniatis, T., 1990, Molecular Cloning, Ά Laboratory Manual, wyd. 2., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). Sekwencje mogą być przecinane w odpowiednich miejscach przez endonukleazę(y) restrykcyjną(e), a następnie, jeśli to pożądane, poddane dalszej modyfikacji enzymatycznej, izolowane i poddane ligacji in vitro. Przy wytwarzaniu genu kodującego urykazę, powinno się upewnić, że zmodyfikowany gen zachowuje odpowiednią ramkę odczytu dla translacji, nie przerwaną przez sygnały stop dla translacji.
Sekwencję nukleotydową kodującą białko urykazy można wstawić do odpowiedniego wektora ekspresyjnego, tj. wektora, który zawiera niezbędne elementy do transkrypcji i translacji wstawionej sekwencji kodującej białko. Obejmuje to między innymi ssacze systemy komórkowe zakażane wirusem (np. wirusem krowianki, adenowirusem, itd.), systemy komórek owadów zakażanych wirusem (np. bakulowirusem), mikroorganizmy, takie jak drożdże zawierające wektory drożdżowe albo bakterie transformowane DNA bakteriofagowym, DNA plazmidowym albo DNA kosmidowym. Elementy ekspresyjne tych wektorów mogą różnić się siłą i specyficznościami. W zależności od zastosowanego systemu gospodarz-wektor, można zastosować dowolny z wielu odpowiednich elementów transkrypcyjnych i translacyjnych.
Dla skonstruowania wektorów ekspresyjnych zawierających chimerowy gen składający się z odpowiednich sygnałów kontrolnych transkrypcyjnych/translacyjnych i sekwencji kodujących białko można zastosować dowolną ze znanych metod wstawiania fragmentów DNA do wektora. Metody te mogą obejmować techniki rekombinowania DNA in vitro i techniki syntetyczne oraz rekombinację in vivo (rekombinację genetyczną). Ekspresję sekwencji kwasu nukleinowego kodującego urykazę można regulować przez drugą sekwencję kwasu nukleinowego, tak że białko urykazy jest wyrażane w gospodarzu transformowanym zrekombinowaną cząsteczką DNA. Przykładowo, ekspresja urykazy może być pod kontrolą dowolnego elementu promotora/wzmacniacza znanych w tej dziedzinie. Promotory, które można zastosować do kontrolowania ekspresji urykazy obejmują między innymi region wczesnego promotora SV40 (Bernoist i Chambon, 1981, Nature 290:304-310), promotor zawarty w długich końcowych powtórzeniach 3' wirusa mięsaka Rousa (Yamamoto, i wsp., 1980, Cell 22:787-797), promotor kinazy tymidynowej opryszczki (Wagner i wsp., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci . U.S.A. 78:144-1445), sekwencje regulacyjne genu metalotioneiny (Brinster i wsp., 1982, Nature 296:39-42); ekspresyjne wektory prokariotyczne, takie jak promotor β-laktamazy (Villa-Kamaroff, i wsp., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731), promotor tac (DeBoer, i wsp., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25) oraz promotor osmB. W konkretnych wykonaniach kwasy nukleinowe zawierają sekwencję kwasu nukleinowego kodującą urykazę połączoną funkcjonalnie z promotorem heterologicznym.
Po wytworzeniu i wyizolowaniu konkretnej cząsteczki DNA zawierającej kodującą sekwencję kwasu nukleinowego, można do jej namnażania zastosować kilka znanych w tej dziedzinie metod. Po opracowaniu odpowiedniego systemu gospodarza i warunków wzrostu, zrekombinowane wektory ekspresyjne można namnażać i uzyskiwać w dużych ilościach. Jak wcześniej wyjaśniono, wektory ekspresyjne, które można zastosować obejmują między innymi następujące wektory albo ich pochodne: ludzkie albo zwierzęce wirusy, aby wymienić kilka takie jak wirus krowianki lub adenowirus, wirusy owadów, takie jak bakulowirus, wektory drożdżowe, wektory bakteriofagowe (np. lambda) oraz wektory DNA plazmidowe i kosmidowe.
Dodatkowo, można wybrać szczep komórek gospodarza, który moduluje ekspresję wstawionych sekwencji albo modyfikuje i dokonuje obróbki produktu genu w specyficzny, pożądany sposób. Ekspresję z określonych promotorów można zwiększyć w obecności pewnych induktorów, a zatem
PL 215 157 B1 ekspresja poddanej zabiegom inżynierii genetycznej urykazy może być kontrolowana. Ponadto, różne szczepy gospodarzy mają właściwości i specyficzne mechanizmy translacyjnej i potranslacyjnej obróbki i modyfikacji (glikozylacja, cięcie) białek. Można wybrać odpowiednie linie komórkowe lub systemy gospodarzy dla zapewnienia pożądanej modyfikacji i obróbki wyrażonego obcego białka. Różne systemy ekspresyjne wektor/gospodarz mogą wpływać w różnym stopniu na reakcje obróbki, takie jak cięcia proteolityczne.
W konkretnych wykonaniach wynalazku ekspresję urykazy w E. coli przeprowadza się korzystnie przy użyciu wektorów, które zawierają promotor osmB.
P r z y k ł a d y
P r z y k ł a d 1. Konstrukcja genu i ekspresja plazmidu dla ekspresji urykazy
Rekombinowana świńska urykaza (oksydaza moczanowa), Pig-KS-ΔΝ (białko urykazy świni ze skróconym końcem aminowym, z zastąpieniem aminokwasów 291 i 301, odpowiednio, lizyną i seryną) wyrażono w szczepie E. coli K-12 W3110 F-. Skonstruowano serię plazmidów, z uzyskaniem na koniec pOUR-P-AN-ks-1, który, po transformacji komórek gospodarza E. coli był zdolny do kierowania wydajną ekspresją urykazy.
Izolacja i subklonowanie cDNA urykazy z wątroby świni i pawiana cDNA urykaz wytworzono z wątrób świń i pawianów przez izolację i klonowanie odpowiedniego RNA. Całkowity komórkowy RNA ekstrahowano z wątrób świń i pawianów (Erlich, H. A. (1989). PCR Technology; Principles and Application for DNA Amplification; Sambrook, J., i wsp. (1989). Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, wydanie 2; Ausubel, F. M. i wsp. (1998). Current protocols in molecular
Biology), a następnie przepisywano przy zastosowaniu zestawu do syntezy pierwszej nici cDNA (First-Strand cDNA Synthesis Kit, Pharmacia Biotech). Amplifikację PCR przeprowadzono przy użyciu polimerazy DNA Taq (Gibco BRL, Life Technologies).
Syntetyczne startery oligonukleotydowe stosowane do amplifikacji PCR oksydaz moczanowych (urykaz) świni i pawiana są pokazane w Tabeli 1.
T a b e l a 1. Startery do amplifikacji przez PCR cDNA dla urykazy
Urykaza z wątroby świni:
sensowny 5' gcgcgaattccATGGCTCATTACCGTAATGACTACA 3' (SEK NR ID: 1) antysensowny 5' gcgctctagaagcttccatggTCACAGCCTTGAAGTCAGC
3' (SEK NR ID: 2)
Urykaza z wątroby pawiana (D3H): sensowny 5' gcgcgaattccATGGCCCACTACCATAACAACTAT 3' (SEK NR ID: 3) antysensowny 5' gcgcccatggtctagaTCACAGTCTTGAAGACAACTTCCT 3' (SEK NR ID: 4)
Sekwencjami enzymów restrykcyjnych wprowadzonymi na końcach starterów i zapisanymi m ałymi literami w Tabeli 1, były sensowne EcoRI i NcoI (świnia i pawian) i antysensowne NcoI, HindIII i XbaI (świnia), XbaI i NcoI (pawian). W starterze sensownym dla pawiana, trzeci kodon GAC (kwas asparaginowy) obecny w urykazie pawiana został zastąpiony CAC (histydyna), kodonem, który jest obecny w tej pozycji w sekwencji kodującej pseudogenu ludzkiej oksydazy moczanowej. Konstrukt dla rekombinowanej urykazy pawiana wytworzony przy użyciu tych starterów jest nazwany D3H Baboon Uricase.
PL 215 157 B1
Produkt PCR dla urykazy świni został strawiony EcoRI i HindIII i sklonowany w pUC18 z wytworzeniem pUC18-Pig Uricase. Produkt PCR dla D3H Baboon Uriease sklonowano bezpośrednio w wektorze pCR™II, stosując TA Cloning™ (Invitrogen, Carlsbad, CA), z wytworzeniem pCR™II-D3H Baboon Uricase.
Poddane ligacji cDNA zastosowano do transformacji szczepu E. coli XLl-Blue (Stratagene, La Jolla, CA). Wytworzono plazmidowy DNA zawierający sklonowane cDNA urykazy i klony, które posiadały opublikowaną sekwencję DNA kodującą urykazę (z różnicą polegającą na podstawieniu D3H w urykazie pawiana, pokazanej w Tabeli 1) wybrano i wyizolowano. W wybranym klonie pCR™II-D3H Baboon Uricase, sekwencje pCR™II znajdowały się obok kodonu stop urykazy, co było wynikiem delecji sekwencji wprowadzonej przez PCR. W konsekwencji, miejsca restrykcyjne XbaI i NcoI z nie podlegającego translacji regionu 3' zostały wyeliminowane, umożliwiając bezpośrednie klonowanie przy zastosowaniu NcoI na końcu 5' produktu PCR i BamHI, które pochodzi z wektora pCR™II.
Subklonowanie cDNA urykazy do wektorów ekspresyjnych pET
Subklonowanie urykazy pawiana cDNA D3H pawiana zawierający sekwencję kodującą pełnej długości dla urykazy wprowadzono do wektora ekspresyjnego pET-3d (Novagen, Madison, WI). pCR™II-D3H Baboon Uricase strawiono NcoI i BamHI i wyizolowamo fragment 960 bp. Plazmid ekspresyjny pET-3d strawiono NcoI i BamHI i wyizolowano fragment 4600 bp. Dwa fragmenty poddano ligacji z wytworzeniem pET-3d-D3H Baboon
Subklobowanie chimerowej urykazy świni-pawiana
Chimerową urykazę świni-pawiana (PBC, od ang. Pig-baboon chimera) skonstruowano w celu osiągnięcia wyższej ekspresji, stabilności i aktywności rekombinowanego genu. PBC skonstruowano przez wyizolowanie fragmentu NcoI-ApaI o wielkości 4936 bp z klonu pET-3d-D3H Baboon i poddania ligacji wyizolowanego fragmentu z fragmentem NcoI-ApaI o wielkości 624 bp wyizolowanym z pUC18-Pig Uricase, prowadząc do wytworzenia pET-3d-PBC. cDNA urykazy PBC składa się z kodonów 1-225 urykazy świni połączonych w ramce z kodonami 226-304 urykazy pawiana.
Subklonowanie cDNA urykazy Pig-KS
Urykazę Pig-KS skonstruowano w celu dodania jednej reszty lizyny, która może dostarczać dodatkowego miejsca PEGylacji. KS oznacza wstawienie aminokwasu lizyny do urykazy świni, w pozycji 291, w miejsce argininy (R291K). Dodatkowo, treonina w pozycji 301 została zastąpiona przez serynę (T301S). Plazmid z urykazą PigKS skonstruowano przez wyizolowanie fragmentu NcoI-NdeI o wielkości 4696 bp z pET-3d-D3H Baboon, a następnie ligację z fragmentem NcoI-NdeI o wielkości 864 bp wyizolowanym z pUC18-Pig Uricase, czego wynikiem było wytworzenie pET-3d-Pig-KS. Otrzymana w rezultacie sekwencja urykazy PigKS składa się z kodonów 1-288 połączonych w ramce z kodonami 289-304 urykazy pawiana.
Subklonowanie sekwencji urykazy regulowanej przez promotor osmB
Gen urykazy subklonowano w wektorze ekspresyjnym zawierającym promotor osmB (zgodnie ze wskazówkami patentu USA nr 5,795,776, włączonego tu w całości jako odniesienie). Wektor ten umożliwia indukcję ekspresji białka w odpowiedzi na wysokie ciśnienie osmotyczne albo starzenie się hodowli. Plazmid ekspresyjny pMFOA-18 zawierał promotor osmB, sekwencję miejsca wiązania rybosomów (rbs, od ang. ribosomal binding site) i sekwencję terminatora transkrypcji (ter). Nadaje on oporność na ampicylinę (AmpR) i wyraża rekombinowaną ludzką esterazę acetylocholiny (AChE, od ang. human acetylcholine esterase).
Subklonowanie D3H Babon Uricase
Plazmid pMFOA-18 strawiono NcoI i BamHI i wyizolowano duży fragment. Konstrukt pET-3d-D3H Babon Uricase strawiono NcoI i BamHI I i wyizolowano fragment o wielkości 960 bp, który zawierał gen D3H Babon Uricase. Te dwa fragmenty poddano ligacji z wytworzeniem pMFOU18.
Plazmid ekspresyjny pMFXT133 zawierał promotor osmB, rbs (operon deo E. coli), ter (TrypA E. coli), rekombinowany polipeptyd inhibitora czynnika Xa (FxaI), i niesie gen oporności na tetracyklinę (TetR). Gen urykazy pawiana wstawiono do tego plazmidu w celu zamiany genów oporności na antybiotyk. Plazmid pMFOU18 strawiono NcoI, wypełniono końce, a następnie strawiono XhoI i wyizolowano fragment o wielkości 1030 bp. Plazmid pMFXT133 strawiono NdeI, wypełniono końce, a następnie strawiono XhoI i wyizolowano duży fragment. Dwa fragmenty poddano ligacji z wytworzeniem wektora ekspresyjnego dla urykazy pawiana, pURBA16.
Subklonowanie chimerowej urykazy świni-pawiana
Plazmid pURBA16 strawiono ApaI i AlwNI i wyizolowano fragment o wielkości 2320 bp. Plazmid pMFXT133 strawiono NdeI, wypełniono końce, a następnie strawiono AlwNI i wyizolowano fragment
PL 215 157 B1 o wielkości 620 bp. Konstrukt pET-3d-PBC strawiono XbaI, wypełniono końce, a następnie strawiono ApaI i wyizolowano fragment o wielkości 710 bp. Trzy fragmenty poddano ligacji z wytworzeniem pURPB, plazmidu, który wyrażał urykazę PBC pod kontrolą promotora i rbs osmB, jak również rbs T7, który pochodził z wektora pET-3d.
Rbs T7 został wycięty w dodatkowym etapie. pUR-PB strawiono NcoI, wypełniono końce, a następnie strawiono AlwNI i wyizolowano fragment o wielkości 3000 bp. Plazmid pMFXT133 strawiono NdeI, wypełniono końce, a następnie strawiono AlwNI i wyizolowano fragment o wielkości 620 bp. Te dwa fragmenty poddano ligacji z pDUR-PB, który wyraża PBC pod kontrolą promotora osmB.
Konstrukcja pOUR-PB-ANC
Wprowadzono kilka zmian w cDNA urykazy, które prowadzą do zasadniczego zwiększenia stabilności rekombinowanego enzymu. Skonstruowano plazmid pOUR-PBC-ANC, w którym N-końcowy peptyd dojrzewania złożony z sześciu reszt i tripeptyd na końcu C, który działa in vivo jako sygnał kierujący do peroksysomów, obydwa zostały usunięte. Przeprowadzono to z użyciem sekwencji PBC w plazmidzie pDUR-PB i specyficznych starterów oligonukleotydowych zamieszczonych w Tabeli 2, przy zastosowaniu amplifikacji w reakcji PCR.
T a b e l a 2. Startery do amplifikacji urykazy PBC-ANC w reakcji PCR
Urykaza PBC-ANC:
Sensowny
5’ gcgcatATGACTTACAAAAAGAATGATGAGGTAGAG 3’ (SEK NR ID: 5) Antysensowny
5' CCgtctagaTTAAGACAACTTCCTCTTGACTGTACCAGTAATTTTTCCGTATGG 3' (SEK NR ID: 6)
Sekwencje enzymów restrykcyjnych wprowadzone na końcach starterów pokazane jako wytłuszczenie i regiony niekodujące są pokazane w Tabeli 2 małymi literami. NdeI jest sensowny, a XbaI jest antysensowny. Starter sensowny zastosowano również w celu wyeliminowania wewnętrznego miejsca restrykcyjnego NdeI przez wprowadzenie mutacji punktowej (podkreślona), która nie wpływa na sekwencję aminokwasową, a zatem ułatwiała subklonowanie przy zastosowaniu NdeI.
Fragment o wielkości 900 par zasad wytworzony przez amplifikację w reakcji PCR pDUR-PB przecięto NdeI i XbaI i wyizolowano. Otrzymany fragment wprowadzono następnie do plazmidu ekspresyjnego deo, pDBAST-RAT-N, który niesie promotor deo-P1P2 i rbs pochodzący z E. coli i wyraża konstytutywnie prekursor ludzkiej rekombinowanej insuliny. Plazmid strawiono NdeI i XbaI i wyizolowano fragment o wielkości 4035 bp i poddano go ligacji z produktem PCR dla urykazy PBC. Otrzymany w rezultacie konstrukt, pDUR-PB-ANC, użyto do transformacji E. coli K-12 Sφ733 (F-cytR strA), która wyrażała wysokie poziomy aktywnej skróconej urykazy.
Podwójne skrócona sekwencja PBC-ANC została również wyrażona pod kontrolą promotora osmB. Plazmid pDUR-PB-ANC strawiono AlwNI - NdeI i wyizolowano fragment o wielkości 3459 bp. Plazmid pMFXT133, opisany powyżej, strawiono NdeI - AlwNI, i wyizolowano fragment o wielkości 660 bp. Fragmenty poddano następnie ligacji z wytworzeniem pOUR-PB-ANC, który został wprowadzony do szczepu E. coli K-12 W3110 F- i wyrażał wysokie poziomy aktywnej skróconej urykazy.
Konstrukcja plazmidu ekspresyjnego dla urykazy pOUR-P^N-ks-1
Plazmid ten skonstruowano w celu polepszenia stabilności rekombinowanego enzymu. Urykazę Pig-KS-ΔΝ skrócono jedynie na końcu N (ΔΝ), gdzie usunięty został N-końcowy peptyd dojrzewania złożony z sześciu reszt i zawierała ona mutatcje S46T, R291K i T301S. W pozycji 46 występowała reszta treoniny zamiast seryny na skutek mutacji konserwatywnej, która nastąpiła w czasie amplifikacji PCR i klonowania. W pozycji 291 lizyna zastąpiła argininę, a w pozycji 301 seryna została wstawiona zamiast treoniny. Obydwie reszty pochodziły z sekwencji urykazy pawiana. Modyfikacje R291K i T301S są oznaczone jako KS i były dyskutowane powyżej. Dodatkowa reszta lizyny dostarczała dodatkowego potencjalnego miejsca PEGylacji.
PL 215 157 B1
W celu skonstruowania pOUR-P-AN-ks-1 (Fig. 1), plazmid pOUR-PB-ANC strawiono ApaI XbaI i wyizolowano fragment o wielkości 3873 bp. Plazmid pET-3d-PKS (konstrukcja pokazana na Fig. 4) strawiono ApaI - SpeI i wyizolowano fragment o wielkości 270 bp. Cięcie SpeI pozostawia wystający w stronę 5' koniec CTAG, który był wydajnie łączony przez ligację z fragmentami DNA wytworzonymi przez XbaI. Te dwa fragmenty poddano ligacji z wytworzeniem pOUR-P-AN-ks-1. Po ligacji miejsca rozpoznawane przez enzymy SpeI i XbaI zostały utracone (ich miejsce jest pokazane w nawiasach na Fig. 9). Konstrukt pOUR-P-AN-ks-1 został wprowadzony do szczepu E. coli K-12 W3110 F-, prototroficznego, ATCC#27325. Otrzymana w rezultacie urykaza Pig-KS-ΔΝ, wyrażana pod kontrolą promotora osmB, dawała wysokie poziomy rekombinowanego enzymu mającego lepszą aktywność i stabilność.
Na Figurze 1 przedstawia strukturę plazmidu pOUR-P^N-ks-1. Numery obok miejsc restrykcyjnych wskazują pozycję nukleotydową w odniesieniu do miejsca HaeII, oznaczonego jako 1; miejsca restrykcyjne, które zostały utracone w czasie klonowania są zaznaczone nawiasami. Plazmid pOUR-P-AN-ks-1, kodujący urykazę Pig-KS-ΔΝ ma długość 4143 par zasad (bp) i zawiera następujące elementy:
1. Fragment DNA o długości 113 bp, rozciągający się od nukleotydu numer 1 do miejsca NdeI (w pozycji 113), który zawiera promotor osmB i miejsce wiązania rybosomów (rbs).
2. Fragment DNA o długości 932 bp, rozciągający się od NdeI (w pozycji 113) do styku Spel/Xbal (w pozycji 1045), który zawiera: 900 bp region kodujący Pig-KS-ΔΝ (sekwencja kwasu nukleinowego dla końca aminowego białka skróconej urykazy świni, w którym aminokwasy 291 i 301 są zastąpione, odpowiednio, lizyną seryną) i sekwencję flankującą o długości 32 bp pochodzącą z pCR™ II, z miejsca klonowania TA przed miejscem restrykcyjnym Spel/Xbal.
3. Sekwencję z wieloma miejscami do klonowania (MCS, od ang. multiple cloning sites) o wielkości 25 bp od styku Spel/Xbal (w pozycji 1045) do HindIII (w pozycji 1070).
4. Syntetyczny oligonukleotyd o wielkości 40 bp, zawierający terminator transktypcji TrpA (ter) z końcami HindIII (w pozycji 1070) i AatII (w pozycji 1110).
5. Fragment DNA o długości 1519 bp, rozciągający się od miejsca AatII (w pozycji 1110) do MscI/Scal (w pozycji 2629) na pBR322, który zawiera gen oporności na tetracyklinę (TetR).
6. Fragment DNA o długości 1514 bp, rozciągający się od miejsca Scal (w pozycji 2629) do HaeII (w pozycji 4143) na pBR322, który zawiera początek replikacji.
Na Figurze 2 pokazano DNA i wydedukowane sekwencje aminokwasowe urykazy Pig-KS-ΔΝ. Na tym rysunku numeracja aminokwasów jest według kompletnej sekwencji urykazy świni. Po reszcie inicjacyjnej metioniny wstawiona została treonina w miejsce kwasu asparaginowego w sekwencji urykazy świni. Ta reszta treoninowa umożliwiała usuwanie metioniny przez bakteryjną aminopeptydazę. Przerwa w sekwencji aminokwasowej przedstawia usunięty N-końcowy peptyd dojrzewania. Wskazane są miejsca restrykcyjne, które zostały wykorzystane na różnych etapach subklonowania różnych sekwencji urykazy (Apal, NdeI, BamHI, EcoRI i SpeI). Nie podlegająca translacji sekwencja 3', zapisana małymi literami, pochodziła z sekwencji pCR™II. Kodon stop dla translacji jest zaznaczony gwiazdką.
Na Figurze 3 pokazano dopasowanie sekwencji aminokwasowych różnych sekwencji rekombinowanych urykaz. Górna linia przedstawia urykazę świni, która obejmuje pełną sekwencję aminokwasową. Druga linia to sekwencja podwójnie skróconej chimerowej urykazy świni-pawiana (PBC-ANC). Trzecia linia pokazuje sekwencję urykazy Pig-KS-ΔΝ, która jest skrócona jedynie na końcu N i zawiera mutacje S46T i zmiany aminokwasowe R291K i T301S, obydwie odzwierciedlające pochodzenie z pawiana końca karboksylowego sekwencji kodującej urykazę. Gwiazdka wskazuje pozycję, w której występują różnice aminokwasów w urykazie Pig-KS-ΔΝ w porównaniu z opublikowaną sekwencją urykazy świni; kółka wskazują na pozycje, w których występują różnice aminokwasów w Pig-KS-ΔΝ w porównaniu z PBC-ΔΝ, chimerze ze świni-pawiana; a linie przerywane wskazują delecje aminokwasów.
cDNA z natywnej urykazy pawiana, świni i królika, z mutacją Y97H oraz chimery ze świni/pawiana (PBC) skonstruowano do klonowania w E. coli. Klony wyrażające wysokie poziomy wariantów urykazy skonstruowano i wyselekcjonowano tak, że wszystkie były w E. coli W3110 F-, a ekspresja była regulowana przez osmB. Plazmidowe DNA izolowano, sprawdzano przez sekwencjonowanie DNA i analizę enzymami restrykcyjnymi i komórki hodowano.
Konstrukcji skróconych urykaz, włączając w to pig-ΔΝ i Pig-KS-ΔΝ dokonano przez ligację krzyżową pomiędzy PBC-ANC i Pig-KS, a następnie cięcie endonukleazami restrykcyjnymi, odpowiednio, ApaI i XbaI oraz ApaI plus SpeI. Można było sądzić, że te skrócone mutanty zachowają aktywność,
PL 215 157 B1 ponieważ sześć N-końcowych reszt, peptyd „dojrzewania (1-2), i C-końcowy tri-peptyd, „sygnał kierowania do peroksysomów (3- 5), nie ma funkcji, która znacząco wpływa na aktywność enzymatyczną, a jest możliwe że te sekwencje mogą być immunogenne. Wybrano klony wyrażające bardzo wysokie poziomy urykazy.
P r z y k ł a d 2. Transformacja plazmidu ekspresyjnego do bakteryjnej komórki gospodarza
Plazmid ekspresyjny, pOUR-P-AN-ks-1, został wprowadzony do was szczepu E. coli K-12 W3110 F . Przygotowano komórki bakteryjne do transformacji, co obejmowało hodowanie do środka fazy logarytmicznej w buforze Luria (LB), następnie komórki zbierano przez wirowanie, przemywano zimną wodą i zawieszano w 10% glicerolu w wodzie w stężeniu około 3x1010 komórek na ml. Komórki przechowywano w porcjach w -70°C. Plazmidowy DNA wytrącano następnie etanolem i rozpuszczano w wodzie.
Komórki bakteryjne i plazmidowy DNA mieszano i przeprowadzano transformację przy zastosowaniu metody wysokonapięciowej elektroporacji z użyciem Gene Pulser II z BIO-RAD (Trevors i wsp. (1992). Electrotransformation of bacteria by plasmid DNA, w Guide to Electroporation and Electrofusion (D.C. Chang, B. M. Chassy, J. A. Saunders and A. E. Sowers, wyd.), str. 265-290, Academic Press Inc., San Diego, Hanahan i wsp. (1991) Meth. Enzymol., 204, 63-113). Transformowane komórki zawieszano w pożywce SOC (2% trypton, 0,5% ekstrakt drożdżowy, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM glukoza), inkubowano w 37°C przez 1 godzinę i poddawano selekcji pod kątem oporności na tetracyklinę. Wybrano klony o wysokiej ekspresji.
P r z y k ł a d 3. Wytwarzanie rekombinowanej urykazy
Bakterie, takie jak te transformowane (patrz wyżej), hodowano w pożywce zawierającej glukozę; pH utrzymywano na poziomie 7,2±0,2, w około 37°C.
W trakcie ostatnich 5-6 godzin hodowli, pożywka była uzupełniona KCl do końcowego stężenia 0,3 M. Hodowlę kontynuowano dla umożliwienia akumulacji urykazy.
Rekombinowana urykaza akumulowała się w komórkach bakteryjnych jako nierozpuszczalny precypitat podobny do ciał inkluzyjnych (IB, od ang. inclusion bodies). Zawiesinę komórek przemywano przez wirowanie i zawieszano 50 mM buforze Tris, pH 8,0 i 10 mM EDTA i doprowadzano do ostatecznej objętości około 40 razy sucha masa komórek.
IB zawierające rekombinowaną urykazę izolowano przez wirowanie po rozbiciu komórek bakteryjnych przy użyciu lizozymu i wysokiego ciśnienia. Traktowanie lizozymem (2000-3000 jednostek/ml) przeprowadzano przez 16-20 godzin przy pH 8,0 i 7±3°C, z mieszaniem. Osad przemywano wodą i przechowywano w -20°C do chwili użycia.
Wzbogacone IB poddawano dalszej obróbce po zawieszaniu w 50 mM buforze NaHCO3, pH 10,3±0,1. Zawiesinę inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej w celu umożliwienia upłynnienia urykazy pochodzącej z IB, a następnie klarowano przez wirowanie.
Urykazę oczyszczano następnie przez kilka etapów chromatografii. Na początek chromatografię przeprowadzono na kolumnie Q-Sepharose FF. Załadowaną kolumnę przemywano buforem wodorowęglanowym zawierającym 150 mM NaCl i urykazę wymywano buforem wodorowęglanowym zawierającym 250 mM NaCl. Następnie zastosowano złoże ksantyna-agaroza, Xanthine Agarose (Sigma) w celu usunięcia z preparatu urykazy niewielkich zanieczyszczeń. Wyciek z Q-Sepharose FF rozcieńczano 50 mM buforem glicynowym, pH 10,3±0,1, do stężenia białka około 0,25 mg/ml i nakładano na kolumnę. Kolumnę przemywano buforem wodorowęglanowym, pH 10,3±0,1, zawierającym 100 mM NaCl, i urykazę wymywano tym samym buforem uzupełnionym 60 μΜ ksantyną. Na tym etapie urykaza była ponownie czyszczona przez chromatografię na Q-Sepharose w celu usunięcia form zagregowanych.
Czystość każdego preparatu urukazy jest większa niż 95%, co oceniano przez sączenie molekularne. W każdym preparacie wykrywano przy zastosowaniu kolumny Superdex 200 mniej niż 0,5% zagregowanych form.
Tabela 3 podsumowuje oczyszczenie urykazy Pig-KSAN z IB pochodzących z 25 I buforu fermentacyjnego.
T a b e l a 3. Oczyszczanie urykazy Pig-KSAN
Etap oczyszczania Białko (mg) Aktywność (jedn.) Aktywność specyficzna (jedn./mg)
Nierozpuszczalne IB 12748 47226 3,7
Klarowany roztwór 11045 44858 4,1
PL 215 157 B1 cd. tabeli 3
Q-Sepharose I - główna pula 7590 32316 4,3
Xanthine Agarose - główna pula 4860 26361 5,4
Q-Sepharose II - główna pula 4438 22982 5,2
frakcja UF 30 kD 4262 27556 6,5
P r z y k ł a d 4. Charakterystyka rekombinowanych urykaz
SDS-PAGE
Analiza SDS-PAGE wysoce oczyszczonych wariantów urykazy (Fig. 4) wykazała dość wyróżnialny wzór. Próbki przechowywano w 4°C, w buforze węglanowym, pH 10,3, do kilku miesięcy. Warianty pełnej długości, Pig, Pig-KS i PBC, wykazywały akumulację dwóch głównych produktów degradacji mających ciężar cząsteczkowy około 20 i 15 kD. Ta obserwacja sugeruje, że co najmniej pojedyncze cięcie dzieli cząsteczkę podjednostki urykazy. Inny wzór degradacji jest wykrywany dla klonów skróconych na końcu aminowym, a także dla urykazy królika, ale w mniejszej proporcji. Koniec aminowy królika przypomina ten dla skróconych klonów. Określono amino-końcowe sekwencje fragmentów urykazy wytworzone w czasie oczyszczania i przechowywania.
Sekwencjonowanie peptydów
N-końcowe sekwencjonowanie dużych preparatów urykazy przeprowadzono przy zastosowaniu metody degradacji Edmana. Przeprowadzono dziesięć cykli. Rekombinowana urykaza Pig (klon pełnej długości) dawała więcej fragmentów degradacji w porównaniu z urykazą Pig-KS-ΔΝ. Wydedukowane miejsca cięcia prowadzące do fragmentów degradacji są jak następuje:
1) Główne miejsce w pozycji 168 mające sekwencję:
--QSG i FEGFI-2) Drugorzędne miejsce w pozycji 142 mające sekwencję:
--IRN i GPPVI-Powyższe sekwencje nie sugerują żadnego znanego miejsca proteolitycznego. Pomimo tego, cięcie może nastąpić bądź na skutek proteolizy bądź jakiejś reakcji chemicznej. Urykazy skrócone na końcu aminowym są zaskakująco bardziej stabilne niż urykazy nie skrócone na końcu aminowym. PBC-ANC miała również stabilność podobną do innych cząsteczek ΔΝ i mniejszą niż PBC bez skrócenia aminowego.
Aktywność
Aktywność urykazy mierzono metodą UV. Szybkość reakcji enzymatycznej określano przez pomiar zmniejszenia absorbancji przy 292 nm będącej wynikiem utleniania kwasu moczowego do alantoiny. Jedna jednostka aktywności jest zdefiniowana jako ilość urykazy wymagana do utlenienia jednego μmola kwasu moczowego na minutę w 25°C, w podanych warunkach. Moc urykazy jest wyrażana w aktywnościach na mg białka (jedn./mg).
-1 -1
Współczynnik ekstynkcji 1 mM kwasu moczowego przy 292 nm wynosi 12,2 mM-1 cm-1. A zatem utlenienie 1 μmola kwasu moczowego na ml mieszaniny reakcyjnej prowadziło do zmniejszenia absorbancji wynoszącego 12,2 mA292. Zmiana absorbancji w czasie (ΔΑ292 na minutę) pochodziła z liniowej części krzywej.
Stężenie białka określano przy zastosowaniu zmodyfikowanej metody Bradford (Macart i Gerbaut (1982) Clin Chim Acta 122:93-101). Aktywność specyficzną (moc) urykazy obliczano dzieląc aktywność w jedn./ml przez stężenie w mg/ml. Wyniki aktywności enzymatycznej dla różnych rekombinowanych urykaz są zestawione w Tabeli 4. Wyniki preparatów handlowych są włączone do tej tabeli jako wartości odnośnikowe. Widać z tych wyników, że skrócenie białek urykazy nie ma znaczącego wpływu na ich aktywność enzymatyczną.
T a b e l a 4. Podsumowanie parametrów kinetycznych natywnych urykaz
Urykazy Stężenie (1) roztworu podstawowego (mg/ml) Aktywność specyficzna (jedn./mg)(2) Km (4) (μίνΐ kwasu moczowego) Kcat (5) (1/min.)
Rekombinowana
Świni 0,49 7,41 4,39 905
Pig-AN 0,54 7,68 4,04 822
PL 215 157 B1 cd. tabeli 4
Pig-KS 0,33 7,16 5,27 1085
Pig-KS-AN 1,14 6,20 3,98 972
PBC 0,76 3,86 4,87 662
PBC-ANC 0,55 3,85 4,3 580
Królika 0,44 3,07 4,14 522
Natywna
Świni (Sigma) 2,70 3,26 (3) 5,85 901
A. flavus (Merck) 1,95 0,97 (3) 23,54 671
Przypisy do Tabeli 4:
(1) Stężenie białka określano przez absorbancję mierzoną przy 278 nm, stosując współczynnik ekstynkcji 11,3 dla roztworu urykazy 10 mg/ml (Mahler, 1963).
(2) 1 jednostka aktywności urykazy jest zdefiniowana jako ilość enzymu, która utlenia 1 μmol kwasu moczowego do alantoiny na minutę, w 25°C.
(3) Wartości aktywności specyficznej pochodziły z wykresów Lineweaver-Burk przy stężeniu substratu równym 60 μΜ.
(4) Mieszaniny reakcyjne składały się z różnych kombinacji następujących roztworów podstawowych
100 mM buforu-boranu sodowego, pH 9,2
300 μΜ kwasu moczowego w 50 mM buforze-boranie sodowym, pH 9,2 mg/ml BSA w 50 mM buforze-boranie sodowym, pH 9,2 (5) Kcat obliczono przez podzielenie Vmax (obliczonej z odpowiednich wykresów Lineweaver-Burk) przez stężenie urykazy w mieszaninie reakcyjnej (wyrażone w równoważnikach molowych, w oparciu o masę cząsteczkową tetramerycznych urykaz).
P r z y k ł a d 5. Sprzęganie urykazy z m-PEG (PEGylacja)
Urykaza Pig-KS-ΔΝ była sprzęgana przy zastosowaniu m-PEG-NPC (węglan monometoksy-poli(etylenoglikolo)nitrofenylu). Ustalono warunki dające 2-12 nici 5, 10 lub 20 kD PEG na podjednostkę urykazy. m-PEG-NPC dodawano stopniowo do roztworu białka. Po zakończeniu dodawania PEG, mieszaninę reakcyjną urykaza/m-PEG-NPC inkubowano w 2-8°C przez 16-18 godzin, aż maksymalna liczba niezwiązanych nici m-PEG przyłączyła się do urykazy.
Liczbę nici PEG na monomer PEG-urykaza określano przez sączenie molekularne (SEC, od ang. size exclusion chromatography), na Superose 6, stosując jako standardy PEG i urykazę. Liczbę związanych nici PEG na podjednostkę określano przy zastosowaniu następującego równania:
Nici PEG 3,42 x Ilość PEG we wstrzykiwanej próbce (pg) /podjednostkę = Ilość białka we wstrzykiwanej próbce (pg)
Stężenie PEG i reszt białkowych w próbce PEG-urykaza ustalano przez sączenie molekularne (SEC) przy zastosowaniu detektorów nadfioletu (UV) i współczynnika załamania (RI) ustawionych szeregowo (opracowane przez Kunitani i wsp., 1991). Wytworzono trzy krzywe kalibracyjne: krzywą białkową (absorpcja mierzona przy 220 nm); krzywą białkową (mierzona przez RI) i krzywą PEG (mierzoną przez RI). Następnie próbki PEG-urykaza analizowano przy zastosowaniu tego samego systemu. Otrzymane w rezultacie wartości powierzchni pod pikami UV i RI próbek eksperymentalnych zastosowano do obliczenia stężeń PEG i białka w stosunku do krzywych kalibracyjnych. Współczynnik 3,42 to stosunek masy cząsteczkowej monomeru urykazy (34,192 Daltonów) do masy 10 kD PEG.
Przyłączenie PEG poprawiało rozpuszczalność urykazy w roztworach mających fizjologiczne wartości pH. Tabela 5 wskazuje na zróżnicowanie pomiędzy partiami produktu - PEGylowanej urykazy Pig-KS-ΔΝ. Generalnie, istnieje odwrotna proporcja pomiędzy liczbą przyłączonych nici PEG i zachowaniem specyficznej aktywności (SA) enzymu.
PL 215 157 B1
T a b e l a 5
Aktywność enzymatyczna koniugatów PEGylowanej urykazy Pig-KS-ΔΝ
Partie koniugatu PEG MW (kD) Nici PEG na podjednostkę urykazy SA urykazy (U/mg) SA-procent kontroli
Pig-KS-AN - - 8,2 100
1-17 # 5 9,7 5,8 70,4
LP-17 10 2,3 7,8 94,6
1-15 # 10 5,1 6,4 77,9
13 # 10 6,4 6,3 76,9
14 # 10 6,5 6,4 77,5
5-15 # 10 8,8 5,4 65,3
5-17 # 10 11,3 4,5 55,3
4-17 # 10 11,8 4,4 53,9
1-18 # 20 11,5 4,5 54,4
P r z y k ł a d 6. PEGylacja urykazy przez PEG 1000 D i 100000 D
Urykaza Pig-KS-ΔΝ została połączona z m-PEG-NPC 1000 D i 100000 D, jak opisano w przykładzie 5. Zastosowano warunki, w których uzyskiwano 2-11 nici PEG na podjednostkę urykazy. Po zakończeniu dodawania PEG, mieszanina reakcyjna urykaza/m-PEG-NPC była inkubowana w 2-8°C przez 16-18 godzin, aż maksymalna liczba niezwiązanych nici m-PEG przyłączyła się do urykazy.
Liczbę nici PEG na monomer PEG-urykaza określono jak opisano powyżej.
Przyłączenie PEG poprawiało rozpuszczalność urykazy w roztworach mających fizjologiczne wartości pH.
P r z y k ł a d 7. Farmakokinetyka urykazy Pig-KS-ΔΝ połączonej z PEG
Przeprowadzono doświadczenia biologiczne w celu określenia optymalnego zakresu i wielkości PEGylacji niezbędnej dla dostarczenia korzyści terapeutycznej.
Badania farmakokinetyczne na szczurach, przy zastosowaniu zastrzyków dożylnych (i.v.) z 0,4 mg (2 jedn.) na kg wagi ciała niezmodyfikowanej urykazy, podawanej w dniu 1 i dniu 8, dawało okres półtrwania w obiegu około 10 minut. Jednakże badania szybkości kliransu u szczurów dla 2-11x10 kD urykazy PEG-Pig-KS-ΔΝ, po aż 9 cotygodniowych zastrzykach, wskazywały, że klirens nie zależy od liczby nici PEG (w tym zakresie) i pozostawał stosunkowo stały w trakcie okresu badania (patrz Tabela 6; z okresem półtrwania około 30 godzin). Różnice od tygodnia do tygodnia są w zakresie błędu eksperymentalnego. Ten sam wzór jest widoczny po dziewięciu wstrzyknięciach koniugatów 10x5kD PEG- i 10x20kD PEG-urykaza. Wyniki wskazują, że w modelu szczurzym niezależnie od stopnia PEGylacji urykazy, w tym zakresie, obserwowane były podobne efekty biologiczne.
T a b e l a 6. Okresy półtrwania preparatów PEGylowanej urykazy Pig-KS-ΔΝ u szczurów
Stopień modyfikacji (nici PEG na podjednostkę urykazy)
5kD PEG 10kD PEG 20kD PEG
Tydzień 10x 2x 5x 7x 9x 11x 10x
1 25,7±1,7 29,4±3,4 37,7±3,1 37,6±3,9 36,9±4,3 31,4±4,3 21,6±1,5
(5) (5) (5) (5) (5) (5) (5)
2 - - - 26,7±3,0 (5) 28,4±1,6 (5) - -
3 27,5±3,8 29,0±2,6 29,9±11,7 32,7±11,1 26,3±4,7 11,8±3,3 14,5±2,7
(5) (5) (5) (5) (5) (5) (5)
4 - - 27,1±5,3 (5) 18,4±2,2 (4) 19,7±5,6 (4) - -
PL 215 157 B1 cd. tabeli
5 28,6±1,7 (5) 22,5±2,7 (5) 34,3±3,9 (4) 37,3±3,0 (5) 30,4±3,6 (5) 30,5±1,3 (5) 19,3±2,5 (5)
6 - - 35,4±3,1 (14) 27,1 ±3,6 (13) 30,7±2,9 (13) - -
7 16,5±4,9 (5) 32,5±4,3 (5) - - - 16,12±2,7 (5) 25,8±2,5 (5)
8 - - - - - - -
9 36,8±4,0 28,7±2,7 34,0±2,4 24,2±3,4 31,0±2,6 29,3±1,4 26,7±0,5
(15) (15) (13) (13) (13) (15) (15)
Przypisy do Tabeli 4:
Wyniki są wskazane w godzinach ± błędy standardowe średniej. Numery w nawiasach wskazują na liczbę testowanych zwierząt.
Szczury otrzymywały co tydzień i.v. zastrzyki z 0,4 mg na kg wagi ciała urykazy Pig-KS-ΔΝ zmodyfikowanej jak wskazano w tabeli. Każda grupa wyjściowo obejmowała 15 szczurów, które były na kolejno skrwawiane w podgrupach po 5. Kilka szczurów zdechło w czasie tego badania na skutek znieczulenia. Okres półtrwania określano przez pomiar aktywności urykazy (test kolorymetryczny) w próbkach osocza zbieranych w 5 minucie, 6, 24 i 48 godzinie po zastrzyku.
Tabela 5 opisuje partie PEGylowanej urykazy użytej w tych badaniach.
Badania biodostępności dla urykazy 6x5 kD PEG-Pig-KS-ΔΝ u królików wskazują, że po pierwszym zastrzyku okres półtrwania w obiegu wynosi 98,2±1,8 godzin (i.v.), a biodostępność po wstrzyknięciu domięśniowym (i.m.) i podskórnym (s.c.) wynosiła, odpowiednio, 71% i 52%. Jednakże, wykrywano znaczące miana przeciwciała anty-urykaza po drugim zastrzyku i.m. i s.c. u wszystkich królików i klirans był przyspieszony po następnych zastrzykach. Wstrzyknięcie szczurom tych samych koniugatów prowadziło do czasu półtrwania 26±1,6 godzin (i.v.), a biodostępność po wstrzyknięciu i.m. i s.c. wynosiła, odpowiednio, 33% i 22%.
Badania na szczurach z urykazą 9x10 kD PEG-Pig-KS-ΔΝ wskazują, że okres półtrwania w obiegu po pierwszym zastrzyku w wynosi 42,4 godzin (i.v.), a biodostępność po wstrzyknięciu i.m. i s.c. wynosiła, odpowiednio, 28,9% i 14,5% patrz Fig. 5 i Tabela 7). Po czwartym zastrzyku okres półtrwania w obiegu wynosił 32,1± 2,4 godziny, a biodostępność po wstrzyknięciu i.m. i s.c. wynosiła, odpowiednio, 26,1% i 14,9%.
Podobne badania farmakokinetyczne, u królików dla urykazy 9x10 kD PEG-Pig-KS-ΔΝ wskazują, że nie obserwuje się przyspieszonego kliransu po wstrzyknięciu tego koniugatu (podawano 4 zastrzyki co dwa tygodnie). U tych zwierząt okres półtrwania w obiegu po pierwszym zastrzyku wynosił 88,5 godzin (i.v.), a biodostępność po wstrzyknięciu i.m. i s.c. wynosiła, odpowiednio, 98,3% i 84,4%. (patrz Fig. 6 i Tabela 7). Po czwartym zastrzyku okres półtrwania w obiegu wynosił 141,1±15,4 godziny, a biodostępność po wstrzyknięciu i.m. i s.c. wynosiła, odpowiednio, 85% i 83%.
Podobne badania farmakokinetyczne dla urykazy 9x10 kD PEG-Pig-KS-ΔΝ przeprowadzono w celu zbadania biodostępności u psów rasy beagle (2 samce i 2 samice w każdej grupie). Okres półtrwania w obiegu zanotowano jako 70±11,7 godzin po pierwszym zastrzyku i.v., a biodostępność po wstrzyknięciu i.m. i s.c. wynosiła, odpowiednio, 69,5% i 50,4% (patrz Fig. 7 i Tabela 7).
Badanie z preparatami urykazy 9x10 kD PEG-Pig-KS-ΔΝ przeprowadzono z użyciem świń. Trzy zwierzęta na grupę użyto do podawania drogami i.v., s.c. i i.m. Okres półtrwania w obiegu zanotowano jako 178±24 godzin po pierwszym zastrzyku i.v., a biodostępność po wstrzyknięciu i.m. i s.c. wynosiła, odpowiednio, 71,6% i 76,8% (patrz Fig. 8 i Tabela 7).
T a b e l a 7. Badania farmakokinetyczne z urykazą 9x10 kD PEG-Pig-KS-ΔΝ
Zastrzyk # Okres półtrwania (godziny) Biodostępność
i.v. i.m. s.c.
Szczury
1 42,4±4,3 28,9% 14,5%
2 24,1±5,0 28,9% 14,5%
PL 215 157 B1 cd. tabeli 7
4 32,1 ±2,4 26,1% 14,9%
Króliki
1 88,5±8,9 98,3% 84,4%
2 45,7±40,6 100% 100%
4 141,1±15,4 85% 83%
Psy
1 70,0±11,7 69,5% 50,4%
Świnie
1 178±24 71,6% 76,8%
Badania abspopcji, dystrybucji, metabolizmu i wydalania (ADME, od ang. Absorption, distribution, metabolism, and excretion) wykonano po jodowaniu urykazy 9x10 kD PEG-Pig-KS-ΔΝ stosując
125 metodę Bolton & Hunter przy użyciu 125I. Wyznakowany koniugat wstrzyknięto 7 grupom, każda po 4 szczury (2 samce i 2 samice). Dystrybucję radioaktywności analizowano po 1 godzinie i co 24 godziny przez 7 dni (z wyjątkiem dnia 5). Każdą grupę kolejno uśmiercano i różne narządy wycinano i analizowano. Siódmą grupę trzymano w klatce metabolicznej, z której zbierano mocz i kał. Dystrybucję materiału w ciele zwierzęcia oceniano przez pomiar całkowitej radioaktywności w każdym narządzie i frakcję zliczeń (nerka, wątroba, płuco i śledziona), która była dostępna do wtrącania TCA (tj.) związane białko, normalizowane w stosunku do rozmiaru narządu). Spośród narządów, które zostały wycięte, żaden nie miał wyższej radioaktywności specyficznej niż inne, a zatem nie obserwowano znaczącej akumulacji, na przykład w wątrobie albo nerce. 70% radioaktywności była wydalana przed upływem 7 dnia.
P r z y k ł a d 8. Wyniki testów klinicznych
Przeprowadzono randomizowane, otwarte, wieloośrodkowe, równoległe badania grupowe w celu zbadania odpowiedzi na moczan i profile bezpieczeństwa PEG-urykazy (Puricase®, Savient Pharmaceuticals) u pacjentów-ludzi z hiperurykemią i ostrą dną moczanową, którzy nie odpowiadali albo nie tolerowali konwencjonalnej terapii. Średni czas choroby wynosił 14 lat i 70 procent badanej populacji miało jeden albo więcej guzków dnawych.
W tym badaniu 41 pacjentów (średnia wieku 58,1 lat) randomizowano do 12 tygodni leczenia dożylną PEG-urykazą w jednym z czterech trybów dawkowania: 4 mg co dwa tygodnie (7 pacjentów); 8 mg co dwa tygodnie (8 pacjentów); 8 mg co dwa tygodnie (13 pacjentów); lub 12 mg co cztery tygodnie (13 pacjentów). Aktywność urykazy w osoczu i poziomy moczanu mierzono w określonych odstępach czasu. Parametry farmakokinetyczne, średnie stężenie moczanu w osoczu i procent czasu, kiedy poziom moczanu w osoczu był mniejszy niż lub równy 6 mg/dl pochodziły z analiz aktywności urykazy i poziomów moczanu .
Pacjenci, którzy otrzymywali 8 mg PEG-urykazy co dwa tygodnie mieli większe zmniejszenie PUA, z poziomami poniżej 6 mg/dl przez 92 procent czasu leczenia (poziom moczanu w osoczu sprzed leczenia 9,1 mg/dl vs. średni poziom moczanu w osoczu 1,4 mg/dl na przestrzeni 12 tygodni).
Zasadnicze i utrzymujące się niższe poziomy moczanu w osoczu obserwowano również w innych grupach dawek przy traktowaniu PEG-urykazą: PUA poniżej 6 mg/ml przez 86 procent czasu leczenia w grupie 8 mg co cztery tygodnie (poziom moczanu w osoczu sprzed leczenia 9,1 mg/dl vs. średni poziom moczanu w osoczu 1,4 mg/dl na przestrzeni 12 tygodni); PUA poniżej 6 mg/ml przez 84 procent czasu leczenia w grupie 12 mg co cztery tygodnie (poziom moczanu w osoczu sprzed leczenia 8,5 mg/dl vs. średni poziom moczanu w osoczu 2,6 mg/dl na przestrzeni 12 tygodni) i PUA poniżej 6 mg/ml przez 73 procent czasu leczenia w grupie 4 mg co cztery tygodnie (poziom moczanu w osoczu sprzed leczenia 7,6 mg/dl vs. średni poziom moczanu w osoczu 4,2 mg/dl na przestrzeni 12 tygodni).
Maksymalny procent zmniejszenia poziomu kwasu moczowego w osoczu w stosunku do poziomu podstawowego w czasie pierwszych 24 godzin podawania dawki PEG-urykazy wynosił 72% dla osobników otrzymujących 4 mg/2 tygodnie (p wynosi 0,0002); 94% dla osobników otrzymujących 8 mg/2 tygodnie (p mniej niż 0,0001); 87% dla osobników otrzymujących 8 mg/4 tygodnie (p mniej niż 0,0001); i 93% dla osobników otrzymujących 12 mg/4 tygodnie (p mniej niż 0,0001).
PL 215 157 B1
Procent zmniejszenia poziomu kwasu moczowego w osoczu w stosunku do poziomu podstawowego w okresie 12-tygodni leczenia wynosił 38% dla osobników otrzymujących 4 mg/2 tygodnie (p wynosi 0,0002); 86% dla osobników otrzymujących 8 mg/2 tygodnie (p mniej niż 0,0001); 58% dla osobników otrzymujących 8 mg/4 tygodnie (p mniej niż 0,0001); i 67% dla osobników otrzymujących 12 mg/4 tygodnie (p mniej niż 0,0001).
Ku zaskoczeniu, niektóre osoby otrzymujące PEG-urykazę doświadczały związanych z wlewem efektów ubocznych, tj. reakcji na wlew. Te reakcje następowały w 14% wszystkich wlewów.
Wszystkie zacytowane tu odnośniki są włączone w całości jako odniesienie i dla wszystkich celów w takim samym zakresie jak gdyby każda indywidualna publikacja albo zgłoszenie patentowe były konkretnie i indywidualnie wskazane aby zostać włączone jako odniesienie w całości dla wszystkich celów.
Można dokonać wielu modyfikacji i odmian niniejszego wynalazku bez odchodzenia od jego ducha i zakresu, co będzie oczywiste dla specjalistów tej dziedzinie. Konkretne opisane tu wykonania są oferowane jedynie jako przykład i wynalazek ma być ograniczony jedynie przez załączone zastrzeżenia, łącznie z pełnym zakresem równoważników, których te zastrzeżenia dotyczą.
PL 215 157 B1
Lista sekwencji
<110> Savient Pharmaceuticals, Inc. Hartman, Jacob Mendelovitz, Simona
<120> Wariant oksydazy moczanowej i jego zastosowanie
<130> 103864-156066
<150> US 60/670,541
<151> 2005-04-11
<160> 16
<170> Patentin version 3.3
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> Sekwencja sztuczna
<220> <223> Urykaza z wątroby świni (sensowna)
<400> 1
gcgcgaattc catggctcat taccgtaatg actaca 36 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Urykaza z wątroby świni (antysensowna) <400> 2 gcgctctaga agcttccatg gtcacagcct tgaagtcagc 40 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> urykaza z wątroby pawiana (D3H) (sensowna) <400> 3 gcgcgaattc catggcccac taccataaca actat 35 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <22O>
<223> urykaza z wątroby pawiana (D3H) (antysensowna) <400> 4 gcgcccatgg tctagatcac agtcttgaag acaacttcct 40 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna
PL 215 157 B1 <220>
<223> Urykaza PBC-DeltaNC (sensowna) <400> 5 gcgcatatga cttacaaaaa gaatgatgag gtagag 36 <210> 6 <211> 54 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> urykaza PBC-DeltaNC (antysensowna) <400> 6 ccgtctagat taagacaact tcctcttgac tgtaccagta atttttccgt atgg 54 <210> 7 <211> 299 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <22O>
<223> Pig-KS-DeltaN <400> 7
Met Thr Tyr Lys Lys Asn Asp Glu 5 val Glu 10 Phe val Arg Thr Gly 15 Tyr
Gly Lys Asp Met Ile Lys val Leu His Ile Gin Arg Asp Gly Lys Tyr
20 25 30
Hi s Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Thr Val Gin Leu Thr Leu Ser Ser
35 40 45
Lys Lys Asp Tyr Leu Hi s Gly Asp Asn Ser Asp Val Ile pro Thr Asp
50 55 60
Thr Ile Lys Asn Thr val Asn Val Leu Al a Lys Phe Lys Gly Ile Lys
65 70 75 80
Ser Ile Gl u Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu His Phe Leu Ser Ser
85 90 95
Phe Lys Hi s Va1 Ile Arg Al a Gin val Tyr Val Glu Gl u val Pro Trp
100 105 110
Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys Hi s Val His Ala Phe ile Tyr
115 120 125
Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Gl u Val Glu Gin Ile Arg Asn Gly
130 13 5 140
Pro Pro Val Ile Hi s Ser Gly Ile Lys Asp Leu Lys Val Leu Lys Thr
145 150 155 160
PL 215 157 B1
Thr Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp Gin Phe Thr Thr 175 Leu
165 170
Pro Glu val Lys Asp Arg Cys Phe Al a Thr Gin val Tyr cys Lys Trp
180 185 190
Arg Tyr His Gin Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu Ala Thr Trp Asp Thr
195 200 205
Val Arg 210 Ser Ile Val Leu Gl n 215 Lys Phe Ala Gly pro 220 Tyr Asp Lys Gly
Glu Tyr Ser Pro Ser val Gin Lys Thr Leu Tyr Asp Ile Gin val Leu
225 230 235 240
Thr Leu Gly Gin Val Pro Glu Ile Glu Asp Met Glu Ile Ser Leu Pro
245 250 255
Asn ile His Tyr Leu Asn Ile Asp Met Ser Lys Met Gly Leu Ile Asn
260 265 270
Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn pro Tyr Gly Lys Ile Thr
275 280 285
Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu
290 295
<210> 8
<211> 298
<212> PRT
<213> Sekwencji a sztuczna
<220>
<223> <400> Thr Tyr 1 Pig-I 8 Lys KS-DeltaN bez startowej Met
Lys Asn 5 Asp Glu Val Glu Phe Val 10 Arg Thr Gly Tyr Gly 15
Lys Asp Met Ile Lys Val Leu Hi s Ile Gin Arg Asp Gly Lys Tyr His
20 25 30
Ser ile Lys Glu val Ala Thr Thr Val Gin Leu Thr Leu Ser Ser Lys
35 40 45
Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp val ile pro Thr Asp Thr
50 55 60
ile Lys Asn Thr val Asn val Leu Ala Lys Phe Lys Gly Ile Lys Ser
65 70 75 80
ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu His Phe Leu Ser Ser Phe
85 90 95
PL 215 157 B1
Lys Hi s Val ile Arg Ala Gin Val Tyr val Glu Glu val Pro Trp Lys
100 105 110
Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His val Hi s Ala Phe Ile Tyr Thr
115 120 12 5
Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu Gin ile Arg Asn Gly Pro
130 135 140
Pro val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu Lys val Leu Lys Thr Thr
145 150 155 160
Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp Gin Phe Thr Thr Leu Pro
165 170 175
Glu Val Lys Asp Arg cys Phe Ala Thr Gin val Tyr Cys Lys Trp Arg
180 185 190
Tyr His Gin Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu Ala Thr Trp Asp Thr val
195 200 205
Arg Ser 210 Ile Val Leu Gin Lys 215 Phe Ala Gly pro Tyr 220 Asp Lys Gly Glu
Tyr Ser Pro Ser Val Gin Lys Thr Leu Tyr Asp Ile Gin val Leu Thr
225 230 235 240
Leu Gly Gin val Pro Gl U Ile Glu Asp Met Glu Ile Ser Leu Pro Asn
245 250 255
Ile His Tyr Leu Asn Ile Asp Met Ser Lys Met Gly Leu Ile Asn Lys
260 265 270
Glu Gl u Val Leu Leu Pro Leu ASp Asn Pro Tyr Gly Lys Ile Thr Gly
275 280 285
Thr Val 290 Lys Arg Lys Leu Ser 295 Ser Arg Leu
<210> 9
<211> 897
<212> DNA
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
<223> Pig- KS-DeltaNA
<400> 9
atgacttaca aaaagaatga tgaggtagag tttgtccgaa ctggctatgg gaaggatatg
ataaaagttc tccatattca gcgagatgga aaatatcaca gcattaaaga ggtggcaact
acagtgcaac tgactttgag ctccaaaaaa gattacctgc atggagacaa ttcagatgtc
PL 215 157 B1 atccctacag acaccatcaa gaacacagtt aatgtcctgg cgaagttcaa aggcatcaaa 240 agcatagaaa cttttgctgt gactatctgt gagcatttcc tttcttcctt caagcatgtc 300 atcagagctc aagtctatgt ggaagaagtt ccttggaagc gttttgaaaa gaatggagtt 360 aagcatgtcc atgcatttat ttatactcct actggaacgc acttctgtga ggttgaacag 420 ataaggaatg gacctccagt cattcattct ggaatcaaag acctaaaagt cttgaaaaca 480 acccagtctg gctttgaagg attcatcaag gaccagttca ccaccctccc tgaggtgaag 540 gaccggtgct ttgccaccca agtgtactgc aaatggcgct accaccaggg cagagatgtg 600 gactttgagg ccacctggga cactgttagg agcattgtcc tgcagaaatt tgctgggccc 660 tatgacaaag gcgagtactc gccctctgtc cagaagacac tctatgacat ccaggtgctc 720 accctgggcc aggttcctga gatagaagat atggaaatca gcctgccaaa tattcactac 780 ttaaacatag acatgtccaa aatgggactg atcaacaagg aagaggtctt gctaccttta 840 gacaatccat atggaaaaat tactggtaca gtcaagagga agttgtcttc aagactg 897 <210> 10 <211> 894 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna
<22O>
<223> Pig- KS-DeltaN bez startowej ATG
<400> 10 acttacaaaa agaatgatga ggtagagttt gtccgaactg gctatgggaa ggatatgata 60
aaagttctcc atattcagcg agatggaaaa tatcacagca ttaaagaggt ggcaactaca 120
gtgcaactga ctttgagctc caaaaaagat tacctgcatg gagacaattc agatgtcatc 180
cctacagaca ccatcaagaa cacagttaat gtcctggcga agttcaaagg catcaaaagc 240
atagaaactt ttgctgtgac tatctgtgag catttccttt cttccttcaa gcatgtcatc 300
agagctcaag tctatgtgga agaagttcct tggaagcgtt ttgaaaagaa tggagttaag 360
catgtccatg catttattta tactcctact ggaacgcact tctgtgaggt tgaacagata 420
aggaatggac ctccagtcat tcattctgga atcaaagacc taaaagtctt gaaaacaacc 480
cagtctggct ttgaaggatt catcaaggac cagttcacca ccctccctga ggtgaaggac 540
cggtgctttg ccacccaagt gtactgcaaa tggcgctacc accagggcag agatgtggac 600
tttgaggcca cctgggacac tgttaggagc attgtcctgc agaaatttgc tgggccctat 660
gacaaaggcg agtactcgcc ctctgtccag aagacactct atgacatcca ggtgctcacc 720
ctgggccagg ttcctgagat agaagatatg gaaatcagcc tgccaaatat tcactactta 780
aacatagaca tgtccaaaat gggactgatc aacaaggaag aggtcttgct acctttagac 840
aatccatatg gaaaaattac tggtacagtc aagaggaagt tgtcttcaag actg 894
<210> 11 <211> 304 <212> PRT <213> Sus scrofa
PL 215 157 B1 <400> 11
Met Ala 1 His Tyr Arg Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu val Glu 15 Phe
5 10
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ile Lys val Leu His Ile Gin
20 25 30
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser ile Lys Glu val Ala Thr Ser val Gin
35 40 45
Leu Thr 50 Leu Ser Ser Lys Lys 55 Asp Tyr Leu Hi s Gly 60 Asp Asn ser Asp
val Ile Pro Thr Asp Thr ile Lys Asn Thr val Asn val Leu Ala Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly ile Lys Ser ile Glu Thr Phe Ala val Thr Ile Cys Glu
85 90 95
His Phe Leu Ser Ser Phe Lys His val Ile Arg Al a Gin val Tyr val
100 105 110
Glu Glu val pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly val Lys His val
115 120 12 5
Hi s Ala Phe ile Tyr Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu
130 135 140
Gin Ile Arg Asn Gly Pro Pro val ile Hi s Ser Gly Ile Lys Asp Leu
145 150 155 160
Lys val Leu Lys Thr Thr Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe ile Lys Asp
165 170 175
Gin Phe Thr Thr Leu Pro Glu val Lys Asp Arg cys Phe Ala Thr Gin
180 185 190
Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr Hi s Gin Gly Arg Asp val Asp Phe Glu
195 200 205
Ala Thr 210 Trp Asp Thr Val Arg 215 Ser ile val Leu Gin 220 Lys Phe Ala Gly
Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser val Gin Lys Thr Leu Tyr
225 230 235 240
Asp Ile Gin val Leu Thr Leu Gly Gin val Pro Glu ile Glu Asp Met
245 250 255
Glu ile Ser Leu Pro Asn Ile Hi s Tyr Leu Asn Ile Asp Met Ser Lys
260 265 270
PL 215 157 B1
Met Gly Leu 275 Ile Asn Lys Glu Glu 280 val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro 285
Tyr Gly Arg Ile Thr Gly Thr val Lys Arg Lys Leu Thr Ser Arg Leu
290 295 300
<210> 12 <211> 296 <212> PRT
<213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> PBC-DeltaNC
<400> 12
Met Thr Tyr Lys Lys Asn Asp Glu val Glu Phe Val Arg Thr Gly Tyr
1 5 10 15
Gly Lys Asp Met ile Lys Val Leu His Ile Gin Arg Asp Gly Lys Tyr
20 25 30
His Ser Ile Lys Gl u val Al a Thr Thr val Gin Leu Thr Leu Ser Ser
35 40 45
Lys Lys ASP Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp val Ile Pro Thr Asp
50 55 60
Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys Phe Lys Gly Ile Lys
65 70 75 80
Ser Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile cys Glu His phe Leu Ser Ser
85 90 95
Phe Lys His Val Ile Arg Ala Gl n Val Tyr val Glu Gl u val pro Trp
100 105 110
Lys Arg Phe Gl u Lys Asn Gly Val Lys His val His Al a Phe Ile Tyr
115 120 125
Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Gl u val Glu Gin Ile Arg Asn Gly
130 13 5 140
Pro Pro val Ile Hi s Ser Gly Ile Lys Asp Leu Lys val Leu Lys Thr
145 150 155 160
Thr Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp Gin Phe Thr Thr Leu
165 170 175
Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin val Tyr Cys Lys Trp
180 185 190
Arg Tyr His Gin Gly Arg Asp val Asp Phe Glu Ala Thr τ rp Asp Thr
PL 215 157 B1
195 200 205
Val Arg Ser Ile val Leu Gin Lys Phe Ala Gly Pro Tyr Asp Lys Gly
210 215 220
Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gin Lys Thr Leu Tyr Asp Ile Gin Val Leu
225 230 235 240
Ser Leu Ser Arg Val Pro Glu Ile Glu Asp Met Glu Ile Ser Leu Pro
245 250 255
Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys Met Gly Leu Ile Asn
260 265 270
Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn pro Tyr Gly Lys Ile Thr
275 280 285
Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser
290 295 <210> 13 <211> 295 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <22O>
<223> PBC-DeltaNC bez startowej Met <400> 13
Thr Tyr 1 Lys Lys Asn Asp Glu 5 Va1 Glu Phe val 10 Arg Thr Gly Tyr 15 Gly
Lys Asp Met Ile Lys val Leu Hi s Ile Gin Arg Asp Gly Lys Tyr Hi s
20 25 30
Ser ile Lys Glu val Al a Thr Thr val Gin Leu Thr Leu Ser Ser. Lys
35 40 45
Lys Asp Tyr Leu Hi s Gly Asp Asn Ser Asp val ile pro Thr Asp Thr
50 55 60
Ile Lys Asn Thr val Asn val Leu Ala Lys Phe Lys Gly ile Lys Ser
65 70 75 80
Ile Glu Thr Phe Ala val Thr Ile Cys Gl U Hi s phe Leu Ser Ser Phe
85 90 95
Lys His Val Ile Arg Ala Gin Val Tyr Val Glu Glu Val Pro Trp Lys
100 105 110
Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val His Ala Phe Ile Tyr Thr
115 120 125
PL 215 157 B1
pro Thr 130 Gly Thr Hi s Phe Cys Glu Val 135 Glu Gin ile 140 Arg Asn Gly pro
Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu Lys val Leu Lys Thr Thr
145 150 155 160
Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp Gin Phe Thr Thr Leu Pro
165 170 175
Glu Val Lys Asp 180 Arg Cys Phe Ala Thr 185 Gin val Tyr Cys Lys 190 Trp Arg
Tyr His Gin Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu Ala Thr Trp Asp Thr Val
195 200 205
Arg Ser Ile val Leu Gin Lys Phe Ala Gly pro Tyr Asp Lys Gly Glu
210 215 220
Tyr Ser Pro Ser Val Gin Lys Thr Leu Tyr Asp Ile Gin val Leu Ser
225 230 235 240
Leu Ser Arg val Pro Glu ile Glu Asp Met Glu Ile Ser Leu Pro Asn
245 250 255
Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys Met Gly Leu ile Asn Lys
260 265 270
Glu Glu val Leu Leu pro Leu Asp Asn Pro Tyr Gly Lys ile Thr Gly
275 280 285
Thr val Lys Arg Lys Leu Ser
290 295
<210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> PBC-DeltaNC (Fragment 44-56 z PBC-DeltaNC) <400> 14
Ala Thr Thr Val Gin Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp 1 5 10 <210> 15 <211> 936 <212> DNA <213> Papio hamadryas (pawian hamadryas) <400> 15 ccagaagaaa atggccgact accataacaa ctataaaaag aatgatgaat tggagtttgt 60 ccgaactggc tatgggaagg atatggtaaa agttctccat attcagcgag atggaaaata 120 tcacagcatt aaagaggtgg caacttcagt gcaacttact ctgagttcca aaaaagatta 180
PL 215 157 B1
cctgcatgga gataattcag atatcatccc tacagacacc atcaagaaca cagttcatgt 240
cttggcaaag tttaagggaa tcaaaagcat agaagccttt ggtgtgaata tttgtgagta 300
ttttctttct tcttttaacc atgtaatccg agctcaagtc tacgtggaag aaatcccttg 360
gaagcgtctt gaaaagaatg gagttaagca tgtccatgca tttattcaca ctcccactgg 420
aacacacttc tgtgaagttg aacaactgag aagtggaccc cccgtcatta cttctggaat 480
caaagacctc aaggtcttga aaacaacaca gtctggattt gaaggtttca tcaaggacca 540
gttcaccacc ctccctgagg tgaaggaccg atgctttgcc acccaagtgt actgcaagtg 600
gcgctaccac cagtgcaggg atgtggactt cgaggctacc tggggcacca ttcgggacct 660
tgtcctggag aaatttgctg ggccctatga caaaggcgag tactcaccct ctgtgcagaa 720
gaccctctat gatatccagg tgctctccct gagccgagtt cctgagatag aagatatgga 780
aatcagcctg ccaaacattc actacttcaa tatagacatg tccaaaatgg gtctgatcaa 840
caaggaagag gtcttgctgc cattagacaa tccatatgga aaaattactg gtacagtcaa 900
gaggaagttg tcttcaagac tgtgacattg tggcca 936
<210> 16 <211> 304 <212> PRT <213> Paplo hamadryas (pawian hamadryas) <400> 16
Met 1 Ala Asp Tyr His Asn 5 Asn Tyr Lys Lys Asn 10 Asp Glu Leu Glu 15 Phe
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met val Lys Val Leu His Ile Gin
20 25 30
Arg Asp Gly Lys Tyr Hi s Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gin
35 40 45
Leu Thr 50 Leu Ser Ser Lys Lys 55 Asp Tyr Leu His Gly 60 Asp Asn Ser Asp
Ile Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val Hi s Val Leu Ala Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Ala Phe Gly val Asn Ile Cys Glu
85 90 95
Tyr Phe Leu Ser Ser Phe Asn His Val ile Arg Ala Gin Val Tyr Val
100 105 110
Gl u Glu ile Pro Trp Lys Arg Leu Glu Lys Asn Gly val Lys His Val
115 120 125
Hi s Ala Phe Ile Hi s Thr Pro Thr Gly Thr Hi 5 Phe Cys Glu val Glu
130 135 140
PL 215 157 B1
Gin Leu Arg ser Gly Pro Pro val ile Thr Ser Gly ile 155 Lys Asp Leu 160
145 150
Lys val Leu Lys Thr Thr Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe ile Lys Asp
165 170 175
Gin Phe Thr Thr Leu Pro Glu val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin
180 185 190
val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gin cys Arg Asp val Asp Phe Glu
195 200 205
Ala Thr Trp Gly Thr Ile Arg Asp Leu val Leu Glu Lys Phe Al a Gly
210 215 220
Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gl n Lys Thr Leu Tyr
225 230 235 240
Asp Ile Gin val Leu Ser Leu Ser Arg val Pro Glu Ile Glu Asp Met
245 250 255
Glu ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys
260 265 270
Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Gl u Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro
275 280 285
Tyr Gly Lys ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu
290 295 300
Zastrzeżenia patentowe

Claims (23)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Wyizolowana urykaza wybrana z grupy składającej się z urykazy składającej się z sekwencji aminokwasowej przedstawionej na SEK NR ID: 7, urykazy składającej się z sekwencji aminokwasowej przedstawionej na SEK NR ID: 8, urykazy składającej się z sekwencji aminokwasowej przedstawionej na SEK NR ID: 12 i urykazy składającej sie z sekwencji aminokwasowej przedstawionej na SEK NR
    ID: 13.
  2. 2. Urykaza według zastrz. 1, znamienna tym, że jest urykazą PEG-ylowaną.
  3. 3. Wyizolowany kwas nukleinowy obejmujący sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje urykazę określoną w zastrz. 1.
  4. 4. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 3, znamienny tym, że sekwencja kwasu nukleinowego jest połączona funkcjonalnie z heterologicznym promotorem.
  5. 5. Kwas nukleinowy według zastrz. 3, znamienny tym, że promotorem jest promotor osmB.
  6. 6. Wektor zbudowany z kwasu nukleinowego, który obejmuje kwas nukleinowy określony w zastrz. 4.
  7. 7. Komórka gospodarza obejmująca wektor określony w zastrz. 6.
  8. 8. Sposób wytwarzania urykazy, znamienny tym, że obejmuje etap hodowania komórki gospodarza określonej w zastrz. 7, w warunkach, w których sekwencja kwasu nukleinowego ulega ekspresji w komórce gospodarza, oraz etap izolowania wyrażonej urykazy.
  9. 9. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca:
    PL 215 157 B1 (a) wyizolowaną urykazę obejmującą sekwencję aminokwasową SEK. NR ID. 7; oraz (b) dopuszczalny farmaceutycznie nośnik;
    przy czym urykaza jest skoniugowana z polimerem.
  10. 10. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca:
    (a) wyizolowaną urykazę obejmującą sekwencję aminokwasową SEK. NR ID. 8; oraz (b) dopuszczalny farmaceutycznie nośnik;
    przy czym urykaza jest skoniugowana z polimerem.
  11. 11. Kompozycja farmaceutyczna według dowolnego spośród zastrz. 9 i 10, znamienna tym, że polimer jest wybrany z grupy składającej się z glikolu polietylenowego, dekstranu, glikolu polipropylenowego, hydroksypropylometyIoceIulozy, karboksymetylocelulozy, poliwinylopirolidonu, alkoholu poliwinylowego.
  12. 12. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 11, znamienna tym, że obejmuje od 2 do 12 cząsteczek glikolu polietylenowego na każdą podjednostkę urykazy.
  13. 13. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 12, znamienna tym, że obejmuje od 3 do 10 cząsteczek glikolu polietylenowego na każdą podjednostkę urykazy.
  14. 14. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 11, znamienna tym, że każda cząsteczka glikolu polietylenowego ma ciężar cząsteczkowy w zakresie od 1 000 do 100 000.
  15. 15. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 14, znamienna tym, że każda cząsteczka glikolu polietylenowego ma ciężar cząsteczkowy w zakresie od 1 000 do 50 000.
  16. 16. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 15, znamienna tym, że każda cząsteczka glikolu polietylenowego ma ciężar cząsteczkowy w zakresie od 5 000 do 20 000.
  17. 17. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 16, znamienna tym, że każda cząsteczka glikolu polietylenowego ma ciężar cząsteczkowy wynoszący około 10 000.
  18. 18. Sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zmniejszania poziomów kwasu moczowego w płynach biologicznych u wymagającego tego osobnika, znamienny tym, że obejmuje:
    (a) wytwarzanie koniugatu urykazy o sekwencji aminokwasowej SEK. NR ID. 7 z polimerem;
    oraz (b) dodawanie koniugatu urykazy do dopuszczalnego farmaceutycznie nośnika.
  19. 19. Sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zmniejszania poziomów kwasu moczowego w płynach biologicznych u wymagającego tego osobnika, znamienny tym, że obejmuje:
    (a) wytwarzanie koniugatu urykazy o sekwencji aminokwasowej SEK. NR ID. 8 z polimerem;
    oraz (b) dodawanie koniugatu urykazy do dopuszczalnego farmaceutycznie nośnika.
  20. 20. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że płynem biologicznym jest krew.
  21. 21. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że płynem biologicznym jest krew.
  22. 22. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że polimer jest wybrany z grupy składającej się z glikolu polietylenowego, dekstranu, glikolu polipropylenowego, hydroksypropylometylocelulozy, karboksymetylocelulozy, poliwinylopirolidonu, alkoholu poliwinylowego.
  23. 23. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że polimer jest wybrany z grupy składającej się z glikolu polietylenowego, dekstranu, glikolu polipropylenowego, hydroksypropyIometylocelulozy, karboksymetylocelulozy, poliwinylopirolidonu, alkoholu poliwinylowego.
PL384263A 2005-04-11 2006-04-11 Wyizolowana urykaza, zawierajaca ja kompozycja farmaceutyczna, kodujacy ja wyizolowany kwas nukleinowy, zawierajacy go wektor i obejmujaca ten wektor komórka gospodarza oraz sposoby wytwarzania urykazy oraz zawierajacej urykaze kompozycji farmaceutycznej PL215157B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US67054105P 2005-04-11 2005-04-11

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL384263A1 PL384263A1 (pl) 2008-07-21
PL215157B1 true PL215157B1 (pl) 2013-10-31

Family

ID=37087650

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL384263A PL215157B1 (pl) 2005-04-11 2006-04-11 Wyizolowana urykaza, zawierajaca ja kompozycja farmaceutyczna, kodujacy ja wyizolowany kwas nukleinowy, zawierajacy go wektor i obejmujaca ten wektor komórka gospodarza oraz sposoby wytwarzania urykazy oraz zawierajacej urykaze kompozycji farmaceutycznej

Country Status (18)

Country Link
US (6) US7811800B2 (pl)
EP (2) EP2918676B1 (pl)
JP (3) JP2008535499A (pl)
KR (1) KR101304289B1 (pl)
CN (2) CN101194016B (pl)
AU (1) AU2006235437B2 (pl)
BR (1) BRPI0612942A2 (pl)
CA (1) CA2604545A1 (pl)
CZ (1) CZ2007700A3 (pl)
HU (1) HU229626B1 (pl)
IL (6) IL186511A (pl)
MX (1) MX2007012548A (pl)
NZ (1) NZ562291A (pl)
PL (1) PL215157B1 (pl)
RU (1) RU2435847C2 (pl)
SG (3) SG10201706384VA (pl)
TW (1) TW200716751A (pl)
WO (1) WO2006110761A2 (pl)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2245114T3 (es) 1998-08-06 2005-12-16 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Conjugados de peg-oxidasa de urato y su uso.
US20080159976A1 (en) * 2005-04-11 2008-07-03 Jacob Hartman Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase
US8148123B2 (en) * 2005-04-11 2012-04-03 Savient Pharmaceuticals, Inc. Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase
PT3321359T (pt) 2005-04-11 2021-03-11 Horizon Pharma Rheumatology Llc Formas variantes de urato-oxidase e a sua utilização
US9534013B2 (en) * 2006-04-12 2017-01-03 Horizon Pharma Rheumatology Llc Purification of proteins with cationic surfactant
JP4890134B2 (ja) * 2006-07-20 2012-03-07 東洋紡績株式会社 ウリカーゼの安定性を向上させる方法、および安定性の向上した改変型ウリカーゼ
JP4890132B2 (ja) * 2006-07-20 2012-03-07 東洋紡績株式会社 ウリカーゼの比活性を向上させる方法、および比活性の向上した改変型ウリカーゼ
JP4890133B2 (ja) * 2006-07-20 2012-03-07 東洋紡績株式会社 安定な尿酸測定試薬
SG10201408480RA (en) 2009-06-25 2015-02-27 Crealta Pharmaceuticals Llc Methods for preventing or predicting infusion reactions or antibody-mediated loss of response, by monitoring serum uric acid levels during pegylated uricase therapy
CN102051348B (zh) * 2009-10-27 2012-10-03 重庆富进生物医药有限公司 人源化重组尿酸酶及其突变体
US8940861B2 (en) 2010-04-08 2015-01-27 Georgia Tech Research Corporation Variants of ancestral uricases and uses thereof
CN102634492B (zh) 2011-02-14 2015-06-10 重庆富进生物医药有限公司 聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物及其制备方法和应用
CN102827073A (zh) 2011-06-17 2012-12-19 安吉奥斯医药品有限公司 治疗活性组合物和它们的使用方法
US9474779B2 (en) 2012-01-19 2016-10-25 Agios Pharmaceuticals, Inc. Therapeutically active compositions and their methods of use
EP2986720B1 (en) 2013-04-17 2017-09-06 Council of Scientific & Industrial Research Uricase mutants
WO2015006591A1 (en) 2013-07-11 2015-01-15 Agios Pharmaceuticals, Inc. 2,4- or 4,6-diaminopyrimidine compounds as idh2 mutants inhibitors for the treatment of cancer
WO2015003360A2 (en) 2013-07-11 2015-01-15 Agios Pharmaceuticals, Inc. Therapeutically active compounds and their methods of use
WO2015003355A2 (en) 2013-07-11 2015-01-15 Agios Pharmaceuticals, Inc. Therapeutically active compounds and their methods of use
US9579324B2 (en) 2013-07-11 2017-02-28 Agios Pharmaceuticals, Inc Therapeutically active compounds and their methods of use
US20150031627A1 (en) 2013-07-25 2015-01-29 Agios Pharmaceuticals, Inc Therapeutically active compounds and their methods of use
AU2015229214B2 (en) 2014-03-14 2019-07-11 Les Laboratoires Servier Pharmaceutical compositions of therapeutically active compounds
BR112017024212A2 (pt) * 2015-05-15 2018-07-17 Medimmune Llc sequências de uricases melhoradas e métodos de tratamento
CN106554948B (zh) * 2015-09-29 2019-06-25 上海生物制品研究所有限责任公司 突变型尿酸酶、peg修饰的突变型尿酸酶及其应用
DK3362066T3 (da) 2015-10-15 2021-11-22 Les Laboratoires Servier Sas Kombinationsterapi til behandling af maligniteter
SG11201803088PA (en) 2015-10-15 2018-05-30 Agios Pharmaceuticals Inc Combination therapy for treating malignancies
EP3538135A4 (en) 2016-11-11 2020-07-29 Horizon Pharma Rheumatology LLC POLYTHERAPIES OF PREDNISONE AND URICASE MOLECULES AND THEIR USES
US10980788B2 (en) 2018-06-08 2021-04-20 Agios Pharmaceuticals, Inc. Therapy for treating malignancies
CN109207479A (zh) * 2018-09-07 2019-01-15 大连大学 海洋低温尿酸氧化酶启动子和终止子
CN111088268B (zh) * 2019-03-05 2022-08-02 北京锦篮基因科技有限公司 一种高尿酸血症的基因治疗药物
CN113244412B (zh) * 2021-06-25 2021-10-26 深圳市瑞吉生物科技有限公司 一种基于mRNA剂型的治疗高尿酸血症或痛风的药物及其制备方法
WO2023233034A1 (en) 2022-06-03 2023-12-07 Boehringer Ingelheim International Gmbh Recombinant expression of myeloid-derived growth factor

Family Cites Families (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3451996A (en) * 1968-02-12 1969-06-24 Thompson Farms Co Method for the preparation of heparin
US3616231A (en) * 1968-11-14 1971-10-26 Boehringer Mannheim Gmbh Process for the production of uricase
US3931399A (en) * 1970-12-22 1976-01-06 Behringwerke Aktiengesellschaft Process for isolating a fibrin-stabilizing factor
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4169764A (en) * 1975-08-13 1979-10-02 Ajinomoto Co., Inc. Process for production of urokinase
US4141973A (en) * 1975-10-17 1979-02-27 Biotrics, Inc. Ultrapure hyaluronic acid and the use thereof
US4301153A (en) * 1977-03-21 1981-11-17 Riker Laboratories, Inc. Heparin preparation
US4425431A (en) * 1978-04-20 1984-01-10 Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd. Production of an allose-containing polysaccharide
US4312979A (en) * 1978-04-20 1982-01-26 Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd. Polysaccharides containing allose
JPS6031472B2 (ja) * 1978-12-14 1985-07-22 協和醗酵工業株式会社 酸性ウリカ−ゼ
JPS5599189A (en) 1979-01-22 1980-07-28 Mihama Hisaharu Modified uricase free from antigenicity and its preparation
DE2916711A1 (de) * 1979-04-25 1980-11-06 Behringwerke Ag Blutgerinnungsfaktoren und verfahren zu ihrer herstellung
FR2475900A1 (fr) * 1980-02-20 1981-08-21 Fabre Sa Pierre Complexe vaccinal contenant un antigene specifique et vaccin le contenant
JPS5740503A (en) * 1980-08-22 1982-03-06 Seikagaku Kogyo Co Ltd Separation of saccharides
FR2497006A1 (fr) 1980-12-24 1982-06-25 Ind Electro Ste Gle Contacts electriques pour cables coaxiaux et cables bifilaires
DE3126759A1 (de) * 1981-07-07 1983-01-27 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Loesliche leber-uricase, verfahren zu ihrer herstellung und verwendung
US4485176A (en) * 1982-06-28 1984-11-27 E. I. Du Pont De Nemours & Company Turbidimetric method for measuring protein in urine and cerebrospinal fluid
EP0109688A3 (en) * 1982-11-23 1986-12-03 The Wellcome Foundation Limited Improved complexes, processes for obtaining them and formulations containing such complexes
US4732863A (en) 1984-12-31 1988-03-22 University Of New Mexico PEG-modified antibody with reduced affinity for cell surface Fc receptors
JPH0671425B2 (ja) * 1985-06-05 1994-09-14 サッポロビール株式会社 ウリカ−ゼおよびその製造法
US4766106A (en) * 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4917888A (en) * 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
AU597924B2 (en) * 1985-12-11 1990-06-14 Natinco Nv Solubilization of protein aggregates
DD279486A1 (de) 1986-03-10 1990-06-06 Akad Wissenschaften Ddr Verfahren zur aktivierung von hydroxylgruppenhaltigen polymeren verbindungen
JPS6255079A (ja) 1986-04-23 1987-03-10 Mihama Hisaharu 修飾ウリカ−ゼ
AU612133B2 (en) * 1987-02-20 1991-07-04 Natinco Nv Production of proteins in active forms
CA1305285C (en) * 1987-04-21 1992-07-14 Malcolm Roy Brandon Production of proteins in active forms
AU609824B2 (en) * 1987-06-15 1991-05-09 Southern Cross Biotech Pty Ltd. Production of proteins in active forms
US5080891A (en) * 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US4847325A (en) * 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US4945086A (en) * 1988-05-03 1990-07-31 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Smooth muscle cell growth inhibitor
US5955336A (en) * 1988-08-17 1999-09-21 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha DNA sequence for uricase and manufacturing process of uricase
US5349052A (en) * 1988-10-20 1994-09-20 Royal Free Hospital School Of Medicine Process for fractionating polyethylene glycol (PEG)-protein adducts and an adduct for PEG and granulocyte-macrophage colony stimulating factor
US5324844A (en) * 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5010183A (en) * 1989-07-07 1991-04-23 Macfarlane Donald E Process for purifying DNA and RNA using cationic detergents
NZ234453A (en) 1989-07-13 1993-01-27 Sanofi Sa Recombinant dna encoding urate oxidase, and vector, host, protein and pharmaceutical compositions associated therewith
US5382518A (en) * 1989-07-13 1995-01-17 Sanofi Urate oxidase activity protein, recombinant gene coding therefor, expression vector, micro-organisms and transformed cells
US5286637A (en) * 1989-08-07 1994-02-15 Debiopharm, S.A. Biologically active drug polymer derivatives and method for preparing same
KR927003090A (ko) * 1989-08-23 1992-12-17 하다사 메디칼 오르가니제이션 헤파린효소를 포함하는 상처 치유 약제
JPH03148298A (ja) 1989-11-01 1991-06-25 Sumitomo Pharmaceut Co Ltd 修飾ペプチドおよびその製造方法
US5766897A (en) * 1990-06-21 1998-06-16 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Cysteine-pegylated proteins
US5653974A (en) * 1990-10-18 1997-08-05 Board Of Regents,The University Of Texas System Preparation and characterization of liposomal formulations of tumor necrosis factor
ATE359842T1 (de) * 1991-07-02 2007-05-15 Nektar Therapeutics Abgabevorrichtung für nebelförmige medikamente
YU66892A (sh) 1991-08-20 1995-10-24 Hoechst Ag. Fosfoinositolglikan - peptid sa delovanjem kao insulin
US5298643A (en) * 1992-12-22 1994-03-29 Enzon, Inc. Aryl imidate activated polyalkylene oxides
US5321095A (en) * 1993-02-02 1994-06-14 Enzon, Inc. Azlactone activated polyalkylene oxides
AU6240494A (en) 1993-02-16 1994-09-14 Enzon, Inc. Ribosome inactivating protein compositions having reduced antigenicity
JP3875730B2 (ja) 1993-02-22 2007-01-31 サノフィ・アベンティス株式会社 自己免疫疾患の予防治療剤
US6385312B1 (en) * 1993-02-22 2002-05-07 Murex Securities, Ltd. Automatic routing and information system for telephonic services
US5298410A (en) * 1993-02-25 1994-03-29 Sterling Winthrop Inc. Lyophilized formulation of polyethylene oxide modified proteins with increased shelf-life
AU682361B2 (en) 1993-04-09 1997-10-02 Bio-Technology General Corporation Novel polypeptide having factor XA inhibitory activity
WO1995000162A1 (en) * 1993-06-21 1995-01-05 Enzon, Inc. Site specific synthesis of conjugated peptides
US5919455A (en) * 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5643575A (en) * 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
WO1995011987A1 (en) 1993-10-29 1995-05-04 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Chimeric proteins including protease nexin-1 variants
US5795776A (en) 1994-03-22 1998-08-18 Bio-Technology General Corp. Expression plasmids regulated by an OSMB promoter
FI96317C (fi) * 1994-05-31 1996-06-10 Exavena Oy Menetelmä hienojakoisten ja muunnettujen tärkkelyksien valmistamiseksi
DE4423131A1 (de) * 1994-07-01 1996-01-04 Bayer Ag Neue hIL-4-Mutantenproteine als Antagonisten oder partielle Agonisten des humanen Interleukin 4
US5633227A (en) * 1994-09-12 1997-05-27 Miles, Inc. Secretory leukocyte protease inhibitor as an inhibitor of tryptase
CA2206852A1 (en) * 1994-12-07 1996-06-13 Novo Nordisk A/S Polypeptide with reduced allergenicity
US5932462A (en) * 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
IL116696A (en) * 1995-01-25 1999-08-17 Bio Technology General Corp Production of enzymatically active recombinant carboxypeptidase b
FR2733914B1 (fr) * 1995-05-11 1997-08-01 Sanofi Sa Composition de liquide stable contenant de l'urate oxydase et composition lyophilisee pour sa preparation
JPH09154581A (ja) 1995-12-05 1997-06-17 Asahi Chem Ind Co Ltd ウリカーゼを生産する実質上純粋な微生物
US6006753A (en) 1996-08-30 1999-12-28 Eli Lilly And Company Use of GLP-1 or analogs to abolish catabolic changes after surgery
ATE342729T1 (de) 1997-01-15 2006-11-15 Phoenix Pharmacologics Inc Modifizierter tumor-nekrosefaktor
KR100369838B1 (ko) 1997-02-26 2003-09-29 주식회사 엘지생명과학 한국형c형간염바이러스의비구조단백질3에서유래한단백질분해효소단백질및그의제조방법
JPH1175876A (ja) * 1997-07-04 1999-03-23 Ajinomoto Co Inc 新規な微生物トランスグルタミナーゼの製造法
WO1999062936A1 (en) * 1998-06-01 1999-12-09 Genentech, Inc. Separation of protein monomers from aggregates by use of ion-exchange chromatography
KR100614212B1 (ko) * 1998-08-06 2006-08-21 마운틴 뷰 파마슈티컬즈 인크. 피이지-유레이트 옥시데이즈 접합체 및 그의 이용
US6783965B1 (en) 2000-02-10 2004-08-31 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates
CN1322243A (zh) 1998-08-06 2001-11-14 杜克大学 尿酸氧化酶
ES2245114T3 (es) * 1998-08-06 2005-12-16 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Conjugados de peg-oxidasa de urato y su uso.
US6429860B1 (en) * 1999-06-15 2002-08-06 Visicomp, Inc. Method and system for run-time visualization of the function and operation of a computer program
UA73967C2 (en) * 2000-02-14 2005-10-17 First Opinion Corp Structure-based automatic processing for diagnostics (variants)
US6913915B2 (en) * 2001-08-02 2005-07-05 Phoenix Pharmacologics, Inc. PEG-modified uricase
AU2002365360A1 (en) 2001-11-28 2003-06-10 Biopolymed Inc. Biologically active non-antigenic copolymer and conjugates thereof and methods for producing the same
US9534013B2 (en) * 2006-04-12 2017-01-03 Horizon Pharma Rheumatology Llc Purification of proteins with cationic surfactant
PT3321359T (pt) * 2005-04-11 2021-03-11 Horizon Pharma Rheumatology Llc Formas variantes de urato-oxidase e a sua utilização
US8148123B2 (en) * 2005-04-11 2012-04-03 Savient Pharmaceuticals, Inc. Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase
US20080159976A1 (en) * 2005-04-11 2008-07-03 Jacob Hartman Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase

Also Published As

Publication number Publication date
US8293228B2 (en) 2012-10-23
WO2006110761A3 (en) 2007-03-08
SG161248A1 (en) 2010-05-27
SG10201706384VA (en) 2017-09-28
CN101194016A (zh) 2008-06-04
US20120225046A1 (en) 2012-09-06
US20090209021A1 (en) 2009-08-20
HUP0700729A3 (en) 2012-09-28
EP2918676A1 (en) 2015-09-16
RU2007141683A (ru) 2009-05-20
KR101304289B1 (ko) 2013-09-12
CZ2007700A3 (cs) 2008-02-27
US20110104751A1 (en) 2011-05-05
US7964381B2 (en) 2011-06-21
NZ562291A (en) 2010-02-26
US8465735B2 (en) 2013-06-18
AU2006235437B2 (en) 2011-11-24
KR20080007360A (ko) 2008-01-18
US20120070876A1 (en) 2012-03-22
EP1871877A2 (en) 2008-01-02
AU2006235437A1 (en) 2006-10-19
BRPI0612942A2 (pt) 2012-10-09
EP2918676B1 (en) 2018-01-31
CN102807973A (zh) 2012-12-05
IL223476A (en) 2017-12-31
MX2007012548A (es) 2008-03-11
IL281228A (en) 2021-04-29
JP2015077144A (ja) 2015-04-23
IL208643A0 (en) 2011-07-31
IL256157B (en) 2021-03-25
IL186511A0 (en) 2008-01-20
US20130084273A1 (en) 2013-04-04
SG2014009484A (en) 2014-05-29
PL384263A1 (pl) 2008-07-21
CN101194016B (zh) 2012-09-05
HUP0700729A2 (en) 2008-03-28
IL186511A (en) 2012-12-31
US8034594B2 (en) 2011-10-11
US8178334B2 (en) 2012-05-15
IL223477A (en) 2017-10-31
IL256157A (en) 2018-02-28
WO2006110761A2 (en) 2006-10-19
JP2008535499A (ja) 2008-09-04
IL223477A0 (en) 2013-02-03
TW200716751A (en) 2007-05-01
US20110217755A1 (en) 2011-09-08
HU229626B1 (en) 2014-03-28
CA2604545A1 (en) 2006-10-19
IL223476A0 (en) 2013-02-03
RU2435847C2 (ru) 2011-12-10
US7811800B2 (en) 2010-10-12
JP2013090636A (ja) 2013-05-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10160958B2 (en) Variant forms of urate oxidase and use thereof
PL215157B1 (pl) Wyizolowana urykaza, zawierajaca ja kompozycja farmaceutyczna, kodujacy ja wyizolowany kwas nukleinowy, zawierajacy go wektor i obejmujaca ten wektor komórka gospodarza oraz sposoby wytwarzania urykazy oraz zawierajacej urykaze kompozycji farmaceutycznej
AU2011257764B2 (en) A variant form of urate oxidase and use thereof