CZ2007700A3 - Variantní forma urátoxidázy a její použití - Google Patents

Abstract

Rešení se týká geneticky modifikovaných proteinu s urikolytickou aktivitou. Konkrétne se též týká proteinu zahrnujících zkrácené urátoxidázy a zpusobu jejich prípravy, vcetne PEGylovaných proteinu zahrnujících zkrácené urátoxidázy.

Description

(57) Anotace:

Řešení se týká geneticky modifikovaných proteinů s urikolytickou aktivitou. Konkrétně se též týká proteinů zahrnujících zkrácené urátoxidázy a způsobů jejich přípravy, včetně PEGylovaných proteinů zahrnujících zkrácené urátoxidázy.

CZ 2007 - 700 A3 • · · ·

Variantní forma urátoxidázy a její použití

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká geneticky modifikovaných proteinů s urikolytickou aktivitou. Konkrétně se vynález týká proteinů zahrnujících zkrácené urátoxidázy a způsobů jejich přípravy.

Dosavadní stav techniky

Výrazy urátoxidáza a urikáza se zde používají zaměnitelně. Urátoxidázy (urikázy, E.C. 1.7.3.3) jsou enzymy, které katalyzují oxidaci kyseliny močové na rozpustnější produkt alantoin, což je purinový metabolit, který je snadněji vylučován. Kvůli několika mutacím v genu pro urikázu, získaným během evoluce vyšších primátů, lidé enzymově aktivní urikázu neprodukují. Wu, X et al., (1992) J.Mol.Evol 34:78-84, úplné zněm je zde začleněno formou odkazu. V důsledku toho mohou nadměrné koncentrace kyseliny močové v krvi (hyperurikémie) vést u náchylných jedinců k bolestivé artritidě (dna), znetvořujícímu ukládání urátu (tofus) a selhání ledvin. Dostupné léky, např. allopurinol (inhibitor syntézy kyseliny močové) u některých postižených jedinců vyvolávají vedlejší účinky, které léčbu limitují, nebo dostatečně tyto chorobné stavy nezmírňují. Hande, KR et al:, (1984) AmJ.Med 76:4756, Fam, AG, (1990) Baillierďs Clin Rheumatol 4:177-192, úplné znění obou prací je zde začleněno formou odkazu. Injekce urikázy mohou hyperurikémii a hyperurikosurii alespoň přechodně snížit. Jelikož urikáza je pro člověka cizí protein, již první injekce nemodifikovaného proteinu z Aspergillus flavus vyvolala u několika procent léčených pacientů anafylaktické reakce (Pui, C-H et al., (1997) Leukemia 11:1813-1816, úplné znění je zde začleněno formou odkazu), a imunologické odpovědi její využitelnost pro chronickou nebo periodickou léčbu limitují. Donadio, D et al., (1981) Noův Presse Med 10:711-712, Leaustic, M et al., (1983) Rev Rhum Mal Osteoartic 50:553-554, úplné znění obou prací je zde začleněno formou odkazu.

Předkládaný vynález se týká mutantmch rekombinantmch urikázových proteinů, které jsou zkrácené a mají zvýšenou strukturální stabilitu.

··· · ·· · ······ • · · · · ·

Λ ········ · · · · · · ··· · ······· ··

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje nové rekombinantní urikázové proteiny. Proteiny podle předkládaného vynálezu jsou zkrácené a mají mutované aminokyseliny ve srovnám s přirozeně se vyskytujícími urikázové proteiny.

Vynález poskytuje mutantní rekombinantní urikázu obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 8. Vynález dále poskytuje mutantní rekombinantní urikázu obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 13.

Předkládaný vynález dále poskytuje prostředek pro metabolizaci kyseliny močové, kde je zahrnut nový rekombinantní urikázový protein s urikolytickou aktivitou. Urikolytická aktivita se zde používá v souvislosti s označením enzymové konverze kyseliny močové na alantoin.

V dalším provedení urikáza obsahuje v polohách 8 až 287 aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 7 nebo SEQ ID č. 12. Vynález dále poskytuje urikázy obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 8 nebo SEQ ID č. 13. V jednom provedení urikáza obsahuje na aminovém konci aminokyselinu, kterou je alanin, glycin, prolin, serin nebo threonin. V konkrétním provedení je na aminovém konci aminokyselina methionin.

Vynález dále poskytuje izolované nukleové kyseliny obsahující sekvenci, která kóduje urikázu podle vynálezu. V konkrétních provedeních je nukleová kyselina kódující urikázu připojená k heterologmmu promotoru, například promotoru osmB. Vynález dále poskytuje vektory obsahující nukleovou kyselinu kódující urikázu, hostitelské buňky obsahující takové vektory a způsoby přípravy urikázy zahrnující kultivaci hostitelské buňky za podmínek, kdy se sekvence nukleových kyselin exprimuje hostitelskou buňkou a exprimovaná urikáza se izoluje.

Stručný popis obrázků

Obrázek 1 zobrazuje strukturu plasmidu pOUR-P-ON-ks-1. Čísla vedle restrikčmch míst označují polohu nukleotidu vzhledem k místu Haell, označenému jako 1. Restrikční místa, která během klonování mizí, jsou uvedena v závorkách.

Obrázek 2 zobrazuje DNA a odvozené aminokyselinové sekvence urikázy prasečí KSΔΝ (SEQ ID č. 9 a SEQ ID č. 7). Číslování aminokyselin na Obrázku 2 se vztahuje k úplné sekvenci prasečí urikázy. V sekvenci prasečí urikázy za iniciačním methioninovým zbytkem nahrazuje aspartamovou kyselinu v poloze 7 threonin. Vyznačená jsou restrikční místa, která • · · · se používají pro různé kroky subklonování. 3'-Netranslatované sekvence jsou označené malými písmeny. Hvězdička označuje stop kodon translace.

Obrázek 3 ukazuje relativní uspořádám odvozených aminokyselinových sekvencí různých rekombinantmch sekvencí prasečí urikázy (SEQ ID č. 11), PBC-ANC (SEQ ID č. 12) a prasečí KS-ΔΝ (SEQ ID č. 7). Hvězdička označuje polohy, ve kterých jsou rozdíly v aminokyselinách u prasečí KS-ΔΝ ve srovnám s publikovanou sekvencí prasečí urikázy, kroužky označují polohy, ve kterých jsou rozdíly v aminokyselinách u prasečí KS-ΔΝ ve srovnám s PBC-ΔΝ. Čárkovaně jsou vyznačené delece aminokyselin.

Obrázek 4 zobrazuje SDS-PAGE prasečí urikázy a velmi čistých variant urikázy připravených podle příkladů 1 až 3. Pro každý vzorek je vyznačeno datum přípravy (měsíc/rok) a odpovídající číslo pásu, viz následující klíč. Na ose Y je vyznačená molekulová hmotnost pomocí markérů a nahoře na obrázku jsou vyznačená čísla pásů. Pás 1 - markéry molekulové hmotnosti, Pás 2 - prasečí KS-AN (7/98), Pás 3 - prasečí (9/98), Pás 4 - prasečí KS (6/99), Pás 5 - prasečí KS (6/99), Pás 6 - prasečí-AN (6/99), Pás 7 - prasečí KS-AN (7/99), Pás 8 - prasečí KS-AN (8/99).

Obrázek 5 zobrazuje farmakokinetické profily PEGylované (9x10 kDa) prasečí KSAN urikázy na krysách následně po IM (intramuskulámí), SC (podkožní) a IV (intravenózní) injekci, stanovené sledováním enzymové aktivity v krevních vzorcích. Urikázová aktivita ve vzorcích plazmy, odebraných ve vyznačených časových úsecích, je stanovena s pomocí kolorimetrické analýzy. Hodnoty aktivity (mAU = jednotky miliabsorbance) představují rychlost enzymatické reakce v 1 μΐ vzorku plazmy. Biodostupnost (množství léku v oběhu ve srovnám s IV injekcí) IV aplikované urikázy byla spočítaná z plochy pod křivkou v grafů.

Obrázek 6 zobrazuje farmakokinetické profily PEGylované (9x ÍOkDa) prasečí KSAN urikázy u králíků následně po IM (intramuskulámí), SC (podkožní) a IV (intravenózní) injekci, stanovené sledováním enzymové aktivity v krevních vzorcích. Urikázová aktivita ve vzorcích plazmy, odebraných ve vyznačených časových úsecích, je stanovena s pomocí kolorimetrické analýzy. Hodnoty aktivity (mAU = jednotky miliabsorbance) představují rychlost enzymatické reakce v 1 μΐ vzorku plazmy. Biodostupnost (množství léku v oběhu ve srovnání s IV injekcí) IV aplikované urikázy byla spočítaná z plochy pod křivkou v grafu.

Obrázek 7 zobrazuje farmakokinetické profily PEGylované (9xÍOkDa) prasečí KS-AN urikázy u psů následně po IM (intramuskulámí), SC (podkožní) a IV (intravenózní) injekci stanovené sledováním enzymové aktivity v krevních vzorcích. Urikázová aktivita ve vzorcích plazmy, odebraných ve vyznačených časových úsecích, je stanovena s pomocí kolorimetrické analýzy. Hodnoty aktivity (mAU = jednotky miliabsorbance) představují rychlost enzymatické reakce v 1 μΐ vzorku plazmy. Biodostupnost (množství léku v oběhu ve srovnání s IV injekcí) IV aplikované urikázy byla spočítaná z plochy pod křivkou v grafu.

Obrázek 8 zobrazuje farmakokinetické profily PEGylované (9xlOkDa) prasečí KS-ΔΝ urikázy u prasat následně po IM (intramuskulámí), SC (podkožní) a IV (intravenózní) injekci stanovené sledováním enzymové aktivity v krevních vzorcích. Urikázová aktivita ve vzorcích plazmy, odebraných ve vyznačených časových úsecích, je stanovena s pomocí kolorimetrické analýzy. Hodnoty aktivity (mAU = jednotky miliabsorbance) představují rychlost enzymatické reakce v 1 μΐ vzorku plazmy. Biodostupnost (množství léku v oběhu ve srovnám s IV injekcí) IV aplikované urikázy byla spočítaná z plochy pod křivkou v grafu.

Detailní popis vynálezu

Předchozí studie uvádějí, že pokud podstatný pokles imunogenity a/nebo antigenity urikázy je dosažen pomocí PEGylace, je to vždy spojeno se značnou ztrátou urikolytické aktivity. Negativním dopadem bezpečnosti, výhodnosti a rentability bioléčiv je vždy pokles jejich síly a výsledná potřeba zvýšit podávanou dávku. Proto jsou zapotřebí bezpečné účinné alternativní způsoby pro snížení zvýšených hladin kyseliny močové v tělesných tekutinách včetně krve. Předkládaný vynález poskytuje mutantm rekombinantní urikázu obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 7, SEQ ID č.8, SEQ ID č. 12 nebo SEQ ID č. 13.

Pokud není stanoveno jinak, zde používaná urikáza zahrnuje jednotlivé podjednotky i tetramer.

V konkrétním provedení urikáza obsahuje na aminovém konci methionin. Tento methionin lze odstranit posttranslačm modifikací. V konkrétních provedeních se methionin na aminovém konci odstraní po přípravě urikázy. V konkrétním provedení se methionin odstraní endogenní bakteriální aminopeptidázou. Předposlední aminokyselina umožňuje odstranění Nkoncového methioninu bakteriální methionin-aminopeptidázou (MAP). Aminokyselinami umožňujícími co nejúplnější odstranění N-koncového methioninu jsou alanin, glycin, prolin, serin a threonin. V konkrétním provedení urikáza na aminové konci obsahuje dvě aminokyseliny, kterými jsou methionin následovaný aminokyselinou vybranou ze skupiny skládající se z alaninu, glycinu, prolinu, šeřinu a threoninu.

Vynález poskytuje sekvenci nukleových kyselin kódující urikázu.

Vynález poskytuje vektor obsahující sekvenci nukleových kyselin.

V konkrétním provedení se urikáza izoluje. V dalším provedení se urikáza čistí. V dalších provedeních se urikáza izoluje a čistí.

Vynález poskytuje hostitelskou buňku obsahující vektor, který obsahuje sekvenci nukleových kyselin kódující urikázu.

Vynález poskytuje způsob přípravy sekvence nukleových kyselin kódující urikázu, kdy se sekvence nukleových kyselin kódující urikázu modifikuje pomocí techniky PCR (polymerázová řetězová reakce). Odborník v oboru ví, že požadovaná sekvence nukleových kyselin se připravuje pomocí PCR přes syntetické oligonukleotidové primery, které jsou komplementární k oblastem cílové DNA (jeden pro každé vlákno), které mají být amplifikovány. Primery se přidávají k cílové DNA (nemusí být čištěná), v přítomnosti nadbytku deoxynukleotidů a Taq polymerázy, tepelně stálé DNA polymerázy. V sérii teplotních cyklů (typicky 30) se cílová DNA opakovaně denaturuje (při 90 °C), aneluje k primerům (typicky při 50-60 °C) a dceřiné vlákno se prodlužuje od primerů (72 °C). Dceřiná vlákna sama o sobě působí jako templáty pro následné cykly, a tak jsou DNA fragmenty odpovídající oběma primerům amplifikované spíše exponenciálně než lineárně.

Vynález poskytuje způsob přípravy mutantní rekombinantní urikázy, kdy se hostitelská buňka transfektuje vektorem, přičemž hostitelská buňka exprimuje urikázu, mutantní rekombinantní urikáza se izoluje z hostitelské buňky, čištěná mutantní rekombinantní urikáza se izoluje s použitím chromatografických technik a mutantní rekombinantní urikáza se čistí. Urikázu lze připravit způsoby popsanými například v mezinárodní patentové publikaci č. WO 00/08196 a US přihlášce č. 60/095 489, jejichž úplné zněm je zde začleněno formou odkazu.

Ve výhodném provedení se hostitelská buňka upraví tak, aby exprimovala mutantní rekombinantní urikázu. Odborník v oboru ví, že transfekce buněk vektorem se obvykle provádí s použitím DNA vy srážené vápenatými ionty, ačkoliv mohou být použité i jiné metody (např. elektroporace).

Urikázu lze izolovat a/nebo čistit libovolným způsobem známým odborníkům v oboru. Exprimované polypeptidy podle vynálezu jsou obecně izolované v podstatě v čisté formě. Výhodně jsou polypeptidy izolované v čistotě nejméně 80 % hmotnostních, výhodněji v čistotě nejméně 95 % hmotnostních a nejvýhodněji v čistotě nejméně 99 % hmotnostních. Čištění se obecně provádí s použitím standardních technik, například frakcionace síranem amonným, SDS-PAGE elektroforézou a afínitm chromatografií. Urikáza se výhodně izoluje s použitím kationtového surfaktantu, například cetylpyridinium-chloridu (CPC), způsobem popsaným v kopendující US patentové přihlášce podané 11. dubna 2005 pod číslem 60/670,520, patentová přihláška č. 103864.146644, s názvem Čištění proteinů kationtovým surfaktantem, jejíž úplné zněm je zde začleněno formou odkazu.

• · • ·

V dalším provedení vynálezu je vektor řízen promotorem citlivým k osmotickému tlaku. Promotor je oblast DNA, ke které se RNA polymerázy vážou před iniciací transkripce DNA na RNA. Promotor citlivý k osmotickému tlaku iniciuje transkripci jako výsledek zvýšeného osmotického tlaku zaznamenaného buňkou.

Urikáza podle vynálezu zahrnuje urikázu, která je konjugovaná s polymerem, například urikázu konjugovanou s polyethylenglykolem, tzn. PEGylovanou urikázu.

V jednom provedení vynález poskytuje farmaceutický přípravek obsahující urikázu. V dalším provedení je přípravek roztok urikázy. Ve výhodném provedení je roztok sterilní a vhodný pro injekci. V jednom provedení přípravek obsahuje urikázu ve formě fyziologického roztoku pufrovaného fosfátem. V dalším provedení vynález poskytuje přípravek ve vialce, výhodně s gumovou injekční zátkou. V konkrétních provedeních přípravek obsahuje urikázu v roztoku o koncentraci 2 až 16 mg urikázy na ml roztoku, 4 až 12 mg/ml nebo 6 až 10 mg/ml. Ve výhodném provedení přípravek obsahuje urikázu o koncentraci 8 mg/ml. Výhodně se množství urikázy měří vzhledem k množství proteinu.

Účinná schémata podávám přípravků podle vynálezu může určit odborník v oboru. Vhodné indikátory pro stanovení účinnosti daného schématu jsou odborníkům v oboru známé. Příklady takových indikátorů zahrnují normalizaci nebo snížení hladiny kyseliny močové v plazmě (PUA) a snížení nebo udržení PUA na hodnotě 6,8 mg/dl nebo nižší, výhodně 6 mg/dl nebo nižší. Ve výhodném provedení má subjekt léčený přípravkem podle vynálezu hodnotu PUA 6 mg/ml nebo nižší alespoň 70 %, alespoň 80 % nebo alespoň 90 % z celkové doby léčení. Například při 24-týdenm léčbě má subjekt výhodně hodnotu PUA 6 mg/ml nebo nižší alespoň po 80 % doby z 24-týdenní léčby, tzn. alespoň po dobu rovnou 134,4 dní (24 týdnů x 7 dní v týdnu x 0,8 = 134,4 dní).

V konkrétních provedeních se podává 0,5 až 24 mg urikázy v roztoku jedenkrát každé 2 až 4 týdny. Urikáza se podává libovolným vhodným způsobem, který odborník v oboru zná, například intravenózně, intramuskulámě nebo podkožně. Při intravenózním podávání se podává 0,5 mg až 12 mg urikázy. Při podkožním podávání se podávají až 24 mg urikázy. Ve výhodném provedení se urikáza podává intravenózní infuzi po dobu 30 až 240 minut. V jednom provedení se podává 8 mg urikázy jednou každé dva týdny. V konkrétních provedeních lze infuzi provádět s použitím 100 až 500 ml fyziologického roztoku. Ve výhodném provedení se podává 8 mg urikázy v roztoku po dobu 120 minut jednou každé dva týdny nebo jednou každé 4 týdny, výhodně se urikáza pro infuzi rozpustí ve 250 ml fyziologického roztoku. V konkrétních provedeních se urikáza podává po dobu léčení 3 měsíce, 6 měsíců, 8 měsíců nebo 12 měsíců. V dalších provedeních je doba léčení 12 týdnů, • · týdnů, 36 týdnů nebo 48 týdnů. V konkrétním provedení je doba léčení prodloužená, např. na 2 roky nebo delší, až po celou dobu života léčeného subjektu. Kromě toho lze použít mnohonásobné doby léčení přerušované obdobím bez léčby, např. 6 měsíců léčby následovaných 3 měsíci bez léčby, následovaných 6 dalšími měsíci léčby, atd.

V některých provedeních mohou být pro odstranění nebo redukování výskytu reakcí na infuzi při podávám urikázy profylakticky podávané protizánětlivé sloučeniny. V jednom provedení se tak podává alespoň jeden kortikosteroid, alespoň jedno antihistaminikum, alespoň jeden NSAID nebo jejich kombinace. Užitečné kortikosteroidy zahrnují betamethason, budesonid, kortison, dexamethason, hydrokortison, methylprednisolon, prednisolon, prednison a triamcinolon. Užitečné NSAID zahrnují ibuprofen, indomethacin, naproxen, aspirin, acetominofen, celecoxib a valdecoxib. Užitečná antihistaminíka zahrnují azatadin, brompheniramin, cetirizin, chlorfeniramin, clemastin, cyproheptadin, desloratadin, dexchlorfeniramin, dimenhydrinat, difenhydramin, doxylamin, fexofenadin, hydroxyzin, loratadin a fenindamin.

Ve výhodném provedení je antihistaminikum fexofenadin, NSAID je acetaminofen a kortikosteroid je hydrokortison a/nebo prednison. Výhodně se kombinace všech tří (není nutno souběžně) podává před vlastní infuzí roztoku s urikázou. Ve výhodném provedení se NSAID a antihistaminikum podávají orálně 1 až 4 hodiny před infuzí urikázy. Vhodná dávka obsahuje 30 až 180 mg, 40 až 150 mg, 50 až 120 mg, 60 až 90 mg, 60 mg, výhodně 60 mg fexofenadinu. Vhodná dávka obsahuje 500 až 1500 mg, 700 až 1200 mg, 800 až 1100 mg, 1000 mg, výhodně 1000 mg acetaminofenu. Vhodná dávka obsahuje 100 až 500 mg, 150 až 300 mg, 200 mg, výhodně 200 mg hydrokortisonu. V jednom provedení není antihistaminikum difenhydramin. V dalším provedení NSAID není acetaminofen. Ve výhodném provedení se 60 mg fexofenadinu podává orálně noc před infuzí urikázy, 60 mg fexofenadinu a 1000 mg acetaminofenu se podává orálně příští ráno a konečně 200 mg hydrokortisonu se podává těsně před infuzí roztoku s urikázou. V jednom provedení se prednison podává den, výhodně večer, před podáním urikázy. Vhodná dávka obsahuje 5 až 50 mg, výhodně 20 mg prednisonu. V některých provedeních se tato profylaktická léčba pro odstranění nebo redukování výskytu reakcí na infuzi používá pro subjekty, které dostávají nebo budou dostávat urikázu, včetně PEGylované urikázy a nePEGylované urikázy. V konkrétních provedeních se tato profylaktická léčba používá pro subjekty, které dostávají nebo budou dostávat terapeutické peptidy jiné než urikáza, přičemž jiné terapeutické peptidy jsou PEGylované nebo nePEGylované.

V jednom provedení vynálezu obsahuje farmaceutický přípravek urikázu konjugovanou s polymerem a modifikovaná urikáza si zachovává urikolytickou aktivitu. Ve výhodném provedení je urikáza PEGylovaná urikáza.

V jednom provedení vynálezu obsahuje farmaceutický přípravek urikázu, která byla modifikovaná konjugací s polymerem a modifikovaná urikáza si zachovává urikolytickou aktivitu. V konkrétním provedení se konjugáty polymer-urikáza připravují způsobem popsaným v mezinárodní patentové publikaci č. WO 01/59078 a U.S. přihlášce č. 5 09/501730, jejichž plné zněm je zde zahrnuto formou odkazu.

V jednom provedení vynálezu je polymer vybrán ze skupiny skládající se z polyethylenglykolu, dextranu, polypropylenglykolu, hydroxypropylmethylcelulózy, karboxymethylcelulózy, polyvinylpyrolidonu a polyvinylalkoholu. Ve výhodném provedení je polymer polyethylenglykol a urikáza je PEGylovaná urikáza.

V provedení vynálezu přípravek obsahuje 2-12 molekul polymeru na každou podjednotku urikázy, výhodně 3 až 10 molekul polymeru na podjednotku urikázy. V dalším provedení vynálezu má každá molekula polymeru molekulovou hmotnost v rozmezí 1 kDa až 100 kDa.

V dalším provedení vynálezu má každá molekula polymeru molekulovou hmotnost v rozmezí 1 kDa až 50 kDa. Ve výhodném provedení vynálezu má každá molekula polymeru molekulovou hmotnost v rozmezí 5 kDa až 20 kDa, 8 kDa až 15 kDa, 10 kDa až 12 kDa, výhodně 10 kDa. Ve výhodném provedení má každá molekula polymeru molekulovou hmotnost 5 kDa nebo 20 kDa. V obzvláště výhodném provedení vynálezu má každá molekula polymeru molekulovou hmotnost 10 kDa.

V dalším provedení vynálezu je přípravek vhodný pro opakované podávání.

Vynález poskytuje prostředek pro metabolizaci kyseliny močové s použitím urikázy.

Vynález poskytuje použití přípravku s urikázou pro snížení hladiny kyseliny močové v biologické tekutině.

V jednom provedení vynálezu se přípravek obsahující urikázu používá pro snížení hladiny kyseliny močové v biologické tekutině zahrnující krev.

Vynález dále poskytuje nové molekuly nukleových kyselin kódující urikázu podle vynálezu. Způsoby jejich přípravy jsou odborníkovi v oboru dobře známé. Sekvence nukleových kyselin urikázy mohou být modifikované libovolnou z mnoha strategií známých v oboru (Maniatis, T., 1990, Molecular Cloning, laboratorní manuál, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). Sekvence může být štěpena na příslušných místech restrikční endonukleázou (endonukleázami), případně následuje další enzymatická • · · · modifikace, izolace a ligace in vitro. Při přípravě genu kódujícího urikázu je zapotřebí zajistit, aby modifikovaný gen zůstal uvnitř příslušného čtecího rámce translace, nepřerušený stopsignály translace.

Nukleotidová sekvence kódující urikázový protein může být vložena do příslušného expresního vektoru, tzn. vektoru, který obsahuje nezbytné prvky pro transkripci a translaci vložené sekvence kódující protein. Pro expresi sekvence kódující protein může být použito mnoho různých systémů hostitel-vektor. Tyto systémy zahrnují, ale nejsou omezeny na systémy savčích buněk infikovaných virem (např. virus vakcinie, adenovirus, atd.), systémy hmyzích buněk infikovaných virem (např. baculovirus), mikroorganismy, např. kvasinky obsahující vektory kvasinek nebo bakterie transformované bakteriofágovou DNA, plasmidovou DNA nebo kosmidovou DNA. Prvky exprese se u těchto vektorů liší v jejich síle a specifitě. V závislosti na použitém systému hostitel-vektor lze použít libovolný z mnoha vhodných prvků transkripce a translace.

Ke konstruování expresních vektorů obsahujících chimérní gen, který se skládá z příslušných regulačních signálů pro transkripci/translaci a sekvencí kódujících protein, lze použít libovolný způsob známý pro inzerci DNA fragmentů do vektoru. Tyto způsoby mohou zahrnovat in vitro DNA rekombinantní a syntetické techniky a rekombinace in vivo (genetické rekombinace). Exprese sekvence nukleových kyselin kódující urikázový protein může být řízena druhou aminokyselinovou sekvencí, takže urikázový protein je exprimovaný v hostiteli transformovaném molekulou rekombinantm DNA. Exprese urikázy může být řízena libovolným elementem promotor/enhancer, který je v oboru známý. Promotory, které lze použít pro řízem exprese urikázy, zahrnují, ale nejsou omezeny na, oblast SV40 raného promotoru (Bemoist a Chambon, 1981, Nátuře 290:304-310), promotor obsažený v dlouhé 3'koncové repetici Rous sarkoma viru (Yamamoto et al., (1980, Cell 22:787-797), promotor herpes thymidinkinázy (Wagner et al., (1981, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 78:144-1445), regulátorové sekvence genu metallothioninu (Brinster et al., (1982, Nátuře 296:39-42); prokaryotické expresní vektory, například promotor 3-laktamázy (Villa-Kamaroff et al., (1978, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731), promotor tac (DeBoer et al., (1983, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25) a promotor osmB. V konkrétních provedeních nukleová kyselina zahrnuje sekvenci nukleových kyselin kódující urikázu operativně připojenou k heterolognímu promotoru.

Jakmile se připraví a izoluje konkrétní molekula rekombinantm DNA obsahující kódující sekvenci nukleových kyselin, lze k její propagaci použít různé způsoby v oboru známé. Jakmile je ustaven vhodný hostitelský systém a vhodné podmínky růstu, mohou být ···· rekombinantaí expresní vektory propagovány a připraveny ve velkém množství. Jak bylo výše vysvětleno, použitelné expresní vektory zahrnují, ale nejsou omezeny na následující vektory nebo jejich deriváty: lidské nebo zvířecí viry, např. virus vakcinie nebo adenovirus, hmyzí viry, např. baculovirus, kvasinkové vektory, bakteriofágové vektory (např. lambda) a plasmidové a kosmidové DNA vektory a další.

Kromě toho lze vybrat kmen hostitelské buňky, který moduluje expresi vložených sekvencí nebo modifikuje a požadovaným způsobem genový produkt upravuje. Exprese u určitých promotorů může být zvýšena v přítomnosti některých induktorů, takže lze kontrolovat expresi geneticky zkonstruovaného urikázového proteinu. Různé hostitelské buňky dále mají charakteristické a specifické mechanismy pro translační a posttranslační úpravy a modifikaci proteinů (např. glykosylace, štěpem'). K zajištění požadované modifikace a úpravy exprimovaného cizího proteinu mohou být vybrány vhodné buněčné linie nebo hostitelské systémy. Různé systémy exprese vektor/hostitel mohou různou měrou ovlivnit reakce probíhající při úpravě, například proteolytické štěpem.

V konkrétních provedeních vynálezu se exprese urikázy E. coli výhodně provádí s použitím vektorů obsahujících promotor osmB.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Konstrukce genu a expresního plasmidu pro expresi urikázy

Rekombinantní prasečí urikáza (urátoxidáza), prasečí KS-ΔΝ (protein prasečí urikázy zkrácený na aminovém konci nahrazující aminokyseliny v poloze 291 a 301 lysinem a serinem) byla exprimovaná na E. coli, K-12 kmen W3110 F-. Byla konstruována série plasmidů s výslednou pOUR-P-AN-ks-l, která po transformaci hostitelské buňky E. coli byla schopna řídit účinnou expresi urikázy.

Izolace a subklonování urikázy cDNA z prasečích a paviáních jater

Z prasečích a paviáních jater byly izolací a subklonováním relevantní RNA připraveny urikázové cDNA. Z prasečích a paviáních jater byla extrahována veškerá buněčná RNA (viz Erlich, H. A. (1989), PCR Technologie, principy a aplikace pro DNA amplifikaci, Sambrook, J. et al. (1989), Molekulární klonování: Laboratorní manuál, 2. vydání, Ausubel, F. M. et al. (1998), Současné protokoly v molekulární biologii), poté se provedla reverzní transkripce s ··«· ······· li · · · · · ··· · ······· · · použitím First-Strand cDNA Synthesis Kit (Pharmacia Biotech). PCR amplifikace byla provedena s použitím Taq DNA polymerázy (Gibco BRL, Life Technologies).

V Tabulce l jsou uvedeny syntetické oligonukleotidové primery použité pro PCR amplifikaci prasečí a paviání urátoxidázy (urikázy).

Tabulka l. Primery pro PCR Amplifikaci Urikázy cDNA

Prasečí jatemí urikáza
sensní (SEQ ID č. I)	5’ gcgcgaattccATGGCTCATTACCGTAATGACTACA 3'
anti-sensní (SEQ ID č. 2)	5' gcgctctagaagcttccatggTCACAGCCTTGAAGTCAGC 3'
Paviání (D3H) jatemí urikáza
sensní (SEQ ID č. 3)	5' gcgcgaattccATGGCCCACTACCATAACAACTAT 3'
anti-sensní (SEQ ID č. 4)	5' gcgcccatggtctagaTCACAGTCTTGAAGACAACTTCCT 3'

Sekvence restrikčmch enzymů, zavedené na konce primerů a v Tabulce l označené malými písmeny, byly sensní EcoRI a Ncol (prasečí a paviání) a anti-sensní Ncol, HindlII 5 a Xbal (prasečí), Xbal a Ncol (paviání). U paviáního sensního primeru byl třetí kodon GAC (aspartamová kyselina), přítomný v paviání urikáze, nahrazen kodonem CAC (histidin), který je v této poloze přítomný v kódující sekvenci pseudogenu lidské urátoxidázy. Rekombinantní konstrukt paviání urikázy generovaný s použitím těchto primerů je nazván D3H Paviání urikáza.

PCR produkt prasečí urikázy byl natráven EcoRI a HindlII a klonování do pUC 18 za vzniku pUC 18 - Prasečí urikáza. PCR produkt D3H paviání urikázy byl nakloňován přímo do vektoru pCRTMII, použil se TA Cloning™ (Invitrogen, Carlsbad, CA), za vzniku paviání urikázy pCR™II -D3H.

Pro transformaci kmene E. coli XLI-Blue (Stratagene, La Jolla, CA) byly použity ligované cDNA. Byla připravena plasmidová DNA obsahující klonovanou cDNA urikázu a byly selektovány a izolovány klony, které obsahují kódující sekvence DNA publikované urikázy (s výjimkou substituce D3H v paviání urikáze, viz Tabulka l). Ve vybraném klonu paviání urikázy pCR™II - D3H byly, v důsledku delece sekvencí zavedených PCR, sekvence pCR™II vedle stop-kodonu urikázy. V důsledku toho byla z 3 '-netranslatované oblasti • ·· · • · ··· · eliminována restrikční místa Xbal a Ncol, což na 5 '-konci produktu PCR umožnilo poziční klonování s použitím Ncol a BamHI, který je odvozený od vektoru pCR™II.

Subklonování urikázové cDNA do expresních vektorů pET

Subklonovám paviání urikázy

Do expresního vektoru pET-3d (Novagen, Madison, WI) byla zavedena D3H paviání cDNA obsahující celou kódující sekvenci urikázy. pCR™II - D3H paviání urikáza byla natrávena Ncol a BamHI a izoloval se fragment 960 bp. Expresní plasmid pET-3d byl natráven Ncol a BamHI a izoloval se fragment 4600 bp. Ligací těchto dvou fragmentů byla vytvořena paviání pET-3d-D3H.

Subklonování chimémí urikázy prase-pavián

Pro získání vyšší exprese, stability a aktivity rekombinantního genu byla konstruována chimémí urikáza prase-pavián (PBC). PBC byla konstruována izolováním 4936 bp fragmentu Ncol-Apal z klonu paviání pET-3d-D3H a ligací izolovaného fragmentu s 624 bp fragmentem Ncol-Apal izolovaným z pUC 18 prasečí urikázy, čímž se vytvoří pET-3d-PBC. Urikázová PBC cDNA se skládá z kodonů 1-225 prasečí urikázy spojených do rámce s kodony 226-304 paviání urikázy.

Subklonování prasečí KS urikázy

Pro vložení jednoho lysinového zbytku, který může poskytnout další místo pro PEGylaci, byla konstruována prasečí KS urikáza. KS znamená vložení aminokyseliny lysinu do prasečí urikázy v poloze 291, namísto argininu (R291K). Navíc byl threonin v poloze 301 nahrazen šermem (T301 S). Plasmid prasečí KS urikázy byl konstruován izolováním 4696 bp Ncol-Ndel fragmentu paviání pET-3d-D3H a následnou ligací s 864 bp Ncol-Ndel fragmentem izolovaným z prasečí urikázy pUC18, za vzniku pET-3d prasečí KS. Výsledná sekvence prasečí KS urikázy se skládá z kodonů 1-288 prasečí urikázy spojených do rámce s kodony 289-304 paviání urikázy.

Subklonování urikázové sekvence regulované promotorem osmB

Gen urikázy byl subklonován do expresního vektoru obsahujícího promotor osmB (podle postupu z US patentu č. 5 795 776, jehož plné zněm je zde zahrnuto formou odkazu). Tento vektor umožňuje indukci exprese proteinu jako odpověď na vysoký osmotický tlak nebo stárnutí kultury. Expresní plasmid pMFOA-18 obsahoval promotor osmB, sekvenci pro • ·· >

• · · · · · • ···· ·· ♦ • · · · · · • · · ·«··· • · · · · · • ····*·· ·· · místo navázání rybozomu (rbs) a sekvenci pro terminátor transkripce (ter). Dodává rezistenci na ampicilin (AmpR) a exprimuje rekombinantní lidskou acetylcholinu-esterázu (AChE).

Subklonovám paviání D3H urikázy

Plasmid pMFOA-18 byl natráven Ncol a BamHI a izoloval se velký fragment. Konstrukt paviání pET-3d-D3H byl natráven Ncol a BamHI a izoloval se 960 bp fragment obsahující gen D3H paviání urikázy. Tyto dva fragmenty byly ligovány za vytvoření pMFOU18.

Expresní plasmid pMFXT133 obsahuje promotor osmB, rbs (deo operon E. coli), ter (TrypA E. coli), rekombinantní polypeptidový inhibitor faktoru Xa (Fxal) a dodává gen rezistence na tetracyklin (TetR). Kvůli změně genů rezistence na antibiotika byl do tohoto plasmidu vložen gen paviání urikázy. Plasmid pMFOU18 byl natráven Ncol, vyplněn, poté natráven Xhol a izoloval se fragment 1030 bp. Plasmid pMFXT133 byl natráven Ndel, vyplněn, poté natráven Xhol a izoloval se velký fragment. Tyto dva fragmenty byly ligovány pro vytvoření expresního vektoru paviání urikázy pURBAló.

Subklonování chimémí urikázy prase-pavián

Plasmid pURBAló byl natráven Apal a AIwNI a izoloval se fragment 2320 bp. Plasmid pMFXT133 byl natráven Ndel, vyplněn, poté natráven AIwNI a izoloval se fragment 620 bp. Konstrukt pET-3d-PBC byl natráven Xbal, vyplněn, poté natráven Apal a izoloval se fragment 710 bp. Tyto tři fragmenty byly ligovány pro vytvoření pUR-PB, plasmidu exprimujícího PBC urikázu pod kontrolou promotoru osmB a rbs i T7 rbs, který byl odvozen z vektoru pET-3d.

V dalším kroku byl T7 rbs odstraněn. pUR-PB byl natráven Ncol, vyplněn, poté digestován AIwNI a izoloval se fragment 3000 bp. Plasmid pMFXT133 byl natráven Ndel, vyplněn a poté natráven AIwNI a izoloval se fragment 620 bp. Tyto dva fragmenty byly ligovány za vzniku pDUR-PB, který exprimuje PBC pod kontrolou promotoru osmB.

Konstrukce pOUR-PB-ANC

Do urikázy cDNA bylo zavedeno několik změn, které vedly k podstatnému nárůstu stability rekombinantního enzymu. Byl konstruován plasmid pOUR-PBC-ANC, u kterého byly odstraněny N-koncový maturovaný peptid se šesti zbytky a tripeptid na C-konci, které působí in vivo jako peroxyzomálm cílový signál. Toto se provedlo s použitím PCR • *· « »« ··* 9 amplifikace PBC sekvence z plasmidu pDUR-PB a specifických oligonukleotidových primerů uvedených v Tabulce 2.

Tabulka 2. Primery pro PCR amplifikaci urikázy PBC-ANC

Zvýrazněné sekvence restrikčních enzymů zavedené na konce primerů nekódující oblasti jsou v Tabulce 2 označené malými písmeny. Ndel je sensní a Xbal je antisensm. Antisensní primer byl použit také pro eliminaci vnitřního místa restrikce Ndel zavedením bodové mutace (podtržené), která neovlivňuje aminokyselinovou sekvenci, a tak usnadňuje subklonování s použitím Ndel.

Fragment 900 bp (base-pair, spárovaných baží), generovaný PCR amplifikaci pDURPB, byl štěpen Ndel a Xbal a izolován. Získaný fragment byl poté vložen do deo-expresního plasmidu pDBAST-RAT-N, který obsahuje deo-PlP2 promotor a rbs odvozený z E. coli a konstitutivně exprimuje lidský rekombinantní prekurzor insulinu. Plasmid byl natráven Ndel a Xbal, fragment 4035 bp se izoloval a ligo val do PCR produktu PBC urikázy. Výsledný konstrukt pDUR-PB-ANC byl použit pro transformaci E. coli K 12 So733 (F- cytR strA), který exprimoval vyšší hladinu aktivní zkrácené urikázy.

Také dvojitě zkrácené sekvence PBC-ANC byly exprimované pod kontrolou promotoru osmB. Plasmid pDUR-PB-ANC byl natráven AlwNI - Ndel a izoloval se fragment 3459 bp. Výše popsaný plasmid pMFXT133 byl natráven Ndel AlwNI a izoloval se fragment 660 bp. Fragmenty byly poté ligované pro vytvoření pOUR PB-ANC, který byl zaveden do E. coli K-12 kmene W3110 F’ a exprimoval vyšší hladinu aktivní zkrácené urikázy.

• ···· « ·· toto ♦··· to* · ··<··· to • · · · · « · r to·»······ ·· · · to to · ··· · ··· ···· ·· ·

Konstrukce expresního plasmidu urikázy pOUR-P-AN-ks-l

Tento plasmid byl konstruován pro vylepšení aktivity a stability rekombinantního enzymu. Prasečí urikáza KS-ΔΝ byla zkrácená pouze na N-konci (ΔΝ), kde byl odstraněn Nkoncový maturovaný peptid se šesti zbytky, a obsahovala mutace S46T, R291K a T301S. V poloze 46 byl kvůli konzervativní mutaci, ke které došlo během PCR amplifikace a klonování, namísto šeřinu zbytek threoninový. Lysin v poloze 291 nahradil arginin a v poloze 301 byl namísto threoninu vložen serin. Obě záměny byly odvozené ze sekvence paviání urikázy. Modifikace R291 K a T301 S jsou označené KS a diskutované výše. Extra lysinový zbytek poskytl další místo pro potenciální PEGylaci.

Pro konstrukci pOUR-P-AN-ks-l (Obrázek 1) byl plasmid pOUR-PB-ANC natráven Apal - Xbal a izoloval se fragment 3873 bp. Plasmid pET-3d-PKS (konstrukce uvedena na Obrázku 4) byl natráven Apal - Spěl a izoloval se fragment 270 bp. Štěpení Spěl zanechalo extenzi 5' CTAG, která byla účinně ligovaná s fragmenty DNA generovanými Xbal. Tyto dva fragmenty byly ligovány pro vytvoření pOUR-P-ON-ks-1. Po ligaci zanikla místa rekognice Spěl a Xbal (jejich umístění je na Obrázku 9 uvedeno v závorkách). Konstrukt pOUR-P-ANks-1 byl zaveden do E. coli K-12 kmene W3110 F’, prototrofní, ATCC # 27325. Výsledná prasečí urikáza KS-ΔΝ, exprimovaná pod kontrolou promotoru osmB, poskytla vysoké hladiny rekombinantního enzymu s vyšší aktivitou a stabilitou.

Obrázek 1 ukazuje strukturu plasmidu pOUR-P-AN-ks-l. Čísla u restrikčmch míst ukazují polohu nukleotidu vzhledem k místu Haell, označenému jako 1. Restrikční místa, která zanikla během klonování, jsou uvedena v závorkách. Plasmid pOUR-P-AN-ks-l, kódující prasečí urikázu KS-ΔΝ, je dlouhý 4143 párů baží (bp) a zahrnuje následující prvky:

1. fragment DNA o délce 113 bp, sahající od nukleotidu číslo 1 do místa Ndel (v poloze 113), který zahrnuje promotor osmB a vazebné místo pro ribozom (rbs).

2. Fragment DNA o délce 932 bp, sahající od Ndel (v poloze 113) do spojky Spel/Xbal (v poloze 1045), který zahrnuje: kódující oblast 900 bp prasečí KS-ΔΝ (sekvence nukleových kyselin proteinu prasečí urikázy zkráceného na aminovém konci, kde jsou aminokyseliny v poloze 291 a 301 nahrazeny lysinem a serinem) a 32 bp boční sekvenci odvozenou z pCR™ II, od místa klonování TA v protisměru do místa restrikce Spel/Xbal.

3. 25 bp sekvenci místa vícečetného klonování (MCS) od spojky Spel/Xbal (v poloze 1045) do HindlII (v poloze 1070).

4. Syntetický 40 bp oligonukleotid obsahující TrpA terminátor transkripce (ter) s konci HindlII (v poloze 1070) a AatlI (v poloze 1110).

• ·

5. Fragment DNA o délce 1519 bp, sahající z místa AatlI (v poloze 1110) do MscI/Scal (v poloze 2629) na pBR322, který obsahuje gen rezistence na tetracyklin (TetR).

6. Fragment DNA o délce 1514 bp, sahající z místa Scal (v poloze 2629) do Haell (v poloze 4143) na pBR322, který obsahuje počátek replikace DNA.

Obrázek 2 ukazuje DNA a odvozené aminokyselinové sekvence prasečí urikázy KSΔΝ. V tomto obrázku je číslování aminokyselin provedeno podle úplné sekvence prasečí urikázy. Za iniciačním methioninovým zbytkem byl namísto kyseliny aspartamové ze sekvence prasečí urikázy vložen threonin. Tento threoninový zbytek umožňuje odstranění methioninu bakteriální aminopeptidázou. Mezera v aminokyselinové sekvenci ukazuje odstraněný N-koncový maturovaný peptid. Vyznačená jsou restrikční místa, která byla použitá pro různé kroky subklonování různých sekvencí urikázy (Apal, Ndel, BamHI, EcoRI a Spěl). 3 '-Netranslatovaná sekvence, označená malými písmeny, byla odvozena ze sekvence pCR™II. Hvězdička označuje stop kodon translace.

Obrázek 3 ukazuje uspořádání aminokyselinových sekvencí různých rekombinantních sekvencí urikázy. Vrchní řada představuje prasečí urikázu s úplnou aminokyselinovou sekvencí. Druhá řádka je sekvence dvojitě zkrácené prasečí-pavián chimémí urikázy (PBCANC). Třetí řádka ukazuje sekvenci prasečí urikázy KS-ΔΝ, která je zkrácená pouze na Nkonci a obsahuje mutace S46T a změny aminokyselin R291 K a T301 S, obě reflektující paviání původ karboxylového konce sekvence kódující urikázu. Hvězdička označuje polohy, kde jsou rozdíly v aminokyselinách u prasečí KS-ΔΝ ve srovnám s publikovanou sekvencí prasečí urikázy, kroužky označují polohy, kde jsou rozdíly v aminokyselinách v prasečí KSΔΝ ve srovnání s prasečí-paviám chimérou PBC-ΔΝ, a čárkovaně jsou vyznačené delece aminokyselin.

Pro klonování do E. coli byly konstruovány cDNA nativní urikázy, paviání, prasečí a králičí, s mutací Y97H a prasečí-paviání chiméra (PBC). Byly konstruovány klony exprimující vysoké hladiny urikázových variant a vybrány všechny E. coli W3110 F’, u kterých je exprese regulovaná osmB. Izolovaly se plasmidové DNA, ověřily DNA sekvenční analýzou pomocí restrikčmch enzymů a kultivovaly se buňky.

Konstrukce zkrácené urikázy, včetně prasečí-ΔΝ a prasečí KS-ΔΝ, byla provedena křížovou ligací mezi PBC-ANC a prasečí KS, následným štěpením restrikčními endonukleázami Apal a Xbal a Apal plus Spěl. Lze odůvodněně předpokládat, že si tyto zkrácené mutanty zachovají svou aktivitu, neboť šest N-koncových zbytků, „maturovaný peptid“ (1-2) a C-koncový tripeptid, „peroxyzomální cílový signál“ (3-5), nemají funkce, • ·· ·

které by podstatně ovlivnily enzymovou aktivitu, a že tyto sekvence budou imunogenní. Vybraly se klony exprimující velmi vysoké hladiny variantních urikáz.

Příklad 2

Transformace expresního plasmidu do bakteriální hostitelské buňky A

Expresní plasmid pOUR-P-AN-ks-l byl zaveden do E. coli K-12 kmene W3110 F'. Bakteriální buňky byly připraveny pro růst spojený s transformací do fáze mid log u Luria broth (LB), poté byly buňky odděleny centriíugací, promyty ve studené vodě, a suspendovány v 10% glycerolu ve vodě o koncentraci 3xlO¹⁰ buňky/ml. Buňky byly uchovávané v alikvotech při -70 °C. Plasmidová DNA byla vysrážena v ethanolu a rozpuštěna ve vodě.

Bakteriální buňky a plasmidová DNA byly smíchány a transformace byla provedena vysokonapěťovou elektroporační metodou s použitím Gene Pulser II z BIO-RAD (Trevors et al (1992). Electrotransformace bakterie plasmidovou DNA, viz Průvodce Elektroporace a Elektrofuze (D.C. Chang, B. M. Chassy, J. A. Saunders a A. E. Sowers, eds.), sír. 265-290, Academie Press lne., San Diego, Hanahan et al (1991) Meth. Enzymol., 204, 63-113). Transformované buňky byly suspendované v médiu SOC (2% trypton, 0,5% kvasinkový extrakt, 10 mM NaCl, 2,5mM KC1, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSC>4, 20 mM glukóza), inkubované 1 hodinu při 37°C, a vytříděné podle rezistence na tetracyklin. Byl vybrán klon s vysokou expresí.

Příklad 3

Příprava rekombinantní urikázy

Bakterie stejného typu jako ty výše popsané transformované byly kultivovány v médiu obsahujícím glukózu, pH bylo udržováno na hodnotě 7,2 ± 0,2, při 37 °C.

Pro posledních 5-6 hodin kultivace byl do média přidán KC1 na konečnou koncentraci 0,3 M. Kultivace pokračovala, aby se umožnila akumulace urikázy.

Rekombinantní urikáza se akumulovala uvnitř bakteriálních buněk jako nerozpustný precipitát podobný inkluzmm tělískům (IBs). Buněčná suspenze byla promytá centriíugací a suspendovaná v 50mM pufru Tris při pH 8,0 a 10 mM EDTA na konečný objem odpovídající 40-násobku suché hmotnosti buněk.

IBs obsahující rekombinantní urikázu byly izolované centrifugací a následným rozrušením bakteriálních buněk s použitím lysozymu a vysokého tlaku. Reakce s lysozymem (2000-3000 jednotek/ml) byla provedena za míchám při pH 8,0 a 7 ± 3° C po dobu 16-20 hodin. Peleta byla promyta vodou a uchovávána při -20 °C až do použití.

Obohacené IBs byly po suspendování dále zpracovávány v 50 mM NaHCOs pufru při pH 10,3 ± 0,1. Kvůli solubilizaci urikázy odvozené od IB byla suspenze přes noc inkubovaná při teplotě místnosti, a následně vyčeřená centrifugací.

Urikáza byla dále čištěná několika chromatografickými kroky. Nejprve byla chromatografie provedena na koloně Q-Sepharose FF. Kolona s látkou byla promyta bikarbonátovým pufrem obsahujícím 150 mM NaCl a urikáza byla eluovaná bikarbonátovým pufirem obsahujícím 250 mM NaCl. Pro odstranění minoritních nečistot z urikázového preparátu byla poté použita xanthin-agarózová pryskyřice (Sigma). Eluát po Q-Sepharose FF byl naředěn 50mM glycinovým pufrem o pH 10,3 ±0,1 na koncentraci proteinu 0,25 mg/ml a nanesen na kolonu. Kolona byla promyta bikarbonátovým pufrem při pH 10,3 ±0,1 obsahujícímlOOmM NaCl a urikáza byla eluovaná stejným pufrem doplněným 60 μΜ xanthinu. V tomto stádiu byla urikáza pro odstranění agregovaných forem přečištěná chromatografií na Q-Sepharose.

Čistota všech urikázových přípravků je vyšší než 95 %, jak bylo stanoveno velikostně vylučující chromatografií. Při použití kolony Superdex 200 bylo ve všech přípravcích detekováno méně než 0,5 % agregovaných forem.

Tabulka 3 podává souhrn čištění prasečí urikázy KSAN z IBs získaných z fermentační půdy 25 L.

Tabulka 3. Čištění prasečí KSAN urikázy

Krok čištění	Protein (mg)	Aktivita (U)	Specifická aktivita (U/mg)
Rozpuštění IB	12 748	47 226	3,7
Vyčištěný roztok	11 045	44 858	4,1
Q-Sepharose I - hlavní podíl	7 590	32 316	4,3
Xanthin-Agaróza - hlavní podíl	4 860	26 361	5,4
Q-Sepharose II - hlavní podíl	4 438	22 982	5,2
Retentát 30 kDa UF	4 262	27 556	6,5

Příklad 4

Charakteristiky rekombinantní urikázy

SDS-PAGE

SDS-PAGE analýza vysoce čištěné variantní urikázy (Obrázek 4) odhalila charakteristický profil. Vzorky byly uchovávány při 4 °C v uhličitanovém pufru při pH 10,3 až po dobu několika měsíců. Úplné prasečí, prasečí KS a PBC varianty vykazují akumulaci dvou hlavních degradačních produktů s molekulovou hmotností 20 a 15 kDa. Toto pozorování naznačuje, že alespoň jeden nick štěpí molekulu podjednotky urikázy. Rozdílný degradační profil je detekován u klonů zkrácených na aminovém konci a v nižší míře také u králičí urikázy. N-konec králičí urikázy připomíná N-konec zkrácených klonů. Určeny byly Nkoncové sekvence fragmentů urikázy generovaných během čištění a skladování.

Sekvencování peptidů

Dlouhé urikázové přípravky byly sekvenovány od N-konce s použitím Edmanovy degradace. Provedlo se deset cyklů. Rekombinantní prasečí urikáza (úplný klon) generovala větší množství degradačních fragmentů ve srovnání s prasečí KS-ΔΝ. Byla vyvozena tato místa štěpení vedoucí k degradačním fragmentům:

1) Majoritní místo v poloze 168 se sekvencí:

-QSG i FEGFI--

2) Minoritní místo v poloze 142 se sekvencí:

-IRN I GPPVI—

Výše uvedené sekvence nepřipomínají žádné známé proteolytické štěpení. Přesto ke štěpení mohlo dojít buď proteolýzou, nebo nějakou chemickou reakcí. Urikázy zkrácené na N-konci jsou překvapivě stabilnější než urikázy na N-konci nezkrácené. Také PBC-ANC měla stabilitu podobnou dalším ΔΝ molekulám a nižší než u PBC na N-konci nezkrácené.

Účinnost

Aktivita urikázy byla měřena pomocí UV. Rychlost enzymatické reakce byla určena z měření poklesu absorbance při 292 nm následkem oxidace kyseliny močové na alantoin. Jednotka aktivity je definovaná jako množství urikázy nutné k oxidaci jednoho mikromolu kyseliny močové za minutu při 25 °C při specifikovaných podmínkách. Účinnost urikázy je vyjádřená v jednotkách aktivity na mg proteinu (U/mg).

Extinkční koeficient lmM kyseliny močové při 292 nm je 12,2 mM^cm’¹. Proto oxidace 1 mikromolu kyseliny močové na ml reakční směsi vedla k poklesu absorbance 12,2 Π1Α292. Změna v absorbanci s časem (ΔΑ292 za minutu) byla odvozená z lineárního úseku křivky.

Koncentrace proteinu byla stanovena s použitím modifikované Bradfordovy metody (Macart a Gerbaut, (1982) Clin Chim Acta 122, 93-101). Specifická aktivita (účinnost) urikázy byla vypočítaná vydělením aktivity v U/ml koncentrací proteinu v mg/ml. Výsledky enzymové aktivity různých rekombinantních urikáz jsou shrnuty v Tabulce 4. Jako referenční hodnoty jsou v této tabulce použity výsledky u komerčních přípravků. Z těchto výsledků je zřejmé, že zkrácení urikázových proteinů jejich enzymatickou aktivitu významně neovlivňuje.

Tabulka 4. Souhrn kinetických parametrů rekombinantních a nativních urikáz

Urikázy	Koncentrace*υ zásobního roztoku (mg/ml)	Specifická aktivita (U/mg)(2)	Km(4} (μΜ kyseliny močové)	Kcat(5) (1/min)
Rekombinantní
Prasečí	0,49	7,41	4,39	905
Prasečí-ΔΝ	0,54	7,68	4,04	822
Prasečí KS	0,33	7,16	5,27	1085
Prasečí KS-ΔΝ	1,14	6,20	3,98	972
PBC	0,76	3,86	4,87	662
PBC-ANC	0,55	3,85	4,3	580
Králičí	0,44	3,07	4,14	522
Nativní
Prasečí (Sigma)	2,70	3,26	5,85	901
A. flavus (Měrek)	1,95	0,97	23,54	671

Poznámky k Tabulce 4:

(1) Koncentrace proteinu byla stanovena z absorbance měřené při 278 nm, s použitím extinkčního koeficientu 11,3 pro roztok urikázy 10 mg/ml (Mahler, 1963).

(2) 1 jednotka aktivity urikázy je definovaná jako množství enzymu, které oxiduje 1 mikromol kyseliny močové na alantoin za minutu při 25 °C.

• ·· ·

(3) Hodnoty specifické aktivity byly odvozené z Lineweaverovy a Burkovy rovnice, při koncentraci substrátu ekvivalentní 60 μΜ.

(4) Reakční směsi byly složené z různých kombinací následujících zásobních roztoků lOOmM sodnoboritanový pufr, pH 9,2

300μΜ kyselina močová v 50 mM sodnoboritanovém pufru, pH 9,2 mg/ml BSA v 50mM sodnoboritanovém pufru, pH 9,2 (5) Kcat byla vypočítaná vydělením Vmax (vypočítaná z odpovídajících Lineweaverových a Burkových rovnic) koncentrací urikázy v reakční směsi (vyjádřené v molámích ekvivalentech, na základě tetramemí molekulové hmotnosti urikázy).

Příklad 5

Konjugace urikázy s m-PEG (PEGylace)

Prasečí KS-ΔΝ urikáza byl konjugovaná s použitím m-PEG-NPC (monomethoxy poly(ethylenglykol)nitrofenyl karbonátu). Byly stanovené podmínky, při kterých vznikalo 2 až 12 vláken 5kDa, lOkDa, nebo 20kDa PEG na podjednotce urikázy. Do roztoku proteinu byl postupně přidáván m-PEG-NPC. Po ukončení přidávání byla reakční směs PEG urikáza / m-PEG-NPC inkubovaná při 2-8 °C po dobu 16-18 hodin, aby se maximální počet volných vláken m-PEG konjugoval s urikázou.

Počet PEG vláken na monomer PEG-urikázy byl stanoven pomocí velikostně vylučující chromatografie na Superose 6 (SEC), s použitím standardů PEG a urikázy. Počet PEG vláken navázaných na podjednotku byl stanoven pomocí následujícího vztahu:

PEG 3,42 x množství PEG v injikováném vzorku (pg) vlákna/podjednotka množství proteinu v injikovaném vzorku (pg)

Koncentrace jednotek PEG a proteinu ve vzorku PEG-urikázy byla stanovena velikostně vylučující chromatografií (SEC) s použitím UV a sériově uspořádaných refrakčních (RI) detektorů (viz Kunitani et al., (1991)). Byly generované tři kalibrační křivky: křivka proteinu (absorpce měřená při 220 nm), křivka proteinu (měřená RI), a křivka PEG (měřená RI). Poté byly s použitím stejného systému analyzovány vzorky PEG-urikázy. Pro výpočet koncentrací PEG a proteinu bylo použito srovnání výsledných hodnot oblasti UV a RI maxim experimentálních vzorků s kalibračními křivkami. Index 3,42 je poměr mezi molekulovou hmotností monomeru urikázy (34 192 Daltonů) a molekulovou hmotností lOkDaPEG.

Navázané PEG vylepšily rozpustnost urikázy v roztocích s fyziologickými hodnotami pH. Tabulka 5 ukazuje variabilitu mezi šaržemi produktu obsahujícího PEGylovanou prasečí urikázu KS-ΔΝ. Mezi počtem navázaných vláken PEG a uchovanou specifickou aktivitou (SA) enzymu je obecně inverzní vztah.

Tabulka 5. Enzymová aktivita konjugátů PEGylované prasečí KS-ΔΝ urikázy

Šarže konjugátu	PEG MW (kDa)	Vlákna PEG na podjednotku urikázy	Urikáza SA (U/mg)	S A procento kontroly
ΔΝ-prasečí KS			8,2	100
1-17#	5	9,7	5,8	70,4
LP-17	10	2,3	7,8	94,6
1-15#	10	5,1	6,4	77,9
13#	10	6,4	6,3	76,9
14#	10	6,5	6,4	77,5
5-15#	10	8,8	5,4	65,3
5-17#	10	11,3	4,5	55,3
4-17#	10	11,8	4,4	53,9
1-18#	20	11,5	4,5	54,4

Příklad 6

PEGylace urikázy s 1000D a 100 000D PEG

Prasečí urikáza KS-ΔΝ byla konjugovaná s použitím 1000D a 100 000D m-PEG-NPC postupem popsaným v Příkladu 5. Byly použity podmínky pro zavedení 2 až 11 vláken PEG na podjednotku urikázy. Po ukončení přidávání PEG byla reakční směs urikáza/m-PEG-NPC inkubovaná při 2-8 °C po dobu 16-18 hodin, aby se maximální počet volných vláken m-PEG konjugoval s urikázou.

Počet PEG vláken na monomer PEG-urikázy byl stanoven postupem popsaným výše.

Navázané PEG vylepšily rozpustnost urikázy v roztocích s fyziologickými hodnotami pH.

····

Příklad 7

Farmakokinetika konjugátu prasečí urikázy KS-ΔΝ s PEG

Pro stanovení optimálního rozsahu a velikosti PEGylace potřebné k poskytnutí terapeutického účinku byly provedeny biologické experimenty.

Při farmakokinetických studiích na krysách s použitím i.v. injekcí 0,4 mg (2U) na kg tělesné hmotnosti nemodifikované urikázy, podávaných v den 1 a den 8, byl poločas v cirkulaci 10 minut. Avšak studie rychlosti clearence na krysách u 2 až 11 x lOkDa PEGylované prasečí urikázy KS ΔΝ, i po 9 týdenních injekcích ukázaly, že clearence nezávisí na počtu PEG vláken (v tomto rozmezí) a zůstala během doby studie relativně konstantní (viz Tabulka 6, poločas 30 hodin). Rozdíly mezi týdny jsou v rámci experimentální chyby. Stejný profil je zřejmý po 9 injekcích 10 x 5kDa PEG a 10 x 20kDa PEG - urikázových konjugátů. Výsledky získané na krysím modelu ukazují, že biologické účinky byly podobné nezávisle na použitém rozsahu PEGylace urikázy.

Tabulka 6. Poločasy přípravků PEGylované prasečí KS-ΔΝ urikázy na krysách

	Rozsah modifikace (PEG vlákna na podjednotku urikázy)
5kDa PEG	lOkDaPEG	20kDa PEG
Týden	lOx	2x	5x	7x	9x	llx	lOx
1	25,7	29,4	37,7	37,6	36,9	31,4	21,6
	±1,7	±3,4	±3,1	±3,9	±4,3	±4,3	±1,5
	(5)	(5)	(5)	(5)	(5)	(5)	(5)
2				26,7 ±3,0 (5)	28,4 ±1,6 (5)
3	27,5	29,0	29,9	32,7	26,3	11,8	14,5
	±3,8	±2,6	±11,7	± 11,1	±4,7	±3,3	±2,7
	(5)	(5)	(5)	(5)	(5)	(5)	(5)
4			27,1 ±5,3 (5)	18,4 ±2,2 (4)	19,7 ±5,6 (4)
5	28,6	22,5	34,3	37,3	30,4	30,5	19,3
	±1,7	±2,7	±3,9	±3,0	±3,6	±1,3	±2,5
	(5)	(5)	(4)	(5)	(5)	(5)	(5)
6			35,4 ±3,1 (14)	27,1 ±3,6 (13)	30,7 ±2,9 (13)
7	16,5 ±4,9 (5)	32,5 ±4,3 (5)				16,12 ±2,7 (5)	25,8 ±2,5 (5)
8	-	-	-	-	-	-	-
9	36,8	28,7	34,0	24,2	31,0	29,3	26,7
	±4,0	±2,7	±2,4	±3,4	±2,6	±1,4	±0,5
	(15)	(15)	(13)	(13)	(13)	(15)	(15)

Poznámky k Tabulce 6: Výsledky jsou vyznačené v hodinách ± střední chyba. Čísla v závorkách udávají počet testovaných zvířat.

Krysám byly týdně podávány i.v. injekce 0,4 mg/kilogram tělesné hmotnosti prasečí urikázy KS-ΔΝ, jejíž modifikace jsou vyznačené v tabulce. V každé skupině bylo nejprve 15 krys, které byly střídavě odebírané v podskupinách po 5. V průběhu studie kvůli anestezi několik krys zemřelo. Poločasy byly stanoveny měřením urikázové aktivity (kolorimetrické stanovém) ve vzorcích plazmy odebíraných po 5 minutách a 6,24 a 48 hodin po injekci.

Tabulka 5 popisuje šarže PEGylované urikázy použité ve studii.

Studie biodostupnosti 6 x 5kDa PEGylované prasečí urikázy KS-ΔΝ u králíků naznačují, že po první injekci je poločas v cirkulaci 98,2 ± 1,8 hodiny (i.v.) a biodostupnost ···· .:. ; .· po i.m. a podkožní (s.c.) injekci byla 71 % a 52 %. Po druhé i.m. a s.c. injekci byly však u všech králíků detekovány signifikantní titry protilátek, a po následných injekcích byla clearence zrychlená. Injekce stejného konjugátu u krys poskytla výsledný poločas 26 ± 1,6 hodiny (i.v.) a biodostupnost po i.m. a s.c. injekcích byla 33 % a 22 %.

Studie na krysách prováděné s 9 x lOkDa PEGylovanou prasečí urikázou KS-ΔΝ naznačují, že po první injekci je poločas v cirkulaci 42,4 hodiny (i.v.) a biodostupnost po i.m. a s.c. injekci byla 28,9 % a 14,5 % (viz Obrázek 5 a Tabulka 7). Po čtvrté injekci byl poločas v cirkulaci 32,1 ± 2,4 hodiny a biodostupnost po i.m. a s.c. injekci byla 26,1 % a 14,9 %.

Podobné farmakokinetické studie prováděné u králíků s 9 x lOkDa PEGylovanou prasečí urikázou KS-ΔΝ naznačují, že následně po injekci tohoto konjugátu (po dobu 4 týdnů byla podávána injekce dvakrát týdně) nebyla žádná zrychlená clearence pozorovaná. U těchto zvířat byl po první injekci poločas v cirkulaci 88,5 hodiny (i.v.) a biodostupnost po i.m. a s.c. injekci byla 98,3 % a 84,4 % (viz Obrázek 6 a Tabulka 7). Po čtvrté injekci byl poločas v cirkulaci 141,1±15,4 hodiny a biodostupnost po i.m. a s.c. injekcích byla 85 % a 83 %.

Podobně byly provedeny studie s 9x10 kDa PEGylovanou prasečí urikázou KS-ΔΝ pro stanovém biodostupnosti u psů beaglů (v každé skupině byli 2 samci a 2 samice). Po první

i.v. injekci byl naměřen poločas v cirkulaci 70 ± 11,7 hodiny a biodostupnost po i.m. a s.c. injekcích byla 69,5 % a 50,4 % (viz Obrázek 7 a Tabulka 7).

Byly provedeny studie s přípravky obsahujícími 9 x lOkDa PEGylovanou prasečí urikázu KS-ΔΝ na prasatech. Pro i.v., s.c. a i.m. způsoby podávám byla použita tři zvířata ve skupině. Po první i.v. injekci byl naměřen poločas v cirkulaci 178 ± 24 hodiny a biodostupnost po i.m. a s.c. injekcích byla 71,6 % a 76,8 % (viz Obrázek 8 a Tabulka 7).

Tabulka 7. Farmakokinetická studie provedená s 9x10 kDa PEGylované prasečí KSAN urikázou

Injekce #	Poločas (hodiny)	Biodostupnost
i.v.	i.m.	s.c.
Krysy
1	42,4 ± 4,3	28,9 %	14,5 %
2	24,1 ±5,0	28,9 %	14,5 %
4	32,1 ± 2,4	26,1 %	14,9 %
Králíci
1	88,5 ± 8,9	98,3 %	84,4 %
2	45,7 ± 40,6	100%	100 %
4	141,1 ±15,4	85%	83%
Psi
1	70,0 ± 11,7	69,5 %	50,4 %
Prasata
1	178 ±24	71,6 %	76,8 %

Studie absorpce, distribuce, metabolismu a vylučování (ADME) byly provedeny po jodaci 9 x lOkDa PEGylované prasečí urikázy KS-ΑΝ s použitím I způsobem dle Boltona & Huntera. Značený konjugát byl injikován 7 skupinám po 4 krysách (2 samci a 2 samice). Distribuce radioaktivity byla analyzována po 1 hodině a každých 24 hodin po dobu 7 dní (s výjimkou pro den 5). Všechny skupiny byly postupně usmrceny a byly vyjmuty a analyzovány různé orgány. Sedmá skupina byla držena v metabolické kleci, ze které byla sbírána moč a výkaly. Distribuce látky ve zvířecím těle byla určená po změření celkové radioaktivity v každém orgánu a poměrné části (v ledvinách, játrech, plicích a slezině), která se srážela s TCA (tzn. navázaný protein, normalizováno na velikost orgánu). Žádný z vyjmutých orgánů neměl specifickou radioaktivitu vyšší než ostatní, takže žádná významná akumulace ani v játrech nebo ledvinách pozorována nebyla. Do 7. dne bylo vyloučeno 70 % radioaktivity.

·· ·· • ·· • ·· • · · · • ··

Příklad 8

Výsledky klinické studie

Randomizovaná, otevřená, multicentrická studie s paralelní skupinou byla provedena za účelem získání urátové odezvy a farmakokinetického a bezpečnostního profilu PEGurikázy (Purikase®, Safient Pharmaceuticals) u lidských pacientů s hyperurikémií a těžkou dnou, u kterých nebyla odezva na konvenční léčbu nebo ktéto léčbě nebyli tolerantní. Průměrná délka choroby byla 14 let a 70 % studované populace trpělo jedním nebo více tofy.

Při této studii bylo 41 pacientů (průměrný věk 58,1 let) randomizováno pro 12-týdenní léčbu intravenózní PEG-urikázou v jednom ze čtyř dávkovačích režimů: 4 mg každé dva týdny (7 pacientů), 8 mg každé dva týdny (8 pacientů), 8 mg každé čtyři týdny (13 pacientů), nebo 12 mg každé čtyři týdny (13 pacientů). V definovaných intervalech byla měřena aktivita urikázy v plazmě a hladiny urátů. Z analýzy aktivity urikázy a hladiny urátů byly odvozené farmakokinetické parametry, střední koncentrace urátů v plazmě a v procentech byla vyjádřena doba, po kterou byly uráty v plazmě nižší nebo rovné 6 mg/dl.

Největší pokles hladiny PUA pod 6 mg/dl po 92 % doby léčby byl zaznamenán u pacientů, kteří dostávali 8 mg PEG-urikázy každé dva týdny (před zahájením léčby byla koncentrace urátů v plazmě 9,1 mg/dl vs. střední koncentrace urátů v plazmě 1,4 mg/dl po 12 týdnech).

Také u dalších skupin léčených jinými dávkami PEG-urikázy bylo pozorováno podstatné a trvalé snížení hladiny urátů v plazmě: PUA nižší než 6 mg/ml po 86 % doby léčby ve skupině dostávající 8 mg každé čtyři týdny (koncentrace urátů v plazmě před zahájením léčby 9,1 mg/dl vs. průměrná koncentrace urátů v plazmě 2,6mg/dl po 12 týdnech), PUA nižší než 6 mg/ml po 84 % doby léčby ve skupině dostávající 12 mg každé čtyři týdny (koncentrace urátů v plazmě před zahájením léčby 8,5 mg/dl vs. průměrná koncentrace urátů v plazmě 2,6 mg/dl po 12 týdnech), a PUA nižší než 6 mg/ml po 73 % doby léčby ve skupině dostávající 4 mg každé dva týdny (koncentrace urátů v plazmě před zahájením léčby 7,6 mg/dl vs. průměrná koncentrace urátů v plazmě 4,2 mg/dl po 12 týdnech).

Během prvních 24 hodin dávkování PEG-urikázy byl maximální procentuální pokles kyseliny močové v plazmě 72 % z výchozí hodnoty u subjektů, kterým byly podávány 4 mg / 2 týdny (p rovno .0002); 94 % u subjektů, kterým bylo podáváno 8 mg / 2 týdny (p menší než .0001), 87 % u subjektů, kterým bylo podáváno 8 mg / 4 týdny (p menší než .0001), a 93 % u subjektů, kterým bylo podáváno 12 mg / 4 týdny (p menší než .0001).

• 4» • ·

Během 12-týdenm léčby byl procentuální pokles kyseliny močové v plazmě z výchozí hodnoty 38 % u subjektů, kterým byly podávány 4 mg / 2 týdny (p rovno .0002), 86 % u subjektů, kterým bylo podáváno 8 mg / 2 týdny (p menší než .0001), 58 % u subjektů, kterým bylo podáváno 8 mg / 4 týdny (p rovno .0003) a 67 % u subjektů, kterým bylo podáváno 12 mg / 4 týdny (p menší než .0001).

Překvapivě se u některých subjektů, kterým byla podávána PEG-urikáza, projevil vedlejší účinek spojený s iníuzí, tzn. reakce na infiizi. Tyto reakce se vyskytly u 14 % z celkového počtu infuzí.

Plné znění všech zde citovaných odkazů je zde zahrnuto formou odkazu ve smyslu stejného rozsahu, jako by zde bylo u každé individuální publikace nebo patentu nebo patentové přihlášky specificky uvedeno, že je začleněná formou odkazu ve smyslu plného znění.

Jak bude odborníkovi v oboru zřejmé, u předkládaného vynálezu lze provést mnoho modifikací a variací, aniž by se překročil jeho duch nebo rozsah. Zde popsaná specifická provedení jsou nabídnuta pouze jako ilustrativní příklad a vynález je limitován pouze přiloženými nároky společně s plným rozsahem analogie podstaty, na který jsou nároky vedeny.

Claims (1)

1. Průmyslová využitelnost

   Geneticky modifikované proteiny s urikolytickou aktivitou připravené podle předkládaného vynálezu jsou použitelné ke snížení hladiny kyseliny močové v biologické tekutině včetně krve.

   ···· •V ·«··

   Seznam sekvencí <110> Savient Pharmaceuticals, lne.

   Hartman, Jacob

   Mendelovitz, Simona <120> Variantní formy urátoxidázy a jejich použití <130> 103864-146638 <150> US 60/670 573 <151> 2005-04-11 <160> 16 <170> Patentln verze 3.3 <210> 1 <211> 36 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>

   <223> Urikáza z prasečích jater (sensní) <400> 1 gcgcgaattc catggctcat taccgtaatg actaca <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Umělá sekvence