CN113244412B - 一种基于mRNA剂型的治疗高尿酸血症或痛风的药物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于mRNA剂型的治疗高尿酸血症或痛风的药物及其制备方法，属于高尿酸血症或痛风的治疗技术领域，所述药物包括SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2所示的编码尿酸酶的mRNA。本发明将编码尿酸酶的mRNA递送至体内，利用人体细胞表达尿酸酶，加快了血液中尿酸的代谢速度，显著降低了尿酸含量，从而起到治疗高尿酸血症和痛风的作用。本发明提供的治疗高尿酸血症的药物‑编码尿酸酶的mRNA生物利用率高、半衰期长，免疫原性低、大大降低了过敏反应，提高了患者的用药依从性和安全性。

Description

一种基于mRNA剂型的治疗高尿酸血症或痛风的药物及其制备 方法
技术领域
本发明属于高尿酸血症或痛风的治疗技术领域，尤其涉及一种基于mRNA剂型的治疗高尿酸血症或痛风的药物及其制备方法。
背景技术
高尿酸血症患者由于嘌呤代谢产生过量尿酸导致血液中尿酸含量升高，当血尿酸水平超过关节单钠尿酸盐饱和度而析出沉积于外周关节及周围组织时则引起痛风。当尿液中的尿酸达到过饱和，肾小管和远端收集系统出现尿酸结晶会引起肾功能损伤。
目前高尿酸血症的标准预防或治疗方案为使用别嘌醇治疗，进行尿液碱化，水合和渗透性利尿。别嘌醇通过抑制黄嘌呤氧化酶阻滞尿酸形成，但会增加肾脏排泄尿酸前体(次黄嘌呤和黄嘌呤)的负荷。与次黄嘌呤不同，黄嘌呤在尿中比尿酸难溶。有时别嘌醇治疗的病人也可出现黄嘌呤肾病和结石。此外，对于病人体内存留的尿酸的排泄，使用别嘌醇治疗无效。
另一种治疗方法是使用蛋白类药物尿酸酶，尿酸酶药物的安全性较高，且未影响患者的肝肾功能，是治疗痛风的理想药物。尿酸酶的主要不良事件为输注反应，发生在多达40%的患者中；并且出现在尿酸降低起效之前，表现出恶心、皮肤潮红和呼吸困难的症状。大约40%多的患者存在高滴度的抗体，并且与治疗反应的丧失和输注反应的风险增加有关。部分使用该药的患者会出现严重的过敏反应，并且出现在使用该药的2h之内。
对于高尿酸症的治疗，目前没有一种有效、安全的药物。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种治疗高尿酸血症或痛风的药物及其制备方法；所述治疗高尿酸血症的药物为编码尿酸酶的mRNA，本发明将编码尿酸酶的mRNA递送至体内，利用人体细胞表达尿酸酶，加快了血液中尿酸的代谢速度，显著降低了尿酸含量，从而起到治疗高尿酸血症和痛风的作用。
本发明提供的治疗高尿酸血症的药物-编码尿酸酶的mRNA生物利用率高、半衰期长，免疫原性低、大大降低了过敏反应，提高了患者的用药依从性和安全性。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种基于mRNA剂型的治疗高尿酸血症或痛风的药物，包括SEQ IDNo.1和/或SEQ ID No.2所示的编码尿酸酶的mRNA。
优选的，所述编码尿酸酶的mRNA的5’端连接5’UTR和帽子结构；所述编码尿酸酶的mRNA的3’端连接3’UTR和多聚A尾。
优选的，所述药物为液体制剂。
优选的，所述药物为注射制剂。
优选的，所述编码尿酸酶的mRNA在所述药物中的浓度为0.5~1.5μg/μl。
优选的，所述药物的溶剂为生理盐水。
本发明还提供了所述药物的制备方法，包括以下步骤：
1）合成转录所述药物中的编码尿酸酶的mRNA的DNA片段，并将所述DNA片段克隆至表达质粒获得重组质粒；
2）将所述重组质粒转入宿主细胞获得重组细胞，从扩繁后的重组细胞中提取质粒，以提取获得的质粒为模板进行PCR扩增获得体外表达mRNA的DNA模板；
3）构建包括所述DNA模板的RNA体外合成体系进行mRNA的体外合成获得所述编码尿酸酶的mRNA。
优选的，所述RNA体外合成体系以1600μl计，包括以下组分：
RNA-free水 440μl；
7.5mM的ATP 160μl；
7.5mM的 UTP 160μl；
7.5mM的CTP 160μl；
7.5mM的GTP 160μl；
7.5mM的Cap analogue 160μl；
150ng/μl的DNA模板 40μl；
10×Buffer 160μl；
Enzyme Mix 160μl。
优选的，所述RNA体外合成的程序为36~38℃，5~7h。
优选的，步骤3）获得所述编码尿酸酶的mRNA后还包括：调节所述编码尿酸酶的mRNA浓度以及分装的步骤。
本发明的有益效果：本发明提供的治疗高尿酸血症或痛风的药物为编码尿酸酶的mRNA，本发明将编码尿酸酶的mRNA递送至体内，利用人体细胞表达尿酸酶，加快了血液中尿酸的代谢速度，显著降低了尿酸含量，从而起到治疗高尿酸血症或痛风以及由尿酸过多形成结晶引起的肾功能损伤的作用。
本发明提供的治疗高尿酸血症的药物-编码尿酸酶的mRNA生物利用率高、半衰期长，免疫原性低、大大降低了过敏反应，提高了患者的用药依从性和安全性。
根据实施例的记载，在大鼠体内注射本发明提供的编码尿酸酶的mRNA后，TNFα和IL-8的表达水平远低于注射相应的蛋白药物，说明本发明提供的编码尿酸酶的mRNA的免疫原性远远小于相应的蛋白药物。在大鼠体内注射相应的蛋白药物，大鼠尿酸水平降低不显著，注射本发明提供的编码尿酸酶的mRNA药物的大鼠体内尿酸水平显著下降，说明本发明提供的治疗高尿酸血症的药物治疗效果更好。
附图说明
图1为编码尿酸酶的mRNA的结构示意图；
图2为pRhe质粒的质粒图谱；
图3为编码尿酸酶的mRNA（Seq1和Seq2）转染细胞后36h蛋白表达水平；
图4为大鼠注射编码尿酸酶的mRNA及相应蛋白药物体内免疫因子水平检测，其中A为TNFα的表达水平，B为IL-8的表达水平；
图5为大鼠注射编码尿酸酶的mRNA及相应蛋白药物血液中的尿酸水平；
图6为尿酸酶mRNA药物与蛋白药物生物利用率及半衰期对比，其中A为注射编码尿酸酶的mRNA（Seq1）和对应的蛋白药物后7d血液中尿酸水平，B为注射编码尿酸酶的mRNA（Seq2）和对应的蛋白药物后7d血液中尿酸水平。
具体实施方式
本发明提供了一种基于mRNA剂型的治疗高尿酸血症或痛风的药物，包括SEQ IDNo.1和/或SEQ ID No.2所示的编码尿酸酶的mRNA；具体如下：
SEQ ID No.1（以下简称seq 1）：
AUGGAGACAGACACACUCCUGCUAUGGGUACUGCUGCUCUGGGUUCCAGGUUCCACUGGUGACGGAUCCACCUACAAGAAGAACGACGAGGUGGAGUUCGUGAGGACCGGCUACGGCAAGGACAUGAUCAAGGUGCUGCACAUCCAGAGGGACGGCAAGUACCACAGCAUCAAGGAGGUGGCCACCACCGUGCAGCUGACCCUGAGCAGCAAGAAGGACUACCUGCACGGCGACAACAGCGACGUGAUCCCCACCGACACCAUCAAGAACACCGUGAACGUGCUGGCCAAGUUCAAGGGCAUCAAGAGCAUCGAGACCUUCGCCGUGACCAUCUGCGAGCACUUCCUGAGCAGCUUCAAGCACGUGAUCAGGGCCCAGGUGUACGUGGAGGAGGUGCCCUGGAAGAGGUUCGAGAAGAACGGCGUGAAGCACGUGCACGCCUUCAUCUACACCCCCACCGGCACCCACUUCUGCGAGGUGGAGCAGAUCAGGAACGGCCCCCCCGUGAUCCACAGCGGCAUCAAGGACCUGAAGGUGCUGAAGACCACCCAGAGCGGCUUCGAGGGCUUCAUCAAGGACCAGUUCACCACCCUGCCCGAGGUGAAGGACAGGUGCUUCGCCACCCAGGUGUACUGCAAGUGGAGGUACCACCAGGGCAGGGACGUGGACUUCGAGGCCACCUGGGACACCGUGAGGAGCAUCGUGCUGCAGAAGUUCGCCGGCCCCUACGACAAGGGCGAGUACAGCCCCAGCGUGCAGAAGACCCUGUACGACAUCCAGGUGCUGACCCUGGGCCAGGUGCCCGAGAUCGAGGACAUGGAGAUCAGCCUGCCCAACAUCCACUACCUGAACAUCGACAUGAGCAAGAUGGGCCUGAUCAACAAGGAGGAGGUGCUGCUGCCCCUGGACAACCCCUACGGCAAGAUCACCGGCACCGUGAAGAGGAAGCUGAGCAGCAGGCUG
SEQ ID No.2（以下简称seq 2）：
AUGGAGACAGACACACUCCUGCUAUGGGUACUGCUGCUCUGGGUUCCAGGUUCCACUGGUGACGGAUCCAGCGCCGUGAAGGCCGCCAGGUACGGCAAGGACAACGUGAGGGUGUACAAGGUGCACAAGGACGAGAAGACCGGCGUGCAGACCGUGUACGAGAUGACCGUGUGCGUGCUGCUGGAGGGCGAGAUCGAGACCAGCUACACCAAGGCCGACAACAGCGUGAUCGUGGCCACCGACAGCAUCAAGAACACCAUCUACAUCACCGCCAAGCAGAACCCCGUGACCCCCCCCGAGCUGUUCGGCAGCAUCCUGGGCACCCACUUCAUCGAGAAGUACAACCACAUCCACGCCGCCCACGUGAACAUCGUGUGCCACAGGUGGACCAGGAUGGACAUCGACGGCAAGCCCCACCCCCACAGCUUCAUCAGGGACAGCGAGGAGAAGAGGAACGUGCAGGUGGACGUGGUGGAGGGCAAGGGCAUCGACAUCAAGAGCAGCCUGAGCGGCCUGACCGUGCUGAAGAGCACCAACAGCCAGUUCUGGGGCUUCCUGAGGGACGAGUACACCACCCUGAAGGAGACCUGGGACAGGAUCCUGAGCACCGACGUGGACGCCACCUGGCAGUGGAAGAACUUCAGCGGCCUGCAGGAGGUGAGGAGCCACGUGCCCAAGUUCGACGCCACCUGGGCCACCGCCAGGGAGGUGACCCUGAAGACCUUCGCCGAGGACAACAGCGCCAGCGUGCAGGCCACCAUGUACAAGAUGGCCGAGCAGAUCCUGGCCAGGCAGCAGCUGAUCGAGACCGUGGAGUACAGCCUGCCCAACAAGCACUACUUCGAGAUCGACCUGAGCUGGCACAAGGGCCUGCAGAACACCGGCAAGAACGCCGAGGUGUUCGCCCCCCAGAGCGACCCCAACGGCCUGAUCAAGUGCACCGUGGGCAGGAGCAGCCUGAAGAGCAAGCUG
在本发明中，所述编码尿酸酶的mRNA的5’端连接5’UTR和帽子结构；所述编码尿酸酶的mRNA的3’端连接3’UTR和多聚A尾；具体结果如图1所示。
在本发明中，所述治疗高尿酸血症或痛风的药物优选为液体制剂，更优选为注射制剂。在本发明中，所述编码尿酸酶的mRNA在所述药物制剂中的浓度优选为0.5~1.5μg/μl，更优选为1μg/μl。所述编码尿酸酶的mRNA的溶剂优选为生理盐水。本发明对所述生理盐水的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规的生理盐水即可。本发明对所述注射制剂的制备方法没有特殊限定，满足本领域常规注射制剂的要求即可。
本发明还提供了所述的药物的制备方法，包括以下步骤：1）合成转录所述药物中的编码尿酸酶的mRNA的DNA片段，并将所述DNA片段克隆至表达质粒获得重组质粒；2）将所述重组质粒转入宿主细胞获得重组细胞，从扩繁后的重组细胞中提取质粒，以提取获得的质粒为模板进行PCR扩增获得体外表达mRNA的DNA模板；3）构建包括所述DNA模板的RNA体外合成体系进行mRNA的体外合成获得所述编码尿酸酶的mRNA。
在本发明中，合成转录所述编码尿酸酶的mRNA的DNA片段，并将所述DNA片段克隆至表达质粒获得重组质粒。本发明对合成所述编码尿酸酶的mRNA对应的DNA片段的方法没有特殊限定，采用本领域常规的DNA合成方法即可，在本发明具体实施过程中，优选的委托生物技术公司合成。在本发明中，所述DNA片段的具体序列根据碱基互补配对原则确定。在本发明中，所述表达质粒优选为pRhe质粒，在本发明中，所述pRhe质粒的质粒图谱如图2所示。在本发明中，优选的通过酶切连接的方法将所述DNA片段克隆至表达质粒中；在本发明中，所述DNA片段优选的通过BamHI和NheI酶进行双酶切获得酶切NDA片段；所述表达质粒优选的通过BamHI和NheI酶进行双酶切后获得酶切质粒；然后将所述酶切DNA片段和酶切质粒连接获得重组质粒。本发明对所述双酶切和连接的具体操作没有特殊限定，采用本领域常规的双酶切和连接的操作即可。
本发明在获得所述重组质粒后，将所述重组质粒转入宿主细胞获得重组细胞，从扩繁后的重组细胞中提取质粒，并进行PCR扩增获得体外表达mRNA的DNA模板。在本发明中，所述宿主细胞优选为大肠杆菌感受态细胞；本发明对所述转入的方法没有特殊限定，采用本领域常规的转入方法即可。本发明在获得重组细胞后，优选的进行阳性重组细胞的筛选和菌落测序。在本发明中，所述阳性重组细胞的筛选优选的在amp抗性的固体培养基上进行。在本发明中，挑选所述amp抗性的固体培养基上的单菌落培养后的菌液进行菌落PCR，选取菌落PCR结果含目的条带的菌落进行测序。在本发明中，所述菌落PCR的引物F序列如下：CTCTAGAGGATCGAACCCTT（SEQ ID No.3）；所述菌落PCR的引物R的序列如下：AAACCCGCTGATCAGCCTCG（SEQ ID No.4）。在本发明中，所述菌落PCR的扩增程序优选的如下：预变性 98℃ 3min；变性98℃ 10s，退火 60℃ 5s，延伸 72℃ 2min，34个循环；最后延伸72℃，10min。在本发明中，所述菌落PCR的体系优选的如下：
Prime STAR Max Premix（2×） 25μl
引物F 1.2μl
引物R 1.2μl
菌液 2μl
水 20.6μl。
在本发明中，所述引物F和引物R的初始浓度优选为10μmol/L，所述DNA模板的浓度优选为1ng/μl。本发明在所述PCR扩增结束后，优选的通过琼脂糖凝胶电泳确定含目的条带的菌落，然后进行测序验证。
在本发明中，提取测序正确的重组细胞的质粒；本发明对所述质粒的提取方法没有特殊限定，优选的采用质粒提取试剂盒进行。在本发明中，以提取获得的质粒为模板进行PCR扩增获得体外表达mRNA的DNA模板。在本发明中，所述PCR扩增的体系以50μl计，优选的如下：
PrimeSTAR Max Premix（2×） 25μl
引物F 1.2μl
引物R 1.2μl
DNA模板 1μl
水 21.6μl。
在本发明中，所述引物F和引物R的初始浓度优选为10μmol/L；所述DNA模板的浓度优选为1ng/μl。在本发明中，所述引物F的序列如下：CTCTAGAGGATCGAACCCTT（SEQ IDNo.3）；所述引物R的序列如下：AAACCCGCTGATCAGCCTCG（SEQ ID No.4）。在本发明中，所述Prime STAR Max Premix（2×）包括以下组分：PrimeSTAR Max DNA Polymerase，dNTPs和Mg2+。在本发明中，所述PCR的扩增程序优选的如下：预变性 98℃ 3min；变性98℃ 10s，退火60℃ 5s，延伸 72℃ 2min，34个循环；最后延伸72℃，10min。
在本发明中，所述PCR扩增反应结束后，优选的对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测以确定反应是否成功；所述琼脂糖凝胶电泳检测的参数优选的如下：1.5%琼脂糖，5V/min，40min。在本发明中，当琼脂糖凝胶电泳出现目的条带认为反应成功。
本发明在所述PCR扩增反应结束后，优选的将所述扩增产物进行浓缩和纯化。在本发明中，所述浓缩优选的采用Millipore 30Kd超滤管进行；所述纯化优选的采用FPLC进行；本发明在所述纯化后优选的采用NanoDrop检测纯化后模板的浓度，以及260/280、260/230的比值，当260/280在1.6~1.8之间，认为模板合格。
本发明在获得所述DNA模板后，构建包括所述DNA模板的RNA体外合成体系进行mRNA的体外合成获得所述活性成分mRNA。在本发明中，所述RNA体外合成体系以1600μl计，包括以下组分：
RNA-free水 440μl；
7.5mM的ATP 160μl；
7.5mM的 UTP 160μl；
7.5mM的CTP 160μl；
7.5mM的GTP 160μl；
7.5mM的Cap analogue 160μl；
150ng/μl的DNA模板 40μl；
10×Buffer 160μl；
Enzyme Mix 160μl。
在本发明中，所述Enzyme Mix包括T7 RNA 聚合酶，RNA酶抑制剂和无机焦磷酸酶。在本发明中，所述RNA体外合成的程序优选的为36~38℃，5~7h，更优选为37℃，6h。在本发明中，所述RNA体外合成优选的在恒温反应器中进行；所述RNA体外合成体系优选的置于2mlRNase-free Tube管中，一次同时反应多管；所述RNA体外合成体系中的反应试剂按照上述顺序添加。
本发明在所述RNA体外合成结束后，优选的还包括去除DNA模板、回收mRNA和纯化mRNA的步骤。在本发明中，所述去除DNA模板优选的通过DNase I消化实现；所述消化优选的包括将DNase I与RNA体外合成反应后的溶液混合后进行；所述DNase I与RNA体外合成反应后的溶液的体积比优选为3:40；所述混合优选的通过上下颠倒所述RNase-free Tube管实现，所述上下颠倒的次数优选为8~12次，更优选为10次；本发明在所述混合后，优选的进行离心将溶液收集至RNase-free Tube管底部。在本发明中，所述离心的转速优选为800~1200rpm，更优选为1000rpm；所述离心的时间优选为8~12s，更优选为10s。所述消化的温度优选为37℃；所述消化的时间优选为1h。本发明在所述消化结束后，优选的进行DNA片段残留检测。在本发明中，所述回收mRNA优选的通过将所述醋酸铵溶液沉淀实现；具体实施方法参见实施例记载；本发明在回收mRNA后，进行mRNA的质量检测；所述质量检测包括mRNA的浓度、mRNA的260/280、260/230的比值。当260/280范围为1.8~2.1，260/230范围为大于2.0时，认为mRNA合格在本发明中，所述纯化mRNA通过FPLC纯化实现。本发明所述纯化mRNA后，优选的对纯化后的mRNA进行分装。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
重组质粒制备：
1）合成编码seq1、seq2的目的DNA片段；
2）将目的片段和pRhe质粒分别进行BamHI和NheI双酶切，
3）使用T4连接酶进行体外连接；
4）转化大肠杆菌感受态，在amp固体培养基上培养12h；
5）菌落PCR，选取含目的条带的菌落进行测序。
6）测序正确的菌落扩大培养，质粒提取。
菌落PCR步骤如下：
单菌落挑取：
把LB培养基倒入排枪槽中，然后用排枪加400μl LB培养基到48孔深孔板，用镊子拿已灭菌的小白枪头挑取平板上的单菌落并放到48孔深孔板中，同时在48孔深孔板和相应的表单上做好记录。挑好的48孔深孔板用封口膜盖好并做好相应标记（日期、板号等），用针头在封口膜打孔，把它放在37℃摇床上摇1h。
菌落PCR反应:
配制好如下PCR反应体系，把配好的反应液加到96孔板中，用排枪加2μl菌液到其中，按照PCR程序进行扩增:
PrimeSTAR Max Premix（2×） 25μl
引物F 1.2μl
引物R 1.2μl
菌液 2μl
水 20.6μl。
在本发明中，所述引物F和引物R的初始浓度为10μmol/L；所述DNA模板的浓度为1ng/μl。在本发明中，所述引物F的序列如下：CTCTAGAGGATCGAACCCTT（SEQ ID No.3）；所述引物R的序列如下：AAACCCGCTGATCAGCCTCG（SEQ ID No.4）。在本发明中，所述PCR的扩增程序优选的如下：预变性 98℃ 3min；变性98℃ 10s，退火 60℃ 5s，延伸 72℃ 2min，34个循环；最后延伸72℃，10min。
琼脂糖凝胶电泳：
先配制1%琼脂糖凝胶（称取1g琼脂糖加入100ml的TAE溶液中），在完成PCR反应的96孔板中加入0.5ul溴酚蓝，震荡混匀，然后点样，电泳好的琼脂糖凝胶拍照、保存。
判断阳性克隆并测序：
根据琼脂糖凝胶电泳条带图来判断阳性克隆，把阳性克隆的菌液进行扩大培养，进行测序验证，选取具备完全正确序列的克隆进行下一步操作。
质粒提取的步骤参考如下参见omega D6915 Endo-free Plasmid Midi Kit 说明书。
得到的质粒按如下反应体系进行DNA模板的扩增：
反应体积，50μl（为单个管的反应体积，一次同时反应多管）
所述PCR扩增的体系以50μl计，优选的如下：
PrimeSTAR Max Premix（2×） 25μl
引物F 1.2μl
引物R 1.2μl
DNA模板 1μl
水 21.6μl。
所述PrimeSTAR Max Premix（2×）包括以下组分：PrimeSTAR Max DNAPolymerase，dNTPs和Mg2+。引物F和引物R的初始浓度优选为10μmol/L；所述DNA模板的浓度优选为1ng/μl。所述引物F的序列如下：CTCTAGAGGATCGAACCCTT（SEQ ID No.3）；所述引物R的序列如下：AAACCCGCTGATCAGCCTCG（SEQ ID No.4）。所述PCR的扩增程序如下：预变性 98℃ 3min；变性98℃ 10s，退火 60℃ 5s，延伸 72℃ 2min，34个循环；最后延伸72℃，10min。
反应结束后，将反应液合并于1.5ml Tube管中。取10μl进行DNA琼脂糖凝胶电泳检测以确定反应成功（1.5%琼脂糖，5V/min，40min）。
合格标准：电泳检测出现单一的条带，且大小正确。
测定结果：条带大小单一，大小符合要求。
DNA模板超滤
利用Millipore 30Kd超滤管浓缩上述获得的DNA模板。
DNA模板的纯化
将上述超滤得到的DNA，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合液（苯酚/氯仿/异戊醇=25/24/1），充分震荡后，12000g离心15min。
去掉沉淀，转移上清至新的离心管中，加入上清体积的1/10 3M NaAc（PH5.2），混匀，然后加入2倍体积的无水乙醇，混匀，至于-20℃静至30min。
4℃，12000g离心10min，弃上清。
用70%乙醇洗涤沉淀，12000g离心5min，取上清，于超净台晾干5min。
用适当的RNase-free水溶解纯化后的DNA模板。
用NanoDrop检测纯化后模板的浓度，以及260/280、260/230的比值。取样进行DNA琼脂糖凝胶电泳检测（1.5%琼脂糖，5V/min，40min）。
合格标准：260/280介于1.8至2.1之间，260/230在1.6至2.2之间。
测定结果：浓度为500ng/μl，260/280=1.90，260/230=1.7。
纯化后模板超滤
Millipore 30Kd超滤管浓缩FPLC纯化后的DNA模板，用RNase-free水洗脱溶解。用NanoDrop检测超滤后模板的浓度，以及260/280、260/230的比值。最终用RNase-free水稀释至150ng/μl。
测定结果：浓度为150ng/μl，260/280=1.95，260/230= 1.85。
mRNA的体外合成
在恒温反应器中，进行mRNA的体外合成。
按照如下合成体系进行（反应试剂按照从上至下添加）：
反应体积，1600μl（置于2ml RNase-free Tube管中，为单个管的反应体积，一次同时反应多管）。
所述RNA体外合成体系以1600μl计，包括以下组分：
RNA-free水 440μl；
7.5mM的ATP 160μl；
7.5mM的UTP 160μl；
7.5mM的CTP 160μl；
7.5mM的GTP 160μl；
7.5mM的Cap analogue 160μl；
150ng/μl的DNA模板 40μl；
10×Buffer 160μl；
Enzyme Mix 160μl。
所述RNA体外合成的程序为37℃，6h。
DNase I消化去除DNA模板
向mRNA体外合成后的每个Tube管中各加入120μl DNase I。
上下颠倒10次混匀，1000rpm离心10s。
重新置于恒温反应器中，37℃，1h。
反应结束后，将反应液合并到RNase-free 50ml Tube管中，检测DNA片段的残留，三次测量结果DNA片段残留分别为0.013ng，0.016ng，0.017ng每100μg mRNA。
DNA残留检测的方法：
采用定量实时PCR检测方法，具体操作步骤如下：
（1）供试品溶液配制：取样品适量，用无酶水稀释10倍，混匀，混得。
（2）标准品溶液配制：用无酶水将标定过的质粒标准品进行稀释至1E+08copies/μl，然后再进行梯度稀释。具体操作如下：
稀释管标识 稀释方法 浓度
ST0 20 μl ZLWZ7V标准品 +148.2 μl 无酶水 1E+08copies/μl
ST1 10 μl ST +90 μl 无酶水 1E+07copies/μl
ST2 10 μlST0+90 μl无酶水 1E+06copies/μl
ST3 10 μlST1+90 μl无酶水 1E+05copies/μl
ST4 10 μlST2+90 μl无酶水 1E+04copies/μl
ST5 10 μlST3+90 μl无酶水 1E+03copies/μl
ST6 10 μlST4+90 μl无酶水 1E+02copies/μl
ERC的制备：取20μl供试品溶液，加入20μl ST4，混匀，即得。
MIX反应液配制：以SuperFast Probe Mixtuure：W2306F：W2521R：W2430P：H2O=10：0.6:0.6:0.4:7.4的比例进行配制，混匀，即得。
PCR管加样：每孔加入19μl qPCR MIX、再依次加入1μl标准曲线（ST1/ST2/ST3/ST4/ST5/ST6）、ERC、NTC、供试品溶液，混匀。每个样各做三个平行。
PCR程序设定如下：
步骤 设置 循环数 读取荧光信号
预变性 95℃ 2min 1 否
变性 95℃ 5s 40 否
退火/延伸 60℃ 10s 是
计算公式： 以标准品的Ct值对其浓度的对数值做图，线性回归分析，将样品Ct值代入方程，计算“稀释10倍后的浓度对数的检测值”，计算“DNA残留。
DNA残留浓度（copies/μl）=检测值×稀释倍数
Figure DEST_PATH_IMAGE001
结果判定： 三个平行孔间的Ct差值应小于1.0；Ct值大于35的样本除外。
线性相关系数R2>0.99。
无模板对照NTC应不得检出或大于标准曲线最低浓度2个Ct值。
标准规定： 应不高于1ng/μl。
mRNA沉淀回收
向上一步骤中的每个50ml Tube管中，加入等体积的醋酸铵溶液。
上下颠倒10次混匀。
置于-20℃ 2h，沉淀。
17000g，4℃离心，30min。
去掉上清，用70%乙醇洗涤沉淀。
17000g，4℃离心，10min。
去掉70%乙醇，于超净台中蒸干，每管加入RNase-free水20ml。
静置10min后，用枪头轻吹混匀。
用NanoDrop检测回收后的mRNA浓度为5μg/μl，A260/A280为1.90、A260/A230为2.0。
取1μl，稀释10倍，进行RNA ScreenTape assay以及琼脂糖凝胶电泳检测其片段完整性。
检测结果为，条带符合大小，片段完整。
LiCl沉淀纯化mRNA
将上一步骤中回收的mRNA按照其1.5倍体积加入Rnase-free 水，混匀。
加入原mRNA 1.5倍体积-20预冷的LiCl溶液，混匀。
然后于-20℃静至2h。
16000g离心20min。
弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀，16000g离心15min。
取上清，于超净台晾干5min。
用适当的RNase-free水溶解纯化后的mRNA。
纯化后的mRNA浓度为2μg/μl，A260/A280为1.95、A260/A230为1.9。
mRNA分装
将上一步骤中纯化后的mRNA分装至西林瓶。
实施例2
编码尿酸酶的mRNA表达水平检测
实验方法：体外效力-Western Blot 检测
1)细胞准备：提前3天准备检测用细胞。取购自中科院细胞库的293T细胞，传代于细胞培养瓶内，保证使用时细胞处于对数生长期。
2)细胞消化计数：取生长状态良好的293T细胞，去掉培养基，以10ml PBS清洗细胞后，加入体积百分含量为0.25%胰酶（T75瓶加1ml 0.25%胰酶，T175瓶加3ml 0.25%胰酶）消化5min，然后加入含10% FBS的DMEM培养基（T75瓶用9ml培养基，T175瓶用17ml培养基）中和胰酶，吹打细胞并转至50ml离心管，反复吹打混匀，然后取0.3~0.5ml的细胞悬液，计数。
3)细胞稀释：取1ml细胞悬液，用含10%FBS的DMEM培养基稀释到5×105个/ml，吹打混匀。
4)细胞接种：取2ml细胞悬液加到6孔板内。每个mRNA样品需要准备2孔平行细胞，对照组样品（GFP-mRNA）需要准备1孔细胞，空白对照1孔。将6孔板放入（37±1）℃、（5±0.5）%CO2培养箱培养过夜。
细胞转染
接种完细胞后约24h，观察6孔板内的细胞状态，汇合度在90%左右。在生物安全柜内，配制所需体积的90%DMEM+10%FBS培养基。转染前30min弃掉孔板的培养基，每孔加入1ml新鲜培养基（90%DMEM+10%FBS）。
a)配制转染体系：取200μl opti-MEM，加入10μg mRNA样品（SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2）或阴性对照GFP-mRNA，用枪头轻轻吹打混匀，再加入60μl PEI(浓度1mg/ml)，立即置于漩涡振荡器上振荡10次，每次1s，充分混匀，静置10min。
b)将配制好的转染体系，直接均匀滴加进入培养的细胞中，再前后左右摇匀，使得转染体系均匀分布于细胞上。
c)换液
转染后6h换液，吸掉旧的培养基，每孔换为2ml新鲜培养基（90%DMEM+10%FBS）。
d)收获
转染后30h收获。吸掉旧的培养基，用1ml PBS清洗一遍。
吸掉PBS，继续用1ml PBS将细胞吹打下来，收集于1.5ml离心管中，300g离心5min。将离心后的上清尽量吸去干净，沉淀的细胞用于Western blot检测。
免疫酶联吸附检测
实验步骤：
1.包被：包被的标准品浓度为0.1μg/μl，0.01μg/μl，0.001μg/μl，0.0001μg/μl，0.00001μg/μl，0.000001μg/μl，稀释于coating buffer，体积为100μl。包被的细胞裂解液体积为100μl，排枪加至96孔板，盖上封板膜，4℃过夜包被。标准品为mRNA seq1、mRNA seq2所编码的重组蛋白Rasburicase和Pegloticase。
2.封闭：包被好的96孔板，倒出包被液，到扣吸水纸上，使劲扣板，直到孔中无残留为止。
3.洗板：配制洗脱液，用去离子水稀释50x的Washing buffer，加入到洗板机的进液瓶中，设置程序，每孔洗板体积设为300μl，重复洗4次。
4.封闭：洗好的板，扣干里面的溶液，按每孔250μl的体积加入Blocking buffer，随后封上封板膜，室温封闭2h。
5.洗板：封闭好的酶标板按照步骤3完成洗板。
6.一抗孵育：用dilution buffer稀释一抗（1：1000），按照每孔100μl的体积加入洗好的96孔板中，随后封上封板膜室温下孵育1.5h。
7.洗板：按照步骤3完成洗板，洗板次数增加为6次。
8.加入二抗：用Dilution buffer 稀释HRP标记二抗IgG，稀释倍数为10000x，稀释好的抗体按照每孔100μl的体积加入酶标板中，封上封板膜，室温下避光孵育1h。
9.洗板：按照步骤8完成洗板，此步骤务必洗干净板，扣干溶液。
10.显色：加入TMB buffer 100μl，避光显色25min，此时阳性样品显蓝色。
11.终止：加入Stop buffer 100μl，10min内在酶标板上读数，设置吸收波长450nm。
编码尿酸酶的mRNA（Seq1和Seq2）分别转染细胞后30h蛋白表达水平如图3和表1所示，seq1 mRNA和seq2具备体外生物活性，在细胞内能够表达出正确的蛋白产物，seq1 mRNA的表达强度平均值为38.2pg/ml，Seq2 mRNA的表达强度平均值为75.1pg/ml。
表1 编码尿酸酶的mRNA细胞表达水平检测(单位：pg/ml)
Control GFP mRNA Seq1 mRNA Seq2 mRNA
1 0 0 41.6 77.2
2 0 0 39.2 68.3
3 0 0 33.8 79.8
平均值 38.2 75.1
实施例2
检测本发明提供的编码尿酸酶的mRNA的免疫原性，评价标准为对大鼠进行肌肉注射编码尿酸酶的mRNA后血清中TNFα和IL-8的表达水平。
将6~8周龄的SD大鼠(购买自北京维通利华)，饲养在SPF条件下，并且保持12h光亮和12h黑暗循环下的通气笼中饲养，对大鼠进行肌肉注射编码尿酸酶的mRNA，每只大鼠的注射剂量为100μg，相应蛋白药物Rasburicase和Pegloticase的注射剂量均为500μg/只，24h后对大鼠进行眼眶取血，分离血清。用大鼠IL-8和TNFa试剂盒（RayBio）进行酶联免疫吸附分析检测（ELISA）。
结果如图4和表2所示，在大鼠体内，本发明提供的编码尿酸酶的mRNA的免疫原性远远小于相应的蛋白药物Rasburicase和Pegloticase。
表2 大鼠注射mRNA及相应蛋白药物后TNFα及IL8水平（单位：pg/ml）
对照 GFP mRNA Seq 1 mRNA Seq 2 mRNA Rasburicase Pegioticase
TNFα 46.5 64.3 102.1 88.2 378.4 355.7
IL8 41.0 78.2 53.8 60.6 335.7 364.2
实施例3
编码尿酸酶mRNA的药物显著降低大鼠血液尿酸水平
检测所述编码尿酸酶的mRNA的药物的治疗效果，评价标准为编码尿酸酶的mRNA对大鼠进行静脉注射后血清中尿酸水平。
体重约200g成年雄性SD大鼠（购买自北京维通利华），饲养在SPF条件下，并且保持12h光亮和12h黑暗循环下的通气笼中饲养，分别以200mg/kg体重的剂量给大鼠灌服腺嘌呤加乙胺丁醇，每天灌服1次，共14天，使血尿酸水平升高，自喂食高腺嘌呤和乙胺丁醇食物一周后，开始检测大鼠血液中的尿酸水平，结果显示大鼠血尿酸水平升高一倍以上，确认造模成功。造模结束后将以上尿酸酶mRNA对大鼠进行静脉注射，每只大鼠的注射剂量为200μg，相应蛋白药物Rasburicase和Pegioticase的注射剂量为1mg/只，每周给药1次，4周后对大鼠进行眼眶取血，分离血清。用大鼠尿酸检测试剂盒进行酶联免疫吸附分析检测（ELISA）。
结果如图5和表3所示，注射蛋白药物的大鼠尿酸水平变化不明显，注射编码尿酸酶的mRNA药物的大鼠体内尿酸水平显著下降。
表3 编码尿酸酶的mRNA注射后血液中尿酸水平（单位：mmol/L）
对照 GFP mRNA Seq 1 mRNA Seq 2 mRNA Rasburicase Pegioticase
1 94.1 89.6 30.2 27.9 81.9 70.7
2 87.8 92.3 37.1 27 80.8 67.8
3 107.6 110.3 31.9 18.6 64.1 65.2
平均值 96.5 97.4 33.2 24.5 75.6 67.9
实施例4
尿酸酶mRNA药物与蛋白药物生物利用率及半衰期对比
检测所述编码尿酸酶mRNA药物在大鼠体内的生物利用率和半衰期，评价标准为编码尿酸酶的mRNA及尿酸酶蛋白对大鼠进行静脉注射后血清中尿酸酶蛋白含量变化。
体重约200g成年雄性SD大鼠（购买自北京维通利华），饲养在SPF条件下，并且保持12h光亮和12h黑暗循环下的通气笼中饲养，mRNA注射剂量为200μg/只，相应蛋白药物Rasburicase和Pegioticase的注射剂量为1mg/只，每天对大鼠进行眼眶取血，分离血清，通过酶联免疫吸附分析检测（ELISA）血清中相应蛋白质的含量。
结果如图6和表4所示，注射蛋白药物的大鼠尿酸酶水平迅速下降，注射编码尿酸酶的mRNA药物的大鼠体内尿酸酶水平维持高水平。
表4 编码尿酸酶的mRNA及相应蛋白药物注射后血液中尿酸酶u水平（单位：ng/μL）
Seq 1 mRNA Seq 2 mRNA Rasburicase Pegioticase
1 222.7 289 51 58
2 326 360 26.7 21
3 257 307 13.4 16
4 167 232 2 4
5 66 98 0 0
6 49 49 0 0
7 17 20.5 0 0
由上述实施例可知，本发明提供的治疗高尿酸血症或痛风的药物免疫原性低、能够显著降低了尿酸含量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 深圳市瑞吉生物科技有限公司
<120> 一种基于mRNA剂型的治疗高尿酸血症或痛风的药物及其制备方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 963
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
auggagacag acacacuccu gcuaugggua cugcugcucu ggguuccagg uuccacuggu 60
gacggaucca ccuacaagaa gaacgacgag guggaguucg ugaggaccgg cuacggcaag 120
gacaugauca aggugcugca cauccagagg gacggcaagu accacagcau caaggaggug 180
gccaccaccg ugcagcugac ccugagcagc aagaaggacu accugcacgg cgacaacagc 240
gacgugaucc ccaccgacac caucaagaac accgugaacg ugcuggccaa guucaagggc 300
aucaagagca ucgagaccuu cgccgugacc aucugcgagc acuuccugag cagcuucaag 360
cacgugauca gggcccaggu guacguggag gaggugcccu ggaagagguu cgagaagaac 420
ggcgugaagc acgugcacgc cuucaucuac acccccaccg gcacccacuu cugcgaggug 480
gagcagauca ggaacggccc ccccgugauc cacagcggca ucaaggaccu gaaggugcug 540
aagaccaccc agagcggcuu cgagggcuuc aucaaggacc aguucaccac ccugcccgag 600
gugaaggaca ggugcuucgc cacccaggug uacugcaagu ggagguacca ccagggcagg 660
gacguggacu ucgaggccac cugggacacc gugaggagca ucgugcugca gaaguucgcc 720
ggccccuacg acaagggcga guacagcccc agcgugcaga agacccugua cgacauccag 780
gugcugaccc ugggccaggu gcccgagauc gaggacaugg agaucagccu gcccaacauc 840
cacuaccuga acaucgacau gagcaagaug ggccugauca acaaggagga ggugcugcug 900
ccccuggaca accccuacgg caagaucacc ggcaccguga agaggaagcu gagcagcagg 960
cug 963
<210> 2
<211> 972
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
auggagacag acacacuccu gcuaugggua cugcugcucu ggguuccagg uuccacuggu 60
gacggaucca gcgccgugaa ggccgccagg uacggcaagg acaacgugag gguguacaag 120
gugcacaagg acgagaagac cggcgugcag accguguacg agaugaccgu gugcgugcug 180
cuggagggcg agaucgagac cagcuacacc aaggccgaca acagcgugau cguggccacc 240
gacagcauca agaacaccau cuacaucacc gccaagcaga accccgugac cccccccgag 300
cuguucggca gcauccuggg cacccacuuc aucgagaagu acaaccacau ccacgccgcc 360
cacgugaaca ucgugugcca cagguggacc aggauggaca ucgacggcaa gccccacccc 420
cacagcuuca ucagggacag cgaggagaag aggaacgugc agguggacgu gguggagggc 480
aagggcaucg acaucaagag cagccugagc ggccugaccg ugcugaagag caccaacagc 540
caguucuggg gcuuccugag ggacgaguac accacccuga aggagaccug ggacaggauc 600
cugagcaccg acguggacgc caccuggcag uggaagaacu ucagcggccu gcaggaggug 660
aggagccacg ugcccaaguu cgacgccacc ugggccaccg ccagggaggu gacccugaag 720
accuucgccg aggacaacag cgccagcgug caggccacca uguacaagau ggccgagcag 780
auccuggcca ggcagcagcu gaucgagacc guggaguaca gccugcccaa caagcacuac 840
uucgagaucg accugagcug gcacaagggc cugcagaaca ccggcaagaa cgccgaggug 900
uucgcccccc agagcgaccc caacggccug aucaagugca ccgugggcag gagcagccug 960
aagagcaagc ug 972
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ctctagagga tcgaaccctt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
aaacccgctg atcagcctcg 20

Claims (5)

1.一种基于mRNA剂型的治疗高尿酸血症、痛风的药物，其特征在于，包括SEQ ID No.2所示的编码尿酸酶的mRNA；
所述编码尿酸酶的mRNA的5’端连接5’UTR和帽子结构；所述编码尿酸酶的mRNA的3’端连接3’UTR和多聚A尾；
所述药物为注射制剂；
所述编码尿酸酶的mRNA在所述药物中的浓度为0.5~1.5μg/μl；
所述药物的溶剂为生理盐水。
2.权利要求1所述的药物的制备方法，包括以下步骤：
1）合成转录权利要求1所述药物中编码尿酸酶的mRNA的DNA片段，并将所述DNA片段克隆至表达质粒获得重组质粒；
2）将所述重组质粒转入宿主细胞获得重组细胞，从扩繁后的重组细胞中提取质粒，以提取获得的质粒为模板进行PCR扩增获得体外表达mRNA的DNA模板；
3）构建包括所述DNA模板的RNA体外合成体系进行mRNA的体外合成获得所述编码尿酸酶的mRNA。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述RNA体外合成体系以1600μl计，包括以下组分：
RNA-free水 440μl；
7.5mM的ATP 160μl；
7.5mM的 UTP 160μl；
7.5mM的CTP 160μl；
7.5mM的GTP 160μl；
7.5mM的Cap analogue 160μl；
150ng/μl的DNA模板 40μl；
10×Buffer 160μl；
Enzyme Mix 160μl。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述RNA体外合成的程序为36~38℃，5~7h。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤3）获得所述编码尿酸酶的mRNA后还包括：调节所述编码尿酸酶的mRNA浓度以及分装的步骤。
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