CN101003794A - 人pex外泌型重组腺病毒的构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
人PEX外泌型重组腺病毒的构建方法和应用，涉及一种人PEX外泌型重组腺病毒构建方法。提供一种带Myc标签的人PEX外泌型重组腺病毒构建方法，步骤为质粒pSecTag A/PEX的构建：pGEX－4T－3/PEX215质粒的构建；PCR技术扩增人MMP2 C端片段PEX cDNA；真核表达质粒pSecTag A/PEX的构建。腺病毒穿梭载体pShuttle－CMV－PEX的构建。大肠杆菌中腺病毒的同源重组。阳性pAdEasy－pShuttle－CMV－PEX(Ad－PEX)重组子的扩增。重组腺病毒Ad－PEX在HEK293细胞包装成完整的腺病毒。可用于治疗肿瘤等血管生成相关疾病的基因治疗药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种病毒，尤其是涉及一种人PEX外泌型重组腺病毒的构建方法。
背景技术
人基质金属蛋白酶2(Matrix metalloproteinase-2，MMP2)又名明胶酶A。人MMP2前体660个氨基酸，前面29个氨基酸为信号肽序列，其后80个氨基酸为前肽结构域，能够保持酶原形式，前肽结构域后为催化结构域。催化结构域后为C端血红素结合蛋白样结构域，即PEX片断。在细胞表面，MT1-MMP(memberance type 1-Matrix metalloproteinase)结合TIMP-2(tissue inhibitor of metalloproteinase-2)后，MMP2酶原通过C端PEX片断与TIMP-2 C端特异性结合而激活MMP2。MMP2通过PEX片断与整合蛋白αvβ3结合从而定位于肿瘤侵袭性细胞和血管形成的血管表面。1998年，Brooks P.C.等用鸡PEX研究发现PEX是MMP2的内源性抑制剂，能阻断MMP2活性、抑制血管生成和肿瘤生长。2000年Pfeifer A.等用鼠PEX研究表明：用漫病毒载体p156RRLsinPPT介导鼠PEX能明显抑制内皮细胞的侵袭、抑制MMP2激活、抑制血管形成并抑制裸鼠黑素细胞瘤模型生长。2001年，Bello L.等的研究结果表明：联合使用重组人PEX和低剂量化疗药品carboplatin或etoposide能非常显著地降低荷人胶质瘤裸鼠瘤体体积、瘤体血管计数、增殖指数、提高凋亡指数、延长荷瘤鼠的存活时间、提高其存活率并且没有毒副作用。同年他们的实验结果表明：从癌细胞培养液中纯化的人PEX能同时抑制人神经胶质瘤血管形成、肿瘤细胞增殖和迁移。他们2002年的研究工作表明：重组人PEX能长时间明显降低并延缓裸鼠人神经胶质瘤移植瘤切除手术后的复发，提高手术后裸鼠存活率并延长其存活时间。2003年，Pluderi M.等发现重组人PEX引低剂量化疗药物联合使用能长期抑制人胶质瘤动物模型，不会产生耐药性。2004年，Bello L.等的研究结果表明：与单独使用比较，联合使用重组人PEX和另一合成血管形成抑制剂PF-4/DLR能显著延长、提高药物对胶质瘤小鼠模型的抑制效应并可以降低药物使用剂量[11]。2005年，Benny O.等的研究结果表明：载有PEX的PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)微球体外能显著抑制人脐静脉内皮细胞、牛毛细血管内皮细胞和U87-MG细胞的增殖，抑制人胶质瘤小鼠模型生长。
在国内，2001年曾庆银等在大肠杆菌中表达了重组小鼠PEX并观察了其表达条件。2002年张志谦等用载体pCal-n原核表达了鸡PEX融和蛋白CBP/PEX，并观察到CBP/PEX对人脐静脉血管内皮细胞生长和鸡胚尿囊膜血管形成的抑制作用。2003年许传杰等将MMP2信号肽和PEX cDNA拼接构建了小鼠PEX真核表达载体pcDNA3.1-sig-pex。2005年，王贵全等构建了具有体外辐射诱导表达特性的小鼠PEX分泌型表达载体pEgr-sPEX。同年，张志谦等将大鼠生长激素信号肽、鸡PEX、Myc 10肽抗原标签以及6×His纯化标签的cDNA序列融合克隆入真核表达载体pcDNA3.0，经转COS-7细胞证明：大鼠生长激素信号肽可成功诱导鸡PEX分泌到细胞培养基中。
人MMP2 C端PEX片段能抑制肿瘤血管生成从而抑制肿瘤生长，其对肿瘤治疗作用越来越受到重视。将PEX基因重组于基因治疗载体并借助于信号肽分泌到胞外，是利用PEX对肿瘤进行基因治疗的有效手段。2000年Pfeifer A.等将鼠MMP2信号肽和鼠PEX基因融合后重组入漫病毒载体p156RRLsinPPT。该基因治疗载体介导的鼠PEX能明显抑制内皮细胞的侵袭、抑制bFGF诱导的MMP2的激活、抑制bFGF诱导的和肿瘤诱导的血管形成并抑制裸鼠模型中黑素细胞瘤的生长。目前国内外没有利用腺病毒载体介导PEX对肿瘤等血管生成相关疾病治疗的研究报道。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种带Myc标签的人PEX外泌型重组腺病毒的构建方法，所获得的腺病毒可作为一种基因治疗药物用于肿瘤等血管生成相关疾病的治疗。
本发明所说的人PEX外泌型重组腺病毒的构建方法如下：
步骤1、质粒pSecTag A/PEX的构建
1、pGEX-4T-3/PEX215质粒的构建
(1)以从胎盘提取的组织总RNA为模板逆转录合成PEX cDNA第一条链；
(2)根据人MMP2序列(Genbank Accession No.：NM_004530)和载体pGEX-4T-3(AmershamBiosciences公司产品)的多克隆位点，设计PCR引物PEX446S：序列为5’-CTG AAT TCC TCTCCT GAC ATT GAC CTT G-3’，上游引物，带限制性内切酶EcoR I酶切位点；PEX660A：序列为5’-CGC TCG AGA GGA AGG GCC TGT GG-3’，下游引物，带限制性内切酶Xho I酶切位点；
(3)以逆转录合成的第一条链为模板，利用PCR技术，用上游引物PEX446S和下游引物PEX660A一起扩增人MMP2 cDNA 1629bp～2304bp片段，即长度为676bp的PEX cDNA片段，并重组入载体pGEX-4T-3中，得编码人MMP2从446aa到660aa的PEX片段PEX215；
(4)将PEX215重组于GST融合蛋白表达载体pGEX-4T-3，获得序列正确的重组质粒pGEX-4T-3/PEX215；
2、PCR技术扩增人MMP2 C端片段PEX cDNA
根据人MMP2序列(Genbank Accession No.：NM_004530)及其编码框架以及pSecTag A(Invitrogen Life Technologies公司产品)载体多克隆位点，设计二条PCR反应引物PEX466sense和PEX660antisense，其中上游引物PEX466sense，序列为5’-GTG TGG CCC AGCCGG CCC CTG AGA TCT GCA AAC-3’，带限制性内切酶Sfi I酶切位点；下游引物PEX660antisense，序列为5’-CGC TCG AGG CAG CCT AGC CAG TC-3’，带限制性内切酶Xho I酶切位点；以pGEX-4T-3/PEX215质粒为模板，用引物PEX466sense与PEX660antisense一起扩增人MMP2 cDNA 1685bp～2269bp片段，即585bp的PEX cDNA片段，编码人MMP2从466aa到660aa的PEX蛋白；
3、真核表达质粒pSecTag A/PEX的构建
将PCR扩增的PEX cDNA片段和载体pSecTag A经Sfi I和XhoI双酶切后，经连接酶连接后构建质粒pSecTag A/PEX，该质粒表达的PEX蛋白N端带有Ig κ-链前导链，C端带有Myc表位标签，Ig κ-链前导肽可介导PEX分泌到胞外，Myc表位检测标签可用于外源性PEX蛋白的检测以区别于内源性PEX蛋白；
步骤2：腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-PEX的构建
根据人MMP2序列(Genbank Accession No.：NM_004530)及其阅读框架、pShuttle-CMV(Stratagene公司产品)载体多克隆位点以及编码框架，设计二条PCR反应引物，其中上游引物PEX466leader序列为5’-GATCAGCGGCCGCCCACCATGGAGACAG-3’，带完整Kozak翻译起始序列和限制性内切酶Not I酶切位点。下游引物PEX660Myc序列为5’-GTGCAAGCTTCAGCTATTCAGATCCTC-3’，末端带限制性内切酶Hind III酶切位点和终止密码子TGA；以步骤1构建的质粒pSecTag A/PEX为模板，利用PCR技术，用上游引物PEX466leader和下游引物PEX660Myc扩增人MMP2 cDNA 1685bp～2269bp片段，即585bp的PEX cDNA片段，编码人MMP2从466aa到660aa的195aaPEX片段，并在表达的PEX N-端带有Ig κ-链前导链METDTLLLWVLLLWVPGSTGD，C-端带有Myc表位EQKLISEEDLN检测标签。将PCR扩增得到的插入片段重组入腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV，构建pShuttle-CMV-PEX质粒；
步骤3：大肠杆菌中腺病毒的同源重组
将质粒pShuttle-CMV-PEX用Pme I酶切线性化和磷酸化酶处理后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1(Stratagene公司产品)共转化大肠杆菌BJ5183(Stratagene公司产品)，二者同源重组生成腺病毒pAdEasy-pShuttle-CMV-PEX(Ad-PEX)；
步骤4：阳性pAdEasy-pShuttle-CMV-PEX(Ad-PEX)重组子的扩增
将确定阳性重组子的病毒载体pAdEasy-pShuttle-CMV-PEX(Ad-PEX)电转化入大肠杆菌DH10B扩增，扩增后提取质粒，经酶切鉴定成功构建腺病毒载体。该病毒能在细胞中表达N-端带Ig κ-链前导肽、C-端带Myc表位标签的PEX蛋白。Ig κ-链前导肽可诱导PEX分泌到胞外，Myc表位检测标签可用于外源性目的蛋白的检测以区别于肿瘤内源性PEX；
步骤5：重组腺病毒Ad-PEX在HEK293细胞包装成完整的腺病毒
将重组腺病毒酶切线性化后转染入HEK293细胞包装成完整的腺病毒。
包装完整的人PEX外泌型重组腺病毒可作为一种基因治疗药物用于肿瘤和血管生成相关疾病的治疗。
本发明所获得的人PEX外泌型重组腺病毒能在细胞中表达N-端带Ig κ-链前导肽、C-端带Myc表位检测标签的PEX蛋白。Ig κ-链前导肽可诱导PEX分泌到胞外，Myc表位检测标签可用于外源性目的蛋白的检测以区别于肿瘤内源性PEX。该重组腺病毒可作为一种基因治疗药物用于肿瘤或血管生成相关疾病的治疗。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。
1.用Qiagen公司Rneasy Mini Kit提取胎盘组织总RNA。
1)取新鲜胎盘组织，用生理盐水冲洗，放入干净研缽，剪碎，加入液氮，将组织块碾成粉末。
2)待液氮挥发，将30mg左右组织转入无Rnase的2ml Ependorf管中。
3)加入预先加入β-巯基乙醇(β-ME，10μl/ml RLT缓冲液)的RLT缓冲液600μl，旋涡振荡以裂解组织。
4)将裂解液用台式离心机最大速度、室温离心3分钟，将上清转入另一Ependorf管中。
5)加入600μl70％乙醇，用枪头吹打混匀。
6)取一Rneasy小柱置入2ml收集管中，加入5)中700μl样品，室温，用12000rpm速度，离心15秒钟，弃过柱液。
7)700μl Buffer RW1入柱中，室温，12000rpm离心15秒钟，弃过柱液及收集管。
8)将小柱置入另一2ml收集管中，向柱中加入500μl预先已加4倍体积100％乙醇的Buffer RPE，室温，12000rpm离心15秒钟，弃过柱液。
9)再向柱中加入500μl预先加4×Vol 100％乙醇的Buffer RPE，室温，14000rpm离心2min，弃过柱液及收集管。
10)将小柱导入-1.5ml收集管中，向柱中加入30μl无RNase H2O，室温，12000rpm离心1分钟，即得20～50μl总RNA。
11)总RNA定量：取5μl RNA加入495μl ddH2O中，测A260值。按以下公式计算：RNA浓度(μg/ml)＝A260值×100×40μg/ml
2、RT-PCR扩增人MMP2 C端片段PEX cDNA片段PEX215：
1)以胎盘组织总RNA为模板逆转录合成PEX cDNA第一条链：反应体系和条件如下：
Oligo(dT)15(500μg/ml，Promega) 1μl
胎盘组织总RNA 3μl(2～5μg)
ddH2O 7μl
11μl
↓70℃ 10min，
反应后迅速置于冰中，迅速离心后加入
RNasin(Promega) 1μl
5×First Strand Buffer 4μl
DTT(0.1M) 2μl
10mM dNTP mix(Promega) 1μl
19μl
↓42℃ 2min，
再加SupersriptTMII Reverse Transcriptase(Invitrogen)1μl，轻轻混匀，于42℃反应60min，最后在70℃反应15min灭活酶活性。
2)PCR扩增人MMP2 C端片段PEX cDNA PEX215
利用引物设计软件，根据人MMP2序列(Genbank Accession No.：NM_004530)和载体pGEX-4T-3多克隆位点，设计PCR引物PEX446S和PEX660A(引物由上海博亚生物技术有限公司合成)。PEX446S：序列为5’-ctg aat tcc tct cct gac att gac ctt g-3’，上游引物，带限制性内切酶EcoR I酶切位点。PEX660A：序列为5’-CGC TCG AGA GGA AGG GCCTGT GG-3’，下游引物，带限制性内切酶Xho I酶切位点。以1)中逆转录反应产物作为模板将上游引物PEX446S与下游引物PEX660A一起扩增人MMP2 cDNA 1629bp～2304bp片段，即长度为676bp的PEX cDNA片段PEX215。该cDNA片段编码人MMP2从446aa到660aa的PEX片段。其PCR反应体系如下：
10×Reaction Buffer 5μl
10mM dNTP mix(Promega) 2μl
50uM引物PEX446S 1μl
50uM引物PEX660A 1μl
Vent DNA Polymerase(NEB) 1μl
模板DNA(逆转录反应产物) 2μl
dI·H2O 38μl
50μl
其PCR反应程序为：94℃预变性5min后进入循环，94℃变性60s、60℃复性90s、68℃延伸90s，94℃变性1min，60℃复性60s，72℃延伸45s，扩增30个循环后，72℃再充分延伸10min。各取5μl PCR产物，用1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。以上反应在PTC-200 PeltierThermal Cycler上进行。
3、原核表达载体pGEX-4T-3/PEX215的构建
1)线性化载体和插入片断的连接
(1)PEX片断的酶切纯化：将PCR反应扩增的PEX215 cDNA片断用1.2％琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外透射仪下用刀片切取目的片断。用Glassmilk纯化目的片断。纯化后的片断用内切酶EcoR I和Xho I酶切后，直接用Glassmilk纯化备用。
(2)线性化载体的酶切线性化和纯化：将原核表达载体pGEX-4T-3用内切酶EcoR I和Xho I酶切后，直接用Glassmilk纯化。
(3)线性化载体和插入片断的连接反应体系和条件：将纯化的插入片断PEX215 cDNA和线性化载体pGEX-4T-3用1.2％琼脂糖凝胶进行电泳，然后用凝胶成像系统成像，分析各片断荧光强度。根据插入片断和载体的荧光强度和分子量比值，将插入片断和载体按3∶1加入连接酶反应体系。反应体系如下：
10×ligase buffer 1μl
T4 DNA Ligase(MBI Fermentas) 1μl
10μl
于22℃反应3小时，65℃，10分钟灭活连接酶。
2)连接产物转化
(1)将新鲜制备的DH5α感受态细菌100μl加入冰上预冷的1.5ml的无菌离心管中。
(2)加入5μl连接产物，轻轻混匀后置冰上30分钟。
(3)42℃水浴60秒钟，立即置冰中2分钟，取出后加入1mlSOC。
(4)37℃，225rpm振荡培养1小时。
(5)室温，10000rpm离心15秒，弃上清1ml，保留100μl上清。
(6)悬浮上清，将经培养的转化液平铺于含氨苄青霉素的固体LB培养基平板。
(7)37℃培养过夜。
3)阳性pGEX-4T-3/PEX215克隆的鉴定
(1)挑取次日长出的克隆6个，用含氨苄青霉素(60μg/ml)的LB培养12～16小时，离心收集菌液。同时保留菌种以备测序使用。
(2)用碱裂解法提取质粒。质粒提取后用内切酶EcoR I和Xho I酶切，酶切产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳，于紫外透射仪下判断是否有预期大小的插入片断释放。
(3)将酶切后释放预期插入片断大小的阳性克隆进行测序。
(4)将得到的测序结果用Blast序列对比工具进行分析，以判断克隆到的PEX215序列的正确性。
(5)保留序列正确的重组质粒pGEX-4T-3/PEX215。
4.PCR扩增人MMP2 C端片段PEX cDNA。
1)引物设计和合成(引物由上海博亚生物技术有限公司合成)：利用引物设计软件，根据人MMP2序列(Genbank Accession No.：NM_004530)及其编码框架以及pSecTag A载体多克隆位点，设计二条PCR反应引物PEX466sense和PEX660antisense。其中上游引物PEX466sense，序列为5’-GTGTGGCCCAGCCGGCCCCTGAGATCTGCAAAC-3’，带限制性内切酶SfiI酶切位点；下游引物PEX660antisense，序列为5’-CGCTCGAGGCAGCCTAGCCAGTC-3’，带限制性内切酶Xho I酶切位点。
2)PCR反应体系和扩增程序：以pGEX-4T-3/PEX215质粒为模板和上游引物PEX466sense与下游引物PEX660antisense一起扩增人MMP2 cDNA 1685bp～2269bp片段，即585bp的PEXcDNA片段，编码人MMP2从466aa到660aa的195aaPEX片段。其PCR反应体系如下，
10×Reaction Buffer 5μl
10mM dNTP mix(Promega) 2μl
50uM引物PEX466sense 1μl
50uM引物PEX660antisnse 1μl
Vent DNA Polymerase(NEB) 1μl
pGEX-4T-3/PEX215质粒(0.5μg/μl) 0.5μl
dI·H2O 39.5μl
50μl
扩增PEX片断反应程序为：94℃预变性5min后进入循环，94℃变性1min，65℃复性60s，72℃延伸45s，扩增30个循环后，72℃再充分延伸10min。各取5μl PCR产物，用1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。以上反应在PTC-200 Peltier Thermal Cycler上进行。
5.真核表达质粒pSecTag A/PEX的构建
1)线性化载体和插入片断的连接
(1)PEX片断的酶切纯化：将PCR反应扩增的PEX片断用1.2％琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外透射仪下用刀片切取目的片断。用Glassmilk纯化目的片断。纯化后的片断先用内切酶Sfi I 50℃于buffer 2中消化5h后将反应温度降至37℃，加Xho I后于37℃继续酶切消化3h后，直接用Glassmilk纯化备用。
(2)载体的酶切线性化和纯化：将真核表达载体pSecTag A用内切酶Sfi I和Xho I与PCR扩增的PEX片断同样方法酶切消化后，直接用Glassmilk纯化。
(3)线性化载体和插入片断的连接反应体系和条件：将纯化的插入片断PEX和线性化载体pSecTag A用1.2％琼脂糖凝胶进行电泳，然后用凝胶成像系统成像，分析各片断荧光强度。根据插入片断和载体的荧光强度和分子量比值，将插入片断和载体按3∶1加入连接酶反应体系。反应体系如下：
10×ligase buffer 1μl
T4 DNA Ligase(MBI Fermentas) 1μl
10μl
于22℃反应3小时，65℃，10分钟灭活连接酶。
2)连接产物转化
(1)将新鲜制备的DH5α感受态细菌100μl加入冰上预冷的1.5ml的无菌离心管中。
(2)将5μl连接产物加入离心管中，轻轻混匀后置冰上30分钟。
(3)42℃水浴60秒钟，立即置冰中2分钟，取出后加入1mlSOC。
(4)37℃，225rpm振荡培养1小时。
(5)室温，10000rpm离心15秒，弃上清1ml，保留100μl上清。
(6)悬浮上清，将经培养的转化液平铺于含氨苄青霉素的固体LB培养基平板。
(7)37℃培养过夜。
3)阳性pSecTag A/PEX克隆的鉴定
(1)挑取次日长出的阳性克隆，用含氨苄青霉素(60μg/ml)的LB培养12～16小时，离心收集菌液。同时保留菌种以备测序使用。
(2)用碱裂解法提取质粒。质粒提取后用内切酶Sfi I和Xho I酶切，酶切产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳，于紫外透射仪下判断是否有预期大小插入片断的释放。
(3)将酶切后释放预期大小插入片断的阳性克隆进行测序。
(4)将得到的测序结果用Blast序列对比工具进行分析，以判断克隆到的PEX片断序列的正确性。
(5)保留序列正确的pSecTag A/PEX菌种和质粒。成功构建的质粒pSecTag A/PEX在表达的PEX片断N-端带有Ig κ-链前导链，C-端带有c-Myc表位检测标签。
6.腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-PEX的构建
1)PCR扩增人MMP2 C端片段PEX cDNA
(1)引物设计和合成：利用引物设计软件，根据人MMP2序列(Genbank AccessionNo.：NM_004530)及其编码框架、pShuttle-CMV载体多克隆位点以及pSecTag A/PEX载体酶切位点，设计二条PCR反应引物PEX4661eader和PEX660Myc。其序列、特征和用途如下：PEX466leader为上游引物，序列为5’-GATCAGCGGCCGCCCACCATGGAGACAG-3’，带完整Kozak翻译起始序列和限制性内切酶Not I酶切位点。PEX660Myc为下游引物，序列为5’-GTGCAAGCTTCAGCTATTCAGATCCTC-3’，末端带限制性内切酶Hind III酶切位点和终止密码子TGA，引物由上海博亚生物技术有限公司合成。
(2)PCR反应体系和扩增程序：PCR反应扩增PEXcDNA片段：以pSecTag A/PEX质粒为模板用如下PCR反应体系扩增PEX片断。
10×Reaction Buffer 5μl
10mM dNTP mix(Promega) 2μl
50uM引物PEX466leader 1μl
50uM引物PEX660Myc 1μl
Vent DNA Polymerase(NEB) 1μl
pSecTag A/PEX质粒(0.5μg/μl) 0.5μl
dI·H2O 39.5μl
50μl
(3)PCR反应程序：扩增PEX片断反应程序为：94℃预变性5min后进入循环，94℃变性1min，62℃复性60s，72℃延伸45s，扩增30个循环后，72℃再充分延伸10min。各取5μl PCR产物，用1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。以上反应在PTC-200 Peltier Thermal Cycler上进行。扩增获得人MMP2 cDNA 1685bp～2269bp片段，即585bp的PEK cDNA片段，编码人MMP2从466aa到660aa的195aaPEX片段，并在表达的PEX N-端带有Ig κ-链前导链，C-端带有Myc表位检测标签。插入片段序列为：GGCCGCCCAC CATGGAGACA G ACACACTCCTGCTATGGGT ACTGCTGCTC TGGGTTCCAG GTTCCACTGG TGACGCGGCC CAGCCGGCC CCTGAG ATCTGCAAACAGGACATTGT ATTTGATGGC ATCGCTCAGA TCCGTGGTGA GATCTTCTTC TTCAAGGACC GGTTCATTTGGCGGACTGTG ACGCCACGTG ACAAGCCCAT GGGGCCCCTG CTGGTGGCCA CATTCTGGCC TGAGCTCCCGGAAAAGATTG ATGCGGTATA CGAGGCCCCA CAGGAGGAGA AGGCTGTGTT CTTTGCAGGG AATGAATACTGGATCTACTC AGCCAGCACC CTGGAGCGAG GGTACCCCAA GCCACTGACC AGCCTGGGAC TGCCCCCTGATGTCCAGCGA GTGGATGCCG CCTTTAACTG GAGCAAAAAC AAGAAGACAT ACATCTTTGC TGGAGACAAATTCTGGAGAT ACAATGAGGT GAAGAAGAAA ATGGATCCTG GCTTTCCCAA GCTCATCGCA GATGCCTGGAATGCCATCCC CGATAACCTG GATGCCGTCG TGGACCTGCA GGGCGGCGGT CACAGCTACT TCTTCAAGGGTGCCTATTAC CTGAAGCTGG AGAACCAAAG TCTGAAGAGC GTGAAGTTTG GAAGCATCAA ATCCGACTGGCTAGGCTGC CTCGAGTCTA GAGGGCCCGA ACAAAAACTC ATCTCAGAAG AGGATCTGAA TAGCTGA。
2)线性化载体和插入片断的连接
(1)PEX片断的酶切纯化：将PCR反应扩增的PEK片断用1.2％琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外透射仪下用刀片切取目的片断。用Glassmilk纯化目的片断。纯化后的片断用内切酶NotI和Hind III于buffer 2(bufferH)中消化后用Glassmilk纯化备用。
(2)载体的酶切线性化和纯化：将腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV用内切酶NotI和HindIII同样方法酶切消化后，直接用Glassmilk纯化。
(3)线性化载体和插入片断的连接反应体系和条件：将纯化的插入片断PEX和线性化载体pShuttle-CMV用1％琼脂糖凝胶进行电泳，然后用凝胶成像系统成像，分析各片断荧光强度。根据插入片断和载体的荧光强度和分子量比值，将插入片断和载体按3∶1加入连接酶反应体系。反应体系如下：
10×ligase buffer 1μl
T4 DNA Ligase(MBI Fermentas) 1μl
10μl
于22℃反应3小时，65℃，10分钟灭活连接酶。
3)连接产物转化
(1)将新鲜制备的DH5α感受态细菌100μl加入冰上预冷的1.5ml的无菌离心管中。
(2)将5μl连接产物加入此1.5ml的无菌离心管，轻轻混匀后置于冰上30分钟。
(3)42℃水浴60秒钟，立即置冰中2分钟，取出后加入1mlSOC。
(4)37℃，225rpm振荡培养1小时。
(5)室温，10000rpm离心15秒，弃上清1ml，保留100μl上清。
(6)悬浮上清，将经培养的转化液平铺于含卡那霉素(50μg/ml)的固体LB培养基。
(7)37℃培养过夜。
4)阳性pShuttle-CMV-PEX克隆的鉴定
(1)挑取次日长出的阳性克隆6个，用含卡那霉素(50μg/ml)的LB培养12～16小时，离心收集菌液。同时保留菌种以备测序使用。
(2)用碱裂解法提取质粒。质粒提取后用内切酶NotI和Hind III酶切，酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳，于紫外透射仪下判断是否有预期大小插入片断的释放。
(3)将酶切后释放预期大小插入片断的阳性克隆进行测序。
(4)将得到的测序结果用Blast序列对比工具进行分析，以判断克隆到的PEX片断序列的正确性。
(5)保留序列正确的pShuttle-CMV-PEX菌种和质粒。构建成功的载体在PEX N-端带有Ig κ-链前导链，C-端带有Myc表位检测标签。
7.大肠杆菌中腺病毒的同源重组
1)穿梭质粒pShuttle-CMV-PEX线性化和磷酸化酶处理：
(1)质粒pShuttle-CMV-PEX的Pme I酶切线性化
质粒pShuttle-CMV-PEX DNA(1μg/μl) 5μl
10×Buffer 4 1μl
BSA(1μg/μl) 1μl
Pme I 1μl
dd.H2O 2μl
10μl
37℃，水浴5小时
(2)线性化pShuttle-CMV-PEX的磷酸化酶处理
上述反应液 10μl
CIAP 10×Raction Buffer 4μl
Diluted CIAP(0.1U/μl，Promega，#M1821) 5μl
dd.H2O 21μl
40μl
混匀，37℃，水浴60分钟
(3)1％琼脂糖凝胶电泳分离并用glassmilk纯化线性化质粒pShuttle-CMV-PEX，将分离的线性化质粒最后溶于dd.H2O中。测A260对其进行定量。
2)线性化pShuttle-CMV-PEX质粒和腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183细胞电转化
(1)取1μg线性化pShuttle-CMV-PEX质粒和100ng pAdEasy-1超螺旋质粒(体积≤5μl)混匀，冰上预冷。
(2)将BJ5183电转化感受态细胞冰上溶化后，加40μl细胞于冰上预冷的0.5ml Ep管中，加入(1)中质粒混合液，轻轻混匀置冰上30分钟。
(3)将电转仪参数调到2，500V、200Ω、25μF。
(4)将(2)中感受态细胞混合液加入冰上预冷的2mm电转杯中。
(5)将电转杯置于电转室中，电击一次后迅速加入1mlSOC溶液与电转化细胞混匀。
(6)将电转化细胞转移至摇菌管中，37℃，225rpm振荡培养1小时。
(7)将孵育后的细胞50μl、500μl分别涂于两个带卡那霉素的LB平板上。37℃孵育16-20小时
8.阳性pAdEasy-pShuttle-CMV-PEX(Ad-PEX)重组子的鉴定和扩增
1)在平板中选择最小的、独立的克隆12个，用牙签挑取置于带50μg/ml卡那霉素的5mlLB培养液中，37℃，225rpm振荡培养过夜。
2)提取质粒，用BamH I或Pac I酶切后，用0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定同源重组腺病毒载体Ad-PEX。确定阳性重组子。
3)将同源重组的腺病毒载体Ad-PEX转化入大肠杆菌DH10B中，扩增后提取质粒，保留以转染哺乳动物细胞。该病毒能在细胞中表达N-端带Ig κ-链前导肽、C-端带Myc表位标签的PEX蛋白。Ig κ-链前导肽可诱导PEX分泌到胞外，Myc表位检测标签可用于外源性目的蛋白的检测以区别于肿瘤内源性PEX。
9.重组腺病毒Ad-PEX在HEK293细胞包装成完整的腺病毒
1)将重组腺病毒Ad-PEX用PacI酶切线性化后用乙醇沉淀纯化，冻存于-20℃。
2)用10％FBS+DMEM+PS培养HEK293细胞，在转染前24小时接种细胞5×105个/瓶于T25细胞培养瓶中。至细胞转染时细胞密度70％。
3)24小时后，细胞密度约为70％，取5μl(5μg)PacI酶切线性化重组腺病毒Ad-PEX溶于20μl去离子水中，再与280μl的无血清DMEM培养液混合成A液；20μl的LipofectAmine与280μl无血清DMEM培养液混合成B液；室温5分钟后，将A液与B液混合并轻轻混匀。室温放置20分钟后加入1.9ml无血清DMEM培养液，37℃水浴10分钟
4)倒去培养瓶中培养液，将细胞用PBS洗一次，缓慢沿瓶壁逐滴加入上述混合液。
5)6-10小时后，换成20％FBS+DMEM+PS的培养液，约20小时后换成10％FBS+DMEM+PS的培养液。
6)7-10天(期间根据细胞状态向培养瓶更换或加培养液)后，小心弃瓶中培养液，用PBS轻轻洗细胞一次，加入0.5mlPBS，收集细胞，经干冰-甲醇和37℃水浴，间歇5分钟反复冻融4次，每次溶化后快速振荡一次。
7)12,000×g，室温离心10分钟，存上清。
8)用此上清直接感染3个T75培养瓶，24-48小时时，细胞出现病态变化，收集上清及细胞。
9)继续下一轮感染，感染15个T75培养瓶。震荡收集细胞，PBS洗一次，溶于5ml PBS中，反复冻融4次，12,000×g，室温离心10分钟，存上清。测病毒滴度，存-70℃。
转染入HEK293细胞包装成完整的重组腺病毒Ad-PEX可作为一种基因治疗药物用于肿瘤和血管生成相关疾病的治疗。
序列表
PCR引物PEX446S：序列为5’-CTG AAT TCC TCT CCT GAC ATT GAC CTT G-3’。
PEX660A：序列为5’-CGC TCG AGA GGA AGG GCC TGT GG-3’。
上游引物PEX466sense，序列为5’-GTG TGG CCC AGC CGG CCC CTG AGA TCT GCA AAC-3’。
下游引物PEX660antisense，序列为5’-CGC TCG AGG CAG CCT AGC CAG TC-3’。二条PCR反应引物，其中上游引物PEX466leader序列为5’-GATCAGCGGCCGCCCACCATGGAGACAG-3’。下游引物PEX660Myc 序列为5’-GTGCAAGCTTCAGCTATTCAGATCCTC-3’。
插入片段序列为：GGCCGCCCAC CATGGAGACA G ACACACTCC TGCTATGGGT ACTGCTGCTCTGGGTTCCAG GTTCCACTGG TGACGCGGCC CAGCCGGCC CCTGAG ATCTGCAAAC AGGACATTGT ATTTGATGGCATCGCTCAGA TCCGTGGTGA GATCTTCTTC TTCAAGGACC GGTTCATTTG GCGGACTGTG ACGCCACGTGACAAGCCCAT GGGGCCCCTG CTGGTGGCCA CATTCTGGCC TGAGCTCCCG GAAAAGATTG ATGCGGTATACGAGGCCCCA CAGGAGGAGA AGGCTGTGTT CTTTGCAGGG AATGAATACT GGATCTACTC AGCCAGCACCCTGGAGCGAG GGTACCCCAA GCCACTGACC AGCCTGGGAC TGCCCCCTGA TGTCCAGCGA GTGGATGCCGCCTTTAACTG GAGCAAAAAC AAGAAGACAT ACATCTTTGC TGGAGACAAA TTCTGGAGAT ACAATGAGGTGAAGAAGAAA ATGGATCCTG GCTTTCCCAA GCTCATCGCA GATGCCTGGA ATGCCATCCC CGATAACCTGGATGCCGTCG TGGACCTGCA GGGCGGCGGT CACAGCTACT TCTTCAAGGG TGCCTATTAC CTGAAGCTGGAGAACCAAAG TCTGAAGAGC GTGAAGTTTG GAAGCATCAA ATCCGACTGG CTAGGCTGC CTCGAGTCTAGAGGGCCCGA ACAAAAACTC ATCTCAGAAG AGGATCTGAA TAGCTGA。
Claims (2)
1.人PEX外泌型重组腺病毒的构建方法，其特征在于所说的构建方法如下：
步骤1、质粒pSecTag A/PEX的构建
1)pGEX-4T-3/PEX215质粒的构建
(1)以从胎盘提取的组织总RNA为模板逆转录合成PEX cDNA第一条链；
(2)根据人MMP2序列(Genbank Accession No.：NM_004530)和载体pGEX-4T-3的多克隆位点，设计二个PCR引物，上游引物PEX446S，序列为5’-CTG AAT TCC TCT CCT GACATT GAC CTT G-3’，带限制性内切酶EcoR I酶切位点；下游引物PEX660A，序列为5’-CGC TCG AGA GGA AGG GCC TGT GG-3’，带限制性内切酶Xho I酶切位点；
(3)以逆转录合成的第一条链为模板，利用PCR技术，用上游引物PEX446S和下游引物PEX660A一起扩增人MMP2 cDNA 1629bp～2304bp片段，即长度为676bp的PEX cDNA片段，并重组入载体pGEX-4T-3中，得编码人MMP2从446aa到660aa的PEX片段PEX215；
(4)将PEX215重组于GST融合蛋白表达载体pGEX-4T-3，获得序列正确的重组质粒pGEX-4T-3/PEX215；
2)PCR技术扩增人MMP2 C端片段PEX cDNA
根据人MMP2序列(Genbank Accession No.：NM_004530)及其编码框架以及pSecTag A载体多克隆位点，设计二条PCR反应引物PEX466sense和PEX660antisense，其中上游引物PEX466sense，序列为5’-GTG TGG CCC AGC CGG CCC CTG AGA TCT GCA AAC-3’，带限制性内切酶Sfi I酶切位点；下游引物PEX660antisense，序列为5’-CGC TCG AGG CAG CCTAGC CAG TC-3’，带限制性内切酶Xho I酶切位点；以pGEX-4T-3/PEX215质粒为模板，用引物PEX466sense与PEX660antisense一起扩增人MMP2 cDNA 1685bp～2269bp片段，即585bp的PEX cDNA片段，编码人MMP2从466aa到660aa的PEX蛋白；
3)真核表达质粒pSecTag A/PEX的构建
将PCR扩增的PEX cDNA片段和载体pSecTag A经Sfi I和XhoI双酶切后，经连接酶连接后构建质粒pSecTag A/PEX，该质粒表达的PEX蛋白N端带有Ig κ-链前导链，C端带有Myc表位标签，lg κ-链前导肽可介导PEX分泌到胞外，Myc表位检测标签可用于外源性PEX蛋白的检测以区别于内源性PEX蛋白；
步骤2：腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-PEX的构建
根据人MMP2序列(Genbank Accession No.：NM_004530)及其阅读框架、pShuttle-CMV载体多克隆位点以及编码框架，设计二条PCR反应引物，其中上游引物PEX466leader序列为5’-GATCAGCGGCCGCCCACCATGGAGACAG-3’，带完整Kozak翻译起始序列和限制性内切酶NotI酶切位点，下游引物PEX660Myc序列为5’-GTGCAAGCTTCAGCTATTCAGATCCTC-3’，末端带限制性内切酶Hind III酶切位点和终止密码子TGA；以步骤1构建的质粒pSecTag A/PEX为模板，利用PCR技术，用上游引物PEX466leader和下游引物PEX660Myc扩增人MMP2 cDNA1685bp～2269bp片段，即585bp的PEX cDNA片段，编码人MMP2从466aa到660aa的195aaPEX片段，并在表达的PEX N-端带有Ig κ-链前导链METDTLLLWVLLLWVPGSTGD，C-端带有Myc表位EQKLISEEDLN检测标签，将PCR扩增得到的插入片段重组入腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV，构建pShuttle-CMV-PEX质粒；
步骤3：大肠杆菌中腺病毒的同源重组
将质粒pShuttle-CMV-PEX用Pme I酶切线性化和磷酸化酶处理后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183，二者同源重组生成腺病毒pAdEasy-pShuttle-CMV-PEX；
步骤4：阳性pAdEasy-pShuttle-CMV-PEX(Ad-PEX)重组子的扩增
将确定阳性重组子的病毒载体pAdEasy-pShuttle-CMV-PEX电转化入大肠杆菌DH10B扩增，扩增后提取质粒，该病毒能在细胞中表达N-端带Ig κ-链前导肽、C-端带Myc表位标签的PEX蛋白，Ig κ-链前导肽可诱导PEX分泌到胞外，Myc表位检测标签可用于外源性目的蛋白的检测以区别于肿瘤内源性PEX；
步骤5：重组腺病毒Ad-PEX在HEK293细胞包装成完整的腺病毒
将重组腺病毒酶切线性化后转染入HEK293细胞包装成完整的腺病毒。
2.如权利要求1所述的人PEX外泌型重组腺病毒在制备用于肿瘤或血管生成相关疾病的基因治疗药物中的应用。
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