CN102787119A

CN102787119A - 治疗和/或预防病毒感染的产品及方法

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Publication number: CN102787119A
Application number: CN2011101262898A
Authority: CN
Inventors: 傅阳心
Original assignee: Individual
Current assignee: Suzhou Alphamab Co Ltd
Priority date: 2011-05-17
Filing date: 2011-05-17
Publication date: 2012-11-21
Anticipated expiration: 2031-05-17
Also published as: CN102787119B

Abstract

本发明涉及病毒感染的预防和/或治疗领域，特别是对由病毒感染引起的疾病，例如肝炎的预防和/或治疗。本发明涉及利用LIGHT多肽，或者编码所述LIGHT多肽的多核苷酸在肝内预防和/或治疗由病毒感染引起的疾病或病况。本发明还涉及LIGHT多肽、病毒抗原、和/或所述病毒抗原的高亲和性中和抗体的组合，及其预防和/或治疗病毒感染的用途和方法。

Description

治疗和/或预防病毒感染的产品及方法

技术领域

本发明属于病毒感染的预防和/或治疗领域，特别是对由病毒感染引起的疾病，例如肝炎的预防和/或治疗。

背景技术

LIGHT(homologous to lymphotoxin，exhibits inducibleexpression，and competes with HSV glycoprotein D for herpesvirus entry mediator，a receptor expressed by T lymphocytes(与淋巴毒素同源，表现出诱导型表达，并与HSV糖蛋白D竞争疱疹病毒进入介体——T淋巴细胞表达的一种受体))是最近鉴定的TNF配体超家族II型跨膜糖蛋白。LIGHT(TNFSF 14)是肿瘤坏死因子(TNF)家族成员，其与分别主要表达在基质细胞和T细胞上的淋巴毒素β受体(LTβR，Lymphotoxinβreceptor)和疱疹病毒进入介体(HVEM，herpesvirus entry mediator)相互作用。LTβR信号传导是形成有组织的淋巴结构所必需的，这可能至少部分归因于LTβR能够诱导趋化因子和粘着分子表达，而后两者可以吸引淋巴器官中的幼稚T细胞和树突细胞(DC)。体内LIGHT对基质细胞上的LTβR的刺激导致CCL21表达，在缺乏LTαβ(LTβR的另一配体)的情况下CCL21吸引脾脏T细胞区域中的幼稚T细胞。这些结果证实了LIGHT能够与LTβR相互作用以调节CCL21趋化因子的表达。此外，LIGHT也表现出有力的、CD28非依赖性的T细胞致敏和扩增共刺激活性，导致增强的抗肿瘤T细胞免疫和/或增强的自身免疫。通过LTβR的信号传导是有组织的淋巴组织形成所必需的。淋巴毒素β受体(LTβR)在淋巴结构的形成中起重要作用。LTβR被TNF家族的两个成员，即，淋巴毒素αβ和LIGHT，激活。LTβR在二级淋巴器官中T、B区的不同组织和淋巴结(LN)的形成上起关键作用。通过LTβR的信号传导调节二级淋巴器官中趋化因子和粘着分子的表达。趋化因子和粘着分子控制脾脏中DC和淋巴细胞的迁移和定位。可溶性LT或TNF在非淋巴组织中的过表达足以促进功能性淋巴新生。

LIGHT在T细胞激活和淋巴组织形成中具有独特作用。LIGHT是LTβR及疱疹病毒进入介体(HVEM)的配体。LIGHT主要表达在淋巴组织上。LIGHT与LTβR的相互作用可以在LTα^-/-小鼠脾脏中重建淋巴结构。此外，LIGHT的上调可以导致T细胞激活和迁移入非淋巴组织中并形成淋巴样结构。相反地，LIGHT^-/-小鼠表现出受损的T细胞激活和延迟的心脏排斥。因此，LIGHT是有力的共刺激分子，其也可以促进淋巴组织形成以增强局部免疫应答。已显示，在肿瘤内施用表达LIGHT的腺病毒，通过吸引和活化更多的免疫细胞进入肿瘤而破坏肿瘤的免疫屏障，从而作用于局部肿瘤的排斥或肿瘤转移⁸。

持续性感染是全球范围内的主要健康问题之一。某些病原体(特别是乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人体免疫缺陷病毒(HIV)、人乳头瘤病毒(HPV)、和Epstein-Barr病毒(EBV))虽然具有较强的抗原，仍可在免疫活性宿主中持续存在。在宿主中清除病毒面临的三个主要问题是：病毒抗原以较高水平存在以及免疫耐受性和疫苗的效力较低。例如，HBV感染中存在高水平的病毒抗原，而宿主的免疫应答不能清除如此之多的病毒，增加的T细胞应答反而造成了肝脏损伤。因此，需要全面的治疗手段来清除这些病原体。下面以乙型肝炎中的病毒感染为例，进一步阐释在清除宿主中的病毒方面本领域中存在的问题。

HBV和丙型肝炎病毒HCV感染是最广泛的全球性健康问题之一，全世界约有20亿人被HBV或HCV感染且其中，慢性HBV或HCV感染影响约4.5亿人。对于HBV而言，在幼年时期曾被慢性感染的成人中，约有25％后来死于由所述慢性感染引起的肝癌或肝硬化(肝的瘢痕形成)(WHO.Hepatitis B-Key facts.2009：http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs204/en/)。清除HBV既需要细胞毒性T淋巴细胞(CTL)来清除细胞内的病毒，也需要针对乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的中和抗体来以互补的方式有效地清除细胞外病毒。通过利用所述中和抗体，CTL或天然杀伤(NK)细胞所释放的游离病毒颗粒将被中和。目前在清除HBV中面临的主要问题是生物体内CTL的功能缺陷、极高水平的抗原(例如HBsAg)和“被耗竭”的CTL上抑制性分子的上调。目前存在的疫苗(HBsAg+明矾)在预防方面是相对有效的，但是对于治疗却根本无效。现存的疫苗在产生CTL方面效果相当差^1-2，而患有慢性HBV感染的患者具有有缺陷的CTL³，因而慢性HBV患者对目前存在的疫苗没有应答。虽然在当前的慢性HBV治疗中，抗病毒治疗能够抑制HBV的复制，但其却没有充分地恢复有功能的CTL，不能完全恢复有功能的抗HBV免疫性。一些研究显示适当活化的T细胞的细胞毒性可以清除之前存在的HBV感染^3-5。然而，由于CTL的产生不佳，治疗的临床试验结果有限^1-2。因此，需要新的策略以产生更强的疫苗，来清除HBV。

发明内容

本发明涉及病毒感染的预防和/或治疗，特别是对由病毒感染引起的疾病，例如肝炎的预防和/或治疗。本发明通过利用LIGHT多肽，或编码所述LIGHT多肽的多核苷酸在肝内预防和/或治疗由病毒感染引起的疾病或病况。本发明还涉及LIGHT多肽、病毒抗原和/或病毒抗原的中和抗体的组合，及其预防和/或治疗病毒感染的用途和方法。

如上文中所述，要清除宿主内的病毒需面临下列问题：病毒抗原以较高水平存在、免疫耐受性和疫苗的效力较低。本发明的技术方案克服了这些问题，产生了治疗病毒感染，特别是肝脏内病毒感染的新产品和方法。

在本发明的一个实施方式中，使用了效力较强的药物组合物(例如包含LIGHT多肽和病毒抗原的免疫组合物)来破坏免疫耐受性并产生有功能的CTL以清除细胞内病毒。在本发明的另一个实施方式中，还进一步使用了病毒抗原的中和抗体来降低细胞外的病毒水平，从而解决了病毒抗原以较高水平存在的问题。此外，使用病毒抗原的中和抗体也可以有效地中和CTL所释放的游离病毒颗粒。

因此，为了更有效地清除病毒，例如HBV，本发明的发明人利用病毒抗原的中和抗体、免疫调节剂LIGHT、病毒抗原、或它们的组合，开发了更强的药物组合物(例如疫苗)、试剂盒以及清除病毒的新的方法，其效果是在受试者中产生下列四种信号中的一种或多种：保护性抗原的增加、对T细胞的协同刺激、对于树突细胞的吸引和活化、以及产生危险/先天免疫信号。在本发明的一个具体实施方式中，发明人发现，在清除HBV时，利用腺病毒载体表达LIGHT蛋白和乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)可以提供上文中所述的四种关键的信号的一种或多种。

在本发明的另一个具体的实施方式中，利用包含编码LIGHT蛋白(SEQ ID NO：1)及乙型肝炎病毒表面抗原的多核苷酸的非复制性腺病毒载体产生了强效的HBV疫苗，其特别的优势是1)低毒性；2)容易产生高滴度；3)高效刺激针对CTL的I类通路；和/或4)特异性靶标肝组织。

在一个方面，本发明涉及分离的核酸分子，其包含：

(a)编码LI GHT多肽的多核苷酸或与之互补的多核苷酸；和

(b)编码病毒抗原的多核苷酸或与之互补的多核苷酸。

在一个具体实施方式中，所述编码LIGHT多肽的多核苷酸包含：

(i)序列如SEQ ID NO：2所示的多核苷酸或其片段；或

(ii)在严格条件下与(i)中的多核苷酸所构成的分子杂交的多核苷酸；或

(iii)因为遗传密码简并性而与(i)或(ii)的多核苷酸在密码子序列中不同的多核苷酸。

在具体的实施方式中，所述LIGHT多肽包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列、其片段或变体，且足以刺激细胞毒性T淋巴细胞；例如，所述变体可以是在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或其片段中经过一个或多个保守氨基酸置换而得到的氨基酸序列。

在又一个具体实施方式中，所述病毒抗原选自引起肿瘤或慢性病原体感染的病毒的免疫原性抗原，所述病毒为例如HBV、HCV、HIV、HPV或EBV；优选地，所述病毒抗原为HBV的免疫原性抗原；特别优选地，所述病毒抗原为HBsAg或其免疫原性片段。在一个具体的实施方式中，所述HBsAg的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

在另一个方面，本发明涉及核酸组合，其包含至少两种不同的核酸分子，其中所述至少两种不同的核酸分子中包含：

(a)编码LIGHT多肽的多核苷酸或与之互补的多核苷酸；和

(b)编码病毒抗原的多核苷酸或与之互补的多核苷酸。

其中，所述(a)和(b)中的多核苷酸可以位于相同和/或不同的核酸分子中。

在一个具体的实施方式中，所述核酸组合中的编码LIGHT多肽的多核苷酸包含：

(i)序列如SEQ ID NO：2所示的多核苷酸或其片段；或

特别地，所述LIGHT多肽可以包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列、其片段或变体，且足以刺激细胞毒性T淋巴细胞；例如，所述变体可以是在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或其片段中经过一个或多个保守氨基酸置换而得到的氨基酸序列。

在又一个具体实施方式中，所述核酸组合中的所述病毒抗原选自引起肿瘤或慢性病原体感染的病毒的免疫原性抗原，所述病毒为例如HBV、HCV、HIV、HPV或EBV；例如，所述病毒抗原可以是HBV的免疫原性抗原，优选地，所述病毒抗原为HBsAg或其免疫原性片段。在一个具体的实施方式中，所述HBsAg的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

在另外的方面，本发明涉及载体，其包含上述本发明的任一分离的核酸分子。在一个具体的实施方式中，所述编码LIGHT多肽的多核苷酸和编码病毒抗原的多核苷酸位于同一个所述载体中，特别地，二者可通过连接子(例如内部核糖体进入位点(IRES))相连。在本发明的一个具体实施方式中，所述载体为腺病毒载体。本领域技术人员将明了，当所述编码LIGHT多肽的多核苷酸和编码病毒抗原的多核苷酸通过连接子彼此相连时，所述连接子可以是任何不影响其所连接的多核苷酸所编码的产物的正常功能的多核苷酸。并且根据本领域的普通技术知识可以很容易地设计、制备此类连接子。

在具体的实施方式中，所述载体为病毒载体，例如选自腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、鼠哈维肉瘤病毒载体、鼠乳腺肿瘤病毒载体、劳斯肉瘤病毒载体、SV40-型病毒载体、多瘤病毒载体、EB病毒载体、乳头状瘤病毒载体、疱疹病毒载体、牛痘病毒载体、脊髓灰质炎病毒载体和RNA病毒载体；优选地，所述病毒载体为腺病毒载体。

在又一个方面，本发明涉及载体系统，其包含至少两个载体，所述至少两个载体中包含：

(a)编码LIGHT多肽的多核苷酸或与之互补的多核苷酸；和

(b)编码病毒抗原的多核苷酸或与之互补的多核苷酸；

其中，所述(a)和(b)中的多核苷酸位于相同和/或不同的载体中。

在一个具体的实施方式中，所述载体系统中的所述编码LIGHT多肽的多核苷酸包含：

(i)序列如SEQ ID NO：2所示的多核苷酸或其片段；或

在具体的实施方式中，所述载体系统中的所述病毒抗原选自引起肿瘤或慢性病原体感染的病毒的免疫原性抗原，所述病毒为例如HBV、HCV、HIV、HPV或EBV；例如，所述病毒抗原可以是HBV的免疫原性抗原，优选地，所述病毒抗原为HBsAg或其免疫原性片段。在一个具体的实施方式中，所述HBsAg的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

在一个具体的实施方式中，所述载体系统中的所述至少两个载体为病毒载体，且彼此独立地选自例如腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、鼠哈维肉瘤病毒载体、鼠乳腺肿瘤病毒载体、劳斯肉瘤病毒载体、SV40-型病毒载体、多瘤病毒载体、EB病毒载体、乳头状瘤病毒载体、疱疹病毒载体、牛痘病毒载体、脊髓灰质炎病毒载体和RNA病毒载体；优选地，所述病毒载体为腺病毒载体。

在本发明的一个具体的实施方式中，所述LIGHT多肽包含SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列、其片段或变体，且足以刺激细胞毒性T淋巴细胞，特别地，所述变体为在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或其片段中经过一个或多个保守氨基酸置换而得到的氨基酸序列；所述病毒抗原为HBsAg或其免疫原性片段，特别地，所述HBsAg的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：4所示；且所述编码LIGHT多肽的多核苷酸和编码病毒抗原的多核苷酸位于同一个腺病毒载体中。

在另一个方面，本发明涉及组合物，其包含LIGHT多肽和病毒抗原。其中所述LIGHT多肽和病毒抗原可以以彼此相结合或不相结合的方式存在。当二者以彼此相结合的方式存在时，它们可以通过形成融合蛋白、化学缀合、和形成免疫脂质体等方法中的一种或者多种方法相连，并且所述结合可以是可逆的或不可逆的。

在一个具体的实施方式中，所述组合物中的LIGHT多肽包含SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列、其片段或变体，且足以刺激细胞毒性T淋巴细胞；特别地，所述变体为在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或其片段中经过一个或多个保守氨基酸置换而得到的氨基酸序列。在另一个具体实施方式中，所述组合物中的病毒抗原可选自引起肿瘤或慢性病原体感染的病毒的免疫原性抗原，所述病毒为例如HBV、HCV、HIV、HPV或EBV；优选地，所述病毒抗原为HBV的免疫原性抗原；特别优选地，所述病毒抗原为HBsAg或其免疫原性片段，在一个具体的实施方式中所述HBsAg的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

在又一个方面，本发明涉及病毒颗粒，其包含上文中所述的载体(例如病毒载体)、载体系统(例如包含病毒载体的载体系统)或组合物。在一个具体的实施方式中，所述病毒颗粒为腺病毒颗粒。

另一方面，本发明涉及宿主细胞，其包含上述的载体、载体系统或病毒颗粒。

本发明还涉及所述的分离的核酸分子、所述核酸组合、所述载体、所述载体系统、所述组合物或所述病毒颗粒用于制备药物的用途，其中所述药物用于预防和/或治疗由病毒引起的肿瘤或慢性病原体感染，例如与HBV、HCV、HIV、HPV或EBV感染相关的病症或病况；特别地，所述药物可以用于预防和/或治疗肝内的病毒感染，特别是乙型肝炎病毒感染。例如所述药物可以用于刺激和扩增对HBsAg有特异性反应的T细胞。

在另外的方面，本发明涉及药物组合物，其包含：

(i)上述的分离的核酸分子、的核酸组合、载体、载体系统、组合物或病毒颗粒；和

(ii)任选地可药用的载体。

在又一方面，本发明还涉及一种试剂盒，其包含所述的药物组合物和针对病毒抗原的中和抗体；其中，所述中和抗体所针对的病毒抗原与所述药物组合物中分离的核酸分子、核酸组合、载体、载体系统、组合物或病毒颗粒所编码或包含的病毒抗原可以是相同的或不同的；并且其中，所述药物组合物和所述中和抗体彼此不相混合。在一个优选的实施方式中，所述试剂盒中的所述中和抗体所针对的病毒抗原与所述药物组合物中分离的核酸分子、核酸组合、载体、载体系统、组合物或病毒颗粒所编码或包含的病毒抗原是相同的；特别地，所述病毒抗原可以均为HBsAg或其免疫原性片段。

在一个具体的实施方式中，作为示例，发明人使用了针对ayw亚型HBsAg的单克隆抗体H25B10(表达此单克隆抗体的杂交瘤细胞购买自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，其保藏编号为ATCC H25B10)作为所述中和抗体并显示了其能够实现本发明的目的。在另外的实施方式中，发明人使用了特别针对在中国普遍存在的adr和adw亚型HBsAg的单克隆抗体scFvC-hIgG1Fc(其可变区序列由SEQ ID NO：5中所示的核酸序列所编码的氨基酸序列组成)和scFvD-hIgG1Fc(其可变区序列由SEQ ID NO：6中所示的核酸序列所编码的氨基酸序列组成)，由于这些抗体对于adr和adw亚型HBsAg的高亲和力，它们也可以理想地作为用于本发明的目的的中和抗体。类似地，下列抗体也可以用于本发明的目的：对于其各自的目标病毒抗原具有与抗体H25B10、可变区序列包含SEQ ID NO：5中所示的核酸序列所编码的氨基酸序列的抗体(例如抗体scFvC-hIgG1Fc)或可变区序列包含SEQ ID NO：6中所示的核酸序列所编码的氨基酸序列的抗体(例如抗体scFvD-hIgG1Fc)同等水平的亲和力(所述亲和力可以为例如Kd≤1x10^-8M，优选Kd≤1x10^-9M)的抗体，例如具有与抗体H25B10、scFvC-hIgG1Fc或scFvD-hIgG1Fc相同或至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)序列一致的重链和/或轻链CDR的抗体，或者具有与抗体H25B10、scFvC-hIgG1Fc或scFvD-hIgG1Fc相同或至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)序列一致的重链和/或轻链可变区的抗体。

在具体的实施方式中，本发明中的所述中和抗体的重链CDR1-3分别与抗体H25B10、scFvC-hIgG1Fc或scFvD-hIgG1Fc中任一个的重链CDR1-3相同；和/或所述中和抗体的轻链CDR1-3分别与抗体H25B10、scFvC-hIgG1Fc或scFvD-hIgG1Fc中任一个的轻链CDR1-3相同。在特别的实施方式中，所述中和抗体的重链和轻链CDR1-3分别与选自抗体H25B10、scFvC-hIgG1Fc或s cFvD-hIgG1Fc的同一个抗体的重链和轻链CDR1-3相同。其中所述scFvC-hIgG1Fc的可变区序列由SEQ ID NO：5中所示的核酸序列所编码的氨基酸序列组成，scFvD-hIgG1Fc的可变区序列由SEQ ID NO：6中所示的核酸序列所编码的氨基酸序列组成。

在另外的实施方式中，所述中和抗体的重链可变区序列与所述抗体H25B10、scFvC-hIgG1Fc或scFvD-hIgG1Fc中任一个的重链可变区序列相同；和/或所述中和抗体的轻链可变区序列与所述抗体H25B10、scFvC-hIgG1Fc或scFvD-hIgG1Fc中任一个的轻链可变区序列相同。在特别的实施方式中，所述中和抗体的重链和轻链可变区序列分别与选自所述抗体H25B10、scFvC-hIgG1Fc或scFvD-hIgG1Fc的同一个抗体的重链和轻链可变区序列相同。

然而，本领域技术人员将会明了，所述试剂盒中包含的所述中和抗体是用于清除预先存在的病毒抗原的，因此，凡是能够中和目标病毒抗原的抗体均可用于本发明的目的。根据具体的实验要求和应用目的，本领域技术人员完全有能力选择合适的中和抗体，从而达到降低免疫耐受性的目的。

在一个具体的实施方式中，所述试剂盒进一步包含使用说明书，从所述使用说明书中可以了解到：在施用所述药物组合物之前，至少施用一次所述中和抗体。

在一个具体的实施方式中，所述试剂盒中的中和抗体所针对的病毒抗原与所述药物组合物中分离的核酸分子、核酸组合、载体、载体系统、组合物或病毒颗粒所编码或包含的病毒抗原是相同的，均为HBsAg；特别地，针对HBsAg的所述中和抗体可以是单克隆抗体H25B10、包含SEQ ID NO：5中所示的核酸序列所编码的氨基酸序列的抗体或可变区序列包含SEQ ID NO：6中所示的核酸序列所编码的氨基酸序列的抗体。

更特别地，本发明中所述中和抗体的可变区序列可以由SEQ IDNO：5或SEQ ID NO：6中所示的核酸序列所编码的氨基酸序列组成。

在又一个方面，本发明还涉及所述的药物组合物与针对病毒抗原的中和抗体共同用于制备药物的用途，其中，所述中和抗体所针对的病毒抗原与所述药物组合物中分离的核酸分子、核酸组合、载体、载体系统、组合物或病毒颗粒所编码或包含的病毒抗原可以是相同的或不同的，在优选的实施方式中，二者是相同的；并且其中，所述药物用于预防和/或治疗由病毒引起的肿瘤或慢性病原体感染，例如与HBV、HCV、HIV、HPV或EBV感染相关的病症或病况；特别地，所述药物可以用于预防和/或治疗肝内的病毒感染，例如乙型肝炎病毒感染。例如所述药物可以用于刺激和扩增对HBsAg有特异性反应的T细胞。

在一个具体的实施方式中，所述中和抗体所针对的病毒抗原与所述药物组合物中分离的核酸分子、核酸组合、载体、载体系统、组合物或病毒颗粒所编码或包含的病毒抗原是相同的，均为HBsAg或其免疫原性片段并且其中所述药物用于预防和/或治疗乙型肝炎病毒感染，例如所述药物可以用于刺激和扩增对HBsAg有特异性反应的T细胞。

在具体的实施方式中，所述中和抗体可以是单克隆抗体H25B10、scFvC-hIgG1Fc或s cFvD-hIgG1Fc，或者是与它们有同等水平的亲和力的抗体，例如本申请上文中所述的任一种中和抗体。

在另外的方面，本发明还涉及LIGHT多肽、或编码LIGHT多肽的多核苷酸用于制备药物的用途，所述药物用于预防和/或治疗肝脏内的病毒感染。特别地，所述病毒可包含但不限于HBV或HCV。在一个具体实施方式中，所述LIGHT多肽包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列、其片段或变体，并且足以刺激细胞毒性T淋巴细胞；特别地，所述变体为在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或其片段中经过一个或多个保守氨基酸置换而得到的氨基酸序列。

在又一个方面，本发明涉及预防和/或治疗病毒感染的方法，所述方法包括下列步骤：

(a)向动物或人的细胞或组织施用预防和/或治疗有效量的上文中所述的本发明的分离的核酸分子、核酸组合、载体、载体系统、组合物、病毒颗粒或药物组合物。

在一个实施方式中，所述方法进一步包括下列步骤：(b)向动物或人的细胞或组织施用上文所述的中和抗体；并且在实施步骤(a)之前，至少实施步骤(b)一次。

所述预防和/或治疗病毒感染的方法可用于预防和/或治疗由于病毒感染引起的疾病或病况。所述疾病或病况包括但不限于癌症，以及由导致慢性感染的病原体(例如HBV、HCV、HIV、HPV和EBV)引起的疾病。在一个具体实施方式中，所述疾病或病况为肝内的病毒感染引起的病症或病况，例如乙型肝炎。例如所述方法可以用于刺激和扩增对HBsAg有特异性反应的T细胞。

在又一个方面，本发明还涉及预防和/或治疗肝脏内病毒感染的方法，所述方法包括将LIGHT多肽，或者编码所述LIGHT多肽的多核苷酸引入肝组织。在一个实施方式中，所述方法用于预防和/或治疗乙型肝炎病毒感染或丙型肝炎病毒感染。在本发明的一个具体实施方式中，表达LIGHT蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)的腺病毒(Ad-LIGHT)可以清除腺相关病毒(AAV)诱导的HCV-核心在肝内的存留。

本发明还涉及上述各种具体实施方式的各种任意组合。

附图说明

图1.腺病毒的图示结构，其包含编码HBsAg和/或LIGHT的多核苷酸。其中CMV5是启动子，Ires是连接子。

图2.通过PCR在肝脏中检测AAV-HCV核心基因的水平。A)列出了处理的安排表。用AAV-HCV-核心感染小鼠从而诱导持续的感染。在第9天，用Ad-LIGHT或对照腺病毒(Ad-null或Ad-LacZ)处理被感染的小鼠。B)在Ad-LIGHT处理后，收集来自肝组织的RNA，然后进行PCR。与未处理的或用Ad-null处理的样品相比，经Ad-LIGHT处理后AAV-HCV-核心基因被减少至很低的水平。其中各泳道中的样品如下：1-2 LTβR-/-，Ad-LIGHT；3-4 LTβR-/-，Ad-null；5-6 B6，Ad-LIGHT；7-8 B6，Ad-null；在各PCR反应中加入0.4μg的DNA，进行33个循环；C)肝组织的H&E染色，显示Ad-LIGHT可以将淋巴细胞募集至肝。

图3.Ad-LIGHT-HBsAg作为产生T细胞应答的强疫苗。用10⁹v.p.的Ad-LIGHT-HBsAg或PBS刺激野生型小鼠。在第9天收集脾脏用于ELISPOT(A)或流式细胞计数分析(B)。

图4.Ad-LIGHT-HBsAg破坏耐受性以在HBsAg转基因小鼠中产生抗体应答。Ad-LIGHT-HBsAg不仅可以在野生型小鼠中，也可以在HBsAg转基因小鼠中刺激抗-HBs Ag抗体的产生。其中，向各小鼠经皮下注射2.5x10⁹v.p.的Ad-LIGHT-HBsAg。

图5.抗HBsAg抗体能够在体内中和HBsAg。使用0.5mg抗HBsAg的单克隆抗体H25B10以减少血清中的HBsAg。实验持续15天。

图6.通过组合处理诱导强干扰素(IFN)产生细胞。用HBsAg抗体预处理野生型(Wt)和HBsAg转基因(Tg)小鼠，且在施用抗体3天后检测不到HBsAg。每5天用抗体处理小鼠，共处理4次。第一次抗体处理后6天，用Ad-LIGHT-HBsAg(4-20x10⁸vp)处理小鼠。在第15天收集脾细胞(6A)和淋巴结细胞(DLN细胞)(6B)。通过针对IFNg的Elispot确定HBsAg特异性T细胞。

图7.scFvC-hIgG1Fc与HBsAg(adr)和HBsAg(adw)的结合具有高亲和力。将10μg的HBsAg(adr或adw型)包被在ELISA平板上，以2％FBS/PBS/NaN3封闭所述平板。加入不同量的hIgG1作为标准。然后加入一系列滴定浓度的scFvC-hIgG1Fc，在室温孵育1小时。

图8.通过scFvD-hIgG1Fc来中和HBsAg与Chang肝细胞的结合。HBsAg(adw或adr型)结合Chang肝细胞，但是scFvD-hIgG1Fc会阻碍HBsAg与Chang肝细胞的结合。将scFvD-hIgG1Fc(约1μg/ml)与Chang肝细胞共同孵育；加入HBsAg(adw)-bio(上海PrimeGene生物科技公司，#671-01)，发现HBsAg(adw)与Chang肝细胞结合，而scFvD-hIgG1Fc可以完全阻碍所述结合。其中adw-bio指HBsAg(adw)-bio。

具体实施方式

本发明中所述的“核酸组合”指一种产品，其包含至少两种不同的核酸分子，其中可仅包含核酸分子，也可以还包含另外的组分。

本发明中所述的“组合物”包括含有一个或多个多肽的组合物，其中所述多个多肽可以是相同的或不同的；以其最广泛的含义，单个分离的多肽分子也属于本发明的“组合物”。所述“组合物”中可仅包含多肽，也可以还包含另外的组分

在本发明中，所述多核苷酸所编码的病毒抗原可以是任何目标病毒的免疫原性抗原。所述目标病毒包括但不限于引起肿瘤的病毒，或者引起慢性病原体感染的病毒，例如HBV、HCV、HIV、HPV和EBV。在一个实施方式中，所述病毒抗原为乙型肝炎病毒抗原，优选乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)或其免疫原性片段。

本发明中所述的“LIGHT多肽”意指包含LIGHT蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)或其片段、变体的多肽。特别地，所述LIGHT蛋白的变体的氨基酸序列为在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或其片段中经过一个或多个保守氨基酸置换而得到的氨基酸序列。优选地，所述LIGHT多肽是人的。更优选地，所述LIGHT多肽足以刺激细胞毒性T淋巴细胞。在一个具体的实施方式中，所述LIGHT多肽的序列如SEQ ID NO：1所示。

在一个实施方式中，所述LIGHT多肽可以包含或者为LIGHT蛋白胞外域的片段。在一个具体实施方案中，所述LIGHT多肽由LIGHT蛋白胞外域组成。在一个实施方案中，所述LIGHT蛋白胞外域具有如下氨基酸序列：

QLHWRLGEMVTRLPDGPAGSWEQLIQERRSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMV(SEQ ID NO：3)

(也参见gi|13124597|sp|043557|TNF14_HUMAN[13124597])。

此外，本领域技术人员将意识到可通过保守氨基酸置换对LIGHT蛋白或其片段进行修饰以提供功能等同的变体，即，所述变体保持LIGHT蛋白或其片段的功能(即足以刺激细胞毒性T淋巴细胞)。在本申请中所使用的“保守氨基酸置换”指不显著改变多肽的三级结构和/或多肽活性的氨基酸置换。所述变体可根据本领域一般技术人员已知的改变多肽序列的方法而制备，也可根据汇编型参考文献中所能找到的此类方法而制备，例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，J.Sambrook等编，Second Edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York，1989，或Current Protocolsin Molecular Biology，F.M.Ausubel等编，John Wiley&Sons，Inc.，New York。示例性的LIGHT多肽的功能等同性变体包括对SEQ ID NO：1进行保守氨基酸置换而得到得多肽。在一个方面，保守氨基酸置换为发生在下列组群内部氨基酸之间的置换：(a)M，I，L，V；(b)F，Y，W；(c)K，R，H；(d)A，G；(e)S，T；(f)Q，N；和(g)E，D。

因此本发明中的“LIGHT多肽”也包含LIGHT蛋白或其片段的功能等同的变体，即，保持天然LIGHT蛋白或其片段功能的LIGHT蛋白或其片段的变体。为了在LIGHT蛋白或其片段的氨基酸序列中产生功能等同性变体而引入的保守氨基酸置换，典型地是通过改变编码LIGHT蛋白或其片段的核酸(SEQ ID NO：2或其片段)而得到的。这类置换可通过多种本领域一般技术人员已知的方法而得到。例如，氨基酸置换可通过PCR导向突变，根据Kunkel的方法(Kunkel，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.82：488-492，1985)的定点突变，或编码LIGHT多肽的基因的化学合成而得到。LIGHT蛋白或其片段的功能等同片段的活性能通过：将编码改变后的LIGHT多肽的基因克隆进载体中，将载体引入合适的宿主细胞，表达改变后的LIGHT多肽，和测试在本申请中公开的LIGHT多肽的功能(例如刺激细胞毒性T淋巴细胞的能力等)，而得到测试。

由上文可知，在本申请中所用的LIGHT蛋白或其片段的“变体”是包含一个或多个对LIGHT蛋白或其片段的一级氨基酸序列的修饰的多肽。典型地，为了得到所述变体，可对编码LIGHT蛋白或其片段的核酸进行修饰，例如通过删除、点突变、截断、置换和/或添加一个或多个核苷酸，例如一个或几个核苷酸；也可对所述LIGHT蛋白或其片段直接进行修饰，例如通过切断，连接分子的添加，可探测部分如生物素的添加，脂肪酸的添加和类似的方式。所述修饰也包括包含全部或部分LIGHT蛋白的氨基酸序列的融合蛋白。本领域技术人员将会熟知预测蛋白序列变化对蛋白构象的影响的方法，并能因此根据已知方法而“设计”所述LIGHT蛋白或其片段的变体。这种方法的一个实例由Dahiyat和Mayo在Science 278：82-87，1997中描述，其中蛋白质可被重新设计。此方法能被应用于已知的蛋白，以仅改变多肽序列的一部分。通过应用Dahiyat和Mayo的计算方法，可提出具体的LIGHT多肽变体并容易地对所述变体进行测试以测定其是否保持了所期望的构象。优选地，所述LIGHT的多肽变体足以刺激细胞毒性T淋巴细胞。

本发明中所述的“编码LIGHT多肽的多核苷酸”意指包含SEQ IDNO：2或其片段所示的核酸序列的多核苷酸，或者通过在其中引入一个或多个核苷酸的缺失、添加或置换，或者其它突变而得到的多核苷酸。优选地，所述核酸突变保存编码序列的氨基酸阅读框，并优选不在核酸中创造出很可能杂交以形成二级结构的区域，其中所述二级结构(例如发卡或环结构)可能对变体多肽的表达有害。

本发明也包括含有天然物质中出现的密码子的替代物的简并核酸。例如，丝氨酸残基被密码子TCA，AGT，TCC，TCG，TCT和AGC编码。因此，本领域一般技术人员将容易理解，任何编码丝氨酸的核苷酸三联体均可被用于在体内或体外指导蛋白质合成装置，以将丝氨酸残基整合进入正在延伸的LIGHT多肽中。类似地，编码其它氨基酸残基的核苷酸序列三联体包括但不限于：CCA，CCC，CCG和CCT(脯氨酸密码子)；CGA，CGC，CGG，CGT，AGA和AGG(精氨酸密码子)；ACA，ACC，ACG和ACT(苏氨酸密码子)；AAC和AAT(天冬酰胺密码子)；及ATA，ATC和ATT(异亮氨酸密码子)。其它氨基酸残基可类似地被若干核苷酸序列编码。因此，本发明包括与生物学上分离的核酸在密码子序列中因遗传密码简并性而有所不同的简并核酸。

因此，根据本发明的编码LIGHT多肽的多核苷酸包括：(i)多核苷酸，其包含SEQ ID NO：2所示的多核苷酸或其片段；(ii)在严格条件下与(i)中的多核苷酸所构成的分子杂交的多核苷酸，其编码足以刺激细胞毒性T淋巴细胞的LIGHT多肽；(iii)(i)或(ii)的缺失、添加和/或取代物，其编码足以刺激细胞毒性T淋巴细胞的LIGHT多肽；(iv)因为遗传密码简并性而与(i)、(ii)或(iii)的核酸分子在密码子序列中不同的核酸分子，和(v)(i)、(ii)、(iii)或(iv)的互补链。在本申请中所用的“互补链”包括“(i)、(ii)、(iii)或(iv)的全长互补链或100％的互补链”。

因此，本发明的一个方面涉及那些编码LIGHT多肽并在严格条件下与SEQ ID NO：2的编码区所组成的核酸分子杂交的多核苷酸。在一些实施方案中，在本申请中所用的术语“严格条件”指本领域所熟悉的参数。对核酸，所述严格的杂交条件典型地是在低离子强度和恰好低于DNA杂交复合物熔点(T_m)(典型地，低于杂交物T_m约3℃)的温度下。严格性越高，就意味着探针序列和靶之间的相关性更特异。核酸杂交中所用的严格条件在本领域中众所周知，可在诸多参考文献中找到，例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，J.Sambrook等编，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York，1989，或Current Protocols in MolecularBiology，F.M.Ausubel等编，John Wiley&Sons，Inc.，New York。例如，所述“严格条件”可以是在6xSSC中于65℃下杂交。又例如，所述严格条件可以是在杂交缓冲液中于65℃下杂交，其中所述杂交缓冲液由3.5xSSC，0.02％Ficoll，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％牛血清白蛋白，2.5mM NaH₂PO₄[pH7]，0.5％SDS，2mM EDTA组成(SSC是0.15M氯化钠/0.15M柠檬酸钠，pH7；SDS是十二烷基硫酸钠；而EDTA是乙二胺四乙酸)。杂交之后，将转上了DNA的膜在2xSSC中于室温下清洗，然后在最高68℃的温度下于0.1xSSC/0.1xSDS中清洗。在进一步的实施例中，可用杂交甲酰胺溶液代替杂交水溶液而进行实验。应用例如50％甲酰胺溶液和42℃，也可实现所述严格的杂交条件。此外，还存在其它能被应用的条件、试剂等，并带来类似的严格程度。本领域技术人员将熟悉这类条件，因此不在此处详述。然而，需要理解的是，本领域技术人员将能以允许清晰鉴别本发明所涉及的编码LIGHT多肽的多核苷酸的方式控制和调节条件和参数。技术人员也将熟悉对于所述分子的表达库进行筛选，然后再分离相关的核酸分子和序列的方法。

在本发明的一个方面，上述“LIGHT多肽”或“编码LIGHT多肽的多核苷酸”的氨基酸序列或核苷酸序列典型地可以与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有至少50％的序列同一性，例如至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％。所述同一性可应用多种由NCBI(Bethesda，Maryland)开发的公开可得的软件工具计算得到。示例性的工具包括Altschul SF等的启发式算法(J Mol Biol，1990，215：403-410)，也称为BLAST。Pairwise和ClustalW比对(BLOSUM30矩阵设置)以及Kyte-Doolittle水疗分析，其可应用公开的(EMBL，Heidelberg，Germany)和商业来源(例如来自Oxford Molecular Group/GeneticsComputer Group，Madison，WI的MacVector序列分析软件)的软件而进行。

在一个实施方式中，由上文中所述的多核苷酸编码的所述病毒抗原或LIGHT多肽还可以进一步包含信号肽(导向肽)或者便于纯化的标签。

在另外的方面，本发明中涉及的、包含上文中所述多核苷酸的载体中可包含编码序列和调控序列，当它们以将编码序列的表达或转录置于调控序列的影响或控制之下的方式而共价连接时，被表述成“可操作性地”连接。因此，如果启动子区域能影响其后的编码序列的转录从而使所得的转录物可被翻译成所期望的蛋白或多肽，则启动子区域将可操作性地连接编码序列。所述启动子可以为适于LIGHT多肽和/或病毒抗原表达的任何启动子，所述启动子包括但不限于：CMV5启动子和U1a启动子。

基因表达所需的调控序列取决于具体的物种或细胞类型，但将一般性地包括：与转录和翻译各自启动有关的5’非转录和5’非翻译序列，如TATA盒，加帽序列，CAAT序列和类似物。尤其是，这类5’非转录调控序列将包括包含对可操控性连接的基因进行转录控制的启动子序列的启动子区域。所述调控序列也可包括所需的增强子序列或上游激动子序列。本发明的载体可任选地包括5’前导或信号序列。对合适的载体的选择和设计是在本领域一般技术人员的能力之内的。

包含所有表达所必需的元件的载体可商业性地获得，并为本领域技术人员所知。参见，例如Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Second Edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989。

一般而言，可用于本发明的上述载体包括但不限于质粒、噬菌粒、病毒、源于病毒或细菌来源的其它载体，已通过将本发明所涉及的多核苷酸序列和结合至本发明所涉及的多核苷酸序列的另外的核酸片段(例如增强子、启动子)插入或整合到所述载体中而对所述载体进行了处理。优选地，所述载体为病毒载体，其包括但不限于来自下列病毒的核酸序列：腺病毒；腺伴随病毒；逆转录病毒，例如鼠莫洛尼白血病毒；鼠哈维肉瘤病毒；鼠乳腺肿瘤病毒；劳斯肉瘤病毒；SV40-型病毒；多瘤病毒；EB病毒；乳头状瘤病毒；疱疹病毒；牛痘病毒；脊髓灰质炎病毒；和RNA病毒例如逆转录病毒。此外，还可以容易地采用在本领域中已知的其它载体。

对某些应用而言，特别优选的、作为载体的病毒是腺伴随病毒(AAV)(一种双链DNA病毒)。腺伴随病毒能感染广泛的细胞类型和物种，且能通过工程化而成为复制缺陷型的。它进一步地具有下述优点，例如热和脂溶剂稳定性、在多种株系细胞包括肝细胞、造血细胞中的高转导频率，和缺乏超感染抑制因此而允许多重系列的转导。经报道，腺伴随病毒能以位点特异的方式整合进人细胞DNA，从而使插入性基因突变的可能性和插入基因的表达的可变性最小化。此外，野生型腺伴随病毒感染已在组织培养物中、在缺乏选择压力的条件下存在超过100代，意味着腺伴随病毒基因组整合是相对稳定的事件。腺伴随病毒也能以染色体外方式发挥作用。

一般而言，其它优选的病毒载体基于非细胞病变性真核病毒，在这些病毒中非必需基因已被目的基因所替代。非细胞病变性病毒包括逆转录病毒，其生命周期包括基因组病毒RNA到DNA的逆转录及随后的前病毒整合到宿主细胞DNA中。腺病毒和逆转录病毒已被许可用于人基因治疗的试验。一般而言，逆转录病毒是复制缺陷型(即，能指导所需蛋白的合成，但不能制造出感染性的颗粒)。这类基因改变的逆转录病毒载体具有对基因在体内的高效转导的一般性用途。产生复制缺陷型逆转录病毒的标准流程(包括步骤：外源性遗传物质整合进质粒，质粒对包装细胞系的转染，重组性逆转录病毒通过包装细胞系的产生，从组织培养基中收集病毒颗粒和病毒颗粒对靶细胞的感染)在Kriegler，M.，“Gene Transfer and Expression，A LaboratoryManual，”W.H.Freeman C.O.，New York(1990)和Murry，E.J.Ed.“Methods in Molecular Biology，”卷7，Humana Press Inc.，Cliffton，New Jersey(1991)中被详细描述。

又一优选的载体是Stratford-Perricaudet所述的腺病毒，其E1和E3蛋白有缺陷(J.Clin.Invest.90：626-630，1992)。腺病毒作为Adeno.P1A重组体的应用被Warnier等所公开，用于在小鼠皮内注射以得到抗P1A的免疫化(Int.J.Cancer，67：303-310，1996)。

除利用前述载体外，也可通过其它的传送方法将本发明的组合物/药物传送到细胞例如神经细胞、肝、成纤维细胞、和/或血管内皮细胞中，并促进在那里的吸收。

在一个优选的实施方式中，编码LIGHT多肽的多核苷酸的核酸序列如SEQ ID NO：2所示，编码病毒抗原的多核苷酸编码的是HBsAg，二者在腺病毒载体中通过IRES连接子相连且在CMV5启动子的控制下被表达。

本发明中所述的“载体系统”指包含至少两个载体的产品，例如载体组合物。其中所述至少两个载体可以是相同的或不同的。

本发明中所述的“病毒颗粒”指成熟的、结构完整的和有感染性的病毒粒子。在一个具体的实施方式中，所述病毒颗粒为腺病毒颗粒。

本发明中所述的“宿主细胞”可以是原核性的(例如大肠杆菌)或真核性的(例如CHO细胞，COS细胞，酵母表达系统和在昆虫细胞中表达的杆状病毒)。特别地，所述宿主细胞是哺乳动物的细胞，例如人、小鼠、仓鼠、猪、山羊、灵长类动物等的细胞。它们可以源自多种组织类型，包括例如原代细胞和永生化的细胞系。所述细胞的具体实例包括HT-1080细胞、CHO细胞、树状细胞、U293细胞、外周血白细胞、骨髓干细胞、胚胎干细胞、和昆虫细胞。本发明也允许构建其中LIGHT基因被“敲除”的细胞和动物，从而为研究LIGHT多肽活性的某些方面提供材料。

在本发明中，“可药用的载体”是指不会在所施用的细胞或受试者中引发过敏反应或其他不适影响，并且不会影响药物活性的载体。合适的可药用载体包括但不限于，例如，一种或多种水、生理盐水、磷酸缓冲液、左旋糖、甘油、乙醇和其他类似物，以及上述物质的组合。可药用载体还可进一步包括能提高核酸、多肽、病毒颗粒或细胞的保存期限或效用的微量辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液。

本发明中的“中和抗体”是指任何能够清除或显著降低目标病毒抗原结合毒力的抗体或抗体片段。特别地，以针对HBV的中和抗体为例，在一个具体的实施方式中，发明人使用了针对ayw亚型HBsAg的单克隆抗体H25B10作为所述中和抗体并显示了其能够实现本发明的目的。在另外的具体实施方式中，发明人使用了特别针对在中国普遍存在的adr和adw亚型HBsAg的单克隆抗体scFvC-hIgG1Fc和scFvD-hIgG1Fc，由于这些抗体对于adr和adw亚型HBsAg的高亲和力，它们也可以理想地作为用于本发明的目的的中和抗体。类似地，以抗HBV的中和抗体为例(对于其他病毒抗原，本领域技术人员可以参照此例进行选择)，下列抗体也可以用于本发明的目的：(1)对于其各自的目标病毒抗原具有与抗体H25B10、scFvC-hIgG1Fc或scFvD-hIgG1Fc同等水平的亲和力(所述亲和力可以为例如Kd≤1x10^-8M，优选Kd≤1x10^-9M)的抗体；(2)具有与抗体H25B10、scFvC-hIgG1Fc或scFvD-hIgG1Fc相同或至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)序列一致的重链和/或轻链CDR的抗体；或者(3)具有与抗体H25B10、scFvC-hIgG1Fc或scFvD-hIgG1Fc相同或至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)序列一致的重链和/或轻链可变区的抗体。然而，本领域技术人员将会明了，本发明中的所述中和抗体是用于清除预先存在的病毒抗原的，因此，凡是能够中和目标病毒抗原的抗体均可用于本发明的目的。根据具体的实验要求和应用目的，本领域技术人员完全有能力选择合适的中和抗体，从而达到降低免疫耐受性的目的。其中所述scFvC-hIgG1Fc的可变区序列由SEQ ID NO：5中所示的核酸序列所编码的氨基酸序列组成，scFvD-hIgG1Fc的可变区序列由SEQ ID NO：6中所示的核酸序列所编码的氨基酸序列组成。

本发明中的“试剂盒”指任何包含本发明所述的药物组合物(或其组分)和所述中和抗体的组合、装置或产品。特别地，其设计使得所述药物组合物和所述中和抗体彼此不相混合，例如，二者位于不同的独立空间中。

本发明中的“预防有效量”或“治疗有效量”指足以防止或减轻因病毒感染而引起的病状或病况的量。例如，其可为含有10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²或更高数量级的本发明的病毒颗粒的药物组合物，或者可以是效果与所述病毒颗粒相当的本发明的核酸组合物、组合物、细胞、药物组合物等的相应的量。

本发明所述的药物组合物的施用方式可以是传统的施用途径，包括但不限于静脉滴注、肌肉注射、阴道、口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径等。优选的，所述施用途径是注射及输液形式。

本发明中所涉及的药物组合物可以各种形式存在，包括但不限于固体、半固体和液体的剂型，例如片剂、丸剂、粉末、溶液、分散液或悬浮液、脂质体、栓剂、注射用及输液用溶液。本领域技术人员能够根据具体的需要选择合适的形式。

适合通过肠胃外途径注射的本发明的药物组合物可能含有符合药物制备要求的无菌水或非水溶液、气雾剂、悬浮液或乳剂，可在临用时重悬成可注射的溶液或气雾剂的无菌粉剂。如适合的水性和非水性载体，工具和各种稀释液如水、乙醇、多羟基化合物(如丙烯乙二醇、聚乙烯二醇、丙三醇及其类似物)，合适的混合物，菜油(如橄榄油)，和可用于注射的有机脂，如乙烷油酸，如使用卵磷脂衣壳维持药物的合适流动性，如使用气雾剂、表面活性剂以维持合适的颗粒尺寸。

本发明所述的药物组合物还可含有一些起保护性、保湿、乳化和气雾化的佐剂，也可以含有预防微生物污染的速溶成分，如各种抗细菌试剂、抗真菌试剂，如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸及类似物。也可以包括维持渗透压的试剂，如糖、NaCl及其类似物。还可使用延长吸附的试剂来延长注射用药物成分吸附时间，如单硬脂酸盐和凝胶等。

口服固相剂型包括胶囊、片剂、粉剂、颗粒剂等。这些固相剂型中的活性成分至少混有一种传统的惰性药物赋形剂(或载体)如柠檬酸钠、磷酸钙，或(a)填充剂或添加剂如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖和硅酸；(b)粘合剂，如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶；(c)湿润剂，如甘油；(d)碎裂剂，如琼脂，碳酸钙，马铃薯粉或木薯粉；(e)缓凝剂，如石蜡；(f)促吸收剂，如四氨基混合物；(g)保湿剂，如十六烷基醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，如高岭土和斑脱土；(i)润滑剂，如滑石，硬脂酸钙，硬脂酸镁，固体聚乙二醇，硫酸十二烷醇钠，或其上述物质的混合物。在片剂和胶囊剂型中，可能还含有缓冲剂。

固相剂型还可以制成改良释放或脉冲释放剂型，其是通过在上述提到的各种直接释放赋形剂中添加一些能改变药物释放速率的赋形剂而形成，可以包含在上述剂型中也可以做成外衣的形式。速率释放改造剂包括羧丙基甲基纤维素，甲基纤维素，碳甲基纤维素钠，纤维素乙烷，醋酸纤维素，聚乙烯氧化物，黄原胶糖，异丙烯酸氨共聚物，氢化调味油，巴西棕榈蜡，石蜡，邻苯二酸醋酸纤维素，邻苯二甲酸羧丙基甲基纤维素，甲基丙烯酸共聚物或上述物质的混合物。改良释放和脉冲释放剂型可能含有一种或多种具有改良释放速率的赋形剂。

用于口服的液体剂型，包括符合药物要求的乳状剂、溶液、悬浮液、糖浆和西也剂等。除了活性成分，所述液体剂型也可含有本领域常用的一些惰性溶液，如水或其它溶剂，可溶性试剂和乳化剂，如乙烷基醇，异丙基醇，乙烷基碳酸盐，苯基安息香酸盐，丙稀乙二醇，1，3-丁烯乙二醇，油，特别是，棉籽油，落花生油，玉米油，橄榄油，调味油和芝麻油，甘油，氢糠基醇，聚乙二醇和脂肪酸山梨醇酯，以及上述物质的混合物或类似的物质。

除了这些惰性稀释液，所述药物组合物也可包括保湿剂、乳化剂、悬浮剂、糖化剂、调味剂和香味剂等佐剂。另外，所述药物组合物还可包括乙氧基化均聚乙醇，聚氧乙烯烷基山梨醇和山梨聚糖脂，微晶纤维素，间氢氧化铝，膨润土，琼脂聚合物和黄芪胶，或这些物质的混合物之类的悬浮剂。

本发明所述的药物组合物也可制成适合用于兽用预防和/或治疗的混合物，或符合兽用的溶剂或初成药，并根据普通兽医和兽医从业者的要求制成最适合某种特定动物的给药剂量和途径药物的合适剂型。

本发明所述的核酸组合物、组合物、病毒颗粒、药物组合物或试剂盒还可以与其他的抗病毒试剂或疗法联合施用，而用于预防或治疗由病毒感染引起的疾病，例如物理或化学疗法。其中，其它抗病毒试剂包含但不限于利巴韦林，金刚烷，羧基脲，IL-2，IL-12和五羧链胞酸。

本领域技术人员可以通过增加或减少持续或间断施用本发明的药物组合物的时间、剂量或施用策略等，根据具体的需求和受试者的个体情况，容易地选择合理的施用方案。

在本发明的一个具体实施方式中，为了克服由HBsAg在转基因小鼠或慢性感染的患者中持续的存在引起的免疫耐受性，发明人测试了新的策略。发明人首先使用HBsAg的中和抗体从淋巴组织中去除目标病毒抗原，从而降低耐受状况并为更好地响应本发明的药物组合物(例如，含有位于腺病毒载体上的、编码LIGHT多肽和编码HBsAg的多核苷酸的药物组合物)做准备。发明人揭示了：1)所述药物组合物产生强的CTL并产生针对HBsAg的抗体；2)HBsAg的中和抗体可以减少足够的抗原负荷从而减少耐受性并允许所述药物组合物破坏耐受性；3)用抗体进行预处理，随后使用所述药物组合物可以清除转基因小鼠中或被HBsAg感染的人化小鼠模型中的HBV。因此，发明人已经通过使用中和抗体，继而使用本发明的药物组合物作为治疗性疫苗开发出了清除病毒的新的策略。本领域技术人员能够明了，在上述技术方案中，使用中和抗体的目的是为了清除预先存在的病毒抗原，因此，凡是能够中和目标病毒抗原的抗体均可用于本发明的目的。根据具体的实验要求和应用目的，本领域技术人员完全有能力选择合适的中和抗体，从而达到降低免疫耐受性的目的。

下述的实施例仅用于阐释本发明的目的，而不以任何方式限制本申请的保护范围。

实施例

实施例1.Ad-LIGHT在肝内清除肝炎相关抗原

I.重组AAV病毒可引起小鼠肝脏内的持续病毒感染

发明人使用自我互补的腺相关病毒(scAAV)血清型8作为基因递送载体。所述scAAV趋向于肝并且能够高效地在体内转导肝细胞。发明人构建了重组病毒AAV-GFP和AAV-HCV-核心，其中使用了U1a启动子来驱动GFP在肝细胞内的表达，其中AAV-GFP和AAV-HCV-核心的构建如PLoS One.5(5)：e10585，2010中所描述。随后，发明人通过向C57/BL6小鼠的门静脉中注射16x10¹¹vp的重组病毒AAV-GFP或AAV-HCV-核心以获得最大程度的肝转导。之后，通过使用来自eGFP的引物进行PCR扩增，从而确定被感染的小鼠的肝组织中AAV基因组的相对数量。此外，发明人从被感染小鼠的肝脏中提取总蛋白，并通过蛋白质印迹法(Western Blotting)测定GFP蛋白的表达。发明人在注射AAV-GFP后86天将小鼠处死，并在肝的切片中观察到了GFP的表达。这一结果表明，AAV-GFP的感染导致肝内持续的GFP表达，而不引起免疫反应。因此，发明人高效地建立了带有肝内持续GFP表达的AAV感染，而没有引起强的肝浸润或创伤。

II.Ad-LIGHT能够在肝脏内清除HCV-核心

LIGHT蛋白会与其受体LTβR相互作用以使局部的趋化因子和粘着分子增加^8，10，而这种增加将募集各种免疫细胞，包括DC和T细胞。此外，LIGHT可以通过HVEM协同刺激T细胞。因此，发明人进而想要测试是否能够在肝内上调LIGHT蛋白的水平而清除肝内持续的AAV感染。

由于腺病毒可以靶向肝组织，发明人使用复制缺陷性的腺病毒载体来表达LIGHT多肽(称为Ad-LIGHT，参见图1)，所表达的LIGHT多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码所述LIGHT多肽的多核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。同时，使用表达半乳糖苷酶的重组腺病毒(Ad-LacZ)或Ad-null(不含任何外源插入片段的腺病毒载体)作为对照。其中，使用Ad5(E1/E3-)腺病毒载体来构建Ad-LIGHT、Ad-LacZ和Ad-null，并使用CMV5启动子来驱动LIGHT的表达，Ad-LIGHT、Ad-LacZ和Ad-null通过之前描述的方法⁸构建。

发明人首先(在第0天)将2x10¹⁰vp的AAV-HCV-核心通过门静脉注射到C57/BL6小鼠或LTβR-/-小鼠中，从而在肝内建立持续的HCV感染(图2A)。第9天时，再将2.5x10¹⁰vp的Ad-LIGHT或Ad-null分别通过门静脉注射到所述小鼠中(图2A)。在注射AAV-HCV-核心之后第40天(第40天)将所述小鼠处死以确定肝内剩余的AAV含量。收集来自肝组织的RNA用于PCR，并对肝组织进行H&E染色，以检测HCV和AAV基因组的表达，并检测肝组织中淋巴细胞的募集情况。所述H&E染色依照本领域常用的一般步骤进行。

发明人观察到，用Ad-LIGHT处理时，所述小鼠显示出其肝内表达的HCV核心被清除，但用Ad-null处理时没有这一现象(图2B)。进行PCR检测以确定肝内的AAV基因组，得到了类似的结果。这些数据表明通过腺病毒载体在肝内异位表达LIGHT，使得LIGHT能够清除已经建立的AAV感染。由LIGHT介导的AAV的清除与增加的肝内感染、肝内白细胞总数(图2C)的增加相关，这可以通过H&E染色确定。

实施例2.Ad-LIGHT-HBAgs在野生型小鼠中诱导强的应答。

I.Ad-LIGHT-HBsAg的构建和重组腺病毒的生产

使用非复制型腺病毒作为HBV疫苗的优势是1)低毒性；2)易于产生高滴度；3)有效刺激CTL的I类通路；和4)特异性靶向肝组织，但是本领域技术人员明了，也可选择其他的载体(特别是病毒载体)达到本实验的目的。发明人能够生产腺病毒Ad-LIGHT-HBsAg并检测其表达。

首先，发明人通过下述方法构建了表达LIGHT和HBsAg的重组腺病毒：用限制性内切酶BamH1和NotI消化质粒pcDNA3.1-LIGHT-HBsAg(其中HBsAg的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)，从而得到含有LIGHTcDNA的片段，并将其克隆到第一亲本质粒pLEP-ubp(左端质粒，带有四环素抗性(Tetr))的BamH1/NotI位点之间以获得pLEP-LIGHT，其中所述含有LIGHT cDNA的片段位于人泛素(ubiquitin)启动子(ubp)之后。随后，将所述pLEP-LIGHT与第二个质粒pREP(右端质粒，带有氨苄青霉素(Ampr))相连，质粒pREP中的连接位点为位于其中编码内含子的多核苷酸序列中的唯一的Cla I位点。使用λ噬菌体包装提取物包装所获得的连接产物，然后将其在Amp/Tet LB琼脂平板上培养以选择pLEP/pREP杂合粘粒。之后，使用Bgl II消化所获得的粘粒以进一步识别含有LIGHT-HBsAg插入片段的重组粘粒。通过I-Ceu I消化将Ad-LIGHT-HBsAg DNA片段从所述重组粘粒中释放出来，然后，不经进一步纯化而用经I-Ceu I消化后的混合物转染293细胞以生产重组腺病毒及病毒颗粒。

II.Ad-LIGHT-HBsAg可以提供保护性抗原和对T细胞的共刺激并可作为引起免疫应答的强效疫苗

病毒特异性CD8+T细胞是清除肝脏内病毒的关键的免疫细胞群，它们对于成功的治疗性疫苗而言是关键的。提供保护性抗原和对T细胞的共刺激将允许淋巴细胞上更好的抗原呈现。LIGHT可以提供对T细胞的共刺激，而Ad-LIGHT-HBsAg可同时提供保护性抗原以及对T-细胞的共刺激，从而有效地刺激和扩增对HBsAg有特异性反应的T细胞。

用10⁹vp上述得到的Ad-LIGHT-HBsAg或PBS刺激野生型小鼠。在第9天收集脾脏用于ELISPOT或流式细胞计数分析。

用ELISPOT试验测定分泌IFN-γ的T细胞。在这一试验中，使用HBsAg或其片段(例如肽ENV190)作为刺激抗原，使用卵清蛋白(OVA)作为对照抗原，从而允许测定HBsAg特异性CD8+T细胞应答。将脾细胞或淋巴结(DLN)细胞(反应细胞)重悬于添加了10％FCS、2mmol/LL-谷氨酰胺、100单位/mL青霉素、和100μg/ml链霉素的RPMI 1640中。向96孔HTS IP板(Millipore)的每个孔中加入1-4x10⁵个脾细胞或淋巴结细胞。以2.5μg/mL大鼠-抗-小鼠IFN-γ(克隆R4-6A2；BD-PharMingen)预包被所述96孔HTS IP板。其中反应细胞与抗原呈递细胞(APC)的比率为10∶1。孵育48小时之后，除去细胞并加入2μg/mL生物素化的大鼠-抗-小鼠-IFN-γ(克隆XMG 1.2；BD-PharMingen)。在4℃再孵育平板12小时，然后清洗平板以去除未结合的抗体。用0.9μg/mL抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(BD-PharMingen)在室温孵育平板2小时，以检测结合的抗体。加入底物3-氨基-9-乙基咔唑(AEC；PharMingen)，所述底物用0.1mol/L乙酸和0.003％过氧化氢稀释，且温育所述平板3至5分钟。丢弃AEC溶液，并用水清洗平板6次。用ImmunoSpot分析仪(CTL)计数可见的细胞因子点，结果表示为产生细胞因子的细胞的数目/10⁴细胞。

通过这一试验，发明人很容易地检测到了对肽ENV190(即HBsAg)有反应的分泌IFN-γ的细胞(图3A)，而不相关的对照蛋白OVA完全不能刺激所述细胞群体的产生。

为了进一步检测所述分泌IFN-γ的细胞群是否主要是CD8+T细胞，发明人对脾细胞或DLN细胞进行了CD8和IFNg的细胞内染色，具体步骤如下：用HBsAg(1μg/ml)在细胞培养物中刺激脾细胞或DLN细胞6小时，其中，在刺激2小时后向细胞中加入GolgiStop(BDPharMingen)。然后用经标记的表面抗体和细胞内抗-IFNγ-FITC对细胞进行染色。

上述细胞内染色或ELISPOT实验的结果表明，Ad-LIGHT-HBsAg能够诱导强的HBsAg特异性CD8+T细胞应答，且这种应答并不限于CTL应答(图3B)。

此外，发明人还通过下述实验发现，Ad-LIGHT-HBsAg在野生型和HBsAg转基因小鼠中都引起了抗-HBsAg抗体应答。用ELISA检测小鼠血清中的抗-HBsAg抗体，具体实验步骤如下：用2U/ml HBsAg于4℃过夜包被ELISA平板(Dynex Technologies，Chantilly，Virginia，USA)。用水清洗平板并用PBS/0.1％BSA封闭。将血清样品稀释为各种浓度，并用AP-缀合的山羊-抗-小鼠IgG(Southern BiotechnologyAssociates，Birmingham，Alabama，USA)检测所结合的抗体。用分光光度计(Molecular Devices，Menlo Park，California，USA)在405nm处测量OD。其中，在HBsAg转基因小鼠中产生强的应答是有重要意义的，虽然这些转基因小鼠耐受HBsAg刺激，但是它们仍然对本发明的Ad-LIGHT-HBsAg产生应答(图4)。此类转基因小鼠至今为止对许多治疗性疫苗有抗性，而本发明的Ad-LIGHT-HBsAg不仅在野生型小鼠中，也在所述转基因小鼠中产生了强的抗-HBsAg抗体(图4)。因此，在存在强耐受性及过量的抗原时，本发明的Ad-LIGHT-HBsAg是第一个有治疗效果的疫苗。

实施例3.在施用HBsAg抗体之后，Ad-LIGHT-HBsAg可在转基因小鼠中产生强的应答

实施例2的方法中，已存在的HBV抗原在慢性感染或转基因肝细胞中可导致和保持耐受性，而这将限制这种治疗性疫苗的临床效力。的确，在病毒DNA已被建立起来之后，少有疫苗可在肝内清除病毒DNA。发明人提出在循环系统中减少HBV抗原可能可以减少抗原载荷、降低病毒诱导的耐受性，从而允许HBV的强疫苗作为治疗性疫苗破坏耐受性。为了验证这一想法，发明人进行了下述试验：首先发明人在小鼠体内注射0.5mg抗-HBsAg的单克隆抗体H25B10以减少血清中的HBsAg，并在注射后的第3、5、7、8、10、15天取血以通过ELISA测定血清中的HBsAg水平。通过这一实验，发明人发现施用HBsAg中和抗体可以非常有效地清除HBsAg转基因小鼠血清中的HBsAg(图5)。其中，由于HBsAg转基因小鼠具有白蛋白启动子，其随着年龄而变强，未处理的转基因小鼠具有增加的血清HBsAg(图5)。发明人的研究表明HBsAg中和抗体可以很有效地中和HBsAg，而其可能创造使淋巴细胞应答的新条件。

基于这一实验结果，发明人首先用所述抗-HBsAg单克隆抗体H25B10随时间推移耗尽血清中的HBsAg以去除由抗原诱导的耐受性，继而用本发明的组合物(包含Ad-LIGHT-HBsAg)来靶向和协同刺激DC和T细胞，从而恢复或再活化那些被耐受的或被抑制的T细胞。HBsAg的持续感染诱导产生了耐受性并限制疫苗的效力。为了避免这一点，用中和抗体预处理转基因小鼠以将血清病毒负荷减少至检测不到的水平。因此，为了检测HBsAg，发明人使用了产生来自肝组织的持续抗原的HBsAg转基因小鼠。发明人连续四周每周向所述小鼠施用所述的抗-HBsAg抗体H25B10以耗尽宿主中游离的抗原，在第二周使用所述的抗-HBsAg抗体H25B10来降低耐受性状态之后，使用包含Ad-LIGHT-HBsAg(2x10⁹v.p.)的组合物进行疫苗接种以破除耐受性并产生强的免疫力。然后，发明人检测了CTL的产生和内源性抗体的产生。发明人发现，使用Ad-LIGHT-HBsAg可于2周内在HBsAg转基因小鼠中破坏耐受性并产生众多产生IFNg的T细胞(图6A和B)。实验结果显示，即使在转基因小鼠中，HBsAg的中和抗体也可以有效地清除HBsAg。因此，很明显，进一步使用病毒抗原的中和抗体将能够产生更强的免疫应答，从而有利于病毒抗原的清除。

由此可见，先施用病毒抗原的中和抗体，而后施用本发明的药物组合物以产生强的免疫应答的这种新策略能够成为清除病毒感染的新的治疗方法。

由于单克隆抗体H25B10针对的是ayw亚型的HBsAg(所述ayw亚型HBsAg在欧美更常见)，发明人进一步开发了针对在中国普遍存在的adr和adw亚型HBsAg的单克隆抗体scFvC-hIgG1Fc(其中编码scFvC的DNA序列如SEQ ID NO：5所示，hIgG1Fc的序列参见NCBI参考序列NM_001136019.2)和scFvD-hIgG1Fc(其中编码scFvD的DNA序列如SEQ ID NO：6所示)，所述抗体的构建方法如Powers，D.B.等人的文章13中所描述的。实验表明，单克隆抗体scFvC-hIgG1Fc对于adr和adw亚型的HBsAg具有很高的亲和力(图7)，其可以以很快的速度中和目标抗原，并且其亲和力比单克隆抗体H25B10与目标抗原的亲和力更高。此外，发明人发现单克隆抗体scFvD-hIgG1Fc可以完全阻碍HBsAg与Chang肝细胞的结合(图8)，而通过这一灵敏度很高的实验，也表明了抗体scFvD-hIgG1Fc能够很好地中和目标抗原，从而用于本发明的目的。所以，上述实验表明，抗体scFvC-hIgG1Fc和抗体scFvD-hIgG1Fc也可以理想地作为用于本发明的目的的中和抗体。

因此，由上面的实验结果可以了解，凡是能够中和目标病毒抗原的抗体均可用于本发明的目的。根据具体的实验要求和应用目的，本领域技术人员完全有能力选择合适的中和抗体，从而达到降低免疫耐受性的目的。

参考文献：

1.Bertoletti A，Gehring A.，Therapeutic vaccination andnovel strategies to treat chronic HBV infection.Expert RevGastroenterol Hepatol.2009；3：561-569。

2.Dienstag JL.，Hepatitis Bvirus infection.N Engl J Med.2008；359：1486-1500。

3.Lopes AR，Kellam P，Das A，等人，Bim-mediated deletionof antigen-specific CD8T cells in patients unable to controlHBV infection.J Clin Invest.2008；118：1835-1845。

4.Penna A，Chisari FV，Bertoletti A，等人，Cytotoxic Tlymphocytes recognize an HLA-A2-restricted epitope within thehepatitis B virus nucleocapsid antigen.J Exp Med.1991；174：1565-1570。

5.Ilan Y，Nagler A，Adler R，Tur-Kaspa R，Slavin S，ShouvalD.，Ablation of persistent hepatitis B by bone marrowtransplantation from a hepatitis B-immune donor.Gastroenterology.1993；104：1818-1821。

6.Gommerman JL，Browning JL.，Lymphotoxin/light，lymphoidmicroenvironments and autoimmune disease.Nat Rev Immunol.2003；3：642-655。

7.Ware CF.，Network communications：lymphotoxins，LIGHT，and TNF.Annu Rev Immunol.2005；23：787-819。

8.Yu P，Lee Y，Wang Y.等人，Targeting the primary tumorto generate CTL for the effective eradication of spontaneousmetastases.J Immunol.2007；179：1960-1968。

9.Lee Y，Chin RK，Christiansen P.等人，Recruitment andactivation of naive T cells in the islets by lymphotoxin betareceptor-dependent tertiary lymphoid structure.Immunity.2006；25：499-509。

10.Yu P，Lee Y，Liu W.等人，Priming of naive T cells insidetumors leads to eradication of established tumors.Nat Immunol.2004。

11.Fan Z，Yu P，Wang Y.等人，NK-cell activation by LIGHTtriggers tumor-specific CD8+T-cell immunity to rejectestablished tumors.Blood.2006；107：1342-1351。

12.Wang YG，Kim KD，Wang J，Yu P，Fu YX，Stimulatinglymphotoxin beta receptor on the dendritic cells is criticalfor their homeostasis and expansion.J Immunol.2005；175：6997-7002。

13.Powers，D.B.等人，Expression of single-chain Fv-Fcfusions in Pichia pastoris.J.Immunol.Methods251(2001)123-135。

Claims

1.分离的核酸分子，其包含：

(a)编码LIGHT多肽的多核苷酸或与之互补的多核苷酸；和

(b)编码病毒抗原的多核苷酸或与之互补的多核苷酸。

2.权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述编码LIGHT多肽的多核苷酸包含：

(i)序列如SEQ ID NO：2所示的多核苷酸或其片段；或

(ii)因为遗传密码简并性而与(i)的多核苷酸在密码子序列中不同的多核苷酸。

3.权利要求1或2所述的分离的核酸分子，其中所述病毒抗原选自引起肿瘤或慢性病原体感染的病毒的免疫原性抗原，所述病毒为例如HBV、HCV、HIV、HPV或EBV；例如，所述病毒抗原可以是HBV的免疫原性抗原，优选地，所述病毒抗原为HBsAg或其免疫原性片段。

4.核酸组合，其包含至少两种不同的核酸分子，其中所述至少两种不同的核酸分子中包含：

(a)编码LIGHT多肽的多核苷酸或与之互补的多核苷酸；和

(b)编码病毒抗原的多核苷酸或与之互补的多核苷酸。

其中，所述(a)和(b)中的多核苷酸位于相同和/或不同的核酸分子中。

5.权利要求4所述的核酸组合，其中所述编码LIGHT多肽的多核苷酸包含：

(i)序列如SEQ ID NO：2所示的多核苷酸或其片段；或

6.权利要求4或5所述的核酸组合，其中所述病毒抗原选自引起肿瘤或慢性病原体感染的病毒的免疫原性抗原，所述病毒为例如HBV、HCV、HIV、HPV或EBV；例如，所述病毒抗原可以是HBV的免疫原性抗原，优选地，所述病毒抗原为HBsAg或其免疫原性片段。

7.载体，其包含权利要求1-3中任一项所述的分离的核酸分子。

8.权利要求7所述的载体，其为病毒载体，例如选自腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、鼠哈维肉瘤病毒载体、鼠乳腺肿瘤病毒载体、劳斯肉瘤病毒载体、SV40-型病毒载体、多瘤病毒载体、EB病毒载体、乳头状瘤病毒载体、疱疹病毒载体、牛痘病毒载体、脊髓灰质炎病毒载体和RNA病毒载体；优选地，所述病毒载体为腺病毒载体。

9.载体系统，其包含至少两个载体，所述至少两个载体中包含：

(a)编码LIGHT多肽的多核苷酸或与之互补的多核苷酸；和

(b)编码病毒抗原的多核苷酸或与之互补的多核苷酸；

10.权利要求9所述的载体系统，其中所述编码LIGHT多肽的多核苷酸包含：

(i)序列如SEQ ID NO：2所示的多核苷酸或其片段；或

11.权利要求10所述的载体系统，其中所述病毒抗原选自引起肿瘤或慢性病原体感染的病毒的免疫原性抗原，所述病毒为例如HBV、HCV、HIV、HPV或EBV；例如，所述病毒抗原可以是HBV的免疫原性抗原，优选地，所述病毒抗原为HBsAg或其免疫原性片段。

12.权利要求9-11中任一项所述的载体系统，其中所述至少两个载体为病毒载体，且彼此独立地选自例如腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、鼠哈维肉瘤病毒载体、鼠乳腺肿瘤病毒载体、劳斯肉瘤病毒载体、SV40-型病毒载体、多瘤病毒载体、EB病毒载体、乳头状瘤病毒载体、疱疹病毒载体、牛痘病毒载体、脊髓灰质炎病毒载体和RNA病毒载体；优选地，所述病毒载体为腺病毒载体。

13.组合物，其包含LIGHT多肽和病毒抗原。

14.权利要求13所述的组合物，其中所述LIGHT多肽包含SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列、其片段或变体，且足以刺激细胞毒性T淋巴细胞；例如，所述变体为在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或其片段中经过一个或多个保守氨基酸置换而得到的氨基酸序列。

15.权利要求13或14所述的组合物，其中所述病毒抗原选自引起肿瘤或慢性病原体感染的病毒的免疫原性抗原，所述病毒为例如HBV、HCV、HIV、HPV或EBV；例如，所述病毒抗原可以为HBV的免疫原性抗原，优选地，所述病毒抗原为HBsAg或其免疫原性片段。

16.病毒颗粒，其包含权利要求8所述的载体，权利要求12所述的所述的载体系统，或权利要求13-15中任一项所述的组合物；例如，所述病毒颗粒为腺病毒颗粒。

17.宿主细胞，其包含权利要求7-8中任一项所述的载体、权利要求9-12中任一项所述的载体系统、或权利要求16所述的病毒颗粒。

18.权利要求1-3中任一项所述的分离的核酸分子、权利要求4-6中任一项所述的核酸组合、权利要求7-8中任一项所述的载体、权利要求9-12中任一项所述的载体系统、权利要求13-15中任一项所述的组合物或权利要求16所述的病毒颗粒用于制备药物的用途，其中所述药物用于预防和/或治疗由病毒引起的肿瘤或慢性病原体感染，例如与HBV、HCV、HIV、HPV或EBV感染相关的病症或病况；特别地，所述药物可以用于预防和/或治疗肝内的病毒感染，例如乙型肝炎病毒感染，例如所述药物用于刺激和扩增对HBsAg有特异性反应的T细胞。

19.药物组合物，其包含：

(i)权利要求1-3中任一项所述的分离的核酸分子、权利要求4-6中任一项所述的核酸组合、权利要求7-8中任一项所述的载体、权利要求9-12中任一项所述的载体系统、权利要求13-15中任一项所述的组合物或权利要求16所述的病毒颗粒；和

(ii)任选地可药用的载体。

20.一种试剂盒，其包含权利要求19中所述的药物组合物和针对病毒抗原的中和抗体，其中：

所述中和抗体所针对的病毒抗原与所述药物组合物中分离的核酸分子、核酸组合、载体、载体系统、组合物或病毒颗粒所编码或包含的病毒抗原可以相同或不同；优选地，所述中和抗体所针对的病毒抗原与所述药物组合物中分离的核酸分子、核酸组合、载体、载体系统、组合物或病毒颗粒所编码或包含的病毒抗原是相同的；并且其中，所述药物组合物和所述中和抗体彼此不相混合。

21.权利要求20所述的试剂盒，其进一步包含使用说明书，从所述使用说明书中可以了解到：在施用所述药物组合物之前，至少施用一次所述中和抗体。

22.权利要求20或21所述的试剂盒，其中所述中和抗体所针对的病毒抗原与所述药物组合物中分离的核酸分子、核酸组合、载体、载体系统、组合物或病毒颗粒所编码或包含的病毒抗原是相同的，均为HBsAg或其免疫原性片段。

23.权利要求22所述的试剂盒，其中所述针对病毒抗原的中和抗体为任何能够中和HBsAg或其免疫原性片段的中和抗体；例如，所述中和抗体选自：

(i)单克隆抗体H25B10、可变区序列包含SEQ ID NO：5中所示的核酸序列所编码的氨基酸序列的抗体或可变区序列包含SEQ ID NO：6中所示的核酸序列所编码的氨基酸序列的抗体；或

(ii)与(i)中的抗体具有同等水平的抗原亲和力的抗体，所述亲和力为例如Kd≤1x10^-8M，优选Kd≤1x10^-9M。

24.权利要求23所述的试剂盒，其中所述针对病毒抗原的中和抗体的重链CDR1-3分别与(i)中的任一抗体的重链CDR1-3相同。

25.权利要求23或24所述的试剂盒，其中所述针对病毒抗原的中和抗体的轻链CDR1-3分别与(i)中的任一抗体的轻链CDR1-3相同。

26.权利要求25所述的试剂盒，其中所述针对病毒抗原的中和抗体的重链和轻链CDR1-3分别与(i)中的同一抗体的重链和轻链CDR1-3相同。

27.权利要求23-26中任一项所述的试剂盒，其中所述针对病毒抗原的中和抗体的重链可变区序列与(i)中的任一抗体的重链可变区序列相同。

28.权利要求23-27中任一项所述的试剂盒，其中所述针对病毒抗原的中和抗体的轻链可变区序列与(i)中的任一抗体的轻链可变区序列相同。

29.权利要求28中所述的试剂盒，其中所述针对病毒抗原的中和抗体的重链和轻链可变区序列分别与(i)中的同一抗体的重链和轻链可变区序列相同。

30.权利要求19中所述的药物组合物与针对病毒抗原的中和抗体共同用于制备药物的用途，其中：

所述中和抗体所针对的病毒抗原与所述药物组合物中分离的核酸分子、核酸组合、载体、载体系统、组合物或病毒颗粒所编码或包含的病毒抗原可以相同或不同；优选地，所述中和抗体所针对的病毒抗原与所述药物组合物中分离的核酸分子、核酸组合、载体、载体系统、组合物或病毒颗粒所编码或包含的病毒抗原是相同的；并且

其中所述药物用于预防和/或治疗由病毒引起的肿瘤或慢性病原体感染，例如与HBV、HCV、HIV、HPV或EBV感染相关的病症或病况；特别地，所述药物可以用于预防和/或治疗肝内的病毒感染，例如乙型肝炎病毒感染，例如所述药物用于刺激和扩增对HBsAg有特异性反应的T细胞。

31.权利要求30所述的用途，其中所述中和抗体所针对的病毒抗原与所述药物组合物中分离的核酸分子、核酸组合、载体、载体系统、组合物或病毒颗粒所编码或包含的病毒抗原是相同的，均为HBsAg或其免疫原性片段；并且其中所述药物用于预防和/或治疗乙型肝炎病毒感染，例如所述药物用于刺激和扩增对HBsAg有特异性反应的T细胞。

32.权利要求31所述的用途，其中所述针对病毒抗原的中和抗体选自权利要求23-29的任一项中所述的中和抗体。

33.LIGHT多肽、或编码LIGHT多肽的多核苷酸用于制备药物的用途，所述药物用于预防和/或治疗肝脏内的病毒感染。

34.权利要求33所述的用途，其中所述病毒为HBV或HCV。

35.权利要求33-34中任一项所述的用途，其中所述LIGHT多肽包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列、其片段或变体，且足以刺激细胞毒性T淋巴细胞；特别地，所述变体为在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或其片段中经过一个或多个保守氨基酸置换而得到的氨基酸序列。