CN112710849A - 一种鉴定抗EBV免疫活性的ELISpot试剂盒、制备方法及应用 - Google Patents

一种鉴定抗EBV免疫活性的ELISpot试剂盒、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鉴定抗EBV免疫活性的ELISpot试剂盒、制备方法及应用，涉及生物医药技术领域。首次提出EBV抗原和IFN‑γ单克隆抗体在制备用于检测免疫细胞抗EBV免疫活性的ELISpot试剂盒中的应用。该试剂盒可用于鉴定抗EBV免疫活性，从而辅助判断治疗效果，也可以用于治疗前的治疗效果预测，从而对临床治疗的选择提供一定的参考。ELISpot具有灵敏度高，操作简便经济，可进行高通量筛选的优势。此外，还提供了一种鉴定抗EBV免疫活性的ELISpot试剂盒。

Description

一种鉴定抗EBV免疫活性的ELISpot试剂盒、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及一种鉴定抗EBV 免疫活性的ELISpot试剂盒、制备方法及应用。
背景技术
EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)属于人类疱疹病毒第四型，是一种双链DNA病毒，主要通过唾液传播，全球超过90％的人群都曾感染该病毒。在机体免疫功能正常时，EBV感染可以触发机体的细胞毒性T细胞(CTL)、NK细胞、γδT细胞以及迟发型超敏反应性T细胞(TDTH)对受染细胞进行免疫清除。在宿主免疫老化以及免疫功能缺陷等情况下，EBV感染无法被清除，因此引起EBV相关淋巴组织增殖性疾病(EBV-associated T-or NK-celllymphoproliferative diseases，EBV+T/NK-LPDs)。
慢性活动性EBV感染(chronic active EBV infection，CAEBV) 是淋巴细胞增殖性疾病的一种。临床表现为初次EBV感染后反复发作或持续数月以上的IM样症状，即发热、咽峡炎、淋巴结肿大和肝脾肿大等。常常进展为恶性疾病，若不及时进行合理、有效地干预治疗，死亡率极高。目前，此类疾病的发病机制仍不明确，对疾病状态的评估主要为外周血EBV-DNA的变化，外周血EBV特异性抗体情况，组织活检病理EBERs原位杂交情况。EBV的清除障碍主要为EB 病毒特异性CTL的功能缺陷，包括无法增殖及活性受损，目前无技术评估患者的抗EB病毒免疫活性。此外，对EB病毒感染相关疾病的治疗效果的评估，仅停留在临床检测EBV-DNA、EBV特异性抗体、组织中EBER表达等宏观方面。
例如，对CAEBV等EBV-LPD疾病的治疗效果的评估，主要集中在临床症状的改善(如发热、淋巴结肿大、肝脾肿大的变化)，以及外周血EBV-DNA拷贝数的变化，组织中EBER表达的变化。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鉴定抗EBV免疫活性的ELISpot试剂盒、制备方法及应用以解决上述技术问题。
本发明是这样实现的：
一种EBV抗原和IFN-γ单克隆抗体在制备用于检测免疫细胞抗 EBV免疫活性的ELISpot试剂盒中的应用。
针对目前对EB病毒感染相关疾病患者的免疫细胞的抗EBV免疫活性尚无评估办法，以及对治疗前后抗EBV免疫活性亦无有效评估手段，无法从免疫层面评估治疗效果，或者在治疗前从免疫层面预测可能治疗效果。
本发明使用ELISpot试剂盒来评估抗EBV免疫活性的变化。该试剂盒用于鉴定抗EBV免疫活性，从而辅助判断治疗效果，也可以用于治疗前的治疗效果预测，从而对临床治疗的选择提供一定的参考。
ELISpot(Enzyme-Linked Immunospot Assay，酶联免疫斑点技术)。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述用于检测免疫细胞抗 EBV免疫活性是指用于检测(EBV抗原刺激后)免疫细胞(例如T 细胞)分泌的细胞因子水平。
在其他实施方式中也可以检测加入EBV抗原和/或PD-1单抗后的T细胞分泌的细胞因子的水平。
例如：检测加入EBV抗原后ELISpot实验下刺激细胞因子的水平以评估患者T细胞抗EBV免疫活性。
IFN-γ作为免疫活性细胞分泌的细胞因子在诱导抗病毒免疫中起着重要的免疫调理作用，包括激活细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)、自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)细胞和吞噬细胞等，机体产生的IFN-γ的水平实际上反映了T细胞的活动。因此，检测IFN-γ的水平就是间接地检测了T细胞的活性。目前，检测IFN-γ的水平已经逐渐代替各种传统的细胞免疫检测手段，成为检测细胞免疫效果的一种重要方法。
本发明提供了一种上述试剂盒的使用方法，首先使用EBV的肽库刺激患者的T细胞，然后使用酶联免疫斑点技术(Enzyme-Linked Immunospot Assay，ELISpot)检测抗原刺激后是否出现斑点，即IFN- γ的释放。出现斑点即为患者的T细胞可识别EBV特异性抗原肽并释放IFN-γ。因此，出现斑点多少可反映T细胞的抗EBV免疫活性。
ELISpot具有如下优势：
一：灵敏度高。一百万个细胞中只要有一个细胞分泌细胞因子就可被检测出来，相对于传统的ELISA方法提升了2～3个数量级。
二：单细胞水平，活细胞功能检测。ELISpot是用抗原直接刺激活细胞，检测的是活细胞的功能。
三：操作简便经济，可进行高通量筛选。ELISpot没有复杂的细胞体外扩增过程，不使用同位素，按照标准化的实验操作，一个实验者可以同时处理数百个样品，效率远远高于其它检测方法。
ELISpot就是用包被好的抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其呈现出来。
实验原理包括：
ELISpot实验使用PVDF膜为底的96孔板，包被上特异性的单克隆抗体(需要无毒，不含内毒素，亲和力高的抗体)，以捕获细胞分泌的细胞因子。
然后在培养板的孔内加入待检测的细胞和抗原刺激物进行培养。在刺激物的刺激下，T细胞就会在对应的时间段分泌对应的细胞因子。此时细胞因子就被包被在膜上的抗体所捕获。
洗去细胞后，被捕获的细胞因子可以与生物素标记的第二抗体结合，然后用酶标亲和素与生物素结合，进行化学酶联显色，就可以在膜的局部形成一个个圆形的斑点，每一个斑点就对应了当初一个分泌细胞因子的细胞。
统计膜上的斑点的数目，再除以当初加入孔内的细胞总数，就可以计算出阳性细胞的百分比。
一种鉴定抗EBV免疫活性的ELISpot试剂盒，其包括EBV抗原和IFN-γ单克隆抗体。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述EBV抗原选自EBV的肽库。
在其他实施方式中，EBV抗原可以是衣壳抗原(CA)、早期抗原(EA)、核抗原(EBNA)、荚膜蛋白(VCA)、膜抗原(MA)、EB 病毒潜在膜抗原(LMP)中的至少一种。此外，EBV抗原还可以是 EBV感染B细胞后合成的早期基因产物。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述EBV的肽库为PepTivator EBV Consensus。例如选自商品名称为美天旎#130-099-764。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述EBV的肽库是以肽库储液的形式存在于试剂盒中。使用前，将肽库储液与水混合配制为肽库工作液备用。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒中还设置有 ELISpot板，ELISpot板上预包被有捕获T细胞分泌的细胞因子的单克隆抗体。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述ELISpot板上预包被有捕获IFN-γ的单克隆抗体。在其他实施方式中，也可以使用空白的板条自行包被待检测的细胞因子的抗体，并不限于直接购买市售的产品。
一种鉴定抗EBV免疫活性的ELISpot试剂盒在药物筛选中的应用，该药物为抗EBV药物，例如：PD-1、更昔洛韦。
一种制备鉴定抗EBV免疫活性的ELISpot试剂盒的方法，其包括用EBV抗原和IFN-γ单克隆抗体制备试剂盒，此外还包括其他制备试剂盒所需要的固相载体。在其他实施方式中，还可以将EBV抗原和IFN-γ单克隆抗体与其他药学上可接受的添加剂或辅料进行复合。
进一步地，EBV抗原选自EBV的肽库。EBV的肽库为PepTivator EBV Consensus。
本发明具有以下有益效果：
本发明首次提出EBV抗原和IFN-γ单克隆抗体在制备用于检测免疫细胞抗EBV免疫活性的ELISpot试剂盒中的应用。该试剂盒可用于鉴定抗EBV免疫活性，从而辅助判断治疗效果，也可以用于治疗前的治疗效果预测，从而对临床治疗的选择提供一定的参考。ELISpot具有灵敏度高，操作简便经济，可进行高通量筛选的优势。此外，还提供了一种鉴定抗EBV免疫活性的ELISpot试剂盒。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为IFN-γ释放试验流式细胞图；
图2为EBV肽库刺激后免疫斑点试验结果图；
图3为患者在加入PD-1单抗后的T细胞抗EBV免疫活性结果图；
图4为使用PD-1单抗治疗后的结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例进行了IFN-γ释放试验。采用Human IFN-γELISpot PRO(ALP)试剂盒中的阳性对照mAb CD3-2作为抗原刺激细胞。刺激细胞后的流式细胞图参照图1所示。
图1中的上方3图为未刺激时的结果，由图1可知，CD8+，CD4+， CD56+细胞的IFN-γ释放十分有限，分别为0.48％、3.81％和0.62％图1中的下方3图为刺激后的结果，由图1可知，经过抗原刺激后的 CD8+，CD4+，CD56+细胞的IFN-γ释放明显增多，分别达到53.39％、52.68％和39.46％。
实施例2
本实施例提供了一种鉴定抗EBV免疫活性的ELISpot试剂盒，包括EBV肽库储液和ELISpot板。利用该试剂盒检测EB病毒感染相关疾病患者的样本经EBV肽库刺激后的IFN-γ水平，通过ELISpot 实验来检测IFN-γ斑点情况，以此评估患者T细胞抗EBV免疫活性。
其包括如下实验步骤：
先配制EBV肽库(peptide pool)储液，EBV肽库购自PepTivator EBV Consensus,human(美天旎#130-099-764)。
第一天：
(1)取Human IFN-γELISpot PRO(ALP)的板条，用PBS洗5 次(PBS的添加量为200uL/孔)。Human IFN-γELISpot PRO(ALP) 的板条上预先包被有捕获T细胞分泌的IFN-γ的单克隆抗体。
(2)向板条中加入试剂盒自带的细胞培养液(200uL/孔)，室温孵育至少30分钟。
(3)从待测样本中提取白膜层，用细胞培养液重悬为 1.25*106/ml，患者样本来源于首都医科大学附属北京友谊医院就诊的 EB病毒感染相关疾病患者。
(4)配制EBV肽库(peptide pool)工作液：取EBV肽库储液 5uL与95uL的无菌水混合，编号管1，即为EBV肽库工作液。混匀时，用移液枪上下轻轻吹打混匀。
(5)配制阳性对照：取Human IFN-γELISpot PRO(ALP)试剂盒中的mAb CD3-2，用水稀释至10倍，每孔中加2uL。
(6)板条按下表1进行加样；加样后置于细胞培养箱(37℃) 孵育20小时。
表1加样表。
Figure BDA0002856879060000081
第二天：
(7)取出细胞培养箱中的板条，每孔中加入PBS(200uL)，清洗5次。
(8)取1ml的PBS，然后加入5uL胎牛血清，吹打混匀。然后再加入7-B6-ALP(HumanIFN-γELISpot PRO(ALP)试剂盒中)5ul，吹打混匀制得7-B6-ALP溶液。
向步骤(7)的板条中每孔加入100ul 7-B6-ALP溶液，室温避光孵育2小时。
(9)然后用PBS(200uL/孔)洗板条5次。
(10)每孔加BCIP-NBT/plus(取自美天旎Human IFN-γELISpot PRO(ALP)试剂盒中)100uL，静置直到有清晰的斑点显现。用无菌去离子水清洗。
(11)最后放置板条至干燥，室温避光保存。
图2中示出了EBV肽库刺激后免疫斑点试验结果。图2的左侧为EB病毒感染相关疾病患者，在加入EBV肽库刺激后，未出现明显斑点，而其父亲(正常人)在EBV肽库刺激后出现明显斑点，表明该EB病毒感染相关疾病患者存在免疫缺陷，主要表现为T细胞对 EB病毒相关抗原识别能力缺陷。实验阳性对照为mAb CD3-2。
实施例3
本实施例分别检测EB病毒感染患者临床治疗前后经EBV肽库刺激后ELISpot实验下斑点的变化，以此评估治疗对T细胞抗EBV 免疫活性的影响，以此从免疫细胞功能恢复的角度评估患者的治疗效果。
实验结果参照图3所示，患者样本来源于首都医科大学附属北京友谊医院就诊的EB病毒感染相关疾病患者。在加入EBV肽库刺激后，未出现明显斑点，斑点较少；而在加入抗PD-1单抗后出现斑点增多，而仅添加患者样本和抗PD-1单抗的处理组无斑点出现，提示可能后续使用PD-1单抗治疗可恢复患者T细胞的抗EBV免疫活性，从而达到有效治疗。
实施例4
本实施例在治疗前对患者样本进行斑点实验，在样本中加入肽库，使用ELISpot检测抗原刺激后是否出现IFN-γ释放(即斑点)，并与之前未加入肽库的处理组进行比较，若出现斑点则提示该患者在抗原的刺激下具有抗EBV免疫活性。
实验结果参照图4所示，图4中左侧为未加肽库组，右侧为加入肽库组。孔1为EB病毒感染相关疾病患者的样本，孔2为EB病毒感染相关疾病患者样本复孔。孔3为阳性对照，孔4为阴性对照。
结果显示，EB病毒感染相关疾病患者的样本在加入肽库后斑点增多，提示在抗原的刺激下，患者T细胞具有抗EBV免疫活性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种EBV抗原和IFN-γ单克隆抗体在制备用于检测免疫细胞抗EBV免疫活性的ELISpot试剂盒中的应用。
2.一种鉴定抗EBV免疫活性的ELISpot试剂盒，其特征在于，其包括EBV抗原和IFN-γ单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的鉴定抗EBV免疫活性的ELISpot试剂盒，其特征在于，所述EBV抗原选自EBV的肽库。
4.根据权利要求3所述的鉴定抗EBV免疫活性的ELISpot试剂盒，其特征在于，所述EBV的肽库为PepTivator EBV Consensus。
5.根据权利要求4所述的鉴定抗EBV免疫活性的ELISpot试剂盒，其特征在于，所述EBV的肽库是以肽库储液的形式存在于试剂盒中。
6.根据权利要求2所述的鉴定抗EBV免疫活性的ELISpot试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还设置有ELISpot板，ELISpot板上预包被有捕获T细胞分泌的细胞因子的单克隆抗体。
7.根据权利要求6所述的鉴定抗EBV免疫活性的ELISpot试剂盒，其特征在于，所述ELISpot板上预包被有捕获IFN-γ的单克隆抗体。
8.一种制备鉴定抗EBV免疫活性的ELISpot试剂盒的方法，其特征在于，其包括用EBV抗原和IFN-γ单克隆抗体制备试剂盒。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述EBV抗原选自EBV的肽库。
10.根据权利要求9所述的鉴定抗EBV免疫活性的ELISpot试剂盒，其特征在于，所述EBV的肽库为PepTivator EBV Consensus。
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