CN110981944A - 非洲猪瘟病毒t细胞抗原多肽及其抗原表位筛选的elispot检测方法 - Google Patents

非洲猪瘟病毒t细胞抗原多肽及其抗原表位筛选的elispot检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明通过筛选ASFV四种重要结构蛋白p30、p54、p72以及CD2v细胞免疫抗原优势表位，并建立相应酶联免疫斑点试验方法。所筛选得到的多肽具有很高的氨基酸序列保守性，可有效诱导ASFV特异性细胞免疫反应，可作为ASFV表位载体疫苗的候选免疫原。本发明筛选得到的ASFV结构蛋白T细胞表位多肽，并建立了相应的ELISPOT检测方法，为ASFV候选疫苗的效力评价提供了有力工具，也为ASFV多肽载体疫苗的研发奠定了基础。

Description

非洲猪瘟病毒T细胞抗原多肽及其抗原表位筛选的ELISPOT检 测方法
技术领域
本发明涉及兽医领域,具体为动物疾病预防和治疗,更具体涉及非洲猪瘟病毒免疫抗原优势表位。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起的一种家猪和野猪的急性、热性和高度接触性传染性疾病(Gomez-Villamandos JC,Bautista MJ,Sanchez-Cordon PJ,Carrasco L.2013.Pathology ofAfrican swine fever:the role of monocyte-macrophage.Virus Res 173:140-149.)。其临床症状从急性、亚急性到慢性不等，主要特征是高热、皮肤发绀、内脏器官广泛出血、呼吸障碍和神经症状，发病率和死亡率几乎达100％。自1921年首次在肯尼亚发现(Kleiboeker SB,Scoles GA,Burrage TG,Sur J.1999.African swine fever virusreplication in the midgut epithelium is required for infection ofOrnithodoros ticks.J Virol 73:8587-8598.)，已经在全球13个不同的国家或地区流行。自2018年8月3日，ASF首次在我国沈阳发现，随后在江苏、浙江、安徽等地相继爆发疫情，至今我国除香港澳门外几乎全部省份均已发生ASF疫情，疫情仍在肆虐，对我国养猪业造成毁灭性重创，亟需研发针对我国流行毒株有效疫苗。
对于非洲猪瘟疫苗的研发，国际学者已经进行了多种尝试，灭活苗(Forman AJ,Wardley RC,Wilkinson PJ.1982.The immunological response of pigs and guineapigs to antigens of African swine fever virus.Arch Virol 74:91-100)、弱毒苗(Boinas FS,Hutchings GH,Dixon LK,Wilkinson PJ.2004.Characterization ofpathogenic and non-pathogenic African swine fever virus isolates fromOrnithodoros erraticus inhabiting pig premises in Portugal.J Gen Virol 85:2177-2187.；Abrams CC,Goatley L,Fishbourne E,Chapman D,Cooke L,Oura CA,Netherton CL,Takamatsu HH,Dixon LK.2013.Deletion of virulence associatedgenes from attenuated African swine fever virus isolate OUR T88/3decreasesits ability to protect against challenge with virulent virus.Virology 443:99-105.)、亚单位疫苗Neilan JG,Zsak L,Lu Z,Burrage TG,Kutish GF,RockDL.2004.Neutralizing antibodies to African swine fever virus proteins p30,p54,and p72 are not sufficient for antibody-mediated protection.Virology 319:337-342.；Gomez-Puertas P,Rodriguez F,Oviedo JM,Ramiro-Ibanez F,Ruiz-GonzalvoF,Alonso C,Escribano JM.1996.Neutralizing antibodies to different proteins ofAfrican swine fever virus inhibit both virus attachment and internalization.JVirol 70:5689-5694)和DNA疫苗(Argilaguet JM,Perez-Martin E,Nofrarias M,Gallardo C,Accensi F,Lacasta A,Mora M,Ballester M,Galindo-Cardiel I,Lopez-Soria S,Escribano JM,Reche PA,Rodriguez F.2012.DNA vaccination partiallyprotects against African swine fever virus lethal challenge in the absence ofantibodies.PLoS One 7:e40942)等均不能提供有效保护，目前尚无ASFV商品化疫苗。这可能是由于ASFV免疫机制尚未完全清楚。一些研究表明体液免疫无法产生有效的免疫保护力，只能延缓病情，细胞免疫在免疫保护中发挥更为重要的作用(Argilaguet JM,Perez-Martin E,Nofrarias M,Gallardo C,Accensi F,Lacasta A,Mora M,Ballester M,Galindo-Cardiel I,Lopez-Soria S,Escribano JM,Reche PA,Rodriguez F.2012.DNAvaccination partially protects against African swine fever virus lethalchallenge in the absence of antibodies.PLoS One7:e40942)。Oura等清除猪体内CD8+T细胞，机体完全丧失对强毒株OUR/T88/1抵抗力(Oura CA,Denyer MS,Takamatsu H,Parkhouse RM.2005.In vivo depletion of CD8+T lymphocytes abrogates protectiveimmunity to African swine fever virus.J Gen Virol 86:2445-2450)，证实了细胞免疫对ASFV免疫保护意义重大，提示有效诱导细胞免疫可提供针对ASFV有效保护。
p72、p54、p30和CD2v是ASFV 4种重要的抗原蛋白和结构蛋白(Leitao A,Malur A,Cornelis P,Martins CL.1998.Identification of a 25-aminoacid sequence from themajor African swine fever virus structural protein VP72 recognised by porcinecytotoxic T lymphocytes using a lipoprotein based expression system.J VirolMethods 75:113-119.；Gomez-Puertas P,Rodriguez F,Oviedo JM,Brun A,Alonso C,Escribano JM.1998.The African swine fever virus proteins p54 and p30 areinvolved in two distinct steps of virus attachment and both contribute to theantibody-mediated protective immune response.Virology243:461-471.)。p72蛋白是病毒粒子的主要结构蛋白，也是血清学检测的主要抗原(Borca MV,Irusta P,Carrillo C,Afonso CL,Burrage T,Rock DL.1994.African swine fever virus structural proteinp72 contains a conformational neutralizing epitope.Virology201:413-418.)。p54介导病毒的吸附和入侵过程(Alonso C,Miskin J,Hernaez B,Fernandez-Zapatero P,Soto L,Canto C,Rodriguez-Crespo I,Dixon L,Escribano JM.2001.African swinefever virus protein p54 interacts with the microtubular motor complex throughdirect binding to light-chain dynein.J Virol 75:9819-9827.；Hernaez B,AlonsoC.2010.Dynamin-and clathrin-dependent endocytosis in African swine fevervirus entry.J Virol 84:2100-2109.)。p30介导ASFV吸附易感细胞(Gomez-Puertas P,Rodriguez F,Oviedo JM,Brun A,Alonso C,Escribano JM.1998.The African swinefever virus proteins p54and p30 are involved in two distinct steps of virusattachment and both contribute to the antibody-mediated protective immuneresponse.Virology 243:461-471.)，具有良好的免疫原性(Alonso F,Dominguez J,Vinuela E,Revilla Y.1997.African swine fever virus-specific cytotoxic Tlymphocytes recognize the 32kDa immediate early protein(vp32).Virus Res 49:123-130.)。CD2v介导红细胞与感染细胞内和胞外病毒粒子结合，这一特性对ASFV在易感动物体内扩散有重要作用(Borca MV,Kutish GF,Afonso CL,Irusta P,Carrillo C,Brun A,Sussman M,Rock DL.1994.An African swine fever virus gene with similarity tothe T-lymphocyte surface antigen CD2 mediates hemadsorption.Virology199:463-468.；Borca MV,Carrillo C,Zsak L,Laegreid WW,Kutish GF,Neilan JG,Burrage TG,Rock DL.1998.Deletion of a CD2-like gene,8-DR,from African swine fever virusaffects viral infection in domestic swine.J Virol 72:2881-2889.；Rodriguez JM,Yanez RJ,Almazan F,Vinuela E,Rodriguez JF.1993.African swine fever virusencodes a CD2homolog responsible for the adhesion of erythrocytes to infectedcells.J Virol67:5312-5320.)。因此本研究选择p72、p54、p30和CD2v这4种重要结构蛋白作为研究和筛选细胞免疫优势抗原多肽的免疫原。酶联免疫斑点技术(enzyme-linkedimmunospot assay,ELISPOT)(Sedgwick JD.2005.ELISPOT assay:a personalretrospective.Methods Mol Biol302:3-14.)，可在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况(Czerkinsky CC,Nilsson LA,Nygren H,Ouchterlony O,Tarkowski A.1983.A solid-phase enzyme-linked immunospot(ELISPOT)assay for enumeration of specificantibody-secreting cells.J Immunol Methods 65:109-121)，可用于高通量筛选(Kalyuzhny AE.2005.Chemistry and biology of the ELISPOT assay.Methods MolBiol 302:15-31)，具备灵敏度高，操作简单经济等诸多优点。以上述所筛选多肽建立ELSIPOT检测方法，可建立针对ASFV细胞免疫评价方法。
ASFV自2108年8月入侵我国，现在我国除香港澳门外几乎所有省份都爆发了疫情，为我国养猪业带来了毁灭性打击，严重威胁着我国畜牧业。ASFV尚无有效疫苗，亟需研发针对中国流行毒株有效疫苗。已有报道称，体液免疫不足以提供完全免疫保护，细胞免疫对ASFV免疫保护具有重要作用。清除猪体内CD8+T淋巴细胞导致OUR/T88/3弱毒株丧失对猪的免疫保护，表明T细胞免疫对ASFV的清除和免疫保护起关键作用(Oura CA,Denyer MS,Takamatsu H,Parkhouse RM.2005.In vivo depletion of CD8+T lymphocytesabrogates protective immunity to African swine fever virus.J Gen Virol 86:2445-2450.)。而病毒特异性CD8+T细胞免疫反应可产生免疫保护(Argilaguet JM,Perez-Martin E,Nofrarias M,Gallardo C,Accensi F,Lacasta A,Mora M,Ballester M,Galindo-Cardiel I,Lopez-Soria S,Escribano JM,Reche PA,Rodriguez F.2012.DNAvaccination partially protects against African swine fever virus lethalchallenge in the absence of antibodies.PLoS One 7:e40942.；Lacasta A,Monteagudo PL,Jimenez-Marin A,Accensi F,Ballester M,Argilaguet J,Galindo-Cardiel I,Segales J,Salas ML,Dominguez J,Moreno A,Garrido JJ,RodriguezF.2015.Live attenuated African swine fever viruses as ideal tools to dissectthe mechanisms involved in viral pathogenesis and immune protection.Vet Res46:135)。此外，DNA疫苗免疫猪检测不到特异性抗体，细胞免疫可产生部分免疫保护作用。
细胞免疫对ASFV免疫保护意义重大，亟需筛选有效诱导细胞免疫多肽，并建立有效评价细胞免疫方法，为后续疫苗研发与评价体系的建立提供技术平台。
发明内容
针对上述需求，本发明通过设计合理的实验方案，筛选ASFV四种重要结构蛋白p30、p54、p72以及CD2v细胞免疫抗原优势表位，并建立相应酶联免疫斑点试验方法。所筛选得到的多肽具有很高的氨基酸序列保守性，可有效诱导ASFV特异性细胞免疫反应，可作为ASFV表位载体疫苗的候选免疫原。本发明筛选得到的ASFV结构蛋白T细胞表位多肽，并建立了相应的ELISPOT检测方法，为ASFV候选疫苗的效力评价提供了有力工具，也为ASFV多肽载体疫苗的研发奠定了基础。
一方面，本发明提供一种ASFV细胞免疫优势抗原多肽，其选自下述氨基酸序列所示的多肽，或在其两端增加1、2、3、4、5个氨基酸：IRAHNFIQTI、KEEEKEVVRL、GYDWDNQTPL、WFIPGVINEISLTNN、VINEISLTNNELYIN、YGGNAIKTPD、MDSEFFQPVYPRHYG、YSRYQYNTPIYYMRP。
具体来说，所述两端增加1、2、3、4、5个氨基酸是指与该抗原表位在ASFV的相应蛋白的氨基酸序列对应的氨基酸。
更优选地，其选自下述多肽：
p30-32：DFNKVIRAHNFIQTI；
p30-33：IRAHNFIQTIHGTPL；
p30-35：HGTPLKEEEKEVVRL；
p30-36：KEEEKEVVRLMVIKL；
p72-28：TFPRNGYDWDNQTPL；
p72-29：GYDWDNQTPLEGAVY；
p72-80：WFIPGVINEISLTNN；
p72-81：VINEISLTNNELYIN；
p72-113：YIPFHYGGNAIKTPD；
p72-114：YGGNAIKTPDDPGAM；
p72-121：SRAREFYISWDTDYV；
p54-1：MDSEFFQPVYPRHYG；
CD2v-56：YSRYQYNTPIYYMRP。
其中，其中相邻的表位有10个氨基酸的重叠的表位是一个有力证据，表明这里确实存在优势表位。筛选到的这13个表位，其中有11个是位于p30和p72蛋白的，表明这两个蛋白诱导T细胞免疫的能力很强。这些研究结果表明与之前认识存在不同，此前对于猪对ASFV的细胞免疫的作用还是被低估。而本发明首次表明这些多肽诱导的T细胞免疫反应实验批次间稳定，对遗传背景不同的SPF猪和现地猪都能诱导良好稳定的T细胞免疫，更重要的发现是其水平和疫苗保护效力直接相关，因此具有创新性和良好的应用价值
本发明还提供所述的ASFV细胞免疫优势抗原多肽在制备ASFV表位载体疫苗中的应用。所筛选得到的多肽具有很高的氨基酸序列保守性，可有效诱导ASFV特异性细胞免疫反应，可作为ASFV表位载体疫苗的候选免疫原。
本发明还提供所述的ASFV细胞免疫优势抗原多肽在ASFV候选疫苗的效力评价中的应用。对非洲猪瘟而言，T细胞免疫水平对病毒血症控制和病毒清除起关键作用，与预后密切相关，因此诱导T细胞免疫反应的能力是ASFV候选疫苗免疫保护效力的重要指标。本研究通过酶联免疫斑点实验，用筛选得到的ASFV主要结构蛋白的T细胞优势表位多肽对候选疫苗免疫猪的外周血淋巴细胞进行刺激，评估其针对表位刺激产生γ干扰素的水平，从而反映ASFV候选疫苗诱导的特异性T细胞免疫反应的水平，同时结合攻毒后数据，建立与病毒血症和预后的相关性，作为疫苗免疫效力评价的重要指标。本发明筛选得到的ASFV结构蛋白T细胞表位多肽，并建立了相应的ELISPOT检测方法，为ASFV候选疫苗的效力评价提供了有力工具。
进一步地，本发明提供用于上述ASFV候选疫苗的效力评价用试剂盒，其包括如所述的ASFV细胞免疫优势抗原多肽。优选地，该试剂盒，还包括96孔ELISPOT板，用于承载细胞和后续显色。针对猪γ干扰素不同抗原区的一对单克隆抗体，其中一种抗体未标记，用以包被ELISPOT板捕获细胞分泌的γ干扰素；另一种单抗为生物素标记，用以检测捕获的γ干扰素。辣根过氧化物酶标记的链亲和素，用以结合生物素标记的单抗，起到信号放大和催化底物显色的作用。AEC显色底物用于斑点显色。
本发明建立了检测ASFV候选疫苗免疫猪的特异性T细胞分泌γ干扰素水平的ELSIPOT方法并筛选得到ASFV四种重要结构蛋白p30、p54、p72以及CD2v的T细胞抗原表位，用于评价疫苗诱导T细胞免疫水平。本发明的研究显示ASFV候选疫苗免疫猪的细胞免疫水平(ELISPOT斑点数)与攻毒后的猪病毒血症控制高度相关，对免疫猪攻毒后的生存和预后具有重要提示作用。同时，筛选得到的多肽表位可有效诱导细胞免疫，可成为多肽载体疫苗的候选免疫原。
附图说明
图1.ELISPOT显色后形成斑点示意图(取自AID酶联斑点分析仪)。1：免疫攻毒猪PBMC以不相关多肽刺激对照；2：未免疫未攻毒猪PBMC以ASFV非优势多肽刺激(阴性对照)；3：免疫攻毒猪PBMC以PMA刺激(阳性对照)；4：免疫攻毒猪PBMC以ASFV病毒刺激；5：免疫攻毒猪PBMC以某一筛选得到的优势表位多肽刺激。
图2.合成肽库单条多肽筛选结果。其中图的纵坐标单位为斑点数/5×105细胞。(图2a)p72多肽库，每条多肽含15个氨基酸，相邻多肽包含5个氨基酸重叠序列，共合成127条多肽，命名为p72-1至p72-127。以p72肽库每条多肽分别刺激猪PBMC，统计ELISPOT显色形成斑点数目，筛选优势表位多肽。共进行两次筛选，所筛选优势表位多肽共7条，分别为p72-28、p72-29、p72-80、p72-81、p72-113、p72-114以及p72-121。(图2b)p30多肽库，每条多肽含15个氨基酸，相邻多肽包含5个氨基酸重叠序列，共合成37条多肽，命名为p30-1至p30-37。以p30肽库每条多肽分别刺激猪PBMC，统计ELISPOT显色形成斑点数目，筛选优势表位多肽。所筛选优势表位多肽共4条，分别为p30-32、p30-33、p30-35、p30-36。(图2c)p54多肽库，每条多肽含15个氨基酸，相邻多肽包含5个氨基酸重叠序列，共合成35条多肽，命名为p54-1至p54-35。以p54肽库每条多肽分别刺激猪PBMC，统计ELISPOT显色形成斑点数目，筛选优势表位多肽。所筛选优势表位多肽共1条，为p54-1。(图2d)CD2v多肽库，每条多肽含15个氨基酸，相邻多肽包含5个氨基酸重叠序列，共合成70条多肽，命名为CD2v-1至CD2v-70。以CD2v肽库每条多肽分别刺激猪PBMC，统计ELISPOT显色形成斑点数目，筛选优势表位多肽。所筛选优势表位多肽共1条，为CD2v-56。
图3.ASFV减毒候选疫苗株rASFVΔ360-eGFP免疫猪ELSIPOT检测结果(实施案例一)。加强免疫后，取猪PBMC，用筛选得到的优势表位多肽进行刺激，检测ELISPOT水平。横坐标为实验猪耳号，纵坐标为斑点计数。
图4.ASFV减毒候选疫苗株rASFVΔ360-eGFP免疫猪用ASFV强毒攻击后生存曲线(实施案例一)。
图5.ASFV减毒候选疫苗株rASFVΔ360-eGFP免疫猪用ASFV强毒攻击后体温变化曲线(实施案例一)。
图6.ASFV减毒候选疫苗株rASFVΔ360-eGFP免疫猪用ASFV强毒攻击后血液HAD检测结果,其中701至712为疫苗免疫猪，761和762为同居哨兵猪，758和760为未免疫攻毒对照(实施案例一)。
图7.ASFV减毒候选疫苗株rASFVΔ360-eGFP免疫猪ELISPOT结果(上图)与同批猪攻毒后血液HAD数据(下图)(实施案例一)。
图8.ASFV减毒候选疫苗株rASFVΔ360-eGFP免疫猪ELISPOT结果与同批猪攻毒后血液HAD相关性分析。相关性分析采用GraphPad软件内建线性回归方法，结果显示ELISPOT值与血液HAD值呈负相关，表明免疫猪T细胞免疫水平越高其攻毒后血液病毒载量越低(实施案例一)。
图9.ASFV减毒候选疫苗株rASFVΔCD2V/360-eGFP-mCherry免疫猪ELSIPOT检测结果(实施案例二)。加强免疫后，取猪PBMC，用筛选得到的优势表位多肽进行刺激，检测ELISPOT水平。横坐标为实验猪耳号，纵坐标为斑点计数。
图10.ASFV减毒候选疫苗株rASFVΔCD2V/360-eGFP-mCherry免疫猪用ASFV强毒攻击后生存曲线(实施案例二)。
图11.ASFV减毒候选疫苗株rASFVΔCD2V/360-eGFP-mCherry免疫猪用ASFV强毒攻击后体温变化曲线(实施案例二)。
图12.ASFV减毒候选疫苗株rASFVΔCD2V/360-eGFP-mCherry免疫猪用ASFV强毒攻击后血液HAD检测结果,其中813至831为疫苗免疫猪，765和774为未免疫攻毒对照(实施案例二)。
图13.ASFV减毒候选疫苗株rASFVΔCD2V/360-eGFP-mCherry免疫猪ELISPOT结果(上图)与同批猪攻毒后血液HAD数据(下图)(实施案例二)。
图14.ASFV减毒候选疫苗株rASFVΔCD2V/360-eGFP-mCherry免疫猪ELISPOT结果与同批猪攻毒后血液HAD相关性分析。相关性分析采用GraphPad软件内建线性回归方法，结果显示ELISPOT值与血液HAD值呈负相关，表明免疫猪T细胞免疫水平越高其攻毒后血液病毒载量越低(实施案例二)。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步的说明，以更好的理解本发明，但其不构成对本发明的限制。
实施例中所采用的实验材料与仪器
7周龄SPF大白猪与长白猪杂交猪由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。7周龄现地猪由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。猪外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)分离自7周龄SPF猪，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基培养。猪PBMC分离试剂盒(MN LTS1110)，购自天津市灏洋生物制品科技有限公司；生物素偶联的猪干扰素γ抗体(MN 559958)，购自BD biosciencespharmingen公司；用于ELISPOT辣根过氧化物酶-链霉亲和素(MN 557630)，购自BDbiosciences pharmingen公司；纯化的猪干扰素γ抗体(MN 559961)，购自BD biosciencespharmingen公司。96-孔ELISPOT细胞板(MN MSIPS4510)，购自Millipore公司。AEC显色液(MN 551951)，购自BD biosciences pharmingen公司。德国AID酶联斑点分析仪(德国AIDELISPOT READER)，购自德国艾迪(AID)公司。
实施例一 筛选细胞免疫优势抗原多肽
1、肽库合成
参照ASFV中国流行毒株ASFV/CN/HLJ/18(GenBank录入号:MK333180.1)的p30、p54、p72以及CD2v基因的氨基酸序列(Zhao DM,Liu RQ,Zhang XF,Li F,Wang JF,ZhangJW,Liu X,Wang LL,Zhang JE,Wu XZ,Guan YT,Chen WY,Wang XJ,H XJ,BuZG.Replication and virulence in pigs of the first African swine fever virusisolated in China.EMERG MICROBES INFEC8:1,438-447)，由金斯瑞生物科技公司合成多肽，每条多肽含15个氨基酸，相邻多肽包含10个氨基酸重叠序列。p30蛋白合成37条多肽，依次命名为p30-1至p30-37；p54蛋白合成35条多肽，依次命名为p54-1至p54-35；p72蛋白合成127条多肽，命名为p72-1至p72-127；CD2v蛋白合成70条多肽，命名为CD2v-1至CD2v-70。同时合成一条非ASFV蛋白的15肽(中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)S蛋白多肽，其序列为：CCDRYEEYDLEPHKV)作为不相关对照。
2、分离外周血单核细胞
采集猪外周抗凝血20ml,加入样本稀释液，稀释后血液样本小心加于淋巴分离液之上，650g离心30min。用吸管小心吸取淋巴细胞层到另一离心管中并加入10ml清洗液混匀。250g离心10min,弃上清。再洗涤细胞一次，弃上清，重悬细胞，计数。
3、ELISPOT检测
用猪γ干扰素抗体包被ELISPOT板，终浓度约为2.5μg/ml，每孔100μl。置于4℃过夜包被。弃去包被液，用含10％血清的RPMI-1640培养液清洗细胞板两次，37℃封闭1h。随后加入50μl含20μg/mL多肽的10％血清RPMI-1640培养液，最后加入相同体积含有5×105个PBMC的培养液，置于5％CO2细胞培养箱37℃培养20h。弃去孔内液体，每孔加入200μl PBST反复吹打，重复洗涤3-4次。用含0.5％BSA的PBST按1：300稀释生物素偶联的猪γ干扰素抗体，每孔100μl，37℃孵育1h。PBST洗涤3-4次。用含0.5％BSA PBST按1：3000稀释辣根过氧化物酶-链霉亲和素，每孔100μl，37℃孵育45min。PBST洗涤3-4次。每孔加入50μl AEC显色剂37℃，避光静置15-30min，用水洗涤细胞板终止显色反应，置于通风处，室温静置干燥。用酶联斑点分析仪获取图像，ELISPOT 7.0s软件斑点计数。
4、红细胞吸附试验(HAD)
PBMC接种到96孔细胞培养板，将病毒液10倍系列稀释后分别加入到细胞板，50μl/孔，每个稀释度5孔，培养并观察红细胞吸附在感染细胞周围所形成的特征性玫瑰花环结构，连续观察7天，记录产生红细胞吸附现象的细胞孔，利用Reed and Muench法计算其HAD50。
5、ASFV减毒候选疫苗株rASFVΔ360-eGFP免疫攻毒试验
11只7周龄SPF猪随机分成2组，ASFV减毒候选疫苗株(rASFVΔ360-eGFP)(专利申请号：201910342578.8)低剂量免疫组5只，耳号分别为701、702、704、705、706；高剂量免疫组6只，耳号分别为707-712。颈部肌肉注射免疫，1ml/头，低剂量组免疫剂量为103TCID50，高剂量组免疫剂量为105TCID50。一免后3周以同种方式加强免疫。二免后2周，用102.5HAD中国流行毒株(ASFV/CN/HLJ/18)肌肉注射途径攻毒。每组设立同群对照1只，低剂量组哨兵猪耳号为761，高剂量组哨兵猪耳号为762。同时设立未免疫攻毒对照组，耳号分别为758和760。二免后10日，采集血液样本，分离PBMC进行ELISPOT检测。攻毒后持续观察临床症状，并于5、10、15、21天分别采集血液样本，进行HAD检测。攻毒9天和21天后对非免疫组实施安乐死并剖检。攻毒21天后对免疫组存活猪实施安乐死并剖检，滴定组织脏器HAD，观察组织病变。
实验结果
1、细胞免疫优势抗原多肽的筛选结果
非洲猪瘟候选疫苗株rASFVΔ360-eGFP加强免疫后10天，分离猪PBMC用每种蛋白合成肽库中的每一条多肽刺激PBMC进行高通量ELISPOT，测定ASFV特异性T细胞受多肽刺激后分泌γ干扰素分泌的水平，以反映ASFV候选疫苗诱导的T细胞免疫水平。设立以下对照：ASFV多肽刺激未免疫未攻毒猪PBMC，不相关多肽(MERS-CoV S蛋白的多肽)刺激免疫猪PBMC，用PMA和ASFV病毒刺激免疫攻毒猪PBMC作为阳性对照。从结果中筛选能诱导较高水平γ干扰素的多肽(图2)，分别为p30-32、p30-33、p30-35、p30-36、p72-28、p72-29、p72-80、p72-81、p72-113、p72-114、p72-121、p54-1以及CD2v-56。其中，前十个多肽，每两个两两之间有氨基酸的重叠，也更表明存在优势表位。
表1 ASFV细胞免疫优势抗原多肽氨基酸序列
多肽名称 ASFV蛋白 多肽序列
p30-32 p30 DFNKVIRAHNFIQTI
p30-33 p30 IRAHNFIQTIHGTPL
p30-35 p30 HGTPLKEEEKEVVRL
p30-36 p30 KEEEKEVVRLMVIKL
p72-28 p72 TFPRNGYDWDNQTPL
p72-29 p72 GYDWDNQTPLEGAVY
p72-80 p72 WFIPGVINEISLTNN
p72-81 p72 VINEISLTNNELYIN
p72-113 p72 YIPFHYGGNAIKTPD
p72-114 p72 YGGNAIKTPDDPGAM
p72-121 p72 SRAREFYISWDTDYV
p54-1 p54 MDSEFFQPVYPRHYG
CD2v-56 CD2v YSRYQYNTPIYYMRP
2、ELISPOT试验
二次免疫后10天，分离PBMC进行ELISPOT试验。所筛选多肽可诱导产生明显的免疫斑点，分别统计每只猪产生斑点总数，统计结果如图2所示。耳号为704、705、707、708以及709实验猪样本产生斑点总数较少，不足100个斑点/5×105淋巴细胞。而耳号为701、702、706、710、711以及712实验猪样本产生斑点总数较多，多达200个斑点/5×105淋巴细胞以上。
3、临床症状观察
攻毒对照组758精神轻度沉郁，鼻子流血、结痂，眼睑肿，轻度便血；攻毒对照组760精神轻度沉郁，便血严重；均于攻毒后第4天开始体温升高(＞41℃)，出现典型非洲猪瘟临床症状，维持高温至第9天死亡。免疫组大部分猪存活，仅有个别猪(708，705)死亡，生存曲线如图3所示。免疫组大部分猪体温正常，个别猪体温一过性升高(704和707)，体温曲线如图4所示。其中高剂量组708体温升高(＞41℃)，皮肤苍白、鼻镜苍白，于攻毒后11天死亡。低剂量组705体温升高(＞41℃)，精神沉郁，臀部潮红，皮肤表面大面积淤血斑，于攻毒后12天死亡。低剂量组704和高剂量组707体温升高，食欲不振，精神抑郁，无精打采，皮肤潮红，耳缘、尾巴以及四肢末端发绀，呼吸窘迫，呕吐。可见ELSIPOT检测细胞免疫水平较低猪只或攻毒后死亡(705、708)，或临床症状严重(704、707)，提示预后不良。
4、剖检变化观察
攻毒对照组758和760麻醉解剖，均可观察到颌下淋巴结充血、肿大，腹股沟淋巴结和肠系膜淋巴结肿大，支气管淋巴结轻度充血；心包积液，呈黄褐色；脾脏肿大，外缘质地变脆；肝脏边缘有暗黑色斑块。高剂量免疫组708于攻毒后11天死亡，低剂量免疫组705于攻毒后9天死亡，剖检均可观察到与攻毒对照组758和760相似病理剖检变化。704和707呈现颌下淋巴结充血呈暗红色，轻微肿大，胃肝淋巴结充血肿大，质地较脆，肠系膜淋巴结充血肿大，呈暗红色，支气管淋巴结充血肿大；肾脏表面充血肿大，呈暗红色。702、709、710、711呈现或颌下淋巴结，或腹股沟淋巴结，或胃肝淋巴结轻度充血肿大；肾脏局部出血。
5、病毒血症分析
ASFV病毒血症是指示疾病进程和预后的重要指标。分别在攻毒后5、10、15、21天采集猪血液样本进行HAD检测，检测结果如图5所示。HAD检测结果显示,708，705号猪的病毒血症最严重，704和707SPF猪病毒血症持续较长时间。可见，ELSIPOT检测细胞免疫水平较低猪只大都或攻毒后死亡(705、708)，或长时间持续产生病毒血症(704、707)，提示预后不良。ELSIPOT检测细胞免疫水平较高猪只大都未发生病毒血症(702、710、711)，或一过性病毒血症(701、712)，提示预后良好，只有709号猪例外。可见，应用所筛选细胞免疫优势抗原多肽建立ELISPOT方法可有效检测细胞免疫反应，其结果与血液HAD检测结果高度相关。
6、ELISPOT检测与血液HAD相关性分析
如图6所示，ELISPOT检测结果与血液HAD值呈现负相关。血液HAD值在攻毒后10日达到最大值，以攻毒后10日血液HAD值与ELISPOT检测结果进行线性分析，结果如图7所示。ELISPOT检测结果与血液HAD值具有良好的线性关系，ELISPOT检测结果可提示预后。可见，ELSIPOT检测细胞免疫水平较低猪只大都或攻毒后死亡(705、708)，或长时间持续产生病毒血症(704、707)，提示预后不良。ELSIPOT检测细胞免疫水平较高猪只大都未发生病毒血症(702、710、711)，或一过性病毒血症(701、712)，提示预后良好。只有709号猪例外。可见，应用所筛选细胞免疫优势抗原多肽建立ELISPOT方法，可有效检测细胞免疫反应，与HAD检测结果高度相关，相关性达90.09％。
实施例二 ASFV减毒候选疫苗株rASFVΔCD2V/360-eGFP-mCherry免疫攻毒试验
9只7周龄现地猪随机分成2组，ASFV减毒候选疫苗株(rASFVΔCD2V/360-eGFP-mCherry)(专利申请号：201910342578.8)低剂量免疫组5只，耳号分别为813、814、815、816、817；高剂量免疫组5只，耳号分别为819、821、824、831。颈部肌肉注射免疫，1ml/头，低剂量组免疫剂量为103TCID50，高剂量组免疫剂量为105TCID50。一免后3周以同种方式加强免疫。二免后2周，102.5HAD中国流行毒株(ASFV/CN/HLJ/18)攻毒。同时，设立同群对照，每组各1只，低剂量组哨兵猪耳号为765，高剂量组哨兵猪耳号为774。二免后10日，采集血液样本，分离PBMC进行ELISPOT检测。攻毒后持续观察临床症状，并于5、10、15、21天分别采集血液样本，进行HAD检测。攻毒9天和21天后对非免疫组实施安乐死并剖检。攻毒21天后对免疫组存活猪实施安乐死并剖检，滴定组织脏器HAD，观察组织病变。
实验结果如下：
1、ELISPOT试验结果：
二次免疫后10天分离PBMC进行ELISPOT试验，分别统计每只猪产生斑点总数，统计结果如图8所示。耳号为813、815、819实验猪样本产生斑点总数较少，不足100个斑点/5×105淋巴细胞。而耳号为814和816实验猪样本产生斑点总数较多，多达400个斑点/5×105淋巴细胞以上。
2、临床症状观察
攻毒对照组765和774精神轻度沉郁，便血严重，分别于攻毒后第8和6死亡。免疫组大部分猪体温正常并存活，仅有低剂量组815，攻毒后第5天开始体温升高(＞41℃)，精神沉郁，臀部潮红，皮肤表面大面积淤血斑，维持高温至第11天死亡，生存曲线如图9所示。免疫组大部分猪体温正常，体温曲线如图10所示。个别猪体温一过性升高(816和824)。高剂量组819体温升高(＞41℃)，精神沉郁，臀部潮红，皮肤表面大面积淤血斑。可见，ELSIPOT检测细胞免疫水平较低猪只(ELISPOT＜100spots)，或攻毒后死亡(815)，或临床症状严重(819)，提示预后不良。
3、病毒血症分析
ASFV病毒血症是分析非洲猪瘟疫苗免疫保护的重要指标之一。分别在攻毒后5、10、15、21天采集血液样本，收集血清，进行HAD检测，检测结果如图11所示。血液HAD检测结果显示,耳号为815和819试验猪病毒血症最为严重，攻毒10日HAD检测值可高达7以上。可见，ELSIPOT检测细胞免疫水平较低猪只大都或攻毒后死亡(815)，或持续产生长时间的病毒血症(813、819、817、824、831)，提示预后不良。ELSIPOT检测细胞免疫水平较高猪只大都未发生病毒血症(814)，或轻微一过性病毒血症(821)，提示预后良好。只有816号猪例外。可见，应用本研究筛选得到的T细胞表位多肽建立ELISPOT方法，可有效检测细胞免疫反应，其结果与血液HAD检测结果高度相关。
4、ELISPOT检测与血液HAD相关性分析
如图12所示，ELISPOT检测结果与血液HAD值呈现负相关性。为评价ELISPOT检测提示预后作用，ELISPOT检测结果分别与血液HAD进行线性关系分析。血液HAD值在攻毒后10日达到最大值，以攻毒后10日血液HAD值与ELISPOT检测结果进行线性分析，结果如图13所示。ELISPOT检测结果与血液HAD值具有良好的线性关系，ELISPOT检测结果可提示预后。ELSIPOT检测细胞免疫水平较低猪只大都或攻毒后死亡(815)，或产生较严重病毒血症，且持续时间较长(817、819、824、831)，提示预后不良。ELSIPOT检测细胞免疫水平较高猪只大都未发生病毒血症(814)，或较轻微病毒血症，且呈一过性(821)，提示预后良好。可见，应用所筛选细胞免疫优势抗原多肽建立ELISPOT方法，可有效检测细胞免疫反应，与HAD检测结果高度相关。
因此，本发明筛选出ASFV四种重要结构蛋白p30、p54、p72以及CD2v细胞免疫优势抗原表位13个，本发明显示ASFV候选疫苗免疫猪的细胞免疫水平(ELISPOT斑点数)与攻毒后的猪病毒血症控制高度相关，对免疫猪攻毒后的生存和预后具有重要提示作用。该13个优势抗原表位可有效诱导免疫猪分离淋巴细胞产生IFNγ，可成为多肽载体疫苗的候选免疫原，为ASFV亚单位疫苗研发提供基础，为后续疫苗研发与评价体系的建立提供技术平台。
序列表
<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)
<120>非洲猪瘟病毒T细胞抗原多肽及其抗原表位筛选的ELISPOT检测方法
<160>13
<210>1
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<400> 1
DFNKVIRAHN FIQTI 15
<210>2
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
IRAHNFIQTI HGTPL 15
<210>3
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<400>3
HGTPLKEEEK EVVRL 15
<210>4
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<400>4
KEEEKEVVRL MVIKL 15
<210>5
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<400>5
TFPRNGYDWD NQTPL 15
<210>6
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<400>6
GYDWDNQTPL EGAVY 15
<210>7
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<400>7
WFIPGVINEI SLTNN 15
<210>7
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<400>7
CGGCA GTATT ATTTT GTG 18
<210>8
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<400>8
VINEISLTNN ELYIN 15
<210>9
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<400>9
YIPFHYGGNA IKTPD 15
<210>10
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<400>10
YGGNAIKTPD DPGAM 15
<210>11
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<400>11
SRAREFYISW DTDYV 15
<210>12
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<400>12
MDSEFFQPVY PRHYG 15
<210>13
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<400>13
YSRYQYNTPI YYMRP 15

Claims (9)

1.ASFV细胞免疫优势抗原多肽，其选自下述氨基酸序列所示的多肽，或在其两端增加1、2、3、4、5个氨基酸：IRAHNFIQTI、KEEEKEVVRL、GYDWDNQTPL、VINEISLTNN、YGGNAIKTPD、SRAREFYISWDTDYV、MDSEFFQPVYPRHYG、YSRYQYNTPIYYMRP。
2.如权利要求1所述的ASFV细胞免疫优势抗原多肽，其特征在于，所述两端增加1、2、3、4、5个氨基酸是指与该抗原表位在ASFV的相应蛋白的氨基酸序列对应的氨基酸。
3.如权利要求2所述ASFV细胞免疫优势抗原多肽，其特征在于，其选自下述多肽：
p30-32：DFNKVIRAHNFIQTI；
p30-33：IRAHNFIQTIHGTPL；
p30-35：HGTPLKEEEKEVVRL；
p30-36：KEEEKEVVRLMVIKL；
p72-28：TFPRNGYDWDNQTPL；
p72-29：GYDWDNQTPLEGAVY；
p72-80：WFIPGVINEISLTNN；
p72-81：VINEISLTNNELYIN；
p72-113：YIPFHYGGNAIKTPD；
p72-114：YGGNAIKTPDDPGAM；
p72-121：SRAREFYISWDTDYV；
p54-1：MDSEFFQPVYPRHYG；
CD2v-56：YSRYQYNTPIYYMRP。
4.如权利要求1至3任一项所述的ASFV细胞免疫优势抗原多肽在制备ASFV表位载体疫苗中的应用。
5.如权利要求1至3任一项所述的ASFV细胞免疫优势抗原多肽在ASFV候选疫苗的效力评价中的应用。
6.一种ASFV候选疫苗的效力评价用试剂盒，其包括如权利要求1至3任一项所述的ASFV细胞免疫优势抗原多肽。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括96孔ELISPOT板，用于承载细胞和后续显色。
8.如权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，还包括针对猪γ干扰素不同抗原区的一对单克隆抗体，其中一种抗体未标记，用以包被ELISPOT板捕获细胞分泌的γ干扰素；另一种单抗为生物素标记，用以检测捕获的γ干扰素。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括辣根过氧化物酶标记的链亲和素，用以结合生物素标记的单抗，和AEC显色底物，用于斑点显色。
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