CN113512095A

CN113512095A - 抗非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体、制备方法及B细胞表位筛选和鉴定

Info

Publication number: CN113512095A
Application number: CN202110913118.3A
Authority: CN
Inventors: 张改平; 王爱萍; 有小娟; 姜文静; 陈玉梅; 丁培阳; 刘红亮; 王海丽; 周景明; 祁艳华; 刘燕凯; 梁超; 朱习芳; 马红芳
Original assignee: Henan Zhongze Biological Engineering Co ltd; Zhengzhou University
Current assignee: Henan Zhongze Biological Engineering Co ltd; Zhengzhou University
Priority date: 2021-08-10
Filing date: 2021-08-10
Publication date: 2021-10-19
Anticipated expiration: 2041-08-10
Also published as: CN113512095B

Abstract

本发明公开了一种抗非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体、制备方法及B细胞表位筛选和鉴定，属于基因工程技术领域，本发明设计并构建能够稳定表达ASFV p30蛋白的H22细胞株和HEK293T细胞株，以稳定表达p30蛋白H22细胞作为免疫原免疫小鼠，利用细胞融合技术，以稳定表达p30蛋白HEK293T细胞作为检测原，通过免疫过氧化物酶单层细胞试验，筛选得到抗ASFV p30蛋白的单克隆细胞株10D7，该细胞株产生的单克隆抗体可特异性识别并结合p30蛋白上的¹⁷¹YGTPLKEEEK¹⁸⁰至¹⁷⁶KEEEKEVVRL¹⁸⁵序列区域，有助于了解抗原‑抗体之间的相互作用，对ASFV的检测和诊断具有重要意义。

Description

抗非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体、制备方法及B细胞表位筛选和鉴定

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种抗非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体、制备方法及B细胞表位筛选和鉴定。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus,ASFV)引起的一种以高热、多脏器出血肿大为典型特征的，致死性极高的接触性传染性疾病，该病对动物健康、食品安全、国民经济和环境构成严重的威胁。ASFV是一种大型核质病毒，该病毒的基因组由170-190kb的双链DNA组成，两端为可变区，中间有125kb左右的保守区，左端长约35kb，右端长约15kb。这些串联的重复序列通过共价键将双链DNA联结在一起。该病毒的基因组含有151-167个开放阅读框(Open Reading Frames,ORFs)。ASFV是一种复杂的多层二十面体状病毒粒子，使用质谱技术鉴定到68种不同的蛋白成分和与病毒相关的21种宿主细胞蛋白。

在组成ASFV的结构蛋白中，p30是重要的抗原结构蛋白之一，并在病毒感染宿主细胞的早期表达，它是由CP204L基因编码的相对分子量为30kDa的蛋白。p30是最重要的抗原结构蛋白之一，参与ASFV进入细胞，并阻碍宿主细胞的转录和翻译。一般在病毒感染后2h至4h左右可以观察到p30蛋白的表达，然后持续存在于整个感染周期中。因此，该蛋白的表达表明病毒已经感染宿主细胞，且已开始病毒早期蛋白的表达。因p30具有高度的免疫原性，所以常被作为ASF诊断和监测的血清学候选蛋白。因此，开发p30蛋白特异性单克隆抗体，并进一步筛选p30蛋白抗原表位，对深入研究p30蛋白生物学功能具有重要意义，也将有助于开发针对ASFV的检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体、制备方法及B细胞表位筛选和鉴定，以解决上述现有技术存在的问题，该单克隆抗体能够特异性识别非洲猪瘟病毒p30蛋白上的¹⁷¹YGTPLKEEEK¹⁸⁰至¹⁷⁶KEEEKEVVRL¹⁸⁵序列区域，这是首次报道的B细胞表位。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种非洲猪瘟病毒p30蛋白的抗原表位，该抗原表位位于p30蛋白的171-180和176-185位上，其氨基酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

本发明还提供如上述的抗原表位在制备非洲猪瘟病毒p30蛋白的单克隆抗体中的应用。

本发明还提供与上述的非洲猪瘟病毒p30蛋白的抗原表位特异性结合的抗非洲猪瘟病毒p30蛋白的单克隆抗体。

进一步地，该单克隆抗体的重链可变区的CDR-H1为SEQ ID No.3所示的氨基酸序列，CDR-H2为SEQ ID No.4所示的的氨基酸序列，CDR-H3为SEQ ID No.5所示的氨基酸序列；以及

该单克隆抗体的轻链可变区的CDR-L1为SEQ ID No.6所示的氨基酸序列，CDR-L2为SEQ ID No.7所示的氨基酸序列，CDR-L3为SEQ ID No.8所示的氨基酸序列。

进一步地，该单克隆抗体的重链可变区为SEQ ID No.9所示的氨基酸序列。

进一步地，该单克隆抗体的轻链可变区为SEQ ID No.10所示的氨基酸序列。

制备该单克隆抗体的免疫原是通过脂质体转染方法，利用pLVX-IRES-ZsGreen1-p30、psPAX-2和pMD2.G三质粒共同包装假病毒颗粒，并将获得的假病毒颗粒转导H22细胞，获得能够稳定表达ASFV p30蛋白的H22细胞株；

制备该单克隆抗体的检测原是是通过脂质体转染方法，利用pTRIP-CMV-Puro-p30、psPAX-2和pMD2.G三质粒包装假病毒颗粒，并将获得的假病毒颗粒转导HEK293T细胞，获得能够稳定表达ASFV p30蛋白的HEK293T细胞株；

然后以稳定表达ASFV p30蛋白的H22细胞株作为免疫原免疫小鼠，利用细胞融合技术，以稳定表达ASFV p30蛋白的HEK293T细胞株作为检测原，通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(Immunoperoxidase monolayer assay,IPMA)，筛选得到该单克隆抗体，并命名为10D7。

本发明还提供一种编码上述的抗非洲猪瘟病毒p30蛋白的单克隆抗体的核酸，编码该单克隆抗体的重链可变区的核酸如SEQ ID No.11所示，编码该单克隆抗体的轻链可变区的核酸如SEQ ID No.12所示。

本发明还提供包含上述的核酸的表达载体，其能够在宿主细胞中表达所述核酸。

本发明还提供包含上述的表达载体的宿主细胞。

本发明还提供一种上述的抗非洲猪瘟病毒p30蛋白的单克隆抗体、上述的核酸、上述的表达载体或上述的宿主细胞在制备抑制或者中和非洲猪瘟病毒p30蛋白的药物中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明提供的抗非洲猪瘟病毒p30蛋白的单克隆抗体，是基于设计并构建能够稳定表达ASFV p30蛋白的H22细胞株和HEK293T细胞株。以稳定表达ASFV p30蛋白的H22细胞株作为免疫原免疫小鼠，利用细胞融合技术，以稳定表达ASFV p30蛋白的HEK293T细胞株作为检测原，通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(Immunoperoxidase monolayer assay,IPMA)，筛选得到了抗ASFV p30蛋白的单克隆细胞株10D7，该细胞株产生的单克隆抗体可特异性识别并结合p30蛋白的¹⁷¹YGTPLKEEEK¹⁸⁰至¹⁷⁶KEEEKEVVRL¹⁸⁵区域，这是首次报道的B细胞表位。

本发明将稳定表达p30蛋白的H22细胞株作为免疫原免疫小鼠，以稳定表达p30蛋白的HEK293T作为检测原，结果显示获得的单克隆抗体效价可达1:6400，证明可以用活细胞载体免疫动物并产生抗体，可同时用于ELISA、IPMA等多种免疫学检测手段，具有良好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为p30目的基因的PCR；

图2为重组载体pLVX-IRES-ZsGreen1-p30的鉴定；

图3为重组载体pTRIP-CMV-Puro-p30的鉴定；

图4为稳定表达ASFV p30蛋白的H22细胞株的筛选；

其中，(a)亚克隆后的H22细胞团荧光；(b)亚克隆后的H22细胞团白光图；

图5为稳定表达ASFV p30蛋白的HEK293T细胞株的筛选；

图6为Western Blot验证p30蛋白在H22细胞的表达；

其中，M为蛋白Marker；H22-pLVX为无重组质粒的H22细胞；H22-pLVX-p30为含有重组质粒pLVX-IRES-ZsGreen1-p30的H22细胞；

图7为Western Blot验证p30蛋白在HEK293T细胞的表达；

其中，M为蛋白Marker；pTRIP-HEK293T为无重组质粒的HEK293T细胞；pTRIP-p30-HEK293T为含有重组质粒pTRIP-CMV-Puro-p30的HEK293T细胞；

图8为IFA检测稳定表达ASFV p30的HEK293T细胞株；

其中，(a)一抗为ASFV阳性猪血清1:1000；(b)一抗为ASFV阳性猪血清1:2000；(c)无重组质粒的HEK293T细胞(阴性对照)；

图9为多抗血清效价图；

其中，(1)一抗为1号小鼠血清1:6400；(2)一抗为2号小鼠血清1:1600；(3)未免疫的小鼠血清；

图10为IPMA检测1D6、1E9、2E7、10D7和9C7杂交瘤细胞株上清；

其中，PC为小鼠阳性多抗血清；NC为未免疫的小鼠血清；BC为空白对照；

图11为1D6，1E9，2E7，9C7和10D7杂交瘤细胞株上清的Western Blot检测；

图12为偶联多肽和阳性血清反应性的Peptide-ELISA检测结果；

图13为Peptide-ELISA检测p30 mAbs与偶联多肽的反应性；

图14为截短多肽和p30 mAbs反应性的Peptide-ELISA检测结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1免疫原和检测原的选择和制备

目前报道关于ASFV p30的定位还不清楚，而p30蛋白是产生在病毒感染的早期，参与病毒的内化，并阻碍宿主细胞的转录和翻译；有研究报道，用杆状病毒表达的p30蛋白免疫猪，结果发现，试验猪免疫后能刺激机体产生中和抗体，对非洲猪瘟的感染起到一定的免疫保护效果，但是有的研究报道抗p30抗体不具有中和保护性，并且不能抵抗强毒株的攻击，因此，p30是否具有中和保护性，这一点目前还存在争议。所以，本发明对进一步开展ASFV p30的工作具有很大的意义。

H22细胞来源于Balb/c小鼠，因此小鼠只能产生抗p30蛋白的抗体，而不产生针对细胞的抗体，这就为用表达细胞作为抗原直接免疫Balb/c小鼠制备抗ASFV p30 mAb奠定了基础。

将ASFV p30基因转染到HEK293T细胞内，由于慢病毒载体能够将外源基因整合到细胞DNA基因组中，因此HEK293T细胞能够稳定表达p30蛋白。外源基因在真核细胞中表达的优点是其蛋白空间构象与天然蛋白相近，保持抗原结构的完整性。

因此，本发明设计并构建能够稳定表达ASFV p30蛋白的H22细胞株作为免疫原，以稳定表达p30蛋白的HEK293T作为检测原。具体的，免疫原和检测原的制备包括如下步骤：

1.引物设计

根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)已发表的ASFV China/2018/AnhuiXCGQ株的CP204L基因序列信息，使用Primer 5.0软件设计p30基因引物，选择Xba I和BamHI两个酶切位点(划线部分)，添加保护性碱基(斜体部分)，合成ASFV China2018AnhuiXCGQ-p30基因，引物序列如表1所示：

表1引物序列表

2.p30基因的PCR扩增

以合成的p30基因序列为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系如下：

表2 PCR扩增体系

3.纯化回收PCR产物

扩增完成之后，用1％的核酸凝胶对产物进行电泳鉴定，结果如图1所示。最后利用DNA纯化回收试剂盒选择和目的条带位置相近条带的PCR产物进行纯化回收。使用NanoDrop 2000c测定回收的DNA溶液浓度，-20℃保存备用。

4.目的基因和载体的双酶切

(1)将p30基因/pLVX-IRES-ZsGreen1载体/pTRIP-CMV-Puro载体进行双酶切，酶切反应体系如下表3所示：

表3双酶切反应体系

(2)各组分混匀后放置于37℃恒温仪上过夜酶切。

5.酶切产物的回收

使用胶回收试剂盒回收酶切产物，吸取离心管中2μL的溶液测回收DNA的浓度，并存放于-20℃备用。

6.重组质粒的构建

(1)p30基因与pLVX-IRES-ZsGreen1/pTRIP-CMV-Puro载体连接

在EP管中加入下列组分：

表4连接体系

将离心管中的上述溶液混匀后，置于16℃连接仪中进行过夜连接。

(2)转化

吸取5μL连接产物加入100μL DH5α感受态细胞中，加入900μL无抗性LB液体培养基，37℃，220r/min震荡培养50min；培养完成后，将离心管溶液以4000r/min转速室温离心4min，弃去上清，用100μL液体LB培养基重悬菌体沉淀；将上述重悬液均匀涂布在含有氨苄抗性的LB固体培养基上，在室温平放培养20min后，再倒置于37℃恒温培养箱中过夜培养。

(3)菌液PCR筛选阳性克隆

挑取圆滑的单个菌落，并将其接种在含有氨苄抗性的LB液体培养基中，之后37℃，220r/min培养6h，将菌液12000r/min室温离心2min，弃去上清，沉淀用适量1×PBS重悬；将重悬液在最大转速下(约12000r/min)离心2min，吸取上清液作为菌液PCR的模板。

按照下列组分加入EP管中：

表5菌液PCR反应体系

将上述反应组分混匀后，置于PCR仪中进行PCR扩增。菌液PCR结束后将产物用1％的核酸凝胶进行鉴定，结果如图2所示，加样孔4显示明亮单一的目的条带；如图3所示，加样孔3显示出与预期大小相近的目的条带。选择条带大小与ASFV p30目的基因相符的单克隆菌株送至尚亚生物公司测序。

(4)重组质粒的获取

选取测序成功的阳性菌株，在含氨苄抗性的液体LB培养基中，37℃，220r/min培养过夜。用Plasmid Miniprep Plus Purification Kit试剂盒，按试剂盒说明书操作步骤提取pLVX-IRES-ZsGreen1-p30/pTRIP-CMV-Puro-p30重组质粒。

7.稳定表达p30蛋白的H22/HEK293T细胞株的构建

(1)H22/HEK293T细胞的复苏

吸取9mL RPMI-1640/DMEM完全培养基到无菌离心管中；取出H22/HEK293T细胞，立即将其转移到37℃恒温水浴锅中，不时轻柔晃动冻存管；把冻存管中的细胞转移至备好的含有9mL RPMI-1640/DMEM完全培养基的无菌离心管中；将离心管1000r/min室温离心9min，弃掉上清；吸取6mL RPMI-1640/DMEM完全培养基重悬细胞，混匀后转移到细胞培养瓶中，放入CO₂细胞培养箱，37℃环境下培养；培养大约17h后，在倒置荧光显微镜下观察细胞生长状态，当细胞密度达到已铺满细胞瓶底的75％左右时可进行细胞传代，吸取新的6mL RPMI-1640完全培养基用电动移液器将H22细胞轻轻吹打下来进行传代培养；而HEK293T则需要先将培养基弃掉，用4mL无菌1×PBS轻轻冲洗两遍后，加500μL胰酶细胞消化液室温消化2min，最后加5mL DMEM完全培养基终止胰酶的消化，用电动移液器将细胞轻轻吹打下来进行传代培养。

(2)重组慢病毒的包装

在转染前24h，将HEK293T细胞按照1×10⁶个细胞量接种于多聚赖氨酸处理过的6孔板，补加DMEM完全培养基至2mL，放入CO₂细胞培养箱，37℃环境下培养；24h后观察细胞生长状态和密度，在密度达到孔底80％左右时换成Opti-MEM完全培养基，两个小时后开始转染；参考Lipofectamine 2000脂质体转染试剂盒说明书，进行转染；转染10h后，弃去转染复合物，并换成Opti-MEM完全培养基，放置于37℃、5％CO2细胞培养箱中继续培养36-48h后，用倒置荧光显微镜观察细胞生长状态，待80％及以上细胞破裂脱落时收取培养基上清即慢病毒悬液，12000r/min，4℃离心15min后备用。

(3)慢病毒转导靶细胞

转导前一天，将复苏并传代培养的H22/HEK293T细胞按照1×10⁴个细胞的量分别接种于96孔细胞培养板；次日，观察细胞状态，选取状态好的细胞各20个孔，弃掉培养基后进行转导；将pLVX-IRES-ZsGreen1-p30/pTRIP-CMV-Puro-p30慢病毒悬液按照100μL/孔，分别加入含有H22/HEK293T细胞的96孔细胞培养板中。

(4)无重组质粒转导H22/HEK293T细胞

按照(2)和(3)相同的方法转染之后并转导H22/HEK293T细胞。

(5)慢病毒转导H22细胞的筛选

将pLVX-IRES-ZsGreen1-p30慢病毒悬液转导24h后，再补加100μL/孔的RPMI-1640完全培养基，继续培养24h后在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况；挑选绿色荧光蛋白表达较多，荧光强度较亮的细胞孔，进行扩大培养。将混匀后的细胞悬液通过无菌尼龙网过滤，装载到BD FACS Aria III仪器上以绿色荧光筛选细胞，然后将绿色荧光蛋白阳性细胞分选并收集在96孔细胞培养板中(含有200μL/孔的RPMI-1640完全培养基)，每孔2个细胞，37℃培养；将获得的绿色荧光蛋白阳性单克隆细胞团吹散之后，通过有限稀释法，根据计数结果用RPMI-1640完全培养基稀释细胞，分别在96孔细胞培养板的1-6列和7-12列加入稀释度为20个细胞/mL和10个细胞/mL的细胞悬液，按照每孔100μL的体积加到96孔细胞培养板中，将亚克隆的细胞放入37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养，连续进行两次亚克隆，直到筛选出单个且绿色荧光蛋白阳性率接近100％的细胞团，将得到的阳性克隆细胞命名为pLVX-IRES-ZsGreen1-p30-H22，结果如图4所示，pLVX-IRES-ZsGreen1-p30-H22细胞株的绿色荧光蛋白阳性率约为94.9％，证实了绿色荧光蛋白表达的稳定性。

(6)慢病毒转导HEK293T细胞的筛选

pTRIP-CMV-Puro-p30慢病毒悬液转导24h后，将96孔板慢病毒悬液弃掉，在DMEM完全培养基中分别加入不同量的嘌呤霉素至终浓度为2、4、8、16、32、64μg/mL，放入CO₂细胞培养箱，37℃环境下培养大约6-8天；每天在倒置荧光显微镜下观察含有不同浓度嘌呤霉素的细胞生长状态，大约筛选6-8天。筛选期间换液或传代后添加新的含有嘌呤霉素DMEM的完全培养基；1周后阴性细胞呈圆形或悬浮状态而阳性细胞呈贴壁状态，将贴壁细胞扩大培养传代后进行亚克隆；直到筛选出在含有嘌呤霉素的DMEM完全培养基条件下，细胞依旧贴壁且可以稳定传代的细胞团，将得到的阳性克隆细胞命名为pTRIP-CMV-Puro-p30-HEK293T，结果如图5所示，阴性细胞呈圆形或悬浮状态，而阳性细胞呈贴壁状态。

8.靶细胞的裂解

将扩大的pTRIP-CMV-Puro-p30-HEK293T/pTRIP-CMV-Puro-HEK293T细胞弃掉培养基后，先用2mL无菌1×PBS轻轻冲洗两遍，在细胞培养瓶中加1mL胰酶细胞消化液，置室温消化2min，最后加5mL DMEM完全培养基终止胰酶的消化，用电动移液器轻轻将其吹散至单个细胞，细胞计数后转移到无菌离心管中；将扩大培养的pLVX-IRES-ZsGreen1-p30-H22/pLVX-IRES-ZsGreen1-H22细胞直接用电动移液器轻轻将其吹散至单个细胞，细胞计数后转移到无菌离心管中，1100r/min离心9min，弃掉上清，收集细胞沉淀；取1mL的1×PBS将收集的细胞充分重悬，重悬液在4℃条件下12000r/min离心10min，收集上清，并去除细胞碎片；在加RIPA裂解液前，提前加入终浓度为1mmoL/mL的苯甲基磺酰氟，按照每1×10⁶个细胞加入100μL的RIPA裂解液，充分混匀裂解液和细胞混合物后，将裂解液和细胞混合物在冰上静止裂解5-10min，最后在4℃条件下12000r/min离心15min，并收集上清；取收集的上清每管40μL分装到离心管中，加入10μL 5×Loading Buffer，之后放入水浴锅中煮沸5min，12000r/min离心1min，通过Western Blot试验来分析p30蛋白的表达效果，结果如图6和图7所示，泳道H22-pLVX-p30/pTRIP-p30-HEK293T显示出单一的目的条带，证明本发明获得的重组p30蛋白具有良好的免疫反应性。

9.间接免疫荧光试验

在进行间接免疫荧光试验的前一天，将筛选到的pTRIP-CMV-Puro-p30-HEK293T细胞按照每孔1×10⁴个细胞的量接种于96孔细胞培养板中；铺细胞的第二天观察96孔细胞培养板密度，待每孔密度达到80％左右时，将孔里的培养基用移液枪轻轻弃掉，加入100μL/孔多聚甲醛溶液固定细胞，室温放置15min后将固定液弃去，用1×PBS洗3次，加入100μL/孔0.1％的曲拉通X-100，室温放置10min后弃去，最后用1×PBS洗3次；将非洲猪瘟病毒阳性猪血清用5％脱脂奶进行1:2000稀释后，以100μL/孔加到96孔细胞培养板，置于37℃恒温箱中孵育1h，然后用PBST洗涤5次；用5％脱脂奶将异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate,FITC)标记的羊抗猪IgG进行1:500稀释后，以100μL/孔加到96孔细胞培养板，置于37℃恒温箱中孵育1h，然后用PBST洗涤5次；每孔加入100μL 1×PBS，用倒置荧光显微镜观察结果，如图8所示，pTRIP-CMV-Puro和pTRIP-CMV-Puro-p30分别稳定转导靶细胞HEK293T后，pTRIP-p30-HEK293T(pTRIP-CMV-Puro-p30-HEK293T)因含有目的基因可以识别并结合一抗(ASFV阳性猪血清)，因此在倒置荧光显微镜下可以观察到绿色荧光，而pTRIP-HEK293T(pTRIP-CMV-Puro-HEK293T)因不含目的基因无法表达目的蛋白而识别一抗，故不能观察到绿色荧光。

实施例2单克隆抗体的制备

1.动物免疫

取6～8周龄雌性Balb/c小鼠2只。以1×10⁵个细胞的数量免疫500μL，将表达p30蛋白的H22细胞(已处理)对小鼠进行腹腔免疫，腹腔注射4次，每次免疫间隔3周。第三次免疫1周后对小鼠尾部进行采血，分离血清并检测效价，以未免疫小鼠作为阴性对照。

2.IFA测定小鼠血清的效价

分别对三免一周后小鼠的多抗血清进行效价的测定，如图9所示，1号小鼠的多抗血清效价可达1:6400，2号小鼠的血清效价可达1:1600。

3.饲养细胞的制备

将发育良好的昆明鼠引颈处死，用大头针将小鼠固定在解剖盘上；吸取预冷的100mL HAT培养基转移至无菌平皿中；从无菌平皿中吸取约15mL的HAT选择培养基，缓慢地将HAT选择培养基注入小鼠腹腔；之后用注射器抽出注入小鼠腹腔内的HAT选择培养基，转移至之前备好的装有HAT选择培养基的无菌平皿中并混匀；混匀的细胞悬液均匀滴加至96孔细胞培养板中，放入37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。

4.脾细胞的制备

取超免后的实验鼠进行眼眶采血，收集在EP管中，收集血清为后续筛选单克隆抗体的阳性对照做备用；小鼠脱颈处死，腹部朝上固定于解剖板上；将预热的GNK溶液取3-6mL润湿无菌且固定在50mL烧杯上的200目尼龙网；小心取出脾脏，并放在200目无菌尼龙网上用剪刀研磨，加GNK洗液冲洗研磨物，使脾脏单细胞通过网格滤入烧杯中；将烧杯中脾细胞重悬液转移至50mL无菌离心管中，放入离心机离心10min，1000r/min；弃去上层GNK洗液，加入20mL GNK溶液充分重悬细胞，吹打混匀后并计数。

5.细胞融合

挑选圆亮且处于对数生长期的SP2/0细胞，吸取适量RPMI-1640完全培养基将半贴壁的SP2/0细胞吹下来混匀，再转移到50mL无菌离心管中，放入离心机离心10min，1000r/min；弃去上层培养基，将预热的GNK取20mL重悬细胞团并进行细胞计数，将脾细胞和SP2/0细胞按5:1-10:1的比例进行混合，放入离心机离心10min，1000r/min；弃去上清，将细胞混合物放于37℃水浴中，滴加1mL的PEG 1500融合剂，然后37℃水浴条件下静置90s；吸取15mL的GNK洗液来将融合反应终止，然后转移到37℃水浴环境中稳定5min，再补加GNK洗液到总体积为40mL，1000r/min离心10min；弃上清，加120mL已预热的HAT选择培养基，重悬并混匀细胞；将融合细胞悬液100μL/孔分散到铺有饲养细胞的96孔细胞培养板，放入CO₂细胞培养箱37℃条件下培养。

6.杂交瘤细胞阳性孔的筛选

细胞融合后的第5天，将预热的HAT选择培养基60μL/孔补加在融合的板中；融合后的第8天左右，观察细胞团生长状态，对杂交瘤细胞团的孔用HAT选择培养基进行半数换液；换液后的第2-3天，待孔内杂交瘤细胞密度长至孔底40％以上，吸取杂交瘤细胞团的培养液作为一抗，以融合前采集的眼球血清作为阳性对照，未免疫的小鼠血清做阴性对照，用IPMA方法筛选阳性克隆。

7.阳性杂交瘤细胞的亚克隆

第一次进行亚克隆，提前一天进行饲养细胞的制备，并将HAT培养基换为HT培养基；无菌条件下将需要进行亚克隆的细胞轻轻吹打混匀，并与适当浓度的台盼蓝混合后，准确计数活细胞；根据细胞计数的结果，通过有限稀释法，用HT培养基作为稀释液，在铺有饲养细胞的培养板中加入稀释的细胞悬液，按照每孔100μL的体积加到铺有饲养层细胞的96孔细胞培养板中，将亚克隆的细胞平放于37℃、5％CO₂培养箱中使其贴壁生长；培养大约7-8天左右，对首次亚克隆的细胞在倒置荧光显微镜下进行观察，挑选只有1个细胞团的孔进行阳性筛选；对阳性杂交瘤细胞团进行24孔扩大培养，并持续亚克隆2-3次，逐步将HT培养基更换为RPMI-1640完全培养基，直至获得的单克隆杂交瘤细胞株可以稳定分泌所需抗体，结果如图10所示，两次亚克隆后，以pTRIP-CMV-Puro-p30-HEK293T细胞为检测原，通过IPMA方法检测杂交瘤细胞株1D6、1E9、2E7、10D7和9C7的细胞上清均可以与稳定表达p30蛋白的HEK293T细胞发生反应。

8.阳性杂交瘤细胞的Western Blot验证

以pTRIP-CMV-Puro-p30-HEK293T/pTRIP-CMV-Puro-p30-HEK293T作为SDS-PAGE的样品，将一抗稀释液替换成阳性杂交瘤细胞上清1:100稀释液，如图11所示，泳道pTRIP-HEK293T为无重组质粒的HEK293T细胞，泳道pTRIP-p30-HEK293T为含有目的基因的重组质粒。Western Blot结果显示1D6，1E9，2E7，10D7和9C7单克隆抗体与细胞裂解上清液反应强烈，而不与pTRIP-CMV-Puro-HEK293T裂解细胞上清液反应，表明这些单克隆抗体可以识别p30蛋白的线性表位。

9.杂交瘤细胞的扩大培养与冻存

经鉴定得到的阳性杂交瘤细胞扩大培养转移至24孔细胞培养板中，待观察到细胞数量约80％时即可冻存。

吸取5mL的RPMI-1640完全培养基将扩大培养后的阳性杂交瘤细胞吹打下来，并转移至无菌离心管中，1000r/min室温离心10min，弃掉上清；取1mL细胞冻存液加入离心管中重悬细胞，充分混匀后将细胞悬液转移至2mL冻存管中，在冻存管壁上标注冻存细胞名称、日期等信息，按照4℃静置15-25min，-20℃静置2h，-80℃冰箱静置24h的顺序进行梯度降温后转移至液氮中长期保存。

10.多克隆抗体可变区基因与序列

本发明的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别为SEQ IDNo.9、SEQ ID No.10所示,其核酸序列分别为SEQ ID No.11、SEQ ID No.12所示。进一步分析得到单克隆抗体重链可变区CDR的氨基酸序列分别为GFSLFNNG、IWRGGAT、AKNGIITTGRTYARAMDY(SEQ ID No.3-5)；单克隆抗体的轻链可变区CDR的氨基酸序列分别为QSVDYDGDSY、AAS、QQSDEDPWT(SEQ ID No.6-8)；

其中，

SEQ ID No.9：

SGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLFNNGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWRGGATGYNAPFMSRLSITKDNSKSQVFFKMNSLHPDDAAIYYCAKNGIITTGRTYARAMDYWGQGTTVTISS；

SEQ ID No.10：

SDMVLMLLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYFCQQSDEDPWTFGWRHQSGNQTGGCCTNCIHLPTIQKAW；

SEQ ID No.11：

tcaggacctggcctagtgcagccctcacagagcctgtccataacctgcacagtctctggtttctcattatttaacaatggtgtacactgggttcgccagtctccaggaaagggtctggagtggctgggagtgatttggagaggtggagccacaggctacaatgcacctttcatgtccagactgagcatcaccaaggacaactccaagagccaagttttctttaaaatgaacagtctgcatcctgatgacgctgccatatactactgtgccaaaaatggaatcattacgacgggacgcacctatgctagggctatggactactggggccaagggaccacggtcacgatctcctca；

SEQ ID No.12：

tcggacatggtcctcatgttgctgctgctatgggttccaggctccactggtgacattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctctagggcagagggccaccatctcctgcaaggccagccaaagtgttgattatgatggtgatagttatatgaactggtaccaacagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctatgctgcatccaatctagaatctgggatccccgccaggtttagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctatttctgtcaacaaagtgatgaggatccgtggacgttcggctggaggcaccaatctggaaatcaaacgggcggatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagaaagcttgg。

实施例3单克隆抗体识别抗原表位的鉴定

1.序列同源比对

从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中获得ASFV p30蛋白的序列(Accession:AYW34064.1)，利用MegAlign分析工具对序列进行比对分析。

2.多肽合成

序列比对并分析后，根据NCBI中获得ASFV p30蛋白的序列，根据表6将和p30蛋白优势克隆序列或同源性高的克隆序列送至吉尔生物公司进行多肽的合成，并鉴定。

表6 p30蛋白全长氨基酸序列截短合成方案

3.多肽的偶联

采用戊二醛法将合成的多肽与牛血清白蛋白(BSA)偶联，最后将获得的合成产物分装保存在-80℃超低温冰箱。

4.Peptide-ELISA检测

以偶联多肽作为包被原，用Peptide-ELISA法测定偶联多肽与ASFV阳性猪血清、ASFV p30阳性小鼠血清和筛选的ASFV p30单克隆抗体反应性。

结果如图12所示，多肽P2、P5、P6、P10和P12能与ASFV p30阳性小鼠血清发生反应；而多肽P2、P5、P6、P10、P12和P13与ASFV阳性猪血清发生反应。多肽P2、P5、P6、P10、P12和P13是p30蛋白的免疫显性优势区域肽段。

将与BSA偶联的多肽包被于酶标板，用筛选出的抗p30单克隆抗体上清与多肽进行Peptide-ELISA检测，结果如图13所示，P2、P5和P6可被9C7 mAb识别，P6可被2E7 mAb识别，P12可被10D7 mAb识别。

5.ASFV p30蛋白B细胞表位氨基酸序列的进一步定位

(1)肽段截短合成方案

根据表位初步定位的结果，对鉴定出的阳性合成肽进一步截短合成，P6进一步截短为P6-1、P6-2、P6-3，P12进一步截短为P12-1、P12-2、P12-3，截短方案如表7所示。

表7截短多肽的氨基酸残基序列

(2)截短多肽与BSA偶联

将合成的截断多肽与BSA偶联。

(3)截短多肽与单抗的ELISA检测

通过Peptide-ELISA法用偶联成功的多肽进行鉴定。如图14，结果显示10D7 mAb识别P12-2和P12-3两段多肽，将其表位定位在¹⁷¹YGTPLKEEEK¹⁸⁰(SEQ ID No.1)至¹⁷⁶KEEEKEVVRL¹⁸⁵(SEQ ID No.2)区域，这是首次报道的B细胞表位。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 郑州大学

河南中泽生物工程有限公司

<120> 抗非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体、制备方法及B细胞表位筛选和鉴定

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Tyr Gly Thr Pro Leu Lys Glu Glu Glu Lys

1 5 10

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Lys Glu Glu Glu Lys Glu Val Val Arg Leu

1 5 10

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gly Phe Ser Leu Phe Asn Asn Gly

1 5

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ile Trp Arg Gly Gly Ala Thr

1 5

<210> 5

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ala Lys Asn Gly Ile Ile Thr Thr Gly Arg Thr Tyr Ala Arg Ala Met

1 5 10 15

Asp Tyr

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Ala Ala Ser

1

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gln Gln Ser Asp Glu Asp Pro Trp Thr

1 5

<210> 9

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys

1 5 10 15

Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Phe Asn Asn Gly Val His Trp Val Arg

20 25 30

Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Arg Gly

35 40 45

Gly Ala Thr Gly Tyr Asn Ala Pro Phe Met Ser Arg Leu Ser Ile Thr

50 55 60

Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu His

65 70 75 80

Pro Asp Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys Asn Gly Ile Ile Thr

85 90 95

Thr Gly Arg Thr Tyr Ala Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Ile Ser Ser

115

<210> 10

<211> 146

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Ser Asp Met Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr

1 5 10 15

Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu

20 25 30

Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr

35 40 45

Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro

50 55 60

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro

65 70 75 80

Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile

85 90 95

His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser

100 105 110

Asp Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Trp Arg His Gln Ser Gly Asn Gln

115 120 125

Thr Gly Gly Cys Cys Thr Asn Cys Ile His Leu Pro Thr Ile Gln Lys

130 135 140

Ala Trp

145

<210> 11

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tcaggacctg gcctagtgca gccctcacag agcctgtcca taacctgcac agtctctggt 60

ttctcattat ttaacaatgg tgtacactgg gttcgccagt ctccaggaaa gggtctggag 120

tggctgggag tgatttggag aggtggagcc acaggctaca atgcaccttt catgtccaga 180

ctgagcatca ccaaggacaa ctccaagagc caagttttct ttaaaatgaa cagtctgcat 240

cctgatgacg ctgccatata ctactgtgcc aaaaatggaa tcattacgac gggacgcacc 300

tatgctaggg ctatggacta ctggggccaa gggaccacgg tcacgatctc ctca 354

<210> 12

<211> 438

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tcggacatgg tcctcatgtt gctgctgcta tgggttccag gctccactgg tgacattgtg 60

ctgacccaat ctccagcttc tttggctgtg tctctagggc agagggccac catctcctgc 120

aaggccagcc aaagtgttga ttatgatggt gatagttata tgaactggta ccaacagaaa 180

ccaggacagc cacccaaact cctcatctat gctgcatcca atctagaatc tgggatcccc 240

gccaggttta gtggcagtgg gtctgggaca gacttcaccc tcaacatcca tcctgtggag 300

gaggaggatg ctgcaaccta tttctgtcaa caaagtgatg aggatccgtg gacgttcggc 360

tggaggcacc aatctggaaa tcaaacgggc ggatgctgca ccaactgtat ccatcttccc 420

accatccaga aagcttgg 438

Claims

1.一种非洲猪瘟病毒p30蛋白的抗原表位，其特征在于，该抗原表位位于p30蛋白的171-180和176-185位上，其氨基酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

2.如权利要求1所述的抗原表位在制备非洲猪瘟病毒p30蛋白的单克隆抗体中的应用。

3.与权利要求1所述的非洲猪瘟病毒p30蛋白的抗原表位特异性结合的抗非洲猪瘟病毒p30蛋白的单克隆抗体。

4.如权利要求3所述的抗非洲猪瘟病毒p30蛋白的单克隆抗体，其特征在于，该单克隆抗体的重链可变区的CDR-H1为SEQ ID No.3所示的氨基酸序列，CDR-H2为SEQ ID No.4所示的的氨基酸序列，CDR-H3为SEQ ID No.5所示的氨基酸序列；以及

该单克隆抗体的轻链可变区的CDR-L1为SEQ ID No.6所示的氨基酸序列，CDR-L2为SEQID No.7所示的氨基酸序列，CDR-L3为SEQ ID No.8所示的氨基酸序列。

5.如权利要求4所述的抗非洲猪瘟病毒p30蛋白的单克隆抗体，其特征在于，该单克隆抗体的重链可变区为SEQ ID No.9所示的氨基酸序列。

6.如权利要求4所述的抗非洲猪瘟病毒p30蛋白的单克隆抗体，其特征在于，该单克隆抗体的轻链可变区为SEQ ID No.10所示的氨基酸序列。

7.一种编码权利要求3-6任一项所述的抗非洲猪瘟病毒p30蛋白的单克隆抗体的核酸，其特征在于，编码该单克隆抗体的重链可变区的核酸如SEQ ID No.11所示，编码该单克隆抗体的轻链可变区的核酸如SEQ ID No.12所示。

8.包含权利要求7所述的核酸的表达载体，其能够在宿主细胞中表达所述核酸。

9.包含权利要求8所述的表达载体的宿主细胞。

10.一种权利要求3-6任一项所述的抗非洲猪瘟病毒p30蛋白的单克隆抗体、权利要求7所述的核酸、权利要求8所述的表达载体或权利要求9所述的宿主细胞在制备抑制或者中和非洲猪瘟病毒p30蛋白的药物中的应用。