CN109295006B - 分泌口蹄疫病毒非结构蛋白单克隆抗体3a10的杂交瘤细胞系及其应用 - Google Patents

分泌口蹄疫病毒非结构蛋白单克隆抗体3a10的杂交瘤细胞系及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了分泌口蹄疫病毒非结构蛋白单克隆抗体3A10的杂交瘤细胞系及其应用。本发明用口蹄疫非结构蛋白为抗原免疫鼠通过细胞融合技术筛选最终筛选获得一株微生物保藏编号为CGMCC NO.16213的稳定分泌口蹄疫病毒非结构蛋白单抗的杂交瘤细胞系，其分泌的单抗广谱性好、保守性高、亲和力强，与血清竞争性强，可作为阻断ELISA检测方法中的检测抗体准确区分口蹄疫自然感染动物与免疫接种动物。本发明还提供了采用该单抗为检测抗体建立的阻断ELISA检测试剂盒，采用该一种该检测试剂盒即可检测任何动物种属的血清，跨越了种间屏障，具有可靠性高、应用性宽、广谱性好、检测更为快捷方便等优点。

Description

分泌口蹄疫病毒非结构蛋白单克隆抗体3A10的杂交瘤细胞系 及其应用
技术领域
本发明涉及口蹄疫病毒单克隆抗体以及分泌该口蹄疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系，本发明尤其涉及口蹄疫病毒非结构蛋白单克隆抗体3A10以及分泌口蹄疫病毒非结构蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系及其应用，本发明进一步涉及它们在区分口蹄疫自然感染动物与免疫接种动物中的应用，属于口蹄疫病毒非结构蛋白单克隆抗体及其应用领域。
背景技术
口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的，主要侵害牛、猪、羊等家畜及多种野生偶蹄动物的高度接触性传染病，人也可以感染。该病引起幼畜死亡、产奶量下降、肉食减少、肉品下降、动物的生产性能降低，而且具有极强的传染性，可形成大范围流行，造成巨大的经济损失。口蹄疫病毒属于微RNA病毒科口蹄疫病毒属的成员，为单股正链RNA，其基因组RNA全长约8.5kb。根据免疫原性，口蹄疫病毒有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asial共7个血清型及65个以上的亚型，各血清型之间无交叉免疫保护。目前，中国主要流行O型和A型FMD。
预防和控制口蹄疫的关键是高效疫苗的应用以及准确的诊断方法。传统灭活疫苗的免疫接种是预防和控制口蹄疫的最有效手段，由于现有的检测方法不能准确区分口蹄疫自然感染动物与免疫接种动物，导致口蹄疫不能得到有效的控制。
现有技术用于检测口蹄疫病毒的单克隆抗体均不同程度的存在以下几方面的缺陷：
(1)单克隆抗体所针对的表位没有进行鉴定，不能确定单抗广谱性的程度：现有的单抗所针对的表位序列及其关键氨基酸或重要氨基酸等情况均不清楚，如果关键氨基酸和重要氨基酸在毒株间有变异，其广谱性的程度就会改变，不能确保其对口蹄疫毒株的广谱性，相应的缺乏真正的应用价值；
(2)单克隆抗体广谱性差：单抗针对的抗原表位保守性较差，导致其与口蹄疫的一些毒株不发生反应；
(3)单克隆抗体的竞争性差：有些单抗与口蹄疫感染血清的竞争能力不好，导致不能建立有效的阻断ELISA检测试剂盒。没有竞争性或者竞争性较差的单克隆抗体只适合用于包被ELISA板来捕获FMDV 3ABC抗原，然后只能加待检猪、牛或者羊血清中的一种，最后用HRP标记抗猪、牛或者羊的IgG抗体。用这种没有竞争性或者竞争性较差的单克隆抗体建立的口蹄疫鉴别诊断方法术士繁琐，更严重的是不能跨越动物种间屏障，不能在一个反应体系中检测任何动物种属的血清。
由于现有的用于检测口蹄疫病毒的单克隆抗体不同程度的存在上述缺陷，导致这些单抗均不能建立有效的阻断ELISA术式，用这些单抗所建立的ELISA检测试剂盒，除了存在检测敏感性低、广谱性(即针对表位的保守性)差外，更为严重的是，每检测一种动物就需要建立一种检测试剂盒，缺乏实际的应用价值。因此，研制一种广谱性好、保守性高、亲和力强的口蹄疫病毒非结构蛋白单克隆抗体并对其表位进行精确鉴定，这对于建立准确区分口蹄疫自然感染动物与免疫接种动物的阻断ELISA检测试剂盒等具有重要意义。
发明内容
本发明的目的之一是提供一株高效、稳定分泌口蹄疫病毒非结构蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系；
本发明的目的之二是提供由所述杂交瘤细胞系分泌的抗口蹄疫病毒非结构蛋白单克隆抗体，其广谱性好、保守性高、亲和力强；
本发明的目的之三是精确鉴定口蹄疫病毒非结构蛋白单克隆抗体所识别的抗原表位；
本发明的之四是应用所述的抗口蹄疫病毒非结构蛋白单克隆抗体作为检测抗体构建阻断ELISA检测试剂盒，应用该阻断ELISA检测试剂盒准确区分口蹄疫自然感染动物与免疫接种动物。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明用真核系统表达的口蹄疫非结构蛋白免疫BALB/c鼠，取脾细胞与SP2/0细胞融合，将获得的杂交瘤细胞用间接ELISA和IFA方法检测培养上清中的FMDV NSP抗体获得抗体阳性杂交瘤细胞，抗体阳性杂交瘤细胞经3次有限稀释法亚克隆，最终筛选获得5株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，分别命名为4B7、7G9、3A3、3A10和2H1。本发明进一步将杂交瘤细胞4B7、7G9、3A3、3A10、2H1的杂交瘤培养上清分别与感染A、O和Asia1型FMDV的BHK-21细胞进行间接免疫荧光检测；检测结果显示，仅杂交瘤细胞3A10以及2H1所分泌的单抗能够与A、O、Asia1型毒株均呈阳性反应，杂交瘤细胞4B7、7G9和3A3所分泌的单抗仅与部分FMDV毒株的感染细胞发生特异性反应；免疫荧光检测结果表明，杂交瘤细胞3A10以及2H1分泌的单抗具有广谱性，杂交瘤细胞4B7、7G9以及3A3所分泌的单抗不具有广谱性。
本发明进一步测定了阳性杂交瘤细胞4B7、7G9、3A3、3A10和2H1所分泌单克隆抗体的亲和力；亲和力测定结果显示，单抗4B7、7G9、3A3、3A10和2H1的相对亲和力常数分别为2.0mol/L、2.5mol/L、1.0mol/L、3.5mol/L和3.5mol/L，根据测定结果可见，单抗3A10以及2H1的亲和力显著高于单抗4B7、7G9以及3A3的亲和力。
根据间接免疫荧光检测和亲和力测定试验结果可见，在所筛选到的所有的阳性杂交瘤细胞中，仅杂交瘤细胞系3A10以及2H1所分泌的单抗具有广谱性，其余的阳性杂交瘤细胞所分泌的单抗均不具有广谱性；此外，单抗3A10以及2H1在亲和力这一性能上也显著高于单抗4B7、7G9、3A3的亲和力；综可可见，杂交瘤细胞系3A10以及2H1所分泌的单克隆抗体在广谱性、保守性、亲和力等性能上远远优于其它的杂交瘤细胞系；可将其作为作为阻断ELISA方法中的检测抗体用于区分或鉴别口蹄疫自然感染动物与免疫接种动物。
本发明将稳定分泌口蹄疫病毒非结构蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系3A10提交到专利认可的机构进行保藏，其保藏编号是：CGMCC No.16213；保藏时间是：2018年8月1日；分类命名是：分泌口蹄疫病毒非结构蛋白单克隆抗体3A10的杂交瘤细胞系；保藏单位是：中国普通微生物菌种保藏管理中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明将稳定分泌口蹄疫病毒非结构蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系2H1提交到专利认可的机构进行保藏，其保藏编号是：CGMCC No.16212；保藏时间是：2018年8月1日；分类命名是：分泌口蹄疫病毒非结构蛋白单克隆抗体2H1的杂交瘤细胞系；保藏单位是：中国普通微生物菌种保藏管理中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
为了检验杂交瘤细胞系3A10所分泌的单抗在口蹄疫病毒非结构蛋白抗体检测方法中的应用价值，本发明用单抗2H1作为包被抗体、HRP标记的单抗3A10作为检测抗体建立一种阻断ELISA检测方法，用以检验3A10在FMD免疫抗体与自然感染抗体鉴别诊断方法中的应用效果。检测结果表明，单抗3A10作为检测抗体所建立的阻断ELISA检测方法能够准确区分口蹄疫自然感染动物与免疫接种动物。因此，本发明提供杂交瘤细胞系3A10以及所分泌的单抗能用于FMDV非结构蛋白抗体的阻断ELISA检测试剂盒中的检测抗体。
由此，本发明提供了一种用于区分口蹄疫自然感染动物与免疫接种动物的阻断ELISA检测试剂盒，包括：ELISA检测板、口蹄疫病毒抗原、口蹄疫病毒非结构蛋白包捕获抗体、标记物标记的口蹄疫病毒非结构蛋白检测抗体、口蹄疫病毒阳性对照血清、阴性对照血清和终止液；其中，所述的检测抗体是杂交瘤细胞系3A10所分泌的单克隆抗体；所述的抗原可以是FMDV的非结构蛋白，譬如FMDV 3AB蛋白。所述的标记物可以是酶、荧光标记物、磷光标记物、冷光标记物或放射性标记物中的任何一种；优选的，所述的标记物是酶，优先的，所述的酶可以是辣根过氧化物酶(HRP)、过氧化氢酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶中的任何一种；所述的口蹄疫病毒非结构蛋白包被获抗体优选是单克隆抗体2H1。
进一步的，所述阻断ELISA检测试剂盒中还可包含：血清稀释液、洗液以及底物溶液；所述血清稀释液可以为含0.05％吐温(V/V)和0.5％BSA(牛血清白蛋白)(mg/ml)的PBS溶液，所述PBS溶液的pH为7.4；所述洗液为PBST溶液；所述底物溶液可以为3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液；所述终止液为2M H2SO4。
本发明进一步提供了应用所述FMDV单克隆抗体3A10识别的口蹄疫病毒非结构蛋白的线性表位：
本发明采用截短表达方法研究表明，7ERTLP11(在FMDV 3A具体位置为34KPLKVK39)为单抗3A10识别表位的最小反应活性单元，即为单抗3A10识别的3A抗原表位的基序。
为进一步了解单抗3A10识别表位中各个氨基酸残基在与单抗结合过程中所起的作用，本发明以3A10表位基序126ERTLP130为基础，用丙氨酸(A)从N端至C端进行逐个氨基酸替换，126ERTLP130作为阳性对照、GST空载体作为阴性对照。经SDS-PAGE与Western blot分析显示，3A10所识别表位的氨基酸序列中，Arg127和Leu129为关键氨基酸，其余残基的替换对表位活性无影响。
为验证3A10所识别表位的保守性，本发明选取GenBank收录的274条FMDV的3A氨基酸序列进行比对，以其中21条FMDV的3A氨基酸序列为代表，比对分析结果显示，3A10识别表位的氨基酸序列在7种血清型FMDV毒株之间有较高的保守性。在序列比对中发现，该表位氨基酸序列中有突变的是Glu126、Thr128和Pro130，但其为该表位的非必需氨基酸，突变后对表位活性不会产生影响；而Arg127和Leu129作为本发明鉴定的3A10表位的关键氨基酸，这两个氨基酸残基在已发表毒株的该表位氨基酸序列中有较高的保守性；上述这些结果表明，3A10表位是针对FMDV 7个血清型毒株的一个保守的线性表位。
在鉴定了单抗3A10所识别的表位基序126ERTLP130后，本发明进一步将表位126ERTLP130的每个氨基酸进行定点诱变得到多个突变体，通过试验确定该抗原表位以及突变体能否用作检测口蹄疫病毒感染血清中病毒非结构蛋白抗体的标志性诊断抗原：
为确定该表位126ERTLP130及其突变体能否作为诊断抗原来检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体(口蹄疫感染血清)，本发明将3A10识别的FMDV 3A表位的氨基酸序列126ERTLP130进行定点诱变，即：E126突变为Ala(A)；R127突变为Ala(A)；T128突变为Ala(A)；L129突变为Ala(A)；P130突变为Ala(A)。以GST融合的方式表达，分别命名为126A、127A、128A、129A和130A。然后，将这些GST融合的表位肽作为抗原分别包被ELISA板，同时，设立GST空载体作为对照，检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体(口蹄疫感染血清)和阴性血清，以检测单抗3A10识别的FMDV表位的氨基酸序列126ERTLP130及其突变体与口蹄疫病毒非结构蛋白抗体(口蹄疫感染血清)的反应能力，由此评价3A10识别的FMDV表位的氨基酸序列126ERTLP130在口蹄疫诊断中的价值；检测结果表明：单抗3A10识别的FMDV表位肽及其表位突变肽126A、128A和130A与口蹄疫病毒非结构蛋白抗体(口蹄疫感染血清)呈现良好的反应能力；表位突变肽127A和129A与口蹄疫病毒非结构蛋白抗体(口蹄疫感染血清)以及FMDV阴性血清均没有反应；这些检测结果说明，与3A10识别表位鉴定过程中发现的氨基酸残基Arg127和Leu129是该表位活性的关键氨基酸，而其余残基替换对该表位的活性无影响的结果相一致；由此，本发明确定了单抗3A10识别的FMDV表位的氨基酸序列126ERTLP130及其系列表位突变肽对于建立口蹄疫病毒非结构蛋白抗体诊断方法的价值和应用潜力。
由此，本发明进一步的提供了由抗FMDV单克隆抗体3A10所识别口蹄疫病毒非结构蛋白的线性表位肽，其氨基酸序列为：X1RX2LX3(SQE ID NO.1)，其中，X1、X2或X3为任何一种氨基酸残基，优选的，所述X1为谷氨酸(E)或丙氨酸(A)；所述X2为苏氨酸(T)或丙氨酸(A)；所述X3为脯氨酸(P)或丙氨酸(A)；优选的，所述抗FMDV单克隆抗体3A10所识别口蹄疫病毒非结构蛋白的线性表位肽为ERTLP(SQE ID NO.2)。
编码所述线性表位肽的基因也属于本发明的保护范畴之内。
本发明还进一步提供了一种口蹄疫抗体检测ELISA试剂盒，包括：ELISA检测板、口蹄疫病毒包被抗原、标记物标记的抗体、口蹄疫病毒感染血清、免疫血清、口蹄疫病毒阴性血清、稀释液、洗涤液、底物液和显色液；其中，所述的口蹄疫病毒包被抗原是抗FMDV单克隆抗体3A10所识别的口蹄疫病毒非结构蛋白的线性表位肽；所述的标记物可以是酶、荧光标记物、磷光标记物、冷光标记物或放射性标记物中的任何一种；优选的，所述的标记物是酶，所述的酶可以是辣根过氧化物酶(HRP)、过氧化氢酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶中的任何一种；所述的抗体可以是羊抗牛IgG抗体；所述的底物液可以是OPD。
本发明更进一步的提供了应用所述FMDV单克隆抗体2H1识别的口蹄疫病毒非结构蛋白的线性表位：
本发明采用截短表达方法研究表明，单抗2H1识别口蹄疫病毒非结构蛋白3B-4肽段，8KPLKVK13(在FMDV 3B具体位置为34KPLKVK39)为单抗2H1识别表位的最小反应活性单元，即为单抗2H1识别的3B抗原表位的基序。
为进一步了解单抗2H1识别表位中各个氨基酸残基在与单抗结合过程中所起的作用，本发明以2H1表位基序34KPLKVK39为基础，用丙氨酸(A)从N端至C端进行逐个氨基酸替换，经SDS-PAGE与Western blot分析显示，在2H1所识别表位的氨基酸序列中，Lys34、Lys37和Val38为关键氨基酸，其余残基的替换对表位活性无影响。
为验证2H1所识别表位的保守性，本发明选取GenBank收录的274条FMDV3B蛋白的氨基酸序列进行比对，对其中12条FMDV 3B的氨基酸序列进行比对分析；对比分析结果显示，2H1所识别的表位的氨基酸序列在A、O、Asia1、C四种血清型FMDV毒株之间是高度保守的。从序列比对可见，有氨基酸突变发生在Leu36和Lys39，分别突变为Pro36和Arg39，但其为该表位的非必需氨基酸，突变后对表位活性不会产生影响；而Lys34、Lys37和Val38作为本试验鉴定的2H1表位的关键氨基酸，在已发表毒株的3B氨基酸序列中是高度保守的；这些结果表明，单抗2H1所识别的表位是针对FMDV四种血清型毒株的一个高度保守的线性表位。
在鉴定了单抗2H1所识别的3B表位基序34KPLKVK39后，本发明进一步将表位34KPLKVK39的每个氨基酸进行定点诱变得到多个突变体，通过试验确定该抗原表位以及突变体能否用作检测口蹄疫病毒感染血清中病毒非结构蛋白抗体的标志性诊断抗原：
本发明分别将2H1识别的FMDV 3B表位34KPLKVK39的每个氨基酸进行定点诱变，分别突变为Ala(A)，以GST融合的方式表达为突变的表位肽，分别命名为34A、35A、36A、37A、38A和39A。然后，将这些GST融合的表位肽作为抗原分别包被ELISA板，同时设立GST空载体对照，检测含有口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的口蹄疫感染血清以及阴性血清，用以检测单抗2H1识别表位序列34KPLKVK39及其突变体与口蹄疫病毒非结构蛋白抗体(口蹄疫感染血清)的反应能力，由此评价2H1识别的FMDV 3B表位肽34KPLKVK39在口蹄疫鉴别诊断中的价值；试验结果表明：单抗2H1识别的FMDV 3B表位肽及其突变体35A、36A和39A与口蹄疫病毒非结构蛋白抗体(口蹄疫感染血清)呈现良好的反应能力，表位突变肽34A、37A和38A与口蹄疫病毒非结构蛋白抗体(口蹄疫感染血清)以及FMDV阴性血清均没有反应。这些检测结果表明，与2H1识别表位鉴定过程中发现的氨基酸残基Lys34、Lys37和Val38是该表位活性的关键氨基酸、而其余残基替换对该表位的活性无影响的结果相一致，由此确定了单抗2H1识别的FMDV 3B表位34KPLKVK39及其一系列表位突变肽对于建立口蹄疫病毒非结构蛋白抗体鉴别诊断方法的价值和应用潜力。
因此，本发明提供了由抗FMDV单克隆抗体2H1所识别口蹄疫病毒非结构蛋白的线性表位肽，其氨基酸序列为：KX1X2KVX3(SQE ID NO.3)，其中，X1、X2或X3为任何一种氨基酸残基，优选的，所述X1为脯氨酸(P)或丙氨酸(A)；所述X2为亮氨酸(L)或丙氨酸(A)；所述X3为赖氨酸(K)或丙氨酸(A)；最优选的，所述抗FMDV单克隆抗体2H1所识别口蹄疫病毒非结构蛋白的线性表位肽为：KPLKVK(SQE ID NO.4)。
编码所述线性表位肽的基因也属于本发明的保护范畴之内。
本发明所提供的线性表位肽及其突变体可作为诊断标志物用于检测口蹄疫自然感染动物与免疫接种动物，譬如，可将该线性表位肽作为包被抗原构建ELISA检测试剂盒用于检测口蹄疫自然感染动物与免疫接种动物。相应的，本发明还提供了一种口蹄疫抗体检测ELISA试剂盒，包括：ELISA检测板、口蹄疫病毒包被抗原、标记物标记的抗体、口蹄疫病毒感染血清、免疫血清、口蹄疫病毒阴性血清、稀释液、洗涤液、底物液和显色液；其中，所述的口蹄疫病毒包被抗原是抗FMDV单克隆抗体2H1所识别的口蹄疫病毒非结构蛋白的线性表位肽；所述的标记物可以是酶、荧光标记物、磷光标记物、冷光标记物或放射性标记物中的任何一种；优选的，所述的标记物是酶，所述的酶可以是辣根过氧化物酶(HRP)、过氧化氢酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶中的任何一种；所述的抗体可以是羊抗牛IgG抗体；所述的底物液可以是OPD。
本发明所述的线性表位肽可通过人工合成(例如多肽的固相合成方法)或者通过基因工程的方法进行制备；其中所述的基因工程方法可以是将线性表位肽的编码基因和表达载体可操作的连接后转化到宿主细胞中诱导表达，收集所表达的蛋白并进行纯化即可得到所述的表位肽。
所述的表达载体可以是原核表达载体或真核表达载体；所述的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，例如所述原核细胞可以是大肠杆菌；所述的真核细胞可以是酵母细胞、动物细胞或昆虫细胞等，优选为大肠杆菌或毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。
本发明也可进一步对编码所述线性表位肽的基因进行适当的修饰或优化，以提高其在宿主细胞中的表达量或表达效率，这些修饰或优化方法是本领域所属技术人员所熟练掌握。
现有的口蹄疫单抗所针对的口蹄疫抗原均表位没有进行精确鉴定，单抗针对的表位没有鉴定，表位序列及其关键氨基酸和重要氨基酸均不清楚，如果关键氨基酸和重要氨基酸在毒株间有变异，广谱性的程度就会改变或者不能确保其具有广谱性，导致单抗包括竞争性、广谱性等一些重要的性能均不能确定，用这样的单抗建立的检测方法的术式不是竞争ELISA，不仅可靠性差，检测不同种动物就需要建立相应的不同试剂盒，在实践中缺乏真正的应用价值。
本发明筛选获得的2株杂交瘤细胞系所分泌的单抗2H1以及3A10具有广谱性好、保守性高、亲和力强等优点；此外，单抗2H1以及3A10所针对的抗原表位已被精确鉴定，二者所针对的表位被定位在3ABC不同的部位，其中，单抗2H1识别的表位定位于3B蛋白，是针对FMDV四种血清型毒株的一个高度保守的线性表位；单抗3A10识别的表位定位于3A蛋白，是针对FMDV七种血清型毒株的一个高度保守的线性表位，二者空间相距较远，不会产生空间位阻效应，能分别作为检测抗体和包被抗体同时用于一个阻断ELISA检测试剂盒中，不仅能够准确区分口蹄疫自然感染动物与免疫接种动物，还能跨越种间屏障，用一种检测试剂盒就能检测任何动物种属的血清，具有可靠性高、应用性宽、检测更为快捷方便等优点。
附图说明
图1 IFA检测单抗3A10、2H1、4B7、7G9、3A3与A型、O型、Asia1型FMDV毒株的反应结果。
图2单抗3A10、4B7、7G9以及3A3的相对亲和力常数的测定结果。
图3单抗2H1、4B7、7G9以及3A3的相对亲和力常数的测定结果。
图4利用口蹄疫非结构蛋白抗体3A10建立的ELISA检测方法检测口蹄疫感染和免疫接种的猪、牛、羊血清以及口蹄疫阴性猪、牛、羊血清的检测结果。
图5单抗3A10识别表位的蛋白定位。
图6截短肽GST融合蛋白的SDS-PAGE(a)和Western blot分析(b)。
图7丙氨酸扫描突变合成肽的SDS-PAGE(a)和Western blot分析(b)。
图8 3A10表位肽氨基酸序列的保守性分析。
图9 GST融合表达的系列表位突变肽与口蹄疫感染和免疫的猪、牛、羊血清以及口蹄疫阴性血清的免疫反应性结果。
图10原核表达3A和3B蛋白间接ELISA结果。
图11 3B合成肽间接ELISA结果。
图12截短肽GST融合蛋白的SDS-PAGE(a)和Western blot分析(b)。
图13丙氨酸扫描突变合成肽的SDS-PAGE(a)和Western blot分析(b)。
图14 2H1表位肽氨基酸序列的保守性分析。
图15 GST融合表达的系列表位突变肽与口蹄疫病毒感染和疫苗免疫的猪、牛、羊血清以及口蹄疫阴性血清的免疫反应性结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1口蹄疫病毒非结构蛋白单克隆抗体3A10的筛选及鉴定
1.试验材料
1.1病毒、细胞、菌株和实验动物
用IFA对单抗进行特异性分析所用毒株包括：A FMDV A/KT/58(GenBankaccession number:AJ131665),A/XJBC/CHA/2010,O FMDV O/Tibet/CHA/99(AJ539138),O/GD/86(AJ131468)，Asia1 FMDV Asia1/YS/CHA/05(GU931682)(Wang et al.,2011)。乳仓鼠肾细胞BHK-21、SP2/0骨髓瘤细胞为本发明人实验室保存；清洁级雌性BALB/c小鼠购于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。A型、O和Asia1型FMDV感染和免疫血清由新疆天康生物有限公司惠赠。杆状病毒表达FMDV 3ABC蛋白，原核系统表达FMDV 3AB蛋白由本实验室保存。MAb 2H1由本发明人实验室保存。
1.2主要试剂
融合剂PEG/DMSO(Mw,1450)、HAT盐(50x)、HT盐(50x)、HRP或FITC标记的羊抗鼠IgG、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；单克隆抗体亚类鉴定试剂盒购自Southern Biotech公司；L-谷氨酰胺(glutamine)、甘氨酸购自Amresco公司；二甲基亚砜(DMSO)、邻苯二胺(OPD)、PEG6000购自Solarbio公司；高糖DMEM干粉购自GIBCO公司；进口优级胎牛血清(PAA)购自西班牙Nalgene公司；96孔细胞培养板购自加拿大JET Biochemical公司。
2.试验方法
2.1鼠免疫与单克隆抗体的制备
(1)以杆病毒表达的FMDV 3ABC抗原100μg/只与等量法国206佐剂混合，皮下途径接种6周龄雌性BALB/c小鼠，两周后肌肉途径第二次免疫，再经两周腹腔途径第三次免疫。两周后断尾采血，用间接ELISA检测抗体效价，对效价达到1:6400以上的小鼠，经腹腔加强免疫无佐剂双倍剂量的抗原，3日后取小鼠脾细胞进行融合。
(2)细胞融合
a)饲养层细胞的制备：细胞融合前一天进行饲养层细胞的制备，眼科剪刀、眼科镊子、平皿等试验用具用前高温干热灭菌，HAT完全培养液做无菌检验。取2只BALB/c小鼠摘除眼球放血，按常规方法分离阴性血清。拉颈脱臼处死小鼠，将其浸泡于75％酒精中，10min后移入超净工作台。将小鼠腹部向上固定在鼠架上，用镊子提起腹正中部皮肤，眼科剪刀横向剪一小口，切勿剪破腹膜，用剪刀和镊子上下撕开皮肤，充分暴露腹膜。用镊子轻轻提起腹膜，将10mL注射器内吸取的8-10mL HAT完全培养液注入腹腔，切勿刺破脏器和肠道，注射器不要拔出，在腹腔内来回抽吸5-10次，然后用镊子按摩两侧腹部30秒左右，再进行抽吸，重复以上操作2-3次。用注射器回吸腹腔内液体。注意避开肠系膜及脂肪组织，以免堵塞针头。将从2只鼠中取出的腹腔细胞加入55mL HAT培养液中，吹散混匀细胞，以100μL/孔分装于6块96孔培养板，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
b)骨髓瘤细胞的制备：融合前36-48h，将骨髓瘤细胞扩大培养，使细胞处于对数生长期。融合当天，用15mL DMEM基础培养液将细胞从瓶壁上吹下，收集于50mL离心管,1000rpm离心10min。将细胞沉淀重悬置20mL DMEM基础培养液中，混匀。取少量骨髓瘤细胞悬液，台盼兰染色计数，备用。
c)免疫脾细胞的制备：融合前摘除小鼠眼球采血，制备阳性血清。将小鼠拉颈脱臼致死，浸泡于75％酒精中，10min后放于超净台。无菌打开腹腔，分离结缔组织并取出脾脏，将脾脏放入装有灭菌尼龙网和盛有15mLDMEM基础培养液的平皿中，用灭菌玻璃注射器内芯研磨脾脏，使脾细胞全部通过网孔进入平皿中。将脾细胞溶液转入50mL离心管中，加DMEM基础培养液大约至30mL，混匀，1000rpm离心8min，弃上清。将细胞沉淀悬于10mL DMEM基础培养液中，混匀。取细胞悬液，台盼兰染色计数，备用。
d)脾细胞与骨髓瘤细胞融合：取65mLHAT培养液，15mL基础DMEM培养液和1mL50％PEG于37℃水浴中预热，另备200mL烧杯盛有37℃的水。按5份脾细胞数加1份骨髓瘤细胞数取相应细胞悬液量，加入50mL玻璃离心管中，补加DMEM基础培养液至30mL，混匀。1 000rpm离心10min，弃上清，尽可能倒干。用手掌轻击离心管底部，使沉淀细胞松散均匀呈糊状。将离心管放入盛有37℃水的200mL烧杯中，一手均匀转动离心管，另一手用1mL巴氏吸管吸取37℃50％PEG溶液1mL，1min内加完，静置2min。随后先慢后快地加入DMEM基础培养液终止反应，37℃水浴静置10min。1000rpm离心10min，弃上清，加入65mLHAT培养基，轻轻地吹散细胞，每孔0.1mL接种于已培养有饲养细胞的6块96孔培养板，置37℃、5％的CO2培养箱中培养。5d后半量换液，8d后全换液，待克隆长至孔底面积1/4-1/3时取上清进行检测并换HT培养液。
2.2.抗体检测ELISA试验
用原核表达的FMDV 3AB抗原包被96孔板，加入100uL杂交瘤细胞培养上清，37℃温育1h后洗涤，加入1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗，洗涤后加入底物TMB避光显色10min，于波长450nm测定吸光值。
2.3.间接免疫荧光检测试验
将单抗3A10、2H1、4B7、7G9、3A3的杂交瘤培养上清分别与感染A、O和Asia1型FMDV的BHK-21细胞进行间接免疫荧光检测，具体方法如下：
96孔板微孔板培养BHK-21细胞至单层，接种口蹄疫病毒4×103TCID50/孔，出现CPE之前用冷无水乙醇进行固定，加入50uL杂交瘤细胞培养上清，37℃温育40min后PBS洗涤三次，加入1:200稀释的FITC标记羊抗鼠IgG抗体，37℃温育40min，洗涤后在倒置荧光显微镜下观察荧光强度。
2.4单抗亲和力常数测定试验
单抗4B7、7G9、3A3、2H1和3A10分别与包被抗原3ABC结合后，用不同浓度的硫氰酸盐溶液进行洗脱，测定亲和力常数。
3.试验结果
3.1筛选获得稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞以及所分泌单抗的亚类鉴定
真核表达的NSP免疫小鼠，取脾细胞与SP2/0细胞融合，获得的杂交瘤细胞用间接ELISA和IFA方法检测培养上清中的FMDV NSP抗体，阳性判定标准为：以杂交瘤细胞培养上清对3AB抗原的OD450光吸收值与正常BALB/c小鼠血清、SP2/0细胞培养上清对3AB抗原OD450值之比均大于2.1，且杂交瘤细胞上清与正常BHK-21细胞不产生荧光反应，判为阳性。抗体阳性杂交瘤细胞经3次有限稀释法亚克隆，获得5株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，分别命名为4B7、7G9、3A3、2H1和3A10。
免疫球蛋白亚类鉴定显示，单抗4B7重链类型为IgG2，轻链为κ类型。单抗7G9重链类型为IgG1，轻链为κ类型。单抗3A3重链类型为IgG1，轻链为κ类型。单抗3A10重链类型为IgG1，轻链为κ类型。单抗2H1重链类型为IgG1，轻链为κ类型。
3.2单抗的广谱性测定结果
间接免疫荧光检测结果显示，3A10以及2H1与A、O、Asia1型毒株均呈阳性反应，表明单抗3A10以及2H1具有广谱性，而单抗4B7、7G9和3A3仅与部分FMDV毒株的感染细胞发生特异性反应，说明单抗4B7、7G9和3A3不具有广谱性(图1)。
3.3单抗的亲和力测定结果
亲和力结果显示，单抗4B7、7G9、3A3、2H1和3A10的相对亲和力常数分别为2.0mol/L、2.5mol/L、1.0mol/L、3.5mol/L和3.5mol/L(图2和图3)，显示3A10以及2H1的亲和力显著高于其它单抗。
本发明将稳定分泌口蹄疫病毒非结构蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系3A10提交到专利认可的机构进行保藏，其保藏编号是：CGMCC No.16213。
实施例2口蹄疫病毒抗体阻断ELISA检测试剂盒的组装
口蹄疫病毒抗体检测阻断ELISA试剂盒，包括：辣根过氧化物酶标记的单克隆检测抗体、包被口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的ELISA板、包被抗体、口蹄疫病毒抗原、口蹄疫病毒阳性对照血清、口蹄疫病毒阴性对照血清、血清稀释液、洗液、底物溶液和终止液。
所述辣根过氧化物酶标记的口蹄疫病毒检测单克隆抗体：由保藏编号为CCTCCNO：16213的细胞株分泌，然后经纯化制得；
所述包被抗体由保藏编号为CCTCC NO：16212的细胞株分泌，然后经纯化制得；
阳性对照血清：口蹄疫病毒灭活疫苗免疫后的猪和牛血清；
阴性对照血清：SPF鸡血清；
血清稀释液：含0.05％(V/V)吐温和0.5％BSA(mg/ml)的PBS(pH7.4)溶液；
洗液：PBST溶液；
底物溶液：TMB底物溶液；
终止液：2M H2SO4。
实施例3口蹄疫抗体检测ELISA试剂盒的组装
口蹄疫抗体检测ELISA试剂盒，包括：ELISA检测板、口蹄疫病毒包被抗原、酶标记的抗体、口蹄疫病毒感染血清、免疫血清、口蹄疫病毒阴性血清、稀释液、洗涤液、底物液和显色液。
其中，所述的口蹄疫病毒包被抗原是线性表位肽(ERTLP)；
包被口蹄疫病毒灭活抗原的ELISA板：将口蹄疫病毒包被抗原的浓度稀释为1ng/μL，100μL/孔包被ELISA板，37℃孵育2h或者4℃过夜；
稀释液：含0.05％(V/V)吐温和0.5％BSA(mg/ml)的PBS(pH7.4)溶液；
所述的底物液是OPD；
洗涤液：PBST溶液；
所述的酶标记的抗体是HRP标记的羊抗牛IgG抗体。
试验例1 FMD NSP单抗阻断ELISA抗体检测方法的建立
1试验方法
1.1单克隆抗体腹水的纯化
鉴于单抗3A10具有广谱性和良好的亲和力，本试验进一步研究单抗3A10在FMD免疫与自然感染血清中鉴别诊断的价值。
将实施例1制备的单抗3A10以及2H1腹水采用辛酸-饱和硫酸铵法对制备的腹水进行纯化，操作步骤简述如下：
(1)取3ml预处理过的腹水加6ml醋酸缓冲液(0.06mol，pH4.8)；腹水中加99ul辛酸室温搅拌30分钟，4℃静置2小时以上；取出11000rpm离心30分钟，弃沉淀；上清用2mol/LNaOH调pH至7.4；
(2)在4℃条件下加入饱和硫酸铵至50％饱和度，冰浴搅拌作用30分钟，4℃静置2小时以上；11000rpm离心30分钟，弃上清；沉淀溶于5ml PBS(0.1M，pH7.4)中；
(3)向沉淀悬浮物中边搅拌边加适量饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵溶液中浓度为30％-40％，冰浴搅拌作用30分钟，4℃静止2小时以上；11000rpm离心30分钟，取沉淀，将沉淀融入2ml PBS中；
(4)将沉淀悬浮液装入透析带中，在4℃用PBS透析，2小时换液一次，透析2天。透析完成后，回收透析袋中的纯化腹水，紫外分光光度计测定蛋白浓度，再用DEAE-Sephadex A-50(GE公司)柱层析进一步纯化单克隆抗体，回收纯化后的单克隆抗体，紫外分光光度计测定蛋白浓度，用SDS-PAGE进行纯度检测，用改良过碘酸钠法标记HRP。
1.2口蹄疫病毒非结构蛋白(FMD NSP)单抗阻断ELISA抗体检测方法
为检验单抗3A10及其杂交瘤细胞系在建立口蹄疫非结构蛋白抗体检测方法中的应用价值，用FMDV非结构蛋白单抗2H1包被ELISA板，FMDV 3AB蛋白作为抗原，单抗3A10作为检测抗体，初步建立一种用于检测口蹄疫非结构蛋白抗体的ELISA方法，检测口蹄疫感染和免疫的猪、牛、羊血清以及口蹄疫阴性血清。
1)用pH9.6的碳酸盐缓冲液按使用浓度稀释包被单抗2H1于ELISA板，100μL/孔，4℃过夜。次日取出ELISA板，弃去液体，用pH7.4 PBST洗板5次，甩干；
2)用PBS稀释3AB抗原至使用浓度，100μL/孔，37℃温育1h，同上洗板5次；
3)阴性血清，阳性血清用PBS 10倍稀释，50μL/孔，37℃温育1h，同上洗板5次；
4)在ELISA板中加入用PBS稀释的HRP-3A10，50μL/孔，充分摇振混匀，37℃温育1h，同上洗板5次；
5)加入底物溶液TMB，50μL/孔，室温避光15min；15min后，加入2M H2SO4终止液，50μL/孔，终止反应，在酶标仪上读取OD450nm值。
结果判定：通过检测已知阴性和阳性血清，计算抑制百分率(Percentageinhibition,PI)。
2试验结果
2.1单克隆抗体腹水的纯化结果
紫外分光光度计测定纯化后的单抗3A10的浓度为6.17mg/mL，单抗2H1的浓度为5.23mg/mL；抗体3A10再经DEAE-sephadex a-50离子交换层析进一步纯化，用改良过碘酸钠法标记HRP。
2.2包被单抗和检测单抗使用浓度的确定
对3AB抗原、包被单抗3A10和检测单抗2H1的使用浓度进行方正滴定，结果如表1所示，当捕获单抗1:2000稀释(3.1μg/ml)、3AB抗原1：1000稀释、、HRP标记检测单抗为1：4000稀释(1.31μg/ml)时，OD450nm值为1.82为最佳组合。
表1单抗最佳包被浓度及检测单抗最佳使用浓度的方阵滴定结果
Figure GDA0003504409690000101
2.3口蹄疫非结构蛋白抗体检测
口蹄疫非结构蛋白抗体检测结果如图4所示，检测结果表明应用该口蹄疫非结构蛋白抗体3A10和2H1所构建的阻断ELISA检测方法能够特异性区分FMDV的感染血清、免疫血清及阴性血清。并且从图4可以看出，本发明建立的阻断ELISA检测方法由于强竞争性单抗2H1的优势，感染血清(PI值80％以上)与免疫血清和阴性血清(PI值20％以下)的检测值差别显著。上述试验结果说明，单抗3A10和2H1在口蹄疫非结构蛋白抗体检测方法中具有应用价值。
试验例2单克隆抗体3A10识别的口蹄疫病毒非结构蛋白3A抗原表位的筛选和鉴定
1、试验材料和试验方法
1.1主要试剂
ELISA板购自于Corning公司，DAB显色液购自北京中杉金桥生物技术有限公司，BL21感受态购自于天根公司，pGEX-6p-1由本实验室保存。原核表达FMDV 3A和3B蛋白由本实验室保存。A型、O和Asia1型FMDV感染和免疫血清由新疆天康生物有限公司惠赠。3B合成肽段购自北京中科亚光生物科技有限公司。
1.2原核表达3A和3B蛋白抗原间接ELISA
1)用pH9.6的碳酸盐缓冲液按使用浓度分别稀释包被口蹄疫重组蛋白3A和3B蛋白于ELISA板，100μL/孔，4℃过夜。次日取出ELISA板，弃去液体，用pH7.4 PBST洗板5次，甩干；2)用PBST稀释单抗2H1腹水至使用浓度，100μL/孔，37℃温育1h，同上洗板5次；3)用PBST稀释羊抗鼠HRP至使用浓度，100μL/孔，37℃温育1h；4)同上洗板5次，加入底物溶液TMB，50μL/孔，室温避光15min。15min后，加入2M H2SO4终止液，50μL/孔，终止反应，在酶标仪上读取OD450nm值。
1.3 3A蛋白的截短表达
根据FMDV Asia1/YS/CHA/05(GenBank accession number:GU931682)株3A蛋白序列，设计7对特异性引物，将蛋白分为7个截短片段进行表达。所有上下游引物均分别引入BamHI、SalI酶切切位点，引物序列见表2，由Invitrogen公司合成。
表2编码截短3A肽的互补寡核苷酸链
Figure GDA0003504409690000111
Figure GDA0003504409690000121
7对引物分别用于扩增7个截短基因片段，其分布如表2所示。酶切后的基因片段插入pGEX-6p-1的BamHI和SalI之间，转化BL21感受态细胞，挑取单个阳性菌落过夜培养并测序验证，然后1:100稀释接种于新鲜的液体LB培养基中，37℃震荡培养至OD600nm＝0.6，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1mmol/L，37℃继续培养4h，收集菌体并用适量PBS重悬，融合蛋白分别命名为3A1、3A2、3A3、3A4、3A5、3A6和3A7。
1.4表位肽的GST融合表达
人工合成表位及其单氨基酸逐一截短表位的编码DNA的两条互补寡核苷酸链，上游引入BamHI粘性延伸末端，下游引入终止密码子以及SalI粘性延伸末端，引物序列见表3。
表3编码截短肽及其截短突变体DNA的互补寡核苷酸链
Figure GDA0003504409690000122
Figure GDA0003504409690000131
将两条互补链直接退火形成带粘性末端的双链DNA，插入pGEX-6p-1的BamHI和SalI之间，转化BL21感受态细胞。挑取单个阳性菌落过夜培养并测序验证，然后1:100稀释接种于新鲜的液体LB培养基中，37℃震荡培养至OD600nm＝0.6，加入诱导剂IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃继续培养4h，收集菌体并用适量的PBS重悬。表达的融合蛋白分别命名为、3A1-15、3A10-25和3A20-34，3A10-1-5至3A10-1-14和3A10-2-15至3A10-10-15。
1.5系列表位突变肽的GST融合表达
人工合成表位编码DNA的两条互补寡核苷酸链，上游引入BamHI粘性延伸末端，下游引入终止密码子以及SalI粘性延伸末端，引物序列见表4和表5。
表4用于本研究的合成肽及其氨基酸序列
Figure GDA0003504409690000132
a口蹄疫病毒Asia1/YS/CHA/05株3A的7～11aa肽
b突变位点氨基酸均加粗并用下划线标出，按左右顺序依次有一个残基用丙氨酸(A)替换
表5编码合成肽DNA的互补寡核苷酸链
Figure GDA0003504409690000133
Figure GDA0003504409690000141
将两条互补链直接退火形成带粘性末端的双链DNA，插入pGEX-6p-1的BamHI和SalI之间，转化BL21感受态细胞，挑取单个阳性菌落过夜培养并测序验证，然后1:100稀释接种于新鲜的液体LB培养基中，37℃震荡培养至OD600nm＝0.6，加入诱导剂IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃继续培养4h诱导蛋白的表达，收集菌体并用适量的PBS重悬，表达的GST融合蛋白分别命名为126A、127A、128A、129A和130A。
1.6 SDS-PAGE电泳和Western blot检测
SDS-PAGE电泳(12％Tris-glycine)分离各融合蛋白，转印至硝酸纤维素滤膜上(90V，60min)，用5％脱脂乳-PBS封闭液4℃封闭过夜，与单抗3A10于37℃温1h，与HRP标记的羊抗鼠IgG室温作用1h，DAB(6mg/10mL)显色。
1.7抗体检测ELISA
用上述材料方法1.5中的GST融合表达的表位肽作为抗原包被96孔板，加入100uL100倍稀释的口蹄疫感染和免疫的猪、牛、羊血清以及口蹄疫阴性血清，37℃温育1h后洗涤，加入1:5000稀释的HRP标记的羊抗猪、牛、羊IgG抗体，洗涤后加入底物OPD避光显色10min，于波长492nm测定吸光值。
2试验结果
2.1单抗3A10识别表位的蛋白定位
原核表达3A和3B蛋白间接ELISA结果如图5-a，结果显示单抗3A10识别口蹄疫病毒非结构蛋白3A，而与3B没有特异性反应。对GST融合表达的3A1、3A2、3A3、3A4、3A5、3A6、3A7进行SDS-PAGE(图5-b)分离，并以1：1000稀释的单抗3A10作为一抗、1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠抗体作为二抗进行Western blot分析(图5-c)；结果显示，3A10所识别的表位位于3A7蛋白节段上。为了进一步定位3A10识别的表位，将3A7分为3段(3A1-15、3A10-25和3A20-35)进一步截短表达，SDS-PAGE(图5-d)和Western blot分析(图5-e)显示，3A10所识别的表位位于3A1-15节段。
2.单抗3A10识别表位的精确定位
为进一步定性单抗3A10识别的表位，本试验以上下游引物退火形成目的片段为目的进而设计了20对引物(表3)，分别从3A1-15短肽的N端和C端以1个氨基酸残基逐步递减设计肽段，直到C末端或N末端剩下5个氨基酸组成的短肽为止，将上述肽段进行GST融合表达以及SDS-PAGE电泳(图6-a)和Western blot(图6-b)分析。结果显示，MAb 3A10能与3A7 N端的1STVGFRERTLP11至1STVGFRERTLPGRKT15以及3A7 C端的2TVGFRERTLPGRKT15至7ERTLPGRKT15发生特异性结合，而与其它融合肽以及GST对照不反应。上述结果表明，7ERTLP11(在FMDV 3A具体位置为34KPLKVK39)为MAb 3A10识别的真实表位的最小反应活性单元，即为单抗3A10识别的3A抗原表位的基序。
3. 3A10识别表位的关键氨基酸
为进一步了解单抗3A10识别表位中各个氨基酸残基在与单抗结合过程中所起的作用，以3A10表位基序126ERTLP130为基础，用丙氨酸(A)从N端至C端进行逐个氨基酸替换(表4和表5)，126ERTLP130作为阳性对照、GST空载体作为阴性对照。经SDS-PAGE(图7-a)与Western blot分析(图7-b)显示，3A10所识别表位的氨基酸序列中，Arg127和Leu129为关键氨基酸，其余残基的替换对表位活性无影响。
4. 3A10表位是七个血清型FMDV各基因型毒株的保守性表位
为验证3A10表位的保守性，选取GenBank收录的274条FMDV的3A氨基酸序列进行比对，以其中21条FMDV的3A氨基酸序列为代表，比对分析结果(图8)显示，3A10表位的氨基酸序列在7种血清型FMDV毒株之间有较高的保守性。在序列比对中发现,该表位氨基酸序列中有突变的是Glu126、Thr128和Pro130，但其为该表位的非必需氨基酸，突变后对表位活性不会产生影响；而Arg127和Leu129作为本发明鉴定的3A10表位的关键氨基酸，这两个氨基酸残基在已发表毒株的该表位氨基酸序列中有较高的保守性，这些结果表明，3A10识别的表位是针对FMDV 7个血清型毒株的一个保守的线性表位。
5.单抗3A10识别抗原表位及其突变体与口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的特异性反应
在鉴定了单抗3A10所识别的表位基序126ERTLP130后，为确定该抗原表位能否作为诊断抗原来检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体(口蹄疫感染血清)，本发明首先将3A10识别的FMDV 3A表位的氨基酸序列126ERTLP130进行定点诱变：E126突变为Ala(A)；R127突变为Ala(A)；T128突变为Ala(A)；L129突变为Ala(A)；P130突变为Ala(A)。以GST融合的方式表达，分别命名为126A、127A、128A、129A和130A。然后，将这些GST融合的表位肽作为抗原分别包被ELISA板，同时，设立GST空载体作为对照，检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体(口蹄疫感染血清)和阴性血清，以检测单抗3A10识别的FMDV表位的氨基酸序列126ERTLP130及其突变体与口蹄疫病毒非结构蛋白抗体(口蹄疫感染血清)的反应能力，由此评价3A10识别的FMDV表位的氨基酸序列126ERTLP130在口蹄疫诊断中的价值。
检测结果(图9)表明：单抗3A10识别的FMDV表位肽及其表位突变肽126A、128A和130A与口蹄疫病毒非结构蛋白抗体(口蹄疫感染血清)呈现良好的反应能力；表位突变肽127A和129A与口蹄疫病毒非结构蛋白抗体(口蹄疫感染血清)以及FMDV阴性血清均没有反应。这些检测结果，与3A10识别表位鉴定过程中发现的氨基酸残基Arg127和Leu129是该表位活性的关键氨基酸，而其余残基替换对该表位的活性无影响的结果相一致，由此确定了单抗3A10识别的FMDV表位的氨基酸序列126ERTLP130及其系列表位突变肽对于建立口蹄疫病毒非结构蛋白抗体诊断方法的价值和应用潜力。
试验例3单克隆抗体2H1识别的口蹄疫病毒非结构蛋白3B抗原表位的筛选和鉴定
1、试验材料和试验方法
1.1主要试剂
ELISA板购自于Corning公司，DAB显色液购自北京中杉金桥生物技术有限公司，BL21感受态购自于天根公司，pGEX-6p-1由本实验室保存。原核表达FMDV 3A和3B蛋白由本实验室保存。A型、O和Asia1型FMDV感染和免疫血清由新疆天康生物有限公司惠赠。3B合成肽段购自北京中科亚光生物科技有限公司。
1.2原核表达3A和3B蛋白抗原间接ELISA
1)用pH9.6的碳酸盐缓冲液按使用浓度分别稀释包被口蹄疫重组蛋白3A和3B蛋白于ELISA板，100μL/孔，4℃过夜。次日取出ELISA板，弃去液体，用pH7.4 PBST洗板5次，甩干；2)用PBST稀释单抗2H1腹水至使用浓度，100μL/孔，37℃温育1h，同上洗板5次；3)用PBST稀释羊抗鼠HRP至使用浓度，100μL/孔，37℃温育1h；4)同上洗板5次，加入底物溶液TMB，50μL/孔，室温避光15min。15min后，加入2M H2SO4终止液，50μL/孔，终止反应，在酶标仪上读取OD450nm值。
1.3 3B合成肽间接ELISA
将口蹄疫病毒非结构蛋白3B蛋白分为7段，每两段之间重叠6个氨基酸，命名为3B1、3B2、3B3、3B4、3B5、3B6、3B7，分别进行序列合成，其分布如表6。
表6 3B合成肽序列
Figure GDA0003504409690000161
用pH9.6的碳酸盐缓冲液按使用浓度稀释包被合成肽3B1至3B7于ELISA板，0.5μg/孔，4℃过夜。次日取出ELISA板，弃去液体，用pH7.4 PBST洗板5次，甩干；
2)用PBST稀释单抗2H1腹水至使用浓度，100μL/孔，37℃温育1h，同上洗板5次；
3)用PBST稀释羊抗鼠HRP至使用浓度，100μL/孔，37℃温育1h；5)同上洗板5次，加入底物溶液TMB，50μL/孔，室温避光15min显色。加入2M H2SO450μL/孔，终止反应，在酶标仪上读取OD450nm值。
1.4表位肽的GST融合表达
人工合成3B表位及其单氨基酸逐一截短表位的编码DNA的两条互补寡核苷酸链，上游引入BamHI粘性延伸末端，下游引入终止密码子以及SalI粘性延伸末端，引物序列见表7。
表7编码截短肽及其截短突变体的DNA的互补寡核苷酸链
Figure GDA0003504409690000162
Figure GDA0003504409690000171
将两条互补链直接退火形成带粘性末端的双链DNA，插入pGEX-6p-1的BamHI和SalI之间，转化BL21感受态细胞。挑取单个阳性菌落过夜培养并测序验证，然后1:100稀释接种于新鲜的液体LB培养基中，37℃震荡培养至OD600nm＝0.6，加入诱导剂IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃继续培养4h，收集菌体并用适量的PBS重悬。表达的融合蛋白分别命名为2h1-1-5至2h1-1-14和2h1-2-15至2h1-10-15。
1.5系列表位突变肽的GST融合表达
人工合成3B表位编码DNA的两条互补寡核苷酸链，上游引入BamHI粘性延伸末端，下游引入终止密码子以及SalI粘性延伸末端，引物序列见表9。
表8用于本试验的合成肽及其氨基酸序列
Figure GDA0003504409690000172
a口蹄疫病毒Asia1/YS/CHA/05株3B表位肽的氨基酸序列(8～13aa)
b突变位点氨基酸均加粗并用下划线标出，按左右顺序依次有一个残基用丙氨酸(A)替换
表9编码合成肽DNA的互补寡核苷酸链
Figure GDA0003504409690000173
Figure GDA0003504409690000181
将两条互补链直接退火形成带粘性末端的双链DNA，插入pGEX-6p-1的BamHI和SalI之间，转化BL21感受态细胞，挑取单个阳性菌落过夜培养并测序验证，然后1:100稀释接种于新鲜的液体LB培养基中，37℃震荡培养至OD600nm＝0.6，加入诱导剂IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃继续培养4h诱导蛋白的表达，收集菌体并用适量的PBS重悬，表达的GST融合蛋白分别命名为8A、9A、10A、11A、12A和13A。
1.6 SDS-PAGE电泳和Western blot检测
SDS-PAGE电泳(12％Tris-glycine)分离各融合蛋白转印至硝酸纤维素滤膜上(90V，60min)，用5％脱脂乳-PBS封闭液4℃封闭过夜，与单抗2H1于37℃温1h，与HRP标记的羊抗鼠IgG室温作用1h，DAB(6mg/10mL)显色。
1.7抗体检测ELISA
用上述材料方法1.5中的GST融合表达的表位肽作为抗原包被96孔板，加入100uL100倍稀释的口蹄疫感染和免疫的猪、牛、羊血清以及口蹄疫阴性血清，37℃温育1h后洗涤，加入1:5000稀释的HRP标记的羊抗牛IgG抗体，洗涤后加入底物OPD避光显色10min，于波长492nm测定吸光值。
2试验结果
2.1单抗2H1识别表位的蛋白定位
原核表达3A和3B蛋白间接ELISA结果如图10，结果显示单抗2H1识别口蹄疫病毒非结构蛋白3B。3B合成肽间接ELISA结果如图11，结果显示单抗2H1识别口蹄疫病毒非结构蛋白3B-4肽段。
2.2单抗2H1识别表位的精确定位
为进一步定性单抗2H1识别的表位，以上下游引物退火形成目的片段为目的进而设计了20对引物，分别从3B-4短肽的N端和C端以1个氨基酸残基逐步递减设计肽段，直到C末端或N末端剩下5个氨基酸组成的短肽为止，将上述肽段进行GST融合表达以及SDS-PAGE电泳(图12-a)和Western blot(图12-b)分析。
分析结果显示，MAb 2H1能与3B-4N端的1AGPMERQKPLKVKA13至1AGPMERQKPLKVKAK15以及3B-4C端的2GPMERQKPLKVKAK15至8KPLKVKAK15发生特异性结合，而与其它融合肽以及GST对照均不反应。上述结果表明，8KPLKVK13(在FMDV 3B具体位置为34KPLKVK39)为单抗2H1识别表位的最小反应活性单元，即为单抗2H1识别的3B抗原表位的基序。
2.3 2H1识别表位的关键氨基酸
为进一步了解单抗2H1识别表位中各个氨基酸残基在与单抗结合过程中所起的作用，以2H1表位基序34KPLKVK39为基础，用丙氨酸(A)从N端至C端进行逐个氨基酸替换，34KPLKVK39作为阳性对照、GST空载体作为阴性对照。经SDS-PAGE(图13-a)与Western blot分析(图13-b)显示，在2H1所识别表位的氨基酸序列中，Lys34、Lys37和Val38为关键氨基酸，其余残基的替换对表位活性无影响。
2.4 2H1表位是七个血清型FMDV各基因型毒株的保守性表位
为验证2H1表位的保守性，选取GenBank收录的274条FMDV3B蛋白的氨基酸序列进行比对，对其中12条FMDV 3B的氨基酸序列进行比对分析。对比分析结果如图14所示，2H1表位的氨基酸序列在A、O、Asia1、C四种血清型FMDV毒株之间是高度保守的。从序列比对可见，有氨基酸突变发生在Leu36和Lys39，分别突变为Pro36和Arg39，但其为该表位的非必需氨基酸，突变后对表位活性不会产生影响；而Lys34、Lys37和Val38作为本试验鉴定的2H1表位的关键氨基酸，在已发表毒株的3B氨基酸序列中是高度保守的。这些结果表明，2H1表位是针对FMDV四种血清型毒株的一个高度保守的线性表位。
2.5单抗2H1识别抗原表位及其突变体与口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的特异性反应
在鉴定了单抗2H1所识别的3B表位基序34KPLKVK39后，本试验进一步确定该抗原表位及其突变体能否用作检测口蹄疫病毒感染血清中病毒非结构蛋白抗体的标志性诊断抗原。
分别将2H1识别的FMDV 3B表位34KPLKVK39的每个氨基酸进行定点诱变，分别突变为Ala(A)，以GST融合的方式表达为突变的表位肽，分别命名为34A、35A、36A、37A、38A和39A。然后，将这些GST融合的表位肽作为抗原分别包被ELISA板，同时设立GST空载体对照，检测含有口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的口蹄疫感染血清以及阴性血清，用以检测单抗2H1识别表位序列34KPLKVK39及其突变体与口蹄疫病毒非结构蛋白抗体(口蹄疫感染血清)的反应能力，由此评价2H1识别的FMDV3B表位肽34KPLKVK39在口蹄疫鉴别诊断中的价值。
试验结果(图15)表明：单抗2H1识别的FMDV 3B表位肽及其突变体35A、36A和39A与口蹄疫病毒非结构蛋白抗体(口蹄疫感染血清)呈现良好的反应能力，表位突变肽34A、37A和38A与口蹄疫病毒非结构蛋白抗体(口蹄疫感染血清)以及FMDV阴性血清均没有反应。这些检测结果表明，与2H1识别表位鉴定过程中发现的氨基酸残基Lys34、Lys37和Val38是该表位活性的关键氨基酸、而其余残基替换对该表位的活性无影响的结果相一致，由此确定了单抗2H1识别的FMDV 3B表位34KPLKVK39及其一系列表位突变肽对于建立口蹄疫病毒非结构蛋白抗体鉴别诊断方法的价值和应用潜力。
试验例4本发明阻断ELISA检测试剂盒的符合率检测试验
检测对象：实施例2制备的口蹄疫病毒抗体阻断ELISA检测试剂盒；
市售试剂盒：Ceditest kit(荷兰赛迪诊断公司，口蹄疫NSP抗体检测试剂盒)。
根据表10的符合率检测结果可见，本发明阻断ELISA检测试剂盒的总符合率为98.68％，这也间接表明单抗3A10和2H1具有良好的广谱性。所检测的76份血清中有39份猪血清和37份牛血清，结合本发明强竞争性单抗2H1的优势，本发明阻断ELISA检测试剂盒能够在一个反应体系中同时检测猪和牛血清。
表10本发明阻断ELISA检测试剂盒的符合率检测结果
Figure GDA0003504409690000201
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
<120> 分泌口蹄疫病毒非结构蛋白单克隆抗体3A10的杂交瘤细胞系及其应用
<130> HLJ-2001-180714A
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> Foot and Mouth Disease Virus
<400> 1
X1 Arg X2 Leu X3
1 5
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> Foot and Mouth Disease Virus
<400> 2
Glu Arg Thr Leu Pro
1 5
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> Foot and Mouth Disease Virus
<400> 3
Lys X1 X2 Lys Val X3
1 5
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> Foot and Mouth Disease Virus
<400> 4
Lys Pro Leu Lys Val Lys
1 5

Claims (2)

1.一株分泌口蹄疫病毒非结构蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系3A10，其特征在于，其微生物保藏编号是：CGMCC NO.16213。
2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞系所分泌的单克隆抗体。
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