CN111413499B - 一种检测禽腺病毒i群的间接免疫荧光试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测禽腺病毒I群的间接免疫荧光试剂盒。该试剂盒包括抗禽腺病毒I群单克隆抗体，FITC标记羊抗鼠抗体，样品稀释液和洗涤液。本发明中所述抗禽腺病毒I群的单克隆抗体，是基于Penton蛋白作为禽腺病毒重要的免疫原性蛋白，在禽腺病毒I群不同血清型毒株之间相对保守所制备的单克隆抗体，可同时识别禽腺病毒I群12个血清型病毒，而不与鸡减蛋综合征病毒(EDSV)等病毒发生交叉反应。本发明试剂盒具有良好的特异性。该试剂盒不仅可用于禽病毒类活疫苗中禽腺病毒I群的外源病毒检测，还可用于禽腺病毒I群的临床检测和流行病学调查。

Description

一种检测禽腺病毒I群的间接免疫荧光试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测禽腺病毒I群的间接免疫荧光试剂盒，属于兽用生物技术检测领域。

背景技术

禽腺病毒(Avian adenoviruses，FAdV)是一种无囊膜的线状双股DNA病毒，根据其抗原结构不同可分为3个群，I群(FAdV-I)主要是传统的FAdV，其中从鸡分离到的有12个血清型(FAdV1-8a，8b-FAdV11)，5个基因型(FAdV ABCDE)。鸡感染FAdV-I后可引起产蛋量下降、饲料转化率低、呼吸道疾病等症状，严重时可能导致死亡，为养殖业造成巨大的经济损失。特别是2015年7月以来，“鸡肝炎-心包积液综合征”在华中和华北地区鸡群中广泛发生。疫情最初出现在饲养管理水平低、卫生条件差的小型养殖场，之后波及大型集约化养殖企业。疫情传播迅速，发病鸡群死亡率高。1月龄内的小鸡死亡率高达80％，青年鸡和成年鸡死亡率1％～20％。当前疫病主要分布于黑龙江、吉林、辽宁及山西等地，根据鉴定确诊为FAdV感染，且FAdV-I血清型4型为主要流行毒株。

疫苗中污染FAdV-I是引起FAdV-I传播和流行的潜在风险。在禽源活疫苗成品检验环节，我国《中华人民共和国兽药典》(三部)二〇一五年版、美国及欧洲药典中，对禽用活疫苗成品外源病毒检验时均无专门针对FAdV-I检验的方法，但《欧洲药典》对基础种毒的外源病毒检验需用鸡检查法，该方法需对I群FAdV进行检测。我国对基础种毒外源病毒的检验未强制使用鸡检查法，且目前的鸡检查法中也没有对FAdV-I进行检测的要求。一旦疫苗中污染了FAdV-I，使用后会引起鸡群大面积感染，造成严重损失，这对该病的疫控带来了潜在的风险，因此亟需建立稳定有效的检测FAdV-I的方法用于禽活疫苗的质量检测。

I群禽腺病毒FAdV-I分为12个血清型(FAdV1-8a，8b-FAdV11)和5个基因型(FAdVABCDE)。除了血清4型外，FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-10及FAdV-11等血清型在我国鸡群中均有流行和感染。该特征为I群FAdV的鉴定和检测带来很大的挑战。然而，目前国内关于FAdVI-I检测方法和试剂盒主要针对血清4型等个别流行毒株，尚无可以同时检测FAdV-I 12个血清型病毒的诊断方法及试剂盒。

本专利建立的FAdV-I检测方法可同时检测FAdV-I 12个血清型病毒，而不对其他病毒产生交叉反应，便捷高效，可操作性强，具有较高的特异性和灵敏度。推广和使用该方法有利于进一步保证我国禽用病毒类活疫苗的纯净性和安全性，进而提高疫苗质量，还可用于禽腺病毒I群的临床检测和流行病学调查。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测禽腺病毒I群12个血清型病毒的间接免疫荧光试剂盒。本发明的原理和最核心的关键技术是针对FAdV-I的12个血清型毒株Penton蛋白保守序列进行二级结构、亲疏水性、抗原性等分析，选取抗原重组表位，构建至原核表达载体，并进行表达纯化，制备免疫原进行单克隆抗体制备，通过抗原抗体特异性反应，同时一抗被带有荧光标记的抗鼠IgG识别，以达到对FAdV-I进行特异性鉴定的目的。

本发明的技术方案

1.一种检测禽腺病毒I群的间接免疫荧光试剂盒，其特征在于该试剂盒包括抗禽腺病毒I群的单克隆抗体，FITC标记的羊抗鼠抗体，样品稀释液和洗涤液；

所述的单克隆抗体来自与禽腺病毒I群的12个血清型病毒株均具有良好反应性的杂交瘤细胞株，该细胞株命名为禽腺病毒I群Penton蛋白杂交瘤细胞Mab-Penton-6株，并已于2020年04月08日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.19662。

2.本发明所述的一种检测禽腺病毒I群的间接免疫荧光试剂盒，其特征在于所述抗禽腺病毒I群的单克隆抗体，是基于禽腺病毒I群Penton蛋白保守序列(序列1)所制备的单克隆抗体，可同时识别禽腺病毒I群12个血清型病毒，而不与EDSV等病毒发生交叉反应；Penton蛋白作为禽腺病毒重要的免疫原性蛋白，在禽腺病毒I群不同血清型毒株之间相对保守。

本发明是通过以下方法实现的：

(1)禽腺病毒I群Penton蛋白免疫原的制备：系统分析禽腺病毒I群12个血清型毒株参考序列，选取其中保守部分进行抗原表位分析，同时根据蛋白序列二级结构及亲疏水性、抗原性等因素，选取长度为825bp的抗原重组表位作为免疫原片段，克隆至带有His标签的pET30a原核表达载体，并转化至BL21菌株进行诱导表达。表达产物纯化后的蛋白浓度>0.5mg/mL，纯度>85％，用于禽腺病毒I群单克隆抗体制备的免疫原。

(2)禽腺病毒I群单克隆抗体的制备：将免疫原蛋白免疫Balb/c小鼠，60μg/只，初免后加强免疫3次，每次加强免疫剂量为30μg/只，免疫间隔14天，三次加强后用免疫原蛋白包被板子，通过ELISA检测单抗效价。选择效价高的小鼠进行融合，通过免疫原蛋白包被板子，ELISA筛选出只针对目的蛋白的阳性单克隆细胞株(该细胞株命名为禽腺病毒I群Penton蛋白杂交瘤细胞Mab-Penton-6株，并已于2020年04月08日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.19662)，制备腹水，用Protein-A亲和纯化，获得禽腺病毒I群单克隆抗体。

(3)检测禽腺病毒I群病毒的间接免疫荧光试剂盒：该试剂盒成分包括抗禽腺病毒I群的单克隆抗体，商品化的FITC标记的羊抗鼠抗体(购自Sigma公司)，样品稀释液及洗涤液。该试剂盒检测禽腺病毒I群抗原的步骤及阳性判定标准如下：将待检样品接种鸡肝癌细胞系(LMH)，一段时间后用冷甲醇固定15min，弃去甲醇，自然风干5min使甲醇挥发，用PBS洗涤一遍后，加入稀释后的抗禽腺病毒I群单克隆抗体，37℃反应1h；PBS洗涤5遍后，加入稀释的FITC标记的羊抗鼠抗体，37℃反应1h；PBS洗涤3遍后，在倒置荧光显微镜下进行观察。若出现细胞内亮绿色特异荧光，则该样品判为阳性；否则判为阴性。

所述样品稀释液和洗涤液是10mM pH 7.2的磷酸缓冲液(PBS)。

本发明的有益效果

本发明涉及一种检测禽腺病毒I群的间接免疫荧光试剂盒。该试剂盒包括抗禽腺病毒I群单克隆抗体，FITC标记羊抗鼠抗体，样品稀释液和洗涤液。本发明中所述抗禽腺病毒I群的单克隆抗体，是基于Penton蛋白作为禽腺病毒重要的免疫原性蛋白，在禽腺病毒I群不同血清型毒株之间相对保守所制备的单克隆抗体，可同时识别禽腺病毒I群12个血清型病毒，而不与鸡减蛋综合征病毒(EDSV)等病毒发生交叉反应。本发明试剂盒具有良好的特异性。该试剂盒不仅可用于禽病毒类活疫苗中禽腺病毒I群的外源病毒检测，还可用于禽腺病毒I群的临床检测和流行病学调查。

附图说明

图1蛋白小量表达图M：Marker；1-2：IPTG诱导(BL21)；3：未诱导对照(BL21)。

图2蛋白大量表达图M：Marker；1：超声后上清；2：超声后沉淀。

图3本发明间接免疫荧光试剂盒检测结果图中A-L为感染FAdV-I 12个血清型病毒：A为FAdV-I A1型(CELO株)；B为FAdV-I D2型(SR48株)；C为FAdV-I D3型(SR49株)；D为FAdV-I C4型(KR5株)；E,为FAdV-I B5型(TR22株)；F为FAdV-I E6型(CR119株)；G为FAdV-IE7型(YR36株)；H为FAdV-I E8a型(TR59株)；I为FAdV-I 8b型(764株)；J为FAdV-I D9型(A-2A株)；K为FAdV-I C10型(C2B株)；L为FAdV-I D11型(380株)；对照：M为EDSV(127株)；N为ALV(RAV-1株,)；O为ILTV(ILT/13株)；P为ARV(Reo1133株)。

具体实施方式

本发明所述一种检测禽腺病毒I群病毒的间接免疫荧光试剂盒包括抗禽腺病毒I群的单克隆抗体，FITC标记的羊抗鼠抗体，样品稀释液和洗涤液。

其中：

所述基于I群Penton蛋白保守序列所制备的单克隆抗体是通过下述步骤得到：

1.禽腺病毒I群Penton蛋白免疫原的制备：系统分析禽腺病毒I群12个血清型毒株参考序列，选取其中保守部分进行抗原表位分析，同时根据蛋白序列二级结构及亲疏水性、抗原性等因素，选取长度为825bp的抗原重组表位作为免疫原片段(序列1)，克隆至带有His标签的pET30a原核表达载体(购自美国默克公司)，并转化至BL21菌株进行诱导表达。表达产物纯化后的蛋白浓度>0.5mg/mL，纯度>85％，用于禽腺病毒I群单克隆抗体制备的免疫原。

序列1禽腺病毒I群Penton蛋白重组表位

2.禽腺病毒I群单克隆抗体的制备：将免疫原蛋白免疫Balb/c小鼠，60μg/只，初免后加强免疫3次，每次加强免疫剂量为30μg/只，免疫间隔14天，三次加强后用免疫原蛋白包被板子，通过ELISA检测单抗效价。选择效价高的小鼠进行融合，通过免疫原蛋白包被板子，ELISA筛选出只针对目的蛋白的阳性单克隆细胞株，制备腹水，用Protein-A亲和纯化，获得禽腺病毒I群单克隆抗体。

3.检测禽腺病毒I群抗原的间接免疫荧光试剂盒：该试剂盒成分包括抗禽腺病毒I群的单克隆抗体，商品化的FITC标记的羊抗鼠抗体(购自Sigma公司)，样品稀释液及洗涤液。该试剂盒检测禽腺病毒I群抗原的步骤及判定标准如下：将待检样品接种鸡肝癌细胞系(LMH)，一段时间后用冷甲醇进行固定15min，弃去甲醇，自然风干5min使甲醇挥发，用PBS洗涤1遍后，加入稀释后的抗禽腺病毒I群单克隆抗体，37℃反应1h；PBS洗涤5遍后，加入稀释的FITC标记的羊抗鼠抗体，37℃反应1h；PBS洗涤3遍后，进行倒置荧光显微镜下观察。若出现细胞内亮绿色特异荧光，则该样品判为阳性；否则判为阴性。

所述稀释液及洗涤液是10mM pH 7.2的磷酸缓冲液(PBS)。

实施例

以下实施例为进一步说明本发明，不对本发明构成限制。

实施例1——禽腺病毒I群Penton蛋白序列分析

从NCBI上下载禽腺病毒I群12个血清型毒株参考序列，通过分析发现，Penton蛋白在12个血清型毒株中具有较高同源性，采用DNAStar软件对Penton蛋白进行二级结构、亲疏水性、抗原性和功能区的分析。结果发现49-166aa和375-525aa蛋白序列含有抗原表位相对集中且在FAdV-I中同源性较高，可作为表达蛋白的备选片段。根据蛋白序列二级结构分析及亲疏水性、抗原性等,选取抗原重组表位位点作为免疫原。根据蛋白结构分析，选取上述蛋白区域的核苷酸片段(825bp)进行序列合成(序列1)，并在5’和3’端加入EcoRⅠ和Xho I酶切位点，用于载体的克隆。序列合成在北京六合华大蛋白研发中心有限公司进行。

实施例2——重组表达质粒的构建和表达纯化

1.重组表达质粒的构建

用限制性内切酶EcoRⅠ和Xho I分别对合成的序列和质粒pET30a进行双酶切，将纯化回收的片段和表达载体酶切产物用DNA Ligation Kit连接后，转化至感受态细胞(BL21)。

2.重组蛋白的小量表达

挑取经PCR鉴定为阳性的克隆到1.5mL含相应抗性的LB液体培养基中，37℃，200r/min培养；培养至OD＝0.6～0.8，IPTG(0.5mM)诱导，37℃，200r/min培养2h；取1mL诱导的菌液，12000r/min，离心1min，弃上清，沉淀用50～100mL Tris-HCl(pH 8.0)溶液吹散(加入缓冲液的量视菌体量而定)，加入与缓冲液等体积的2×loading buffer，100℃5min，电泳检测。结果显示，在大小约37KD处出现重组Penton蛋白的特定目的条带(图1)，说明Penton蛋白表达成功。

3.重组蛋白的大量表达

将培养的菌液按照1:50比例转接到500mL相应抗性LB液体培养基中，37℃震荡，200r/min，培养至OD＝0.6～0.8，IPTG(0.5mM)37℃诱导3h；收菌：8000r/min，离心6min。弃上清；超声破菌：菌体用20～30ml 10mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液吹散，超声波破碎(500W,180次，每次5s，间隔5s)；电泳确定表达形式：取100μL超声后的菌悬液，12000r/min，离心10min，取50μL上清至另一EP管，弃去上清后沉淀用50μL10 mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液吹散。分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE检测，结果在沉淀中检测到大量的目的蛋白，说明该重组菌表达形式为包涵体表达。将表达好的蛋白进行纯化，方法如下：20～30ml 10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液重悬超声离心得到的沉淀，静置10min；12000r/min，离心10min，上清转入另一管中保存；用20～30ml 10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液重悬沉淀，静置10min；12000r/min，离心10min，弃上清。重复上述重悬和离心的步骤一次；先加入少量的10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液重悬沉淀，再加5～10mL含8M尿素的10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液溶解蛋白，12000r/min，离心10min，收集上清，取50μL样品进行SDS-PAGE电泳检测(图2)。以BSA为标准，通过SDS-PAGE凝胶扫描分析估计纯化蛋白浓度>0.5mg/mL，纯度>85％，命名为FAdV-I-penton。

实施例3——单克隆抗体的制备

1.小鼠的免疫

用FAdV-I-penton纯化蛋白与弗氏完全佐剂1:1乳化后，按60μg蛋白/只小鼠的量，皮下注射4只SPF BALB/c雌性小鼠(初次免疫)。并于初次免疫后2周、4周、6周，分别皮下注射加强免疫，免疫量为30μg/只。第三次加强免疫后10日，眼眶取血，用间接ELISA测血清效价。选择血清效价高的小鼠，用免疫原50μg进行腹腔注射免疫冲击一次，免疫后3日，进行细胞融合。

2.细胞融合实验

无菌取免疫小鼠脾脏，制备成脾细胞悬液，取免疫脾细胞与SP2/0细胞(本实验室保存)，采用常规50％PEG法进行细胞融合，并将融合细胞分置于5块96孔板中，以HAT培养液(购自Sigma公司)进行选择性培养。

3.杂交瘤细胞的克隆与筛选

将上述96孔板中培养物经FAdV-I-penton蛋白和标签蛋白包被的ELISA板进行筛选。筛选方法如下：

(1)包被ELISA板用pH为9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液稀释纯化好的FAdV-I-penton蛋白，终浓度为2μg/mL，100μL/孔，4℃，过夜；后用PBST(含0.05％吐温的PBS)洗涤3次。

(2)封闭 用含2％牛奶的PBS进行封闭，200μL /孔，37℃孵箱，2h，后用PBST(含0.05％吐温的PBS)洗涤3次。

(3)孵育一抗 分别加入杂交瘤细胞培养上清、阴性对照(SP2/0培养上清)、空白对照(PBS)、阳性对照(阳性血清用PBS做1000倍稀释)作为一抗，均为100μL/孔，37℃孵箱，1h。

(4)洗涤 用PBST(含0.05％吐温的PBS)洗涤3次。

(5)孵育二抗 分别加入用PBS稀释20000倍的山羊抗小鼠IgG/HRP作为二抗，100μL/孔，37℃孵箱，1h。

(6)洗涤 用PBST(含0.05％吐温的PBS)洗涤3次。

(7)显色 加入显色液(含1％A液和10％B液的柠檬酸缓冲液，A液：1％TMB inDMSO；B液：0.1％H₂O₂)100ul/孔，显色时间为5min左右。

(8)每孔加入50μL终止液(含2M硫酸)终止。

(9)读数 在双波长(450，630nm)波长下测吸光值，记录保存数据。

经检测，筛选到2#，6#，9#3株ELISA阳性的杂交瘤细胞株供进一步筛选。试验结果见表1：

表1杂交瘤细胞株ELISA筛选结果

4.间接免疫荧光检测

将ELISA筛选获得的3株阳性杂交瘤细胞株(2、6和9号)的上清作为一抗，采用间接免疫荧光法筛选到一株与FAdV-I的12个血清型毒株全病毒具有良好反应性的细胞株，该细胞株命名为禽腺病毒I群Penton蛋白杂交瘤细胞Mab-Penton-6株，并已于2020年04月08日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.19662。选取免疫荧光检测为阳性的细胞株采用有限稀释法进行亚克隆，直至细胞克隆抗体阳性率达100％。将上述亚克隆后阳性率达100％的阳性细胞株扩大培养后，液氮中保存。间接免疫荧光检测方法如下：

(1)阳性病毒板的制备 将FAdV-I的12个血清型毒株(表2)病毒液分别用含2％新生牛血清的DMEM培养液稀释成100TCID₅₀/0.1ml，接种已长成良好鸡肝癌细胞(LMH，本实验室保存)单层的96孔板，每个毒株接种4孔，100μL/孔，同时设空白对照。然后置于37℃，含5％CO₂的温箱中培养5天，进行荧光染色。

表2禽腺病毒12个血清型毒株和对照用毒株信息表

以上病毒株来自中国微生物菌种保藏管理委员会兽医微生物中心(请见中国兽医药品监察所、中国微生物菌种保藏管理委员会兽医微生物中心编著，中国兽医菌种目录第一版中英文合订本1992年，中国科学技术出版社，125-127、132、137和151页)；禽白血病病毒(ALV)RAV-1株来自中国兽医药品监察所(毛娅卿，王嘉，吴涛，王哲，蒋桃珍，禽白血病病毒p27蛋白在大肠杆菌中的表达和多克隆抗体的制备，《中国兽药杂志》2013年11期61-66)。

(2)染色

1)固定弃去96孔板的细胞培养液，每孔约加250μl细胞培养液，轻洗细胞表面1次，尽量弃尽PBS，然后每孔加入100μL冷甲醇，置室温固定10～15min，弃去甲醇，自然晾干2～5min。

2)加一抗(单克隆抗体)用PBS(pH7.2)洗细胞面1次，将待检的单克隆细胞株上清用PBS稀释10倍，加入FAdV-I病毒阳性细胞板(使用前用PBS洗涤1次)中，每孔50μL，每孔，37℃避光作用1h。

3)洗涤弃去板孔中的单克隆抗体，用PBS洗涤5次，每孔每次加入洗液0.3mL，轻微振荡洗涤。

4)荧光二抗染色尽量弃尽洗液，每孔加入用PBS作适当稀释(1:100～1:200)的荧光标记的羊抗小鼠IgG 50μL，37℃避光作用1h。

5)洗涤方法同3)。

6)观察和结果判定在荧光倒置显微镜下用蓝色激发光(波长490nm)观察，细胞有完整的细胞形态。当接种孔视野中出现特异性绿色荧光，放大到200～400倍时，可见被感染细胞的细胞核和与细胞质均有着色时，判定该孔FAdV-I检测为阳性。当接种孔未出现特异性绿色荧光时，视野发暗，证明细胞未被感染，判定该孔FAdV-I检测为阴性。5.杂交瘤细胞的鉴定

(1)培养特性

用含10％～15％胎牛血清的DMEM培养液，在37℃，5％CO₂培养箱中培养，用显微镜检查杂交瘤细胞株的细胞形态，观察细胞形态应一致。

(2)纯净性检验

按现行《中国兽药典》(中国兽药典委员会编，中华人民共和国兽药典，2015版，中国农业出版社，2016，本发明简称《中国兽药典》)附录方法进行无菌检验、支原体检验和外源病毒检验。

(3)胞核学检查

将培养24小时的杂交瘤细胞用秋水仙素法检查染色体数目，观察染色体特征是否符合杂交瘤细胞的染色特性。

(4)腹水的制备取8～10周龄BALB/C小鼠，腹腔注射降植烷，每只0.5ml。7～10日后小鼠腹腔注射杂交瘤细胞10⁶～10⁷个/0.5ml/只，7～10日后，观察小鼠状态，待小鼠腹部明显膨大、行动不便时，抽取小鼠腹水，3000r/min离心10min，取上清，-40℃保存。间隔2～3日，若腹水再次产生，可再次采集，此腹水即为鼠抗FAdV-I单克隆抗体。

(5)腹水效价测定

将每株单抗的腹水从1:100开始倍比稀释至1:102400，按照实施例3中4.间接免疫荧光检测方法测定腹水的荧光抗体效价，为1:8000。

实施例4——检测禽腺病毒I群病毒的间接免疫荧光试剂盒组装及应用

该试剂盒成分包括抗禽腺病毒I群的单克隆抗体，商品化的FITC标记的羊抗鼠抗体(购自：Sigma公司)，样品稀释液及洗涤液。

该试剂盒检测I群禽腺病毒的步骤及判定标准如下：

1.样品接种

将处理好的样品100μL接种于长满96孔板的LMH细胞单层，置37℃，吸附1h，，每孔补加100μL含3％牛血清的DMEM培养液，37℃培养5-7天。

2.荧光染色及结果判定

(1)固定：弃去96孔板的细胞培养液，每孔约加0.3mL PBS(pH7.2)轻洗细胞表面1次，尽量弃尽PBS，然后每孔加入0.2mL冷甲醇，置室温固定15min，弃去甲醇，自然晾干(5min)。

(2)加一抗：自然晾干后，用PBS(pH7.2)洗细胞面1次，然后每孔加入50μL用PBS(pH7.2～7.4)进行适当稀释的FAdV-I单克隆抗体，置37℃作用1h。

(3)洗涤：弃去FAdV-I单克隆抗体，用PBS(pH7.2)洗5次，每次每孔加入洗液0.3ml，轻微振荡洗涤。

(4)荧光二抗染色尽量弃尽洗液，每孔加入50μL用PBS(pH7.2～7.4)进行适当稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG，置37℃作用1h。

(5)洗涤：方法同(3)。

(6)观察和判定：在荧光倒置显微镜下用蓝色激发光(波长490nm)观察，细胞有完整的细胞形态。当接种孔视野中出现特异性绿色荧光，放大到200～400倍时，可见被感染细胞的细胞核和与细胞质均有着色时，判定该孔FAdV-I检测为阳性。当接种孔未出现特异性绿色荧光时，视野发暗，证明细胞未被感染，判定该孔FAdV-I检测为阴性。

3.试剂盒的特异性试验：

按照已建立的间接免疫荧光操作方法，利用间接免疫荧光试剂盒检测已知的FAdV-I 12个血清型病毒、鸡减蛋综合征病毒(EDSV)、禽白血病病毒(ALV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽正呼肠孤病毒(ARV)，观察感染病毒的细胞着色情况，确定该间接免疫荧光方法的特异性。

检测结果表明(见图3)，该方法可以特异性地识别检测FAdV-I 12个血清型代表毒株(A-L)反应结果均显示为阳性，而与EDSV(见图3中M)，ALV(见图3中N)，ILTV(见图3中O)和ARV(见图3中P)反应均为阴性，证明建立的方法特异性良好，该间接免疫荧光试剂盒可应用于禽腺病毒I群12个血清型病毒的特异性检测。

4.试剂盒的敏感性试验：

将FAdV-4(KR5株)稀释为10TCID₅₀/100μL，以此为基础进行二倍倍比稀释至10/2⁸TCID₅₀/100μL，将以上8个稀释度的样品，分别接种长满单层的LMH细胞，100μL/孔，每个样品4个重复。同时设置DMEM组作为阴性对照。按照实施例4中检测I群禽腺病毒病毒的步骤及判定标准进行检测。

结果各剂量梯度的FAdV-I检测结果为，当感染剂量大于等于0.313TCID₅₀ FAdV-I病毒时4/4阳性。以上结果表明，该试剂盒对FAdV-I污染的最低检出限为0.313TCID₅₀。

5.试剂盒的初步应用：

将本试剂盒应用于禽病毒类活疫苗的外源病毒检验，本试验抽取了18家国内生产企业、7家国外企业生产的禽用活疫苗重点品种，按照本专利的试剂盒进行FAdV-I检测，并根据《中国兽药典》2010年版三部和农业农村部《禽病活疫苗禽腺病毒污染摸底调查工作方案》用鸡检查法对抽检的禽病活疫苗进行FAdV-I污染的血清学检验。同时设置PBS组为阴性对照，感染FAdV-4(KR5毒株)组为阳性对照。结果显示，血清学检验和应用本试剂盒检测的结果一致，所抽检的禽用活疫苗均无FAdV-I污染，阴性对照为FAdV-I检测阴性，阳性对照为FAdV-I检测阳性。抽检疫苗信息见表3和表4：

表3采用本发明试剂盒对国内企业疫苗检测结果

表4采用本发明试剂盒对进口疫苗检测结果

序列表

<110> 中国兽医药品监察所

<120> 一种检测禽腺病毒I群的间接免疫荧光试剂盒

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 825

<212> DNA

<213> 禽腺病毒(Avian adenovirusesPenton蛋白重组表位)

<400> 1

gaattcgaac tgtatatgcc gctgcaacgc gttatggcac cgaccggcgg tcgtaactct 60

attaaatacc gtgattacac cccgtgtcgt aataccacca aactgttcta cgtcgacaac 120

aaagcgagcg atatcgacac ctacaacaaa gacgcgaacc atagcaactt ccgtaccacc 180

gtcatccata accaagatct ggacgcagat accgcagcaa ccgaaagcat tcagctggat 240

aaccgtagtt gttggggcgg cgatctgaaa accgcagttc gtaccaattg tccgaacgtt 300

agcagcttct ttcagagcaa cagcgttcgc gttcgtatga tgtggaaacg cgatccgccg 360

ggtagtaccc tgctgaccgt tccggatatg gcaggcggta ttggcgcaat gtataccagt 420

ctgccggata cctttattgc gccgaccggc ttcaaagaag acaataccac caacctgtgt 480

ccggttgttg gtatgaacct gttcccgacc tacaacaaaa tctactatca ggcggcgagc 540

acctacgttc agcgtctgga aaatagctgc cagtctgcaa ccgcagcgtt taatcgtttt 600

ccggaaaacg agatcctgaa acaagctccg ccgatgaacg ttagcagcgt ttgcgataat 660

cagccggcag ttgttcaaca aggcgttctg ccggttaaaa gtagtctgcc gggtctgcaa 720

cgcgttctga ttaccgacga tcaacgtcgt ccgattccgt acgtgtataa aagcatcgcg 780

accgttcaac cgaccgttct gagttctgca accctgcaac tcgag 825

Claims (2)

1.一种检测禽腺病毒I群的间接免疫荧光试剂盒，其特征在于该试剂盒包括抗禽腺病毒I群12个血清型病毒的单克隆抗体，FITC标记的羊抗鼠抗体，样品稀释液和洗涤液；

所述的单克隆抗体来自与禽腺病毒I群的12个血清型病毒株均具有良好反应性，来自于禽腺病毒I群Penton蛋白杂交瘤细胞Mab-Penton-6株，该杂交瘤细胞株已于2020年04月08日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCCNo.19662。

2.如权利要求1所述一种检测禽腺病毒I群的间接免疫荧光试剂盒，其特征在于所述抗禽腺病毒I群的单克隆抗体，是基于Penton蛋白保守序列所制备的单克隆抗体，所述Penton蛋白保守序列的核苷酸序列如序列1所示，可同时识别禽腺病毒I群12个血清型病毒，而不与鸡减蛋综合征病毒(EDSV)发生交叉反应；Penton蛋白作为禽腺病毒重要的免疫原性蛋白，在禽腺病毒I群不同血清型毒株之间相对保守。

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