CN107937352B

CN107937352B - 用于检测小反刍兽疫病毒h蛋白抗体的胶体金免疫层析试纸条

Info

Publication number: CN107937352B
Application number: CN201711144370.2A
Authority: CN
Inventors: 陈西钊; 孙明; 田克恭; 吴培星; 迟立超; 冯向辉; 孔汉金; 申屠芬琴; 张丽
Original assignee: Beijing Anheal Laboratories Co ltd
Current assignee: Beijing Anheal Laboratories Co ltd
Priority date: 2017-08-02
Filing date: 2017-11-17
Publication date: 2020-09-29
Anticipated expiration: 2037-11-17
Also published as: CN107937352A

Abstract

本发明“一株可分泌PPRV‑H mAb的杂交瘤细胞株PPRV‐H4C₁₂、其分泌的PPRV‑H mAb及包含该PPRV‑H mAb的胶体金免疫层析试纸条”，属于动物疫病检测领域。所述杂交瘤细胞株PPRV‐H4C12的保藏号为CGMCC No.13383。所述小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体由所述的杂交瘤细胞株PPRV‑H4C12分泌而得。所述试纸条包括所述抗体。该试纸条具有操作简便、成本低廉、现场操作、无需专业仪器、人员，结果直观可见，可快速、特异的检测血清中小反刍兽疫病毒H蛋白抗体。本发明适用于疫苗免疫动物中和抗体水平的快速现场评估。

Description

用于检测小反刍兽疫病毒H蛋白抗体的胶体金免疫层析试纸条

技术领域

本发明属于动物疫病检测领域，具体涉及一株可分泌PPRV-H mAb的杂交瘤细胞株PPRV‐H4C₁₂、其分泌的PPRV-H mAb及包含该PPRV-H mAb的胶体金免疫层析试纸条。

背景技术

小反刍兽疫(Peste des petits ruminants，PPR)又被称为小反刍兽假性牛瘟，是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)引起山羊、绵羊以及包括野生动物在内的多种小反刍动物的一种急性、烈性传染病。目前PPR已被世界动物卫生组织(OIE)规定为法定报告传染病，我国农业部也将其列为一类动物疫病。PPR主要流行于撒哈拉以南的非洲、阿拉伯半岛和整个印度次大陆。2007年7月我国西藏地区首次发生PPR疫情，此后我国新疆、甘肃、内蒙古等多个省份均有该疫情发生的报道。PPR因其具有极高的发病率和死亡率 (70～80％)，在流行国家和地区对当地畜牧业造成了毁灭性的打击，给当地农场主和牧民造成严重的经济损失。因此，对PPR疫情的监测和防控关系到我国养羊业的健康发展，并具有重要的公共卫生意义。

小反刍兽疫病毒属于副粘病毒科麻疹病毒属成员，其基因组为单股负链 RNA，基因组全长为15,948nt，编码N、P、M、F、H、L 6个结构蛋白和C、V 两个非结构蛋白。在病毒的这些结构蛋白中，N蛋白保守性最强、抗原性也最稳定，能够刺激机体产生强烈的免疫应答，在PPRV的阳性血清中，针对N蛋白的抗体占主导地位，但是此抗体并不能起到中和病毒的作用，主要用于诊断研究，常作为诊断抗原。在病毒侵入宿主细胞的过程中H蛋白起到重要的作用，当病毒侵染细胞时，病毒通过H蛋白与宿主细胞的受体结合，然后病毒囊膜与细胞膜融合，使核衣壳进入受体细胞胞浆内，衣壳蛋白去蛋白化后，病毒基因组开始转录过程。H蛋白具有很强的免疫原性，能够刺激机体产生中和抗体，从而抑制病毒入侵宿主细胞。因些，通过检测血清中的H蛋白抗体水平，可以对PPRV 疫苗免疫情况进行评估。

目前，常用的实验室诊断技术分为：病毒分离培养、血清学检测和抗原检测。主要包括病毒分离、病毒中和试验(VN)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、琼脂凝胶免疫扩散(AGID)、对流免疫电泳(CIEP)、聚合酶链式反应(RT-PCR)、胶体金免疫层析以及其他分子生物学等检测方法。VN是国际贸易指定试验，但此方法检测时间长，检测的血清样品对细胞形态有较大影响，结果判定带有一定的主观性。PCR和竞争ELISA是被OIE指定为标准的检测方法，也是目前应用最为广泛的检测方法，但这两种方法都需要在实验室仪器设备配合的条件下才能完成。胶体金免疫层析技术是一种快速的诊断方法，与ELISA方法相比，它省去了繁琐的加样、洗涤步骤。因而这种分析技术操作简单快速,分析结果清楚,易于判断,且无须仪器,非常适用于现场快速检测。

目前，国内外还没有检测H蛋白抗体的胶体金免疫层析试纸条，无法现场检测血清中H蛋白的抗体水平，进行快速免疫评估。因此，建立这种迅速简便、针对H蛋白抗体的现场检测技术是一个亟待解决的难题。

发明内容

基于本领域存在的上述空白和需求，本发明采用全病毒免疫动物的方法筛选得到一株可稳定分泌小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体(Peste des petits ruminants virusH protein monoclonal antibody,PPRV-H mAb)的杂交瘤细胞株 PPRV-H4C12，并利用其分泌的小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体(PPRV-H mAb)进行胶体金标记，制成试纸条，用于检测小反刍兽疫病毒H蛋白抗体。基于所述杂交瘤细胞株分泌的PPRV-H mAb制成的胶体金试纸条在检测小反刍兽疫病毒H蛋白抗体方面具有高度的敏感性、特异性和准确率。

本发明的技术方案如下：

本发明的第一个方面提供一株可分泌小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株PPRV-H4C12，其保藏号为CGMCC No.13383。本发明采用小反刍兽疫全病毒做为免疫原对小鼠进行免疫，并将免疫后的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP 2/0)进行细胞融合获得一批杂交瘤细胞，并筛选鉴定出一株可高效、稳定地分泌小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体(Peste des petits ruminants virus H protein monoclonal antibody,PPRV-H mAb)的杂交瘤细胞株PPRV-H4C12，该细胞株连续传代培养20代后，其分泌的小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体PPRV-H mAb的效价还能保持在1:2560。本领域技术人员熟知，采用全病毒免疫动物，动物体内发生的免疫反应可针对免疫原病毒的不同蛋白，即不同的抗原位点发生免疫反应，因而产生针对不同蛋白的不同抗体，动物体内免疫反应的发生机制和抗体产生过程是不确定的，可随机针对小反刍兽疫病毒内的N、P、M、F、H、 L 6个结构蛋白和C、V两个非结构蛋白产生不同的抗体。

本发明的第二个方面提供一种小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体，其特征在于，由所述的杂交瘤细胞株PPRV-H4C12分泌而得。该抗体经后续的胶体金试纸条检测效果验证是一种很好的用来制备小反刍兽疫病毒H蛋白抗体检测试剂的抗体材料。本发明所述的小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体，由小反刍兽疫病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌产生。此杂交瘤细胞株的获得是将纯化的小反刍兽疫全病毒免疫小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合后,进一步亚克隆,筛选出分泌抗小反刍兽疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株,经Western Blot鉴定，优选出一株可稳定分泌抗小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体(PPRV-H mAb)的杂交瘤细胞株，命名为4C12。

杂交瘤细胞株PPRV-H4C12已于2016年12月9日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰路1号院3号，中国科学院微生物研究所，简称CGMCC，邮编100101)保藏，分类命名为杂交瘤细胞，保藏号为：CGMCC No.13383。

在一些实施例中，所述小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体的亚型为IgG1， Kappa链。

本发明的第三个方面提供了所述的小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体在制备小反刍兽疫病毒H蛋白抗体检测试剂中的应用。

本发明的第四个方面提供一种用于检测样品中是否含有小反刍兽疫病毒H 蛋白抗体的胶体金免疫层析试纸条，其包括：用于设置在固相载体上的胶体金标记的所述的小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体，以及，用于设置在固相载体上并用于结合和/或捕获小反刍兽疫病毒H蛋白抗体的小反刍兽疫病毒H蛋白抗原；所述固相载体上，按所述样品的层析流动方向，胶体金标记的所述小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体的设置位置位于小反刍兽疫病毒H蛋白抗原的设置位置的上游。本发明的胶体金免疫层析试纸条检测样品中是否含有小反刍兽疫病毒H蛋白抗体的检测原理在于，如果样品中存在小反刍兽疫病毒H蛋白抗体，那么它会与设置在试纸条上的胶体金标记的所述的小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体(Au-PPRV-H mAb)一起层析涌动，流向小反刍兽疫病毒H蛋白抗原 (PPRV-H)的设置位置，样品中的小反刍兽疫病毒H蛋白抗体与胶体金标记的所述的小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体(Au-PPRV-H mAb)竞争结合小反刍兽疫病毒H蛋白抗原，形成的小反刍兽疫病毒H蛋白抗体-抗原结合物，在小反刍兽疫病毒H蛋白抗原(PPRV-H)的设置位置就不产生显色反应；如果样品中不存在小反刍兽疫病毒H蛋白抗体，就不会与胶体金标记的所述的小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体(Au-PPRV-H mAb)竞争结合小反刍兽疫病毒H蛋白抗原(PPRV-H)的设置位置小反刍兽疫病毒H蛋白抗原(PPRV-H)，那么就只有胶体金标记的所述的小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体(Au-PPRV-H mAb)与小反刍兽疫病毒H蛋白抗原(PPRV-H)的设置位置的小反刍兽疫病毒H蛋白抗原(PPRV-H)结合，形成胶体金标记的所述的小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体-抗原复合物(Au-PPRV-H mAb-PPRV-H)，此时就会发生显色反应。

只有样品中存在小反刍兽疫病毒H蛋白抗体达到一定浓度才能竞争到大部分小反刍兽疫病毒H蛋白抗原(PPRV-H)，才能达到T线不显色的效果。即使 Au-PPRV-H mAb竞争到一些小反刍兽疫病毒H蛋白抗原(PPRV-H)，但是如果达不到肉眼能观察的程度，则试纸条就起不到定性检测的作用。所以当样品中存在小反刍兽疫病毒H蛋白抗体达到一定浓度结合到大部分的小反刍兽疫病毒H 蛋白抗原(PPRV-H)，在小反刍兽疫病毒H蛋白抗原(PPRV-H)的设置位置就不产生显色反应。为此，本发明测定了达到显色反应所需的小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体的最低浓度为10ng/ml。

在一些实施例中，胶体金标记的所述小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体设置在所述固相载体上形成结合区；所述小反刍兽疫病毒H蛋白抗原设置在所述固相载体上形成检测线。

结合垫上喷涂有胶体金标记的抗小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体，即 Au-PPRV-H mAb，硝酸纤维素膜包被有纯化的昆虫杆状病毒表达系统表达的小反刍兽疫病毒H蛋白，即PPRV-H。检测时，当样本中存在小反刍兽疫病毒H蛋白抗体时，则与Au-PPRV-H mAb竞争，与PPRV-H结合,使检测线不显色。反之，显红色。

在优选的实施例中，所述结合区和所述检测线在所述固相载体上的设置位置不重叠。

在进一步的实施例中，所述胶体金免疫层析试纸条还包括：用于设置在固相载体上并用于结合小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体的的羊抗鼠IgG抗体。

在具体的实施例中，其特征在于，所述羊抗鼠IgG抗体设置在固相载体上形成质控线，所述质控线与结合区、检测线在固相载体上的设置位置互不干扰重叠。

采用上述胶体金免疫层析试纸条检测小反刍兽疫病毒H蛋白抗体时，检测原理如下：当被检样品中含有小反刍兽疫病毒H蛋白抗体时,Au-PPRV-H mAb 与样品中小反刍兽疫病毒H蛋白抗体一起层析移动，在喷涂检测线上的竞争包被PPRV-H，检测线形成小反刍兽疫病毒H蛋白抗体-PPRV-H复合物，未结合的 Au-PPRV-H mAb继续运动到质控线上，被羊抗鼠IgG捕获,形成Au-PPRV-H mAb- 羊抗鼠IGg复合物,此时，检测线不显色，而质控线显示出肉眼可见的红色。当被检样品中不含有小反刍兽疫病毒H蛋白抗体时，Au-PPRV-H mAb与检测线上 PPRV-H形成复合物，过量的Au-PPRV-H mAb继续运动到质控线上，被羊抗鼠 IgG捕获,形成Au-PPRV-H mAb-羊抗鼠IgG复合物,检测线与质控线均显示出肉眼可见的红色。结果判定：检测线不显色，质控线显红色，检测样品为阳性，检测线和质控线都显红色，检测样品为阴性，若质控线和检测线均不显色,则说明试纸条失效。

在更具体的实施例中，所述固相载体为硝酸纤维素膜；

所述设置指喷涂；

所述胶体金标记的所述小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体在结合区上的喷涂量为65ul/cm²，所述胶体金标记的小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体的工作浓度为240ug/ml；结合区是长度为0.4cm，宽度为0.5cm，所以结合区的喷涂量单位用ul/cm²

所述小反刍兽疫病毒H蛋白抗原在检测线上的喷涂量为1ul/cm(浓度： 1mg/ml)；检测线只有很细的一条，宽度可以忽略不计，只按长度来计算，所以单位是ul/cm。

所述羊抗鼠IgG抗体在质控线上的喷涂量为1ul/cm(浓度：1mg/ml)。同上, 质控线只有很细的一条，宽度可以忽略不计，只按长度来计算，所以单位是ul/cm。

在另一些实施例中，所述胶体金与所述的小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体在胶体金标记过程中的标记比含量为：1ml胶体金∶9.6μg所述的小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体。

在最具体的实施例中，所述小反刍兽疫病毒H蛋白抗原通过下述步骤获得：

采用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.1所示的引物对，以小反刍兽疫病毒RNA 为模板进行RT-PCR扩增，将所获得的扩增片段连接至表达载体，并将重组后的表达载体与待重组病毒共转染感受态细胞获得重组病毒；所述重组病毒表达所述小反刍兽疫病毒H蛋白抗原。

本发明所述的小反刍兽疫病毒H蛋白(PPRV-H)是用昆虫杆状病毒表达系统表达的，根据小反刍兽疫病毒H基因序列设计并合成两条引物， PPRV-H-F:CGGGATCCAACTCCTAAAAAACCGCCACCatgtccgcacaaagggaaPPRV -H-R:CGGGGTACCtcagactggattacatgt，上游引物的起始密码子前引入BamHⅠ酶切位点和L21前导序列，下游引物引入KpnⅠ酶切位点；以提取的小反刍兽疫病毒RNA为模板，应用RT-PCR方法扩增小反刍兽疫病毒的H基因，并将其克隆到pbacPAK9载体中，获得重组载体pbacPAK9-H，用脂质体介导法将其与线性化杆状病毒bacPAK6共转染至SF21细胞中，经蚀斑纯化获得纯的重组杆状病毒，优化表达条件并用SDS-PAGE进行鉴定。

在进一步的实施例中，所述表达载体为pBacPAK9质粒；

所述待重组病毒为线性化杆状病毒BacPAK6；

所述感受态细胞为SF21细胞。

本发明的第五个方面还请求保护所述的胶体金免疫层析试纸条在检测小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体方面的应用。

本发明所提供的保藏号为CGMCC No.13383的杂交瘤细胞株PPRV-H4C12可高效稳定地分泌PPRV-H mAb；而本发明所提供的杂交瘤细胞株PPRV-H4C12分泌的PPRV-H mAb具有特异性好、敏感性强、效价高等优点，可用于研制小反刍兽疫病毒的免疫学诊断试剂,如胶体金免疫试纸条等。本发明基于杂交瘤细胞株PPRV-H4C12分泌的PPRV-H mAb进一步开发的胶体金免疫层析试纸条采用竞争法检测样品中的小反刍兽疫病毒H蛋白抗体，可以现场进行初步的免疫效果评估，填补了小反刍兽疫病毒领域胶体金检测试剂的空白，同时，本发明的胶体金层析试纸条在检测小反刍兽疫病毒H蛋白抗体时，操作简便、快速、特异性强、敏感性高、肉眼判读、实验结果易保存、无需专业人员、特殊仪器设备和试剂。

所述杂交瘤细胞株已送保藏，其保藏信息如下：

细胞株保藏名称：PPRV‐H4C12

保藏号：CGMCC No.13383

分类命名：小鼠杂交瘤细胞系

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2016年12月09日

附图说明

图1为免疫胶体金试纸组装示意图。图中标记列示如下：1-样品垫；2-结合垫；3-检测线T；4-质控线C；5-吸收垫；6-硝酸纤维素膜；7-硬质聚氯乙烯衬板。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明,并不局限于所述最佳实施方式,不对本发明的内容和保护范围构成限制,任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的方法和产品,均落在本发明的保护范围之内。

生物材料的来源

PPRV全病毒来自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司；

BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；

小反刍兽疫病毒、O型口蹄疫病毒、羊痘病毒、羊传染性脓疱病毒来自于商购疫苗与诊断试剂；

Trans5α感受态菌来自北京全式金生物技术有限公司；

SF21细胞来自北京六合通经贸有限公司；

线性化杆状病毒BacPAK6来自北京六合通经贸有限公司；

91份被检血清样品来自中国动物疫病预防控制中心。

第1组实施例、本发明的杂交瘤细胞株

本组实施例提供一株可分泌小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株PPRV-H4C12，其保藏号为CGMCC No.13383。本发明采用小反刍兽疫全病毒做为免疫原对小鼠进行免疫，并将免疫后的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞 (SP2/0)进行细胞融合获得一批杂交瘤细胞，并筛选鉴定出一株可高效、稳定地分泌小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体(Peste des petits ruminants virus H protein monoclonal antibody,PPRV-H mAb)的杂交瘤细胞株PPRV-H4C12，该细胞株培养传代20代后，其分泌的抗体效价仍能高达1：2560。本领域技术人员熟知，采用全病毒免疫动物，动物体内发生的免疫反应可针对免疫原病毒的不同蛋白，即不同的抗原位点发生免疫反应，因而产生针对不同蛋白的不同抗体，动物体内免疫反应的发生机制和抗体产生过程是不确定的，可随机针对小反刍兽疫病毒内的N、P、M、F、H、L 6个结构蛋白和C、V两个非结构蛋白产生不同的抗体。

第2组实施例、本发明的小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体

本组实施例提供一种小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体。在本组所有的实施例中，所述小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体都具有如下共同特征：所述小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体由第一组实施例所提供的杂交瘤细胞株 PPRV-H4C12分泌而得。该抗体经后续的胶体金试纸条检测效果验证是一种很好的用来制备小反刍兽疫病毒H蛋白抗体检测试剂的抗体材料。本发明所述的小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体，由小反刍兽疫病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌产生。此杂交瘤细胞株的获得是将纯化的小反刍兽疫全病毒免疫小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合后,进一步亚克隆,筛选出分泌抗小反刍兽疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株,经Western Blot鉴定，优选出一株可稳定分泌抗小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体(PPRV-H mAb)的杂交瘤细胞株，命名为PPRV-H4C12。

第3组实施例

本组实施例提供了所述的小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体在制备小反刍兽疫病毒H蛋白抗体检测试剂中的应用。

具体的应用过程中涉及的操作手段、实验步骤可参考实验例3中记载的操作步骤。

第4组实施例

本组实施例提供一种用于检测样品中是否含有小反刍兽疫病毒H蛋白抗体的胶体金免疫层析试纸条。在本组所有的实施例中，所述胶体金免疫层析试纸条都具有如下特征：所述试纸条包括用于设置在固相载体上的胶体金标记的所述的小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体，以及，用于设置在固相载体上并用于结合和/或捕获小反刍兽疫病毒H蛋白抗体的小反刍兽疫病毒H蛋白抗原；所述固相载体上，按所述样品的层析流动方向，胶体金标记的小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体的设置位置位于小反刍兽疫病毒H蛋白抗原的设置位置的上游。本发明的胶体金免疫层析试纸条检测样品中是否含有小反刍兽疫病毒H蛋白抗体的检测原理在于，如果样品中存在小反刍兽疫病毒H蛋白抗体，那么它会与设置在试纸条上的胶体金标记的所述的小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体 (Au-PPRV-H mAb)一起层析涌动，流向小反刍兽疫病毒H蛋白抗原(PPRV-H) 的设置位置，样品中的小反刍兽疫病毒H蛋白抗体与胶体金标记的所述的小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体(Au-PPRV-H mAb)竞争结合小反刍兽疫病毒H 蛋白抗原，形成小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体-抗原结合物，在小反刍兽疫病毒H蛋白抗原(PPRV-H)的设置位置就不产生显色反应；如果样品中不存在小反刍兽疫病毒H蛋白抗体，就不会与胶体金标记的所述的小反刍兽疫病毒H 蛋白单克隆抗体(Au-PPRV-H mAb)竞争结合小反刍兽疫病毒H蛋白抗原 (PPRV-H)的设置位置小反刍兽疫病毒H蛋白抗原(PPRV-H)，，那么就只有胶体金标记的所述的小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体(Au-PPRV-H mAb)与小反刍兽疫病毒H蛋白抗原(PPRV-H)的设置位置的小反刍兽疫病毒H蛋白抗原 (PPRV-H)结合，形成胶体金标记的所述的小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体- 抗原复合物(Au-PPRV-H mAb-PPRV-H)，此时就会发生显色反应。

在一些实施例中，所述胶体金标记的第2组实施例所述的小反刍兽疫病毒H 蛋白单克隆抗体设置在所述固相载体上形成结合区；所述小反刍兽疫病毒H蛋白抗原设置在所述固相载体上形成检测线。

结合垫上喷涂有胶体金标记的抗小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体，即 Au-PPRV-H mAb，硝酸纤维素膜包被有纯化的昆虫杆状病毒表达系统表达的小反刍兽疫病毒H蛋白，即PPRV-H-Pc。检测时，当样本中存在小反刍兽疫病毒H 蛋白抗体时，则与Au-PPRV-H mAb竞争，与PPRV-H-Pc结合,使检测线不显色。反之，显红色。

在进一步的实施例中，所述胶体金免疫层析试纸条还包括：用于设置在固相载体上并用于结合胶体金标记的所述的小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体 (Au-PPRV-H mAb)的羊抗鼠IgG抗体。

采用上述胶体金免疫层析试纸条检测小反刍兽疫病毒H蛋白抗体时，检测原理如下：当被检样品中含有小反刍兽疫病毒H蛋白抗体时,Au-PPRV-H mAb 与样品中小反刍兽疫病毒H蛋白抗体一起层析移动，在喷涂检测线上竞争包被的PPRV-H，检测线形成小反刍兽疫病毒H蛋白抗体-PPRV-H复合物，未结合的 Au-PPRV-H mAb继续运动到质控线上，被羊抗鼠IgG捕获,形成Au-PPRV-H mAb- 羊抗鼠IgG复合物,此时，检测线不显色，而质控线显示出肉眼可见的红色。当被检样品中不含有小反刍兽疫病毒H蛋白抗体时，Au-PPRV-H mAb与检测线上PPRV-H形成复合物，过量的Au-PPRV-H mAb继续运动到质控线上，被羊抗鼠 IgG捕获,形成Au-PPRV-H mAb-羊抗鼠IGg复合物,检测线与质控线均显示出肉眼可见的红色。结果判定：检测线不显色，质控线显红色，检测样品为阳性，检测线和质控线都显红色，检测样品为阴性，若质控线和检测线均不显色,则说明试纸条失效。

在更具体的实施例中，所述固相载体为硝酸纤维素膜；本领域技术人员开可以采用除硝酸纤维素膜以外的其它固相载体，如玻璃片、硅胶晶片、尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、微缩磁珠等。本领域技术人员可根据实际需求，如产品成本、尺寸、包装要求具体选择采用哪种更符合要求的固相载体。

所述设置指喷涂；当然，本领域技术人员还可以采用其它常规设置手段，例如，涂布、浸泡、划线等等。

所述胶体金标记的小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体在结合区上的喷涂量为65ul/cm²，所述胶体金标记的小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体的工作浓度为 240ug/ml；

所述小反刍兽疫病毒H蛋白抗原在检测线上的喷涂量为1ul/cm；所述小反刍兽疫病毒H蛋白抗原的工作浓度为1mg/ml；

所述羊抗鼠IgG抗体在质控线上的喷涂量为1ul/cm；所述羊抗鼠IgG抗体的工作浓度为1mg/ml。

在另一些实施例中，所述胶体金与所述的小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体在胶体金标记过程中的标记比含量为：1ml胶体金∶20μg第2组实施例所提供的小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体。

采用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.1所示的引物对，以小反刍兽疫病毒RNA 为模板进行RT-PCR扩增，将所获得的扩增片段连接至表达载体，并将重组后的表达载体与待重组病毒共转染感受态细胞获得重组病毒；所述重组病毒科表达所述小反刍兽疫病毒H蛋白抗原。

在进一步的实施例中，所述表达载体为pBacPAK9质粒；

所述待重组病毒为线性化杆状病毒BacPAK6；

所述感受态细胞为SF21细胞。

第5组实施例

本组实施例提供第4组实施例所述的胶体金免疫层析试纸条在检测小反刍兽疫病毒H蛋白抗体方面的应用。

所述具体的应用操作步骤和实验程序可以是：将待测样品滴加至所述试纸条上，看具体的显色反应结果，以判断样品中是否存在小反刍兽疫病毒和/或小反刍兽疫病毒H蛋白抗体。

实验例1、本发明杂交瘤细胞株的获得

1、免疫抗原制备：VERO细胞长成单层后接种PPRV，37℃孵育1h。加入 2％胎牛血清的完全培养基继续培养，4～5天后细胞病变达80％以上时，收获病毒。将收获的病毒液反复冻融2次，6000rpm/min离心30min，取上清液用0.45 μm滤膜过滤，用100K超滤管浓缩后，8000rpm/min离心30min，收集上清。将收集上清加入Sepharose-4FF柱，收集样品峰，超滤浓缩后，用BioDrop超微量蛋白核酸分析仪测定其蛋白含量。SDS-PAGE电泳鉴定后，-70℃保存备用。

2、小反刍兽疫病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选，单克隆抗体的制备

2.1动物免疫：纯化的PPRV全病毒作为免疫原。免疫小鼠时，取免疫原与等量的弗氏佐剂，制成乳化剂，按照下表的免疫程序免疫6周龄BALB/c小鼠，每只小鼠50μg，免疫间隔为2周，第三次免疫2周后，小鼠眼底采血，收集血清，用纯化的PPRV全病毒建立的间接ELISA检测血清抗体效价,选择效价最高的一只，加强免疫。

表1：BALB/c小鼠免疫方案

2.2细胞融合

2.2.1饲养细胞制备

细胞融合的前24h，将未免疫的BALB/c小鼠眼球采血并处死，浸泡于75％酒精5min后，置超净工作台中，无菌吸取小鼠腹腔细胞制备成饲养细胞，细胞浓度为2×10⁵个/ml，用含HAT的完全培养基悬浮细胞。加入96孔细胞培养板中(100μl/孔)，置于37℃,5％CO2的培养箱中培养。

2.2.2细胞融合

将上述免疫小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞相融合。无菌取出小鼠脾脏,研磨成脾细胞悬液，与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)以10:1比例混合,1000r/min离心5min,弃上清，经50％PEG1450作用,将两种细胞融合，融合后的细胞液1000r/min离心7min，重悬于含HAT的完全培养基(含20％胎牛血清的DMEM培养基)100μl/孔，加入有饲养细胞的96孔培养板中，置于37℃，5％CO2 培养箱中培养。

2.2.3杂交瘤细胞的筛选

融合后，每天观察细胞生长情况，待培养孔中杂交瘤细胞生长至孔底1/3～ 1/2时，取细胞上清原液，用间接ELISA方法进行检测，对检测特异性抗体阳性孔的细胞根据有限稀释法进一步亚克隆，直至检测到阳性的单克隆细胞株后，扩大培养。

2.2.4效价检测

包被抗原板：包被原为PPRV全病毒(PPRV-ELISA)。

2.2.4.1用包被液将包被原稀释至工作浓度(1μg/ml)；向板孔中每孔加100μl， 4℃过夜；然后弃去孔内液体。洗涤三次，拍干。

2.2.4.2每孔加200μl封闭液，37℃2h，洗涤2次，拍干。

2.2.4.3将待测培养上清液顺序加入，每孔100μl；每块板同时设空白对照、阴性对照和阳性对照各2孔。置37℃1h，洗涤5次，拍干。

2.2.4.4用稀释液将酶标二抗稀释到工作浓度，每孔加100μl，置37℃1h，洗涤5次，拍干。

2.2.4.5各孔加A液和B液各50μl，反应10min。

2.2.4.6每孔加终止液50μl终止反应。

2.2.4.7判定结果：空白对照调零，阴性对照孔(SP2/0细胞上清)无颜色反应，阳性对照孔(免疫小鼠血清)有颜色反应。待测样品孔OD值P/N≥2.1倍，即为阳性。

2.2.5筛选结果

经过三次亚克隆，筛选出22株PPRV-ELISA检测均为阳性、能高效稳定分泌抗小反刍兽疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将稳定的单克隆抗体杂交瘤细胞株逐步扩大培养，直至能在细胞培养瓶中稳定传代，冻存保存。

2.2.6杂交瘤细胞及单克隆抗体的鉴定

用Western Blot对筛选出的15株杂交瘤细胞的上清进一步鉴定，选出1株高效、稳定分泌PPRV-H mAb的杂交瘤细胞株，命名为4C12。

表2：PPRV-H mAb 4C12不同代次上清检测结果

2.2.7单克隆抗体免疫球蛋白类及亚类的鉴定

经Southern Biotech公司试剂盒测定，杂交瘤细胞株PPRV-H4C12分泌的PPRV-HmAb的亚型鉴定结果：IgG1，kappa链。

2.2.8腹水制备及效价

采用体内诱生腹水法制备单克隆抗体

选择20g以上BALB/C小鼠，每只腹腔内注射灭菌液体石蜡0.5ml；18d后，接种杂交瘤细胞。将培养的杂交瘤细胞吹打下来，1000rpm离心5min，弃去上清液，用无血清培养基将其混匀，并将细胞数调至3×10⁵个/ml，每只小鼠腹腔注射0.5ml；植入细胞后第7d起，每天观察小鼠腹部，待小鼠腹部明显膨大，用 9#针头穿刺腹腔，采集腹水，3000rpm离心10min，收集上清液，测定效价。用间接ELISA方法测定细胞上清效价为1:2560，小鼠腹水效可达到1:64000。

2.2.9单克隆抗体的纯化

上述腹水采用辛酸/硫酸铵沉淀法纯化,得到纯化的单克隆抗体经SDS-PAGE 鉴定并用BioDrop超微量蛋白核酸分析仪测定蛋白含量,纯化的单克隆抗体浓度为2mg/ml，-70℃保存备用。此处的单克隆抗体浓度2mg/ml是纯化后的浓度，仅反应纯化后得到的抗体的量，是保存浓度。与本文中胶体金标记的单克隆抗体浓度(工作浓度)是两个概念。

2.2.10单克隆抗体的特异性

采用间接ELISA对单克隆抗体特异性进行鉴定。用小反刍兽疫病毒、O型口蹄疫病毒、羊痘病毒、羊传染性脓疱病毒作为抗原,分别建立间接ELISA方法，检测杂交瘤细胞培养上清。结果显示，除小反刍兽疫病毒之外，细胞上清均不其他抗原有免疫反应，表明该单克隆抗体具有良好的特异性。

表3：PPRV-H mAb特异性检测结果

实验例2、用于本发明胶体金试纸条的小反刍兽疫病毒H蛋白抗原制备

包被抗原制备：

1、PPRV H基因的扩增

根据小反刍兽疫病毒H基因序列设计两条引物， PPRV-H-F:CGGGATCCAACTCCTAAAAAACCGCCACCatgtccgcacaaagggaa PPRV-H-R:CGGGGTACCtcagactggattacatgt，带下划线部分分别为方便克隆而引入的酶切位点，加粗的部分为引入的L21前导序列，进行引物合成。以提取的小反刍兽疫病毒RNA为模板、PPRV-H-F和PPRV-H-R为引物，进行PPRV-H基因的RT-PCR扩增，具体的反应条件为42℃45min；94℃3min；94℃30S，52℃ 30S，72℃40S，35个循环；72℃10min。PCR产物于1.5％的琼脂糖凝胶中经电泳鉴定后进行胶回收，回收产物与PMD-19T载体4℃连接过夜，转化Trans5 α感受态细胞，挑取单菌落进行PCR鉴定，将鉴定正确的质粒命名为PMD-H 并测序。

2、pBacPAK9-H重组质粒的构建

以BamHⅠ和KPNⅠ分别双酶切PMD-H和杆状病毒表达质粒pBacPAK9，回收目的片段，利用T4DNA连接酶16℃过夜连接后转化到Trans5α感受态菌，挑单菌落进行PCR和酶切鉴定，阳性重组质粒命名为pBacPAK9-H。

3、SF21的转染及重组病毒的纯化与鉴定

参照BacPAKTM杆状病毒表达系统使用手册的说明将重组质粒 pBacPAK9-H和线性化杆状病毒BacPAK6共转染SF21细胞，25℃培养4天后取上清进行蚀斑纯化，挑取3个空斑在SF21细胞中分别传代，提取传代后的杆状病毒DNA，用clontech公司提供的引物进行PCR鉴定，保存鉴定出的重组杆状病毒备用。

4、重组蛋白的表达和鉴定

用感染复数(MOI)为5的重组杆状病毒感染对数生长期的SF21细胞，25℃培养4天后离心收集细胞，加入适量细胞裂解液，100℃处理5min后进行 SDS-PAGE电泳。

5、表达产物活性的鉴定

按4所述表达条件培养250ml重组杆状病毒，离心收取细胞，加入25ml pH7.5 1％Triton X-100的Tris缓冲液反复冻融裂解，离心取上清作为包被抗原，用间接法对英国BDSL公司的试剂盒中的PPRV H蛋白单抗及上述筛选的H蛋白单抗进行ELISA试验，经检测细胞裂解后离心的上清与两种H蛋白单抗均有反应活性。

6、抗原纯化

6.1将批量培养的重组杆状病毒离心收取细胞，加入pH7.5 1％Triton X-100 的Tris缓冲液反复冻融裂解，离心收取上清。

6.2根据Sepharose 4B说明书，将纯化的PPRV-H mAb与活化的Sepharose 4B 偶联,制备PPRV-H mAb-Sepharose 4B亲和层析柱。

6.3将6.2中亲和层析柱用TBS(50mmol/L Tris-Cl、150mmol/L NaCl,pH7.8) 平衡，然后加入6.1中收集到的离心上清混合,于4℃反应1h后装柱。以TBS充分洗涤后，用5倍柱床体积的0.1mol/L Gly-HCl(pH 2.7)溶液洗脱，流速为1.5 ml/min,收集洗脱液，pH值立即用1mol/L Tris-HCl(pH 9.0)中和至PH 7.0～7.2。最后，洗脱液用TBS透析过夜，用BioDrop超微量蛋白核酸分析仪测定蛋白含量，分别用SDS-PAGE和ELISA对蛋白纯度和抗原活性进行鉴定。

实验例3、本发明的胶体金试纸条制备

免疫胶体金试纸条的制备

如附图1，本发明为检测小反刍兽疫病毒H蛋白抗体的胶体金免疫层析试纸条,该试纸条是由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫、硬质聚氯乙烯衬板通过粘结组合而成。胶体金结合垫由玻璃纤维素膜制成,该胶体金结合垫上喷涂胶体金标记的抗小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体，即Au-PPRV-H mAb。硝酸纤维素膜为试纸条的检测膜,硝酸纤维素膜的中部喷涂有检测线和质控线,左侧为检测线,右侧为质控线,检测线喷涂表达纯化的小反刍兽疫病毒H蛋白，即 PPRV-H-Pc，质控线喷涂羊抗鼠IgG抗体。

当被检样品中含有小反刍兽疫病毒H蛋白抗体时,Au-PPRV-H mAb与样品中小反刍兽疫病毒H蛋白抗体一起层析移动，在喷涂检测线上的竞争包被 PPRV-H-Pc，检测线形成小反刍兽疫病毒H蛋白抗体-PPRV-H-Pc复合物，未结合的Au-PPRV-H mAb继续运动到质控线上，被羊抗鼠IgG捕获,形成Au-PPRV-H mAb-羊抗鼠IGg复合物,此时，检测线不显色，而质控线显示出肉眼可见的红色。当被检样品中不含有小反刍兽疫病毒H蛋白抗体时，Au-PPRV-HmAb与检测线上PPRV-H-Pc形成复合物，过量的Au-PPRV-H mAb继续运动到质控线上，被羊抗鼠IgG捕获,形成Au-PPRV-H mAb-羊抗鼠IGg复合物,检测线与质控线均显示出肉眼可见的红色。结果判定：检测线不显色，质控线显红色，检测样品为阳性，检测线和质控线都显红色，检测样品为阴性，若质控线和检测线均不显色，则说明试纸条失效。

1、胶体金的制备

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金。量取99ml超纯水于洁净的三角烧瓶中，加入1ml 1％氯金酸(HAuCl4)溶液微波炉加热至沸腾后，加入1.25ml 1％新配制的柠檬酸三钠溶液，继续加热4min至酒红色。制备的胶体金外观清亮透明，冷却后通过分光光度计扫描其在吸收光谱中产生最大吸收所对应的波长λMax为 530nm，通过电镜观察，制备的胶体金颗粒大小均匀，平均直径为40nm。

2、小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体胶体金标记与纯化

2.1取2μg、4μg、6μg、8μg、10μg PPRV-H mAb，分别加入到装有1ml胶体金的离心管中，5min后在上述各管内分别加入0.1ml 10％氯化钠(NaCl)，混匀静置2h以上观察结果。当PPRV-H mAb量不够时不足以稳定胶体金，管内液体会呈现由红变蓝的聚沉逛现象，当加入PPRV-H量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。记录颜色保持红色不变的最低抗体用量，以最低PPRV-H mAb用量的基础再加10％-20％，即为1ml胶体金待标记的PPRV-HmAb实际用量。当1ml胶体金中单克隆抗体添加量为9.6μg时，为最适抗体标记比含量。

2.2取6支小试管，分别加入5ml胶体金，用0.2mol/L碳酸钾(K2CO3)将胶体金的pH值分别调为6.5、7、7.5、8、8.5、9，然后在每种不同PH值的胶体金中分别加入48μg的PPRV-HmAb，记录颜色保持红色不变的pH值，最佳pH值为9。

2.3确定最适抗体标记比后，取20ml制备好的胶体金溶液置于50ml烧杯中，根据最佳抗体标记浓度，缓慢加入192μl PPRV-H mAb。搅拌1h混匀，加入终浓度为1％的BSA溶液，继续搅拌30min，4℃过夜后，2000rpm/min离心30min，收集上清。将上清溶液于4℃，12000rpm/min，离心30min，弃上清，收集沉淀。将得到的沉淀用硼酸缓冲液进行1/10体积重悬，重复离心一次，2000rpm/min离心30min，收集上清液，4℃保存备用。

3、检测膜检测线和质控线喷洒及胶体金结合垫制备

包被缓冲液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS,PH7.2)，检测膜为硝酸纤维素膜(型号：Millipore HF135,孔径为0.45μm)，将PPRV-H和羊抗鼠IgG用包被缓冲液稀释后，分别喷涂于硝酸纤维素膜上，作为检测线和质控线，H蛋白浓度 1mg/ml，喷涂量为1ul/cm，羊抗鼠IgG浓度为1mg/ml，喷涂量为1ul/cm，置于 37℃温箱烘干备用。胶体金结合垫的材料为玻璃纤维膜，将胶体金标记抗体作2 倍稀释后，喷涂于胶体金结合垫上，喷涂量分为65ul/cm²，37℃烘干备用。上述喷涂量的确定是发明人经过反复调试所得到的最佳喷涂量，喷涂量的多少直接影响试纸条的敏感性。

4、试纸的组装

将样品垫、喷涂有Au-PPRV-H mAb的胶体金结合垫、喷涂有PPRV-H作为检测线和喷涂有羊抗鼠IGg作为质控线的硝酸纤维素膜、吸收垫按顺序依次粘附在硬质聚氯乙烯衬板上。其组装结构为硝酸纤维素膜置于硬质聚氯乙烯衬板的上面,样品垫平贴于硝酸纤维素膜左侧，吸收垫平贴于硝酸纤维素膜右侧,胶体金结合垫平贴于样品垫与硝酸纤维素膜之间，使其一端压于样品垫之下，另一端覆于硝酸纤维素膜之上。组装成的试纸条真空封装，常温保存。

5、检测小反刍兽疫病毒H蛋白抗体的免疫层析胶体金试纸的应用

5.1取40ul待测样品液滴在本发明试纸样品垫上，10min后观察结果，同时分别取已知阳性血清样品和缓冲液分别作为阳性和阴性对照。

5.2结果判定：在样品垫上加入检测样品时，若检测线不显色，为小反刍兽疫病毒H蛋白抗体阳性，即样品中含有小反刍兽疫病毒H蛋白抗体；若检测线显红色，为小反刍兽疫病毒H蛋白抗体阴性，即样品中不含小反刍兽疫病毒H 蛋白抗体；若质控线不显色，则试纸无效。

6、特异性试验：对己知的O型口蹄疫病毒、羊痘病毒、羊口疮病毒的阳性血清及小反刍兽疫病毒H蛋白抗体阳性血清进行交叉试验。只有小反刍兽疫病毒H蛋白抗体阳性血清样品，检测线不显色，呈阳性反应，而与其他几种血清和缓冲液反应时，检测线均显红色，呈阴性反应，表明该方法具有高度的特异性。

7、稳定性试验：将本发明的3批试纸，在37℃恒温培养箱中放置30d后，与常温保存的同批试纸同时检测10份小反刍兽疫病毒H蛋白抗体阳性样品和10 份小反刍兽疫病毒H蛋白抗体阴性样品，结果显示37℃作用30d对本发明的试纸无破坏作用，证明试纸在高温下稳定。

8、免疫胶体金试纸条与病毒中和试验进行比较：71份被检血清样品，其中病毒中和试验结果阳性为41份，阴性为30份；与病毒中和试验相比，免疫胶体金试纸条检测结果敏感性为95.1％，特异性为93.3％，符合率为94.3％(见表3)。尽管与病毒中和试验相比，胶体金试纸条的敏感性和特异性略低，但是中和试验检测时间长，需在实验室中由专业人员进行操作，无法进行快速评估。而免疫胶体金试纸条检测速度快，操作简单，无需专业仪器，适用于免疫效果的现场初步评估。

表3：胶体金试纸条与病毒中和试验检测结果比较

SEQUENCE LISTING

<110> 北京世纪元亨动物防疫技术有限公司

<120> 用于检测小反刍兽疫病毒H蛋白抗体的胶体金免疫层析试纸条

<130> P170678/SJY

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 47

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 小反刍兽疫病毒（Peste des petits ruminants

virus）H蛋白核酸序列引物PPRV-H-F

<400> 1

cgggatccaa ctcctaaaaa accgccacca tgtccgcaca aagggaa 47

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 小反刍兽疫病毒（Peste des petits ruminants

virus）H蛋白核酸序列引物PPRV-H-R

<400> 2

cggggtacct cagactggat tacatgt 27

<210> 3

<211> 1830

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 小反刍兽疫病毒（Peste des petits ruminants

virus）H蛋白的全基因序列

<400> 3

atgtccgcac aaagggaaag gatcaatgcc ttctataaag acaatcttca taataagacc 60

catagggtaa tcctggatag ggaacgctta actattgaaa gaccctacat cttacttgga 120

gtcctactgg taatgtttct gagtctaatt gggctgctgg ccattgcagg gatcaggctt 180

caccgagcca ccgttgggac tgcggagatc cagagtcggc tgaataccaa cattgagttg 240

accgaatcca ttgatcatca aactaaggat gtcttaactc ccctgtttaa aatcattggt 300

gatgaagtcg gcatcagaat tccacagaag ttcagtgatc ttgtcaagtt catctccgat 360

aagattaagt tcctcaaccc tgacagagaa tatgatttta gggatctccg gtggtgtatg 420

aactcccctg agagagtcaa aattaacttt gaccagtttt gtgaatacaa agccgcagtc 480

aagtcagttg aacatatatt tgagtcatca ctcaacaggt cagaaaggtt gcgattattg 540

actcttgggc ccggaacagg ctgtctcggc aggacagtaa caagagctca gttctcagag 600

cttacgctga ccctgatgga cctggatctc gagatgaagc acaacgtgtc ctcagtgttt 660

accgtagtcg aagagggatt attcggaaga acatatactg tctggagatc cgacaccgga 720

aaaccgagca ccagtccagg tattggccgt tttttaagag tcttcgagat cgggctggtg 780

agagatctcg agctgggtgc ccctattttc catatgacca actacctcac agtaaacatg 840

agtgatgact atcggagctg tcttttagca gtaggggagt tgaagctgac agccctatgc 900

accccatctg agactgtgac tctgagtgag agtggagttc caaagagaga gcctcttgtg 960

gttgtgatac tcaacctagc tgggcctact ctagggggcg aactatacag tgtattgcct 1020

accactgacc ccacggtgga gaaactctat ttatcctcac atagggggat tatcaaagat 1080

aacgaggcca attgggtagt accgtcgacc gatgttcgtg atcttcaaaa caaaggagaa 1140

tgtctggtgg aagcatgcaa gactcgacct ccttcatttt gcaatggcac aggaataggc 1200

ccatggtcag aggggagaat ccctgcctac ggggtgatca gggtcagtct tgacttagct 1260

agtgacccgg gtgtagttat cacttcagtg tttggcccat tgatacctca cctatccggt 1320

atggatcttt acaacaatcc gttttcaaga gctgcatggt tggctgtacc accttatgag 1380

cagtcatttc taggaatgat aaatacaatt ggcttcccgg acagagcaga ggttatgccg 1440

cacattttga ccacagagat cagagggcct cgaggtcgtt gtcatgttcc tatagagttg 1500

tccagcagga ttgatgatga tatcaagatc gggtccaaca tggttgtatt gccgacgaag 1560

gacctgaggt acataacagc cacttatgat gtttccagga gcgagcatgc aatcgtgtac 1620

tatatctatg acacgggtcg ctcatcatct tacttctacc cagttcgatt gaatttcagg 1680

ggcaatcctc tctctctgag gatagagtgt tttccctggt atcataaggt gtggtgctac 1740

catgattgtc ttatatacaa caccataaca aacgaagaag tccacacgag agggctgacc 1800

ggtatagagg taacatgtaa tccagtctga 1830

Claims

1.一株可分泌小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株PPRV-H4C12，其保藏号为CGMCC No.13383。

2.一种小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的杂交瘤细胞株PPRV-H4C12分泌而得。

3.权利要求2所述的小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体在制备小反刍兽疫病毒检测试剂中的应用。

4.用于检测样品中是否含有小反刍兽疫病毒H蛋白抗体的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，包括：用于设置在固相载体上的胶体金标记的权利要求2所述的小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体，以及，用于设置在固相载体上并用于结合和/或捕获小反刍兽疫病毒H蛋白抗体的小反刍兽疫病毒H蛋白抗原；

所述固相载体上，按所述样品的层析流动方向，胶体金标记的权利要求2所述的小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体的设置位置位于小反刍兽疫病毒H蛋白抗原的设置位置的上游。

5.根据权利要求4所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述胶体金标记的权利要求2所述的小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体设置在所述固相载体上形成结合区；所述小反刍兽疫病毒H蛋白抗原设置在所述固相载体上形成检测线。

6.根据权利要求4所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，还包括：用于设置在固相载体上并用于结合小反刍兽疫病毒H蛋白抗原-小反刍兽疫病毒H蛋白抗体复合物的羊抗鼠IgG抗体；所述羊抗鼠IgG抗体在固相载体上的设置位置按层析方向位于检测线的下游。

7.根据权利要求5所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，还包括：用于设置在固相载体上并用于结合小反刍兽疫病毒H蛋白抗原-小反刍兽疫病毒H蛋白抗体复合物的羊抗鼠IgG抗体；所述羊抗鼠IgG抗体在固相载体上的设置位置按层析方向位于检测线的下游。

8.根据权利要求6所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述羊抗鼠IgG抗体设置在固相载体上形成质控线，所述质控线与结合区、检测线在固相载体上的设置位置互不干扰重叠。

9.根据权利要求7所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述羊抗鼠IgG抗体设置在固相载体上形成质控线，所述质控线与结合区、检测线在固相载体上的设置位置互不干扰重叠。

10.根据权利要求6-9任一所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述固相载体为硝酸纤维素膜；

所述设置指喷涂；

所述胶体金标记的权利要求2所述的小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体在结合区上的喷涂量为65ul/cm²，所述胶体金标记的小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体的工作浓度为240ug/ml；

所述羊抗鼠IgG抗体在质控线上的喷涂量为1ul/cm，所述羊抗鼠IgG抗体的工作浓度为1mg/ml。

11.根据权利要求4或5所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述胶体金与权利要求2所述的小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体在胶体金标记过程中的标记比含量为：1ml胶体金∶9.6μg权利要求2所述的小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体。

12.根据权利要求4、5、6、7任一所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述小反刍兽疫病毒H蛋白抗原通过下述步骤获得：

采用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对，以小反刍兽疫病毒RNA为模板进行RT-PCR扩增，将所获得的扩增片段连接至表达载体，并将重组后的表达载体与待重组病毒共转染感受态细胞获得重组病毒；所述重组病毒可表达所述小反刍兽疫病毒H蛋白抗原。

13.根据权利要求10所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述小反刍兽疫病毒H蛋白抗原通过下述步骤获得：

14.根据权利要求12所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述表达载体为pBacPAK9质粒；

所述待重组病毒为线性化杆状病毒BacPAK6；

所述感受态细胞为SF21细胞。

15.根据权利要求13所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述表达载体为pBacPAK9质粒；

所述待重组病毒为线性化杆状病毒BacPAK6；

所述感受态细胞为SF21细胞。

16.权利要求5-15任一所述的胶体金免疫层析试纸条在检测小反刍兽疫病毒H蛋白抗体方面的应用。