CN116144601B - 一种分泌抗小反刍兽疫病毒h蛋白胞外区单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用 - Google Patents

一种分泌抗小反刍兽疫病毒h蛋白胞外区单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种分泌抗小反刍兽疫病毒H蛋白胞外区单克隆抗体的杂交瘤细胞株10‑1hcy及应用。所述杂交瘤细胞株10‑1hcy分泌的抗小反刍兽疫病毒H蛋白胞外区单克隆抗体抗体具有耐热、耐酸、耐碱性能，稳定性好、亲和力高的特点，因此可用作竞争性抗体检测抗小反刍兽疫病毒H蛋白的中和抗体；且以上述制备的单克隆抗体为竞争抗体，建立了检测抗小反刍兽疫病毒H蛋白中和抗体的cELISA方法，所述方法特异性好、敏感性高，与商品化cELISA试剂盒的符合率高，且操作简单、成本低、结果稳定可靠；适用于进出口检疫、饲养场大批样品的筛查，为小反刍兽疫防控及消除提供了新的技术支持。

Description

一种分泌抗小反刍兽疫病毒H蛋白胞外区单克隆抗体的杂交 瘤细胞株及应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种分泌抗小反刍兽疫病毒H蛋白胞外区(以下简称tH)单克隆抗体的杂交瘤细胞株10-1hcy及应用；本发明利用原核表达并纯化的重组 tH蛋白为检测抗原，以杂交瘤细胞株10-1hcy分泌的抗小反刍兽疫病毒tH蛋白单克隆抗体为竞争抗体，建立cELISA方法，并优化形成了cELISA试剂盒。
背景技术
小反刍兽疫(Peste des petits ruminants，PPR)是由小反刍兽疫病毒(Pestedes petits ruminants virus，PPRV)引起的一种急性、烈性、接触性A类传染病，可感染山羊、绵羊、小鹿瞪羚及长角羚等，主要表现为发热、腹泻、肠炎、肺炎等临床症状，发病率和致死率均非常高，为一种重大跨国传播的动物疫病。因此，我们必须加强对PPR的研究工作，特别是诊断制剂。
H蛋白是PPRV的一种重要的跨膜糖蛋白，含有609个氨基酸，估计分子质量为70kD；构成病毒粒子表面的纤突，具有神经氨酸酶和血凝素的功能，且含有T细胞决定簇，是几种结构蛋白中最易变异的蛋白。H蛋白的主要作用是与宿主细胞膜受体发生结合，调节病毒吸附并侵入宿主细胞，并刺激机体产生中和抗体，参与体液保护性免疫，是病毒的主要抗原成份，也是引起宿主细胞病变(CPE)的决定因素。近年来，国内外学者利用多种表达体系对PPRV H蛋白的表达进行了研究。Stech等在哺乳动物细胞中表达的重组H糖蛋白具有生物活性。 Balamurugan利用Vero细胞系表达H糖蛋白，并评估了其作为酶联免疫吸附反应诊断抗原的潜力。Diallo等把PPRV的F基因和H基因引进山羊痘病毒疫苗株的基因组中，产生的重组病毒可以有效的防止PPRV和山羊痘病毒的感染。此外，还有研究发现去除胞内区的截短H蛋白(truncated H protein)仍具有正常的与细胞受体结合的能力。
除了传统的临床诊断方法，目前已经研究出多种针对PPRV抗体的诊断技术，这些方法包括病毒中和试验(VN)、琼脂扩散(AGID)、免疫荧光抗体试验(IFAT)和对流免疫电泳(CIEP)等。随着免疫学和分子生物学的在动物疫病诊断中的应用和发展，目前已有PCR、酶联免疫吸附试验(ELISA)和其它分子生物学检测方法等多种PPR检测方法，其中间接竞争ELISA(cELISA)和PCR方法是OIE推荐的检测方法。由于感染PPRV的动物血清抗体有相当一部分是针对N蛋白和H蛋白的，因此已经研制出许多针对PPRV和RPV N、H蛋白的竞争ELISA试验方法，并且该方法已成为OIE的标准检测方法之一。Libeau应用重组杆状病毒表达的N蛋白建立了检测PPRV抗体的cELISA方法，单抗和待检血清抗体竞争性地结合抗原，提高了试验的特异性。Saliki等建立了针对PPRV H蛋白的阻断ELISA(B-ELISA) 方法，与竞争ELISA原理基本一致，都是两种抗体竞争结合同一抗原表位。但是在cELISA 方法中，样品和单抗同时与抗原结合，而B-ELISA是先将样品和抗原反应，然后再加入检测单抗，所用的时间要比cELISA方法长。2004年，Singh等制备了一株针对PPRV H蛋白中和表位的单克隆抗体，建立了竞争ELISA的检测方法。与VNT相比，更加方便快捷；但也存在一些缺点，如不能区分RPV与PRRV。其后韩国科学家Choi等又研发出了一种检测PPR 的快速竞争ELISA(rapidcELISA)，该方法是在包被了PPRV重组核衣壳蛋白(rPPRV-N) 的反应孔中，将血清与单抗混合孵育30min，然后对单抗进行定量。对249个PPRV阳性血清和733个阴性血清样品进行检测，用该方法检测免疫了RPV的高免血清，VNT≥1:512时，检测结果呈阳性，但显示的抗体滴度只有1:2～1:16；VNT≤1:128，则检测结果呈阴性，说明该方法能较好的区分PPRV与RPV感染。通过对琼脂糖凝胶免疫电泳方法(AGID)和cELISA 两种血清学方法进行比对，发现cELISA的特异性和敏感性高于AGID的，AGID法可将 cELISA阳性样品检测为阴性。
综上所述，研发出具有快速、特异、敏感的中和抗体诊断试剂盒，具有及其重要的意义。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一株能够稳定分泌抗小反刍兽疫病毒tH单克隆抗体的杂交瘤细胞株；并构建一种具备良好稳定性、特异性、准确性和高亲和力的小反刍兽疫病毒中和抗体cELISA试剂盒及其使用方法。具体包括以下内容：
第一方面，本发明提供了一株能够稳定分泌抗小反刍兽疫病毒tH蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株10-1hcy，所述的杂交瘤细胞株10-1hcy于2019年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为:CGMCC No.17289；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；联系电话为010-64807355。
第二方面，本发明提供了上述第一方面所述的杂交瘤细胞株10-1hcy在生产抗小反刍兽疫病毒tH蛋白单克隆抗体中的应用。
第三方面，本发明提供了一种抗小反刍兽疫病毒tH蛋白单克隆抗体，所述抗小反刍兽疫病毒tH蛋白单克隆抗体由上述第一方面所述的杂交瘤细胞株10-1hcy或其传代细胞株分泌产生。
第四方面，本发明提供了上述第一方面所述的杂交瘤细胞株10-1hcy，和/或上述第三方面所述的抗小反刍兽疫病毒tH蛋白单克隆抗体在制备用于检测小反刍兽疫病毒中和抗体的检测试剂、试剂盒或试纸条中的应用。
优选地，所述试剂盒为间接竞争ELISA试剂盒。
第五方面，本发明提供了一种用于检测小反刍兽疫病毒中和抗体的间接竞争ELISA试剂盒，所述试剂盒包括单克隆抗体、包被抗原、包被液、酶标板、标准血清、血清稀释液、酶标二抗、封闭液、显色液、终止液和洗涤液；所述单克隆抗体为上述第三方面所述的抗小反刍兽疫病毒tH单克隆抗体。
优选地，所述包被抗原为重组小反刍兽疫病毒tH蛋白。
优选地，所述包被液为0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH9.6。
优选地，所述洗涤液为1×PBST。
优选地，所述封闭液为1％BSA。
优选地，所述终止液为1mol/L H2SO4溶液。
优选地，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG。
第六方面，本发明提供了一种非疾病诊断和治疗目的的小反刍兽疫间接竞争ELISA检测方法，所述方法包括如下步骤：
(1)包被酶标板：用包被液稀释纯化后的包被抗原包被酶标板，封板膜封板，反应；
(2)封闭酶标板：洗涤步骤(1)处理后的酶标板，加入封闭液，封板膜封板，反应；
(3)加入血清和抗小反刍兽疫病毒tH蛋白单克隆抗体：洗涤步骤(2)处理后的酶标板，将酶标板孔分为阳性对照孔、阴性对照孔、待检样品孔、单抗对照孔和空白对照孔；其中阳性对照孔、阴性对照孔、待检样品孔、单抗对照孔中分别加入等量的阳性血清、阴性血清、待检血清、血清稀释液，后再加入等量的单克隆抗体和酶结合物工作液混合均匀；空白对照孔加入与阳性对照孔中液体总量一致的血清稀释液；封板膜封板反应；所述单克隆抗体工作液为血清稀释液稀释的单克隆抗体；
(4)加入酶标二抗：洗涤步骤(3)处理后的酶标板，每孔加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG酶结合物工作液，封板膜封板，反应；
(5)显色：取步骤(4)处理后的酶标板，每孔加入等量的底物溶液，避光反应；
(6)终止：取步骤(5)处理后的酶标板，每孔加入等量的1M硫酸，在酶标仪上读取OD450的光吸收值；
(7)结果判定：根据公式计算各样品抑制率(PI)值，PI＝(1－(样品孔的OD450/单抗对照孔的OD450))×100％；其中，PI＞50％，抗体阳性；PI＜50％，抗体阴性；PI＝50％，判定阳性可疑，重复检测一次，结果≥50％，为抗体阳性；＜50％需再次检测。
优选地，所述包被抗原的包被量为0.05μg/孔。
优选地，所述步骤(1)为：用包被液稀释纯化的重组蛋白tH蛋白，包被酶标板，封板膜封板，于37℃包被2h或4℃包被过夜；
优选地，所述步骤(2)为：用1×PBST洗涤步骤(1)处理后的酶标板3次，每孔加入1％BSA封闭液100μL，封板，于37℃反应1h；
优选地，所述步骤(3)为：1×PBST洗涤步骤(2)处理后的酶标板3次，将酶标板孔分为阳性对照孔、阴性对照孔、待检样品孔、单抗对照孔和空白对照孔；其中阳性对照孔、阴性对照孔、待检样品孔、单抗对照孔中分别加入50μL/孔的阳性血清、阴性血清、待检血清、血清稀释液，后再加入50μL/孔的单克隆抗体工作液，混合均匀；空白对照孔加入100μL/ 孔的血清稀释液；封板膜封板，37℃反应1h；
优选地，所述单克隆抗体工作液为单克隆抗体与血清稀释液1:8000稀释。
优选地，所述步骤(4)为：1×PBST洗涤步骤(3)处理后的酶标板3次，每孔加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG酶结合物工作液50μL；封板膜封板，37℃反应1h；
优选地，所述辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG酶结合物工作液为：辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG与血清稀释液1:6000稀释。
优选地，所述步骤(5)为：取步骤(4)处理后的酶标板，每孔加入底物溶液50μL，封板，37℃避光反应10min；
优选地，所述步骤(6)为：取步骤(5)处理后的酶标板，每孔加入1M硫酸50μL终止反应。
本发明的有益效果是：(1)本发明提供了一株能够稳定分泌抗小反刍兽疫病毒tH蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株10-1hcy，所述的杂交瘤细胞株10-1hcy于2019年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为:CGMCC No.17289；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；联系电话为010-64807355； (2)所述杂交瘤细胞株10-1hcy分泌的抗小反刍兽疫病毒H蛋白胞外区单克隆抗体亚型为 IgG3，轻链类型为κ，间接ELISA检测方法测定其腹水效价为6.4×104，且具有耐热、耐酸、耐碱性能，稳定性好、亲和力高的特点，因此可用作竞争性抗体检测抗小反刍兽疫病毒H蛋白的中和抗体；(3)本发明根据间接竞争ELISA反应原理，参照商品化cELISA试剂盒，以上述制备的抗小反刍兽疫病毒tH蛋白单克隆抗体作为竞争抗体，建立了检测抗小反刍兽疫病毒H蛋白中和抗体的cELISA方法，所建立的cELISA方法反应特异性好、敏感性高，与商品化cELISA试剂盒的符合率高(97.7％)，操作简单、成本低廉、反应结果稳定可靠，为我国及世界防控乃至消除PPR疫情提供了新的技术支持。
附图说明
图1为本发明所述单克隆抗体的亚型鉴定结果；
图2为本发明所述单克隆抗体的热稳定性实验结果；
图3为本发明所述单克隆抗体的酸稳定性实验结果；
图4为本发明所述单克隆抗体的碱稳定性实验结果；
图5为本发明所述单克隆抗体的相对亲和力；
图6为本发明所述单克隆抗体的饱和度曲线；
图7为本发明所述单克隆抗体的cELISA检测结果，最上面为杂交瘤细胞株10-1hcy，中间为杂交瘤细胞株12-3hcy，最下面为杂交瘤细胞株3-9hcy；
图8为本发明所述单克隆抗体的检测样品量；
图9为本发明所述单克隆抗体的竞争反应时间检测结果，最上面为strongpositive，中间为weak positive，最下面为negative。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
以下实施例所用抗原为原核表达的重组小反刍兽疫病毒tH蛋白，制备方法为：将实验是保存的重组质粒pET-30a(+)-tH转化至E.coli BL21感受态细胞，经含卡那霉素的LB培养基筛选，以IPTG终浓度为1.0mmol/L于37℃诱导表达6h，重组tH蛋白主要以包涵体形式表达；利用镍琼脂糖亲和层析柱纯化重组tH蛋白；BCA Protein Assay Kit测定纯化的tH蛋白浓度为0.56mg/mL。
所述的杂交瘤细胞株10-1hcy(小鼠骨髓瘤细胞与脾细胞的杂交瘤细胞株)于2019年1 月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为:CGMCCNo. 17289；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；联系电话为010-64807355。
以下实施例所用疫苗株PPRV和SP2/0株骨髓瘤细胞由兰州兽医研究所保存；试验动物为清洁级5周龄雌性BALB/c小鼠由兰州兽医研究所实验动物中心提供；田间羊血清采自内蒙古自治区和甘肃省。
以下实施例所述试剂包括：弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、8-氮鸟嘌呤、HAT购自Sigma 公司；HRP标记兔抗鼠IgG购自北京博奥森公司；RPMI-1640培养液购自海克隆公司；胎牛血清(FBS)购自GIBCO公司；青霉素购自中诺药业有限公司，链霉素购自大连美罗药厂；底物TMB购自Surmodics公司；Isostrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit购自Roche 公司；二甲基亚砜(DMSO)、聚乙二醇(PEG2 000)购自Merck公司；各种型号细胞培养板和96孔酶标板购自Costar公司；细胞冻存管购自Corning公司；英国商品化PPRVcELISA 试剂盒，购自BDSL公司；96孔酶标板，购自Costar公司；辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG 购自北京博奥森公司；底物TMB购自Surmodics公司，BSA、明胶购自德国Sigma公司；牛血清购自Gibco公司。
50％PEG2000溶液：称取10g PEG2000，10磅高压25min，冷却至50～60℃，加10mL不完全培养基RPMI-1640，混匀，调pH至7.0～7.4，分装于高压过的2mL离心管，每管1mL， 4℃保存备用；
A贮存液(氨基蝶呤液)：称取3.5mg Aminopterin，加高压过的三蒸水180mL，轻轻震荡至完全溶解，最后加水至200mL，0.22μm滤器过滤，分装于高压过的2mL eppendorf管，每管1mL，-20℃保存备用；
次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷(HT)贮存液(100×，H：10-4mol/L；T：1.6×10-3mol/L)：称取0.054g Hypoxanthine，0.016g Aminopterin，加高压过的三蒸水40mL，待溶解后0.22μm滤器过滤，分装于高压过的2mL eppendorf管，每管1mL，-20℃保存备用；
8-氮鸟嘌呤贮存液：称取20mg 8-azaguanine，加10mL水和约30μL氨水，待溶解后，0.22μm 滤器过滤，分装于高压过的2mL eppendorf管，每管1mL，-20℃保存备用；
HAT选择培养液：78％RPMI-1640培养液，l％A储存液，l％HT储存液，20％胎牛血清，混合均匀，4℃保存备用；
HT培养液：79％RPMI-1640培养液，l％HT储存液，20％胎牛血清，混合均匀，4℃保存备用；
细胞冻存液：70％RPMI-1640培养液，20％小牛血清，10％二甲亚枫(DMSO)，4℃保存，混合均匀，4℃保存备用；
包被液(0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH9.6)：NaHCO3 2.9g，Na2CO3 1.5g，加双蒸水定容至1000m1，调pH至9.6，4℃保存备用；
PBS：Na2HPO4·12H2O 2.9g、KCl 0.2g、KH2PO4 0.2g、NaCl 8g，溶解于950ml去离子水中，用NaOH调pH值至7.2后用容量瓶定量至1000ml；
PBST溶液：在PBS溶液中加入0.05％Tween-20，摇匀即可使用；
酶标封闭液1(0.8％明胶)：0.8g明胶加入100mL PBST(pH7.4)于37℃水浴中溶解，保存于4℃备用；酶标封闭液2(1％BSA溶液)：1g BSA加入100mL PBS(pH7.4)轻轻震荡至溶解，保存于4℃备用；酶标封闭液3(2％小牛血清)：2mL牛血清加入100mL PBS(pH7.4)，保存于4℃备用；
酶标终止液(1mol/L H2SO4溶液)：双蒸水95mL，浓硫酸5mL，将硫酸缓慢滴加至双蒸水中并不断搅拌。
7.5％碳酸氢钠溶液：称取7.5g碳酸氢钠粉末，加入90mL蒸馏水充分溶解，再定容至 100mL，用0.22μm滤器过滤除菌，分装至高压灭菌的2mL离心管内，用封口膜封口保存于4℃备用；
20000U/mL双抗储备溶液：在购买的80万单位青霉素瓶中加入高压过的三蒸水4mL， 100万单位链霉素瓶中加入高压过的三蒸水5mL，轻轻摇晃直至瓶内粉末完全溶解，分别取 4mL加入32mL高压过的三蒸水中，用0.22μm滤器过滤除菌，分装至高压灭菌的2mL离心管内，用封口膜封口后保存于-20℃备用。
所述抗小反刍兽疫病毒tH蛋白的单克隆抗体：以原核表达的小反刍兽疫病毒tH蛋白为靶蛋白，利用镍柱纯化的重组蛋白tH对6-8周龄的雌性BALB/c小鼠进行免疫，当抗体滴度在1:3200以上时，对免疫小鼠脾细胞的单细胞悬液与对数生长期的骨髓瘤细胞进行融合，筛选获得分泌抗tH蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；向6-8周龄的经产BALB/c小鼠腹腔注射杂交瘤细胞，注射7天左右收集腹水，protein G/A琼脂糖珠纯化腹水，获得纯度较高的抗 tH蛋白的单克隆抗体。用Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit确定10-1hcy单克隆抗体亚型为IgG3，轻链类型为κ，间接ELISA检测方法测定其腹水效价为6.4×104，且具有耐热、耐酸、耐碱，稳定性好、亲和力高的特点，因此可用作竞争性抗体检测抗小反刍兽疫病毒H 蛋白的中和抗体。
实施例1抗小反刍兽疫病毒H蛋白胞外区单克隆抗体的制备和鉴定
1、最佳抗原包被量及阳性血清最佳稀释度的确定
按方阵滴定试验方法进行，将小反刍兽疫病毒灭活后按1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、 1:70、1:80、1:100进行稀释，在酶标板上按100μL/孔包被，阴性、阳性血清从左到右按1:100、 1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200稀释，HRP标记二抗按1:6000稀释。然后根据测定的 OD450值确定最佳抗原包被量及阳性血清稀释度。
其中，间接ELISA操作程序如下：
(1)用包被液按上述梯度稀释初纯病毒液，酶标板的每孔中加入100μL稀释抗原，封板膜封板，4℃过夜；
(2)弃去包被液，PBST洗板3次；
(3)用PBST将阴性、阳性血清按上述梯度稀释，每孔加100μL，封板，37℃孵育1h，甩干后PBST洗涤；
(4)用PBST将羊抗鼠IgG-HRP稀释1:4000，每孔加100μL，封板膜封板，37℃反应1h，甩干后PBST洗涤；
(5)每孔加入底物溶液50μL，封板，37℃避光反应15min；
(6)每孔加入1M硫酸50μL，终止反应。
(7)用酶标检测仪检测各孔OD450nm值。
方阵滴定试验测定OD450值结果见表1；从表1可见，初纯病毒抗原最佳稀释度为1:50，阴性、阳性血清稀释度为1:200。
表1 小反刍兽疫病毒包被量和阳性血清稀释滴度方阵试验结果
2、动物免疫
灭菌PBS稀释重组小反刍兽疫病毒tH蛋白至1mg/mL，取200μg溶液与等量的弗氏完全佐剂充分混匀乳化。选取健康的六周龄雌性小鼠6只，待其适应环境两天后，在背部皮下分点注射200μL乳化后的重组tH蛋白溶液，后腿肌肉各注射100μL。然后分别在首次免疫后第 15、30天用弗氏不完全佐剂乳化等量重组tH蛋白加强免疫两次，免疫部位及方法同首次免疫。三免后两周尾静脉采血，分离血清，用间接ELISA法确定每只小鼠的抗体水平。对免疫效果较好的小鼠融合前三天再次加强免疫一次，加强免疫时可用腹腔注射100μg不加佐剂的重组tH蛋白溶液。对免疫效果不理想的小鼠可以进行四免，免疫部位和方法与第三次相同。
第三次免疫14d后，小鼠尾静脉采血，分离血清，进行ELISA检测，OD450平均值按P>2.0N 判为阳性，结果见表2，当血清稀释到1:3200时仍为阳性。
表2 tH抗原三免后14d小鼠血清ELISA检测结果
3、细胞融合
3.1复苏与培养骨髓瘤细胞
在融合前两周左右，开始复苏和培养骨髓瘤细胞sp2/0株：(1)将超净台用酒精棉球擦拭干净，用紫外灯将超净台照射至少30min，同时打开超净台风机；(2)从液氮罐中取出冻存的sp2/0细胞冻存管，迅速放入盛有37℃水的烧杯中，轻轻摇动烧杯，使冻存管内液体完全融化；(3)从烧杯中取出冻存管，1000r/min离心10min，用吸管轻轻吸取上清弃去；(4)加入约1mL不完全RPMI-1640，轻轻悬起细胞，移入准备好的细胞瓶内，再补充9mL完全RPMI-1640培养液；(5)轻轻摇动细胞培养瓶，使细胞分布均匀，37℃含5％CO2细胞培养箱内培养，24h后观察，待细胞贴壁后更换细胞培养液继续培养。
在传代培养过程中如果出现细胞大小不均，细胞返祖等现象，可以用含有20μg/mL8-氮鸟嘌呤的完全培养液选择培养三代以上，以保持HGPRT缺陷型。
在融合当天，将处于对数生长期，生长良好的SP2/0细胞吹打起来，移至灭菌离心管中， 1000r/min离心10min，弃去上层培养基，收集细胞，加入20mL不完全RPMI-1640培养液洗涤一次，离心后将细胞重新悬浮，用台盼兰染色，计数板计数活细胞，备用。
3.2饲养细胞的制备
取8-10周龄健康BALB/c小鼠一只，眼球采血，分离阴性血清，待小鼠失血死亡后，浸泡于75％酒精中消毒5min，固定于超净台内塑料板上，用消毒后的小镊子提起腹部皮肤，用剪刀剪开腹部皮肤，注意不要剪破腹膜，将腹部皮肤拉开固定在塑料板上，使腹膜充分暴露。用无菌的一次性注射器吸取3～4mL完全培养基注射到小鼠腹腔内，保持注射器不动，用灭菌的小镊子轻揉腹部1～2min，再用注射器吸出腹腔内的培养液，此时培养液内含有巨噬细胞等可作为饲养细胞。调整培养基中饲养细胞的浓度，使其在1×105个/mL左右，将调整好浓度的培养基放在灭菌的平皿内，备用。
3.3脾细胞的制备
取3天前加强免疫的BALB/c小鼠，眼球采血，分离血清作为阳性对照；将小鼠颈椎脱臼处死，浸泡于75％酒精中消毒5min，固定于超净台内塑料板上，用消毒后的小镊子提起腹部皮肤，用剪刀剪开腹部皮肤和腹膜，找到脾脏，用无菌小镊子将其取下，放入盛有不完全 RPMI-1640培养液的无菌平皿中稍作清冼，剥离表面脂肪和结缔组织。然后放在高压过的200 目铜网上剪碎，用高压过的注射器芯研磨脾脏，便研磨边滴加不完全RPMI-1640培养液，直至脾脏完全磨碎，再用约20mL不完全RPMI-1640培养液冲洗筛网，使脾细胞完全通过筛网进入烧杯中。1000r/m离心10min收集脾细胞备用。
3.4细胞融合
脾细胞与骨髓瘤细胞sp2/0按细胞数量1:5～1:10混合均匀，1000r/m离心10min，倒掉上清，轻弹管底使其疏松。在一干净的烧杯中加入37℃蒸馏水，将含有混合细胞的离心管置于水浴中，在90s内加入800μL 37℃预热的PEG2000，边滴加边旋转离心管，静置1min，再在5min内加入37℃预热的不完全RPMI-1640培养液，先慢慢滴入，然后加快，不可将底部细胞冲起，稀释完PEG后1500r/min离心10min，倒掉上清。
将细胞沉淀重悬于20％胎牛血清的HAT选择培养液中，混合均匀，同时将制备好的饲养细胞按相同体积加入，再次混合均匀，用多道移液器加入96孔细胞培养板中，每孔200μL，饱和湿度、5％CO2、37℃培养。
4、阳性杂交瘤细胞的筛选和亚克隆
4.1阳性杂交瘤细胞孔的筛选
融合后的细胞每隔2～4天更换一次培养基，更换的时候采用半换液方式，即弃去100μL 培养基，再加入100μL新的HAT选择培养液。融合后7～8d时，开始观察细胞，标出有存活的杂交瘤细胞的细胞孔，待杂交瘤细胞长满孔底1/10以上时，取上清100μL作为一抗，用灭活的弱毒株病毒作为抗原，用间接ELISA检测方法筛选阳性克隆孔。
4.2阳性杂交瘤细胞的亚克隆
将间接ELISA检测阳性的细胞孔中的杂家瘤细胞吹起，并移入24孔细胞培养板中，待其长满后，重新吹起混匀并细胞计数。计数后，用含20％胎牛血清的HAT培养液将其稀释到 10个细胞/mL，将此浓度的细胞悬液按照100μL/孔加入预先铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中培养。筛选方法同上，同时要将每次克隆化后的剩余细胞扩大培养后冻存，以免丢失。经过3次亚克隆后，所有克隆化细胞孔内的上清经检测都呈阳性时，可以确定已经获得分泌单克隆抗体的细胞株。选取OD450nm值最高的几孔，扩大培养。
前后共融合3次，用1:50倍稀释的灭活病毒作为包被抗原，用间接ELISA检测方法筛选，最后筛选出了3株阳性杂交瘤细胞，分别命名为3-9hcy、10-1hcy和12-3hcy。对3株阳性杂交瘤细胞进行三次亚克隆检测，之后扩大培养各株OD450值最高的细胞孔内的杂交瘤细胞，扩大培养后上清OD450值见表3。扩大培养后冻存。
表3 杂交瘤克隆化后ELISA检测结果
4.3细胞冻存
将形态良好，生长旺盛的杂交瘤细胞吹打均匀，1000r/min离心10min，收集细胞，用1mL 细胞冻存液将细胞悬起，加入到细胞冻存管中，同时做好标记，将冻存管先放置于4℃30min，然后移至-20℃冷冻30min，再移至-70℃低温冰箱中过夜，最后投入液氮容器中，并做好记录。
5、单克隆抗体腹水的制备
在接种阳性杂交瘤细胞株前一周，给每只8-12周龄雌性BALB/c小鼠腹腔注射0.2mL液体石蜡。在此期间，对阳性单克隆杂交瘤细胞株进行扩大培养。一周后，将扩大培养的细胞从细胞瓶中吹下，用高压过的PBS重悬，洗涤两次遍，1000r/min离心10min，台盼兰染色计数，将细胞密度调至1～2×106个/mL，每只小鼠腹腔注射0.5mL细胞悬液。接种细胞后每天观察小鼠腹部，待小鼠腹部明显膨大，行动困难时，将小鼠颈椎脱臼处死，用无菌注射器从小鼠腹部吸出暗红色的液体，3000r/min离心20min，取清亮的上清分装、标记，-20℃保存备用。
6、杂交瘤细胞及单克隆抗体特性的鉴定
6.1抗体亚类的测定
吸取杂交瘤细胞培养液上清200μL，用Isostrip Mouse Monoclonal AntibodyIsotyping Kit 抗体亚类试剂盒对单抗进行亚型鉴定：取杂交瘤细胞上清20μL，加入pH7.2的PBS 180μL做 1:10稀释；取该稀释液150μL加入含有兰色粉末的实验管中，轻轻震荡混匀，至兰色粉末完全融化；将Isotrip胶体金试纸条插入管底，5～10min内观察结果。
获得的3株单克隆抗经Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit检测后，杂交瘤细胞 10-1hcy株分泌的单克隆抗体亚型鉴定为IgG3，轻链类型为κ，其余2株单抗亚型鉴定均为 IgG 2b，轻链类型为κ，结果如图1所示。
6.2腹水效价的测定
为测定腹水中抗tH蛋白单克隆抗体效价，用初纯的1:50倍稀释的小反刍兽疫Nigeria 75/1 疫苗株病毒作为包被抗原，将小鼠腹水作2倍梯度稀释，从1:1×103～1:1.024×106倍，用间接ELISA方法检测腹水效价。同时用sp2/0细胞上清、正常小鼠腹水作阴性对照，病毒阳性血清做阳性对照，具体判定标准为：P/N>2.0时的腹水最大稀释倍数为腹水的ELISA效价。
将上述3株杂交瘤细胞株的腹水梯度稀释后用间接ELISA检测方法测定效价，从表4可知：杂交瘤细胞3-9hcy株单抗的腹水效价为1:3.2×104，杂交瘤细胞10-1hcy株单抗的腹水效价为1:6.4×104，杂交瘤细胞12-3hcy株单抗的腹水效价为1:1.6×104。
表4 杂交瘤细胞株的腹水效价的检测结果
6.3单克隆抗体对热稳定性试验
取粗纯的腹水用灭菌的PBS 1:1000稀释，置56℃水浴中4h、8h、12h、24h、36h、48h，然后用间接ELISA检测其OD450值的变化，根据试验数据绘制稳定性变化曲线。
上述3株杂交瘤细胞株的腹水经热稳定性试验结果见表5，根据试验数据绘制其效价热消减曲线，见图2。结果表明，本发明所述的杂交瘤细胞株10-1hcy具有良好的热稳定性。
表5 杂交瘤细胞株的腹水热稳定性实验结果
*表中的列出的对照均为4℃鼠腹水处理4h时的结果
6.4单克隆抗体对酸碱稳定性试验
酸稳定性试验：将腹水用pH2.2的盐酸溶液1:10倍稀释，于4℃保存4h、8h、12h、24h、 36h、48h，再用pH7.2的PBS稀释到1:1000，ELISA检测其OD450值变化，根据试验数据绘制稳定性变化曲线。
碱稳定性试验：用包被液(pH9.6碳酸盐缓冲液)按上述方法进行碱稳定性试验。
上述3株杂交瘤细胞株的腹水经酸碱稳定性试验结果分别见表6、表7，根据试验数据分别绘制两株单抗效价酸和碱消减曲线，分别如图3和图4所示。结果表明，上述3株杂交瘤细胞株刚开始受热和酸处理时，其活性下降较快，而之后活性波动较小；受到碱处理时3株单抗活性波动很小。由此可知，本发明所述的杂交瘤细胞株10-1hcy及其分泌的单克隆抗体对热、酸、碱都较稳定。
表6 杂交瘤细胞株的腹水酸稳定性实验结果
*表中的列出的小鼠腹水对照均为4℃处理4h时的结果
表7 杂交瘤细胞株的腹水碱稳定性实验结果
*表中的列出的小鼠腹水对照均为4℃处理4h时的结果
6.5单克隆抗体相对亲和力试验
分别用1:50稀释的PPRV包被，加入5倍比稀释的单克隆抗体，采用间接ELISA方法测定3株单克隆抗体的相对亲和力。
由表8和图5可知，上述3株单克隆抗体与抗原均均有亲和力，且差异不明显，其中10-1hcy 较其他2株单抗的亲和力稳定。
表8 单抗相对亲和力
6.6单克隆抗体识别抗原表位的测定
用间接ELISA相加法检测3株单克隆抗体的抗原表位。用初纯的病毒液1:50倍稀释包被酶标板，先用间接ELISA法测定腹水中McAb与包被抗原反应达到饱和时的稀释度。然后进行间接ELISA相加实验，用上述浓度的抗原包被酶标板，在酶标板上横向加入上述3株单克隆抗体腹水，反应2h后，再纵向依次加入上述腹水，反应2h后，OD450值记录为A1+2，在对照孔中只加入一株单抗的腹水，其值分别记录为A1～A6，计算相加指数时，按照下列公式：AI＝(A1+2-A1)/A2×100％，每组重复试验3次，取其平均值，AI值大于50％即可认为两种单克隆抗体识别不同的抗原表位。
经测定腹水中的McAb与包被抗原反应的饱和浓度。根据McAb饱和浓度用间接ELISA 法相加实验进行3株单克隆抗体识别抗原表位分析，检测结果见表9和表10以及图6所示，根据表中数据计算AI值。结果显示，AI值均小于50％，即3株单克隆抗体都识别同一抗原表位。
表9 单抗腹水饱和度实验
表10 抗原表位分析检测结果
实施例2小反刍兽疫中和抗体cELISA检测试剂盒及其使用方法
1.商品化cELISA试剂盒操作方法
1.1溶液配制
(1)用无菌蒸馏水溶解冻干的PPRV抗原和抗PPR单克隆抗体，无菌甘油水溶解酶结合物；
(2)封闭液：0.01M PBS中加入0.1％吐温20、0.3％阴性对照血清。
(3)单克隆抗体：将(1)配制的单克隆抗体储存液用封闭液1:100稀释。
(4)酶结合物：将(1)配制的酶结合物储存液用封闭液1:100稀释。
1.2操作步骤
(1)用0.01M PBS稀释抗原(His-tH)100倍，包被酶标板，每孔50μL，封板，37℃轻柔振荡包被1h；
(2)0.002M PBS洗涤3次，血清样品孔先加入40μL/孔封闭液，再按照说明书内铺板方式，在孔内分别加入阳性血清、阴性血清或待检血清10μL/孔；单抗对照孔加入50μL封闭液，结合对照孔加入100μL封闭液；而后向除结合对照孔外的其余各孔中加入1:100倍稀释的单抗工作液50μL，震荡至液体混合均匀，封板膜封板，37℃轻柔振荡反应1h；
(3)0.002M PBS洗涤3次，每孔加入1:100倍稀释的酶结合物工作液50μL，封板膜封板，37℃轻柔振荡反应1h；
(4)每孔加入底物溶液50μL，置暗盒中37℃反应15分钟；
(5)每孔加入1M硫酸50μL，终止反应；
(6)用酶标仪检测各孔OD450值，根据够公式计算各样品抑制率(PI)值，PI＝100-[样品孔OD450/单抗对照孔平均OD450x100]；实验成立标准：阳性对照PI≥50％，阴性对照PI≤25％，结合对照95％≤PI≤105％。结果判定：PI≥50％，中和抗体阳性；PI<50％，中和抗体阴性。
经商品化cELISA试剂盒检测，选择出本实验室保存的血清样品中的强阳性样品3份、弱阳性样品3份和阴性样品3份，用于后续cELISA检测方法的建立。
2、本发明所述单抗用于cELISA检测
参照上述商品化cELISA试剂盒的操作方法，以重组tH蛋白作为抗原，本发明实施例1 制备的3株抗小反刍兽疫病毒tH蛋白单克隆抗体作为检测抗体，分别检测强阳性、弱阳性和阴性血清，比较本发明实施例1制备的3株抗小反刍兽疫病毒tH蛋白单克隆抗体的检测效果。
本发明实施例1制备的3株抗小反刍兽疫病毒tH蛋白单克隆抗体用于cELISA检测结果见图7所示，PI值结果显示，本发明所述的杂交瘤细胞10-1hcy株分泌的抗小反刍兽疫病毒 tH蛋白单克隆抗体竞争时阴、阳性检测孔PI值对比最明显。
2.1最佳抗原抗体反应浓度
(1)将重组蛋白tH以0.2、0.1、0.05、0.025和0.0125μg/孔，包被酶标板，封板膜封板， 4℃包被过夜；
(2)PBST洗涤3次，在孔内分别加1:1×103、1:2×103、1:4×103、1:8×103、1:1.6×104、 1:3.2×104和1:6.4×104倍稀释的杂交瘤细胞10-1hcy株分泌的抗小反刍兽疫病毒H蛋白胞外区单克隆抗体工作液50μL，封板膜封板，37℃反应1h；
(3)PBST洗涤3次，每孔加入1:5000倍稀释的酶结合物工作液50μL，封板膜封板，37℃反应1h；
(4)每孔加入底物溶液50μL，置暗盒中37℃反应15min；
(5)每孔加入1M硫酸50μL，终止反应；
(6)用酶标检测仪检测各孔OD450nm值，根据OD450nm值筛选出最佳反应浓度。
结果如表11所示，最佳抗原包被量为0.05μg/孔，而最佳单抗稀释度为1:8×103。
表11 最佳反应浓度方阵检测结果
2.2最佳样品加入量
cELISA操作方法与1.2相同，在加入待检血清时上样量分别为5、10、25和50μL。酶标检测仪检测各孔OD450值，根据OD450值和PI值筛选出最佳上样量。
PI值见图8，比较发现本方法检测样品量为50μL时，阴阳性样品PI值差异最大。
2.3最佳封闭液
cELISA操作方法与1.2相同，封闭液分别为PBST，0.8％明胶，1％BSA溶液，2％小牛血清溶液。酶标仪检测各孔OD450值，根据OD450值和PI值筛选出最佳封闭液。
检测结果见表12，使用1％BSA溶液作为封闭液时，OD450值较稳定，阴、阳性血清PI值与商品化试剂盒检测计算符合性最好。
表12 最佳封闭液检测结果
2.4最佳反应时间
cELISA操作方法与1.2相同，竞争反应时间分别为0.5、1、1.5和2h。酶标检测仪检测各孔OD450值，根据OD450值和PI值筛选出最佳反应时间。
检测结果见图9，发现反应0.5影响结果判断；1、1.5和2h结果一致，均不影响结果判断。从阴阳性样品PI值差异、快速测定的角度看，反应时间1.0h最利于结果判断。
2.5 cELISA检测方法标准操作步骤的确定
根据以上优化的条件确定建立的cELISA操作步骤：
(1)用包被液(0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH9.6)稀释纯化的重组蛋白His-tH，按0.05μg/孔包被酶标板，封板膜封板，4℃包被过夜；
(2)1×PBST洗涤3次，每孔加入1％BSA封闭液100μL，封板膜封板，于37℃孵育1h；
(3)1×PBST洗涤3次，按照布局在孔内分别加入阳性、阴性血清和待检血清，每孔50μL，单抗对照孔以每孔50μL加入血清稀释液，空白对照孔以每孔100μL加入血清稀释液；而后除空白对照孔外，每孔再加入用血清稀释液1:8000稀释的单抗工作液50μL；振荡使液体混合均匀，封板膜封板，37℃反应1h；
(4)1×PBST洗涤3次，用血清稀释液1:6000稀释辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG酶结合物，每孔加入50μL，封板膜封板，37℃反应1h；
(5)每孔加底物溶液50μL，封板膜封板，优选地，37℃反应10min；
(6)每孔加入1M硫酸50μL终止反应；
(7)用酶标检测仪检测各孔OD450值并计算PI值。
(8)结果判定：根据公式计算各样品抑制率(PI)值，PI＝【1-(样品孔的OD450/单抗对照孔的OD450)】×100％，阴阳性结果判断标准为：PI＞50％，抗体阳性；PI＜50％，抗体阴性； PI＝50％，判定阳性可疑。重复检测一次可疑样品，如果仍大于或仍然为50％，判定为阳性；如果小于50％需再次检测，或用其它方法(如病毒中和试验)检测。
2.6特异性试验
用建立的cELISA方法检测羊痘、羊口疮、亚洲Ⅰ型口蹄疫、O型口蹄疫阳性血清，根据所测OD450值计算其PI值。
检测结果如表13所示，PI值均小于50％，能够与这些病毒的阳性血清区分。
表13特异性试验结果
2.7建立的cELISA与商品化试剂盒的符合性试验
用建立的cELISA检测方法与商品化试剂盒同时检测血清样品129份，计算出各自PI值，检测本方法的特异性和敏感性。
商品化cELISA试剂盒对比检测129份样品，共有3份样品漏检(结果如表14所示)；与商品化试剂盒检出25份阳性样品相比，试验cELISA方法共检出22份阳性血清，其相对敏感性为88％(22/25)，相对特异性为97.7％(126/129)。
表14对比结果
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3、小反刍兽疫中和抗体cELISA试剂盒
根据以上实验研制成小反刍兽疫中和cELISA检测试剂盒，具体如下：
(1)配制所用试剂：
包被液(0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH9.6)：NaHCO3 2.9g，Na2CO3 1.5g，加双蒸水定容至1000m1，调pH至9.6，4℃保存备用。
25×PBST洗涤液：每1000mL中含NaCl 200.00g、KCl 5.00g、Na2HPO4·12H2O73.00g、 KH2PO4 7.50g和Tween-20 12.50mL，60mL/管分装，4℃保存备用。
1％BSA溶液封闭液：1g BSA加入100mL PBS(pH7.4)轻轻震荡至溶解，保存于4℃备用。
单克隆抗体：用抗体稳定剂(Sigma公司产品，产品编号为55514)稀释成100×储备液，150μL/管分装，4℃保存备用。
酶结合物：用酶标结合物稳定剂(Sigma，产品编号18995)稀释成100×的储备液，150μL/ 管分装，4℃保存备用。
血清稀释液：本试剂盒所用血清稀释液为山东百迪泰生物科技有限公司产品，40mL/管分装，4℃保存备用。
TMB底物：本试剂盒所用TMB底物为Surmodics公司，12mL/瓶分装，4℃保存备用。
终止液：将50mL浓硫酸(H2SO4)缓慢滴加至900mL双蒸水中并不断搅拌，定容至1000mL，12mL/瓶分装，4℃保存备用。
(2)包被酶标板：用包被液稀释纯化的重组蛋白His-tH，以0.5μg/孔包被酶标板，封板膜封板，4℃包被过夜；
(3)封闭酶标板；将浓缩稀释液以1:25稀释，洗涤酶标板3次，每孔加入封闭液100μL，封板膜封板，37℃孵育1h；
(4)制备抗原包被板：同上洗涤，拍干，干燥，用铝箔袋将抗原包被板真空包装，4℃保存备用。
(5)组装成试剂盒：将检验合格的各试剂盒组份按表15组装成试制的小反刍兽疫中和抗体cELISA检测试剂盒，4℃保存备用。
表15 试剂盒组分
4、小反刍兽疫中和抗体cELISA试剂盒使用方法
(1)配制所用试剂：洗涤液(1×PBST)：将浓缩洗涤液(25×)用无离子水或蒸馏水做 25倍稀释；单克隆抗体和酶结合物工作液：使用前用血清稀释液做100倍稀释。
(2)操作步骤：①空白对照设2孔，每孔加100μL血清稀释液；单克隆抗体对照设4孔，每孔加50μL血清稀释液；在样品孔中分别加入阴性对照血清、阳性对照血清或待检血清50μL；而后除空白对照孔外，每孔再加入单克隆抗体工作液50μL，振荡使液体混合均匀，封板膜封板，37℃反应1h；②取出酶标板甩干，每孔加满洗涤液，洗涤3次，在吸水纸上拍干；③每孔加入酶结合物工作液50μL，封板膜封板，37℃反应1h；④同②洗涤；⑤每孔加入底物溶液50μL，37℃避光反应10～15min；⑥每孔加入50μL终止液，在酶标仪上读取OD450的光吸收值；⑦结果判定：计算同一酶标板上单抗对照和各样本(对照血清和待检血清)在450nm 波长处的平均光吸收值(OD450)，根据公式计算各样本的抑制率(PI值)，PI＝[1－(样本OD450/单抗对照OD450)]×100％。判定标准为：PI＞50％，抗体阳性；PI＜50％，抗体阴性；PI＝50％，判定阳性可疑。可疑样品重复检测一次，如果仍大于或仍然为50％，判定为阳性；如果小于50％需再次检测，或用其它方法(如病毒中和试验)检测。

Claims (10)

1.一株能够稳定分泌抗小反刍兽疫病毒H蛋白胞外区单克隆抗体的杂交瘤细胞株10-1hcy，所述杂交瘤细胞株10-1hcy于2019年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为:CGMCC No. 17289。
2.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株10-1hcy在生产抗小反刍兽疫病毒H蛋白胞外区单克隆抗体中的应用。
3.一种抗小反刍兽疫病毒H蛋白胞外区单克隆抗体，其特征在于，所述抗小反刍兽疫病毒H蛋白胞外区单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株10-1hcy或其传代细胞株分泌产生。
4.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株10-1hcy，和/或权利要求3所述的抗小反刍兽疫病毒H蛋白胞外区单克隆抗体在制备用于检测小反刍兽疫病毒中和抗体的检测试剂、试剂盒或试纸中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为间接竞争ELISA试剂盒。
6.一种用于检测小反刍兽疫病毒中和抗体的间接竞争ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括单克隆抗体、包被抗原、包被液、酶标板、标准血清、血清稀释液、酶标二抗、封闭液、显色液、终止液和洗涤液；所述单克隆抗体为权利要求3所述的抗小反刍兽疫病毒H蛋白胞外区单克隆抗体。
7.如权利要求6所述的间接竞争ELISA试剂盒，其特征在于，所述包被抗原为重组小反刍兽疫病毒H蛋白胞外区。
8.如权利要求6所述的间接竞争ELISA试剂盒，其特征在于，所述包被液为0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH9.6；所述洗涤液为1×PBST；所述封闭液为1%BSA；所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG；所述终止液为1mol/L H2SO4溶液。
9.一种非疾病诊断和治疗目的的小反刍兽疫间接竞争ELISA检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）包被酶标板：用包被液稀释纯化后的包被抗原包被酶标板，封板膜封板，反应；
（2）封闭酶标板：洗涤步骤（1）处理后的酶标板，加入封闭液，封板膜封板，反应；
（3）加入血清和抗小反刍兽疫病毒H蛋白胞外区单克隆抗体：洗涤步骤（2）处理后的酶标板，将酶标板孔分为阳性对照孔、阴性对照孔、待检样品孔、单抗对照孔和空白对照孔；其中阳性对照孔、阴性对照孔、待检样品孔、单抗对照孔中分别加入等量的阳性血清、阴性血清、待检血清、血清稀释液，后再加入等量的单克隆抗体工作液，混合均匀；空白对照孔加入与阳性对照孔中液体总量一致的血清稀释液；封板膜封板反应；所述单克隆抗体工作液为血清稀释液稀释的单克隆抗体；所述单克隆抗体为权利要求3所述的抗小反刍兽疫病毒H蛋白胞外区单克隆抗体；
（4）加入酶标二抗：洗涤步骤（3）处理后的酶标板，每孔加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG酶结合物工作液，封板膜封板，反应；
（5）显色：取步骤（4）处理后的酶标板，每孔加入等量的底物溶液，避光反应；
（6）终止：取步骤（5）处理后的酶标板，每孔加入等量的1M硫酸，在酶标仪上读取OD 450的光吸收值；
（7）结果判定：根据公式计算各样品抑制率（PI）值，PI=（1－（样品孔的OD 450/单抗对照孔的OD 450））×100%；其中，PI＞50%，抗体阳性；PI＜50%，抗体阴性；PI＝50%，判定阳性可疑，重复检测一次，结果≥50%，为抗体阳性；＜50%需再次检测。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述包被抗原的包被量为0.05μg/孔。
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