CN105158480A - 用于检测小反刍兽疫病毒血凝素蛋白抗体的试剂盒及其使用方法 - Google Patents

用于检测小反刍兽疫病毒血凝素蛋白抗体的试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于检测小反刍兽疫病毒血凝素蛋白（H蛋白）抗体的试剂盒，所述试剂盒以小反刍兽疫病毒血凝素蛋白基因胞外区序列编码的重组蛋白为包被抗原。本发明还提供其使用方法。本发明的试剂盒可快速而特异地检测血清中小反刍兽疫病毒H蛋白抗体，反应特异性好，灵敏度高，其操作简单、成本低廉，反应结果稳定可靠、易于观察。适用于小反刍兽的进出口检疫、食品卫生以及畜牧饲养场的疫苗免疫效果监测。

Description

用于检测小反刍兽疫病毒血凝素蛋白抗体的试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明涉及用于检测小反刍兽疫病毒血凝素蛋白抗体的试剂盒及其使用方法。
背景技术
小反刍兽疫是我国农业部制定的《法定动物疫病病种名录》中规定的Ⅰ类动物疫病。在周边国家相继发生此病后，自然的地理屏障—喜马拉雅山脉最终被突破，2007年该疫病在我国西藏发生，对我国动物卫生安全造成了严重威胁。
自2007年我国确诊在西藏阿里地区暴发了一起山羊小反刍兽疫疫情后，到目前为止，我国新疆、甘肃、内蒙、贵州等20多个省区发生了小反刍兽疫疫情。小反刍兽疫危害着我国西部地区养羊业的发展，因此对疫情的监视和控制是防止小反刍兽疫进一步扩散首要的任务。
麻疹病毒属的病毒都是亲淋巴细胞性，可使各自宿主发生灾难性疾病，伴随有严重的淋巴细胞减少和免疫抑制。病毒与宿主易感细胞上的特异性受体分子相结合而启动其复制过程，是病毒进入细胞的第一步，是病毒进入宿主细胞的“核心”机制。H糖蛋白的主要作用是与宿主细胞膜受体结合，并调节病毒的吸附及入侵宿主细胞。同时，H蛋白也是病毒的主要抗原成份和引起宿主细胞病变（CPE）的决定因素。
近年来，国内外学者利用多种表达体系对H蛋白的表达和功能进行了研究，该蛋白可在多种表达系统中表达，但由于编码基因自身特征，表达量均不高。在表达系统中，原核系统如E.coli比哺乳动物细胞和昆虫表达系统更为经济，也因为其简单、容易大批生产以及不用翻译后修饰而被广泛使用。此外，现有研究发现去除胞内区域的截短H蛋白(truncatedHprotein)仍具有正常的与细胞受体结合的能力。
发明内容
本发明提供了用于检测小反刍兽疫病毒血凝素蛋白抗体的试剂盒及其使用方法。
本发明提供一对用于扩增小反刍兽疫病毒血凝素蛋白（H蛋白）胞外区基因的特异性引物，所述特异性引物为：
上游引物：5'GGGATCCATGAGGCTTCACCGAGCCACC3'；
下游引物：5'CCAAGCTTCTAGACTGGATTACATGTTACCTC3'。
本发明提供一种用于检测小反刍兽疫病毒血凝素蛋白（H蛋白）抗体的试剂盒，所述试剂盒以小反刍兽疫病毒血凝素蛋白基因胞外区序列编码的重组蛋白为包被抗原。
优选地，所述重组蛋白的制备方法为：将小反刍兽疫病毒血凝素蛋白基因胞外区序列扩增后克隆至pET-30a(+)表达载体的多克隆位点处，获得重组表达质粒，将重组质粒转入宿主感受态细胞中，在IPTG诱导下表达，纯化后得到重组蛋白。
更进一步地，所述重组蛋白的制备方法为：（1）合成引物，上游引物：5'GGGATCCATGAGGCTTCACCGAGCCACC3'，下游引物：5'CCAAGCTTCTAGACTGGATTACATGTTACCTC3'；（2）通过RT-PCR方法从小反刍兽疫病毒RNA中获得长度为1653bp的片段，将该片段构建到原核表达载体pET-30a(+)中得重组质粒pET-30a(+)-tH；（3）将重组质粒转化BL-21宿主菌，用IPTG诱导表达，纯化得到重组蛋白。
优选地，所述重组蛋白的氨基酸序列参见SEQIDNo.2。
优选地，所述试剂盒还包括酶标二抗，所述酶标二抗为鼠抗羊酶标二抗，所述酶为辣根过氧化物酶；优选地，所述酶标二抗的稀释度为1:30000。
优选地，所述试剂盒中包被抗原的包被量为1.0μg/孔。
本发明的第二个目的是提供上述试剂盒的使用方法，步骤如下：
（1）包被酶标板：用纯化后的重组蛋白包被酶标板，洗涤；
（2）封闭酶标板，洗涤；封闭剂优选含有5%脱脂奶粉的PBST；
（3）加入待检血清，反应后洗涤；优选地，稀释倍数为1:80；
（4）加入酶标二抗，反应后洗涤；所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的鼠抗羊酶标二抗；优选地，稀释倍数为1:30000倍；
（5）显色，终止，在酶标仪上读取OD 450的光吸收值；
（6）结果判定：当待检血清的OD 450值≥0.57时，则判为阳性；当待检血清的OD 450值＜0.47时，则判为阴性；当0.47≤待检血清的OD 450值＜0.57时，为可疑阴性。
本发明的第三个目的是提供小反刍兽疫病毒血凝素蛋白基因胞外区序列编码的重组蛋白在检测小反刍兽疫病毒中的应用，所述应用不以活的人体或动物体及其离体样品为检测对象。
优选地，所述重组蛋白的氨基酸序列参见SEQIDNo.2。
本发明的第四个目的是提供小反刍兽疫病毒血凝素蛋白（H蛋白）抗体的检测方法，步骤如下：
（1）包被酶标板：用纯化后的重组蛋白包被酶标板，洗涤；
（2）封闭酶标板，洗涤；封闭剂优选含有5%脱脂奶粉的PBST；
（3）加入待检血清，反应后洗涤；优选地，稀释倍数为1:80；
（4）加入酶标二抗，反应后洗涤；所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的鼠抗羊酶标二抗；优选地，稀释倍数为1:30000倍；
（5）显色，终止，在酶标仪上读取OD 450的光吸收值；
（6）结果判定：当待检血清的OD 450值≥0.57时，则判为阳性；当待检血清的OD 450值＜0.47时，则判为阴性；当0.47≤待检血清的OD 450值＜0.57时，为可疑阴性。
应用本发明的方法能够快速而特异地检测血清中小反刍兽疫病毒H蛋白抗体，反应特异性好，灵敏度高，其操作简单、成本低廉，反应结果稳定可靠、易于观察，非常适用于小反刍兽疫的进出口检疫、食品卫生以及畜牧饲养场的大批样品的筛查，易于大范围推广应用。与OIE推荐的“小反刍兽疫竞争ELISA试剂盒(PPRcompetitiveELISAkit)”(BDSL公司，BiologicalDiagnosticSuppliesLtd,France)的对比检测符合率为96.4%。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1
一、小反刍兽疫病毒（PPRV）血凝素蛋白（H）胞外区重组蛋白（tH蛋白）的制备
1、引物设计
根据GenBank登载的PPRVNigeria75/1株序列（登录号：X74443）中H基因胞外区(tH)序列设计引物。
上游引物：5'GGGATCCATGAGGCTTCACCGAGCCACC3'；
下游引物：5'CCAAGCTTCTAGACTGGATTACATGTTACCTC3'。
其中，划横线部分分别为BamHⅠ和HindⅢ酶切位点。
2、RT-PCR扩增
（1）提取小反刍兽疫疫苗株Nigeria75/1细胞毒RNA；
（2）RT-PCR扩增，获得tH片段（1653bp）。tH片段的核苷酸序列见序列表SEQIDNo.1。
具体反应体系及反应条件为：反应体系：25μl总体系中总RNA0.5μg，5×buffer5μl，10mmol/LdNTP0.5μl，DTT1.25μl，引物（上游+下游）2μl，酶（mix）0.5μl，剩余为DEPC水。反应条件：95℃预热变性5min；94℃，lmin；53℃，lmin；72℃，100s，35个循环，72℃，10min；4℃，30min。
（3）将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在1653bp左右处出现一条特异电泳条带，与预期的大小一致。
（4）将扩增产物连接到原核表达载体pET-30a(+)中，取用BamHⅠ和HindⅢpET-30a(+)双酶切的pET-30a(+)载体1μL（50μg/μL）与上述RT-PCR片段3μL混合后，加入2×Rapidligasebuffer5μL，T 4 DNA连接酶1μL（3u/μL），混匀后置4℃连接过夜，得到重组质粒pET-30a(+)-tH。
（5）将重组质粒转化至E.coliBL21感受态细胞，用含氨苄青霉素的LB培养基筛选；用IPTG诱导表达，并优化、确定蛋白的最佳表达条件。该重组蛋白的氨基酸序列参见序列表SEQIDNo.2。
灰度扫描分析发现，经IPTG诱导的重组基因工程菌获得表达，产生分子量大小约为60kDa的特异性蛋白条带，重组tH蛋白主要以包涵体形式表达。通过改变诱导温度、诱导时间和IPTG浓度来增加重组tH蛋白的表达量，SDS-PAGE分析显示，按1%比例接入二级种子液，37℃振荡培养5h，以IPTG终浓度为1.0mmol/L诱导表达5h的表达量最高。所以最终选择诱导条件为37℃诱导5h，IPTG浓度为1.0mmol/L。
（6）将构建的重组表达载体pET-30a(+)-tH经PCR、双酶切（BamHⅠ和HindⅢ）鉴定均为阳性；阳性菌液送往上海生工生物工程有限公司测序鉴定。测序结果表明，PPRVtH成功插入到pET-30a(+)表达载体中且保持正确的阅读框。
二、tH重组蛋白的纯化
1重组蛋白的浓缩
（1）大量表达pET-30a(+)-tH后，离心收集菌体，PBS(20mM，pH7.4)重悬，冰浴超声波破碎，离心收集沉淀（包涵体）；
（2）向沉淀中加入表达菌液1%体积的WashBufferⅠ（洗涤液Ⅰ）(0.1mol/LTris-Base、5mmol/LEDTA、2%Triton-X-100和2mol/LUrea)，涡旋混匀；4℃20000g离心30min，弃上清；重复一次。
（3）加入表达菌液1%体积的WashBufferⅡ（洗涤液Ⅱ）(0.1mol/LTris-Base和5mmol/LEDTA)，涡旋混匀；4℃20000g离心30min，弃上清；重复一次。
（4）向沉淀中加入适量8M尿素，充分溶解，4℃过夜。
（5）4℃20000g离心30min，收集上清存于4℃，即包涵体，测定蛋白含量。
2重组蛋白的纯化
（1）将sephadexG-200于PBS中浸泡3天取50cm长的玻璃柱洗净，装上滤网，先加入1/3柱高的0.01M的PBS，关闭出口；
（2）然后加入sephadexG-200，当柱床高于5cm时，打开出水口，控制流速为1mL/min，在柱上端留出4～5cm的柱长加样品，继续加入PBS适量，置室温平衡过夜；
（3）当柱内胶面以上的缓冲液约为0.5cm时，将样品缓慢加到凝胶顶部中央；
（4）待样品快全部进入凝胶床时（约剩0.5cm），立即用上述PBS洗脱，调节蠕动泵控制流速为1mL/min，并保持柱床上层液面深1～2cm左右。
（5）收集峰值蛋白，保存于低温冰箱中备用。
3蛋白表达量的测定
将纯化的重组tH蛋白进行SDS-PAGE，染色、脱色后灰度扫描分析纯化产物。
以牛血清白蛋白（BSA）作为标准品，采用ImageJ软件进行灰度扫描分析，以牛血清白蛋白（BSA）含量1、2、3、4μg作为横坐标，灰度值为纵坐标制作标准蛋白标准曲线，得到标准曲线线性方程。根据标准曲线线性方程求出纯化后PPRVtH蛋白浓度，进而计算重组蛋白PPRVtH的表达量为4.68g/L大肠杆菌发酵液。
实施例2本发明的检测小反刍兽疫病毒（PPRV）的间接ELISA试剂盒的建立
1材料
1.1抗原、抗体
抗原：实施例1制备的tH重组蛋白，田间羊血清采自于新疆某边境地区。PPRV标准阳性血清通过用小反刍兽疫疫苗免疫健康羊制备，标准阴性血清采集未免疫小反刍兽疫的健康羊。
1.2试剂及耗材
商品化PPRVcELISA试剂盒购自英国BDSL公司；96孔酶标板购自Costar公司；牛血清白蛋白（BSA）购自Solarbio公司；辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG购自Sigma公司；酶标底物TMB购自promega公司；明胶购自Sigma公司；吐温-20购自Solarbio公司；其它试剂均为国产分析纯。
1.3溶液及培养基
抗原包被液（0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH9.6）：NaHCO32.9g，Na2CO31.5g，加双蒸水定容至1000m1，调pH至9.6，4℃保存备用。
酶标封闭液1（1%明胶溶液）：1g明胶加入100mLPBS（pH7.4）于37℃水浴中溶解，保存于4℃备用。
酶标封闭液2（5%BSA溶液）：5gBSA溶解于100mLPBS（pH7.4），保存于4℃备用。
酶标封闭液3（5%脱脂奶粉溶液）：5g脱脂奶粉溶解于100mLPBS（pH7.4），保存于4℃备用。
浓缩洗涤液：含0.05%吐温-20的25倍浓缩PBST溶液。
酶标终止液（2mol/LH2SO4溶液）：双蒸水89mL，浓硫酸11mL，将浓硫酸缓慢滴加至双蒸水中并不断搅拌。
2方法
2.1间接ELISA检测方法标准操作步骤的确定
每次改变一个反应的参数的进行实验设计，根据各个反应中的阴阳性血清OD450值及P/N值，确定ELISA反应的最佳条件，具体如下：
2.1.1最佳抗原包被量和最佳抗体稀释度的确定
按方阵滴定试验方法进行，用抗原包被液将纯化的tH重组蛋白稀释至0.25、0.5、1.0、1.5、2.5、3.0μg/100μL，在酶标板上按100μL/孔包被。用PBST将PPRV标准阳性、田间阳性血清、阴性血清按1:5、1:10、1:20、1:40、1:50、1:80、1:100、1:200进行稀释，1:3000稀释酶标二抗，酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的鼠抗羊酶标二抗。然后根据测定的OD 450值确定最佳抗原包被量及阳性血清稀释度。
2.1.2最佳包被温度和时间的确定
按上述已确定的最佳间接ELISA参数进行试验，按最佳抗原包被量，分别选择4℃12h、4℃2h、37℃1h和37℃2h共四种包被条件，其它参照2.1间接ELISA步骤，显色后，计算P/N值，筛选出最佳包被的条件。
2.1.3最佳封闭液的确定
按上述已确定的最佳间接ELISA参数进行试验，封闭液分别选择1×脱脂牛奶、1%BSA、5%脱脂奶粉、5%BSA、1%明胶的PBST，并且以PBST封闭作为对照组。显色后，计算P/N值，筛选出最佳封闭液。
2.1.4最佳血清反应时间的确定
按上述已确定的最佳间接ELISA参数进行试验,对阴阳性血清进行稀释，置于湿盒中在37℃温箱中分别作用30min、45min和60min。显色后计算P/N值，选择最佳的血清反应时间。
2.1.5最佳酶标二抗稀释度的确定
按上述筛选的最佳抗原包被量、最佳血清稀释度、最佳血清反应时间进行试验，酶标二抗选择1:20000、1:30000、1:40000、1:50000进行稀释，其它条件参照2.1常规ELISA步骤。显色后计算P/N值，筛选出酶标二抗最佳稀释度。
2.1.6最佳酶标二抗反应时间的确定
按上述已经确定的最佳条件进行试验，将酶标二抗在37℃分别作用30min、45min和60min。其它参照2.1间接ELISA步骤，显色后计算P/N值，筛选出最佳二抗反应时间。
2.1.7最佳显色反应时间的确定
按上述已确定的最佳间接ELISA参数进行试验，在加TMB底物显色时，分别于37℃避光条件下作用5min、10min和15min后终止反应，测定OD 450值。计算P/N值，确定最佳显色反应时间。
2.1.8阴性样品临界值的确定
将12份经进口PPRV竞争ELISA试剂盒检测为PPRV阴性的血清在最优反应条件下按间接ELISA程序进行试验，计算样品OD 450值的平均值和标准差。
综上得到间接ELISA反应最佳参数参见表1。
表1
。
2.2间接ELISA检测方法操作步骤的确定
（1）用抗原包被液稀释tH重组蛋白至10μg/mL，包被酶标板，每孔100μL，4℃包被12h；
（2）倒掉包被液，PBST洗涤3次，加入质量百分比为5%的脱脂奶粉作为封闭液，每孔100μL，置于湿盒内37℃反应1h；
（3）PBST洗涤3次，加入1:80倍稀释的田间羊血清（100μL/孔），置于湿盒中37℃反应1h；
（4）PBST洗涤3次，加入1:30000倍稀释的酶标二抗（100μL/孔），置于湿盒中37℃反应1h；其中酶标二抗为辣根过氧化物酶（HRP）标记的鼠抗羊酶标二抗；
（5）PBST洗涤3次，每孔加入100μL已加入H2O2的TMB溶液，置于湿盒中37℃反应10min，
（6）每孔加入2M硫酸50μL，终止反应。
（7）用酶标检测仪检测各孔OD 450值；
（8）判定标准：已知阳性血清与已知阴性血清的比值P/N≥2.1，而且已知阳性血清的OD 450值≥0.4；在上述条件成立的情况下，经统计分析这12份PPRV羊阴性血清样品的OD 450平均值x为0.36，标准差SD为0.053。取99.9%置信区间的上限x+3SD=0.52，所以当待检血清的OD 450值≥0.52，则判为阳性；当待检血清OD 450值小于0.52时，可在99.9%的置信度下确定为阴性。可疑区间确定为（x+2SD，x+4SD），也就是说当样品OD 450值大小位于0.47和0.57之间时，判定为可疑阴性。
3性能试验
3.1敏感性试验
将PPRV阳性血清作1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200共7个稀释度，按最适反应条件进行间接ELISA试验。结果显示：当血清稀释倍数至1:800时检测结果仍为阳性(见表2)。
表2敏感性试验结果
。
3.2重复性试验
3.2.1同批次抗原重复性试验
用同一批次纯化的重组蛋白作为包被抗原，取阴性血清2份、阳性血清2份，并做标准阴阳性对照，在不同时间进行ELISA试验，每份血清做4个孔平行组，对结果进行统计分析表明，各测定样品重复孔间的变异系数在4.0%～7.8%之间，小于10%，说明同一样品在同一批试验中变异程度很小，具有较好的重复性。
3.2.2不同批次抗原重复性试验
用不同批次纯化的重组蛋白作为包被抗原，取阴性血清2份、阳性血清2份，并做标准阴阳性对照，在同一时间进行ELISA试验，每份血清做4个孔平行组，对结果进行统计分析表明，各测定样品不同批次抗原包被孔间的变异系数在7.0%～9.3%之间，小于10%，说明不同批次纯化制备的重组抗原在试验中变异程度很小，重组抗原的纯化制备过程稳定性较好。
3.3特异性试验
用建立的间接ELISA检测方法检测羊痘、羊口疮和羊口蹄疫阳性血清，以PPRV标准阳性血清、阴性血清作对照，每份血清平行作4个重复，所得试验结果数据进行统计学分析。试验结果均为阴性，这说明以重组tH蛋白为诊断抗原的PPRV间接ELISA方法特异性较好，结果见表3。
表3特异性试验结果
。
3.4与商品化cELISA试剂盒的符合性试验
用本发明的检测小反刍兽疫病毒试剂盒与商品化cELISA试剂盒（小反刍兽疫竞争ELISA试剂盒(PPRcompetitiveELISAkit，BDSL公司，BiologicalDiagnosticSuppliesLtd,France)）同时检测血清样品138份，检测本方法的特异性和敏感性。结果参见表4。
表4与商品化cELISE试剂盒的对比结果
。
由表3可见，商品化cELISE试剂盒检出24份阳性样品，114份阴性血清；本发明的间接ELISA试剂盒共检出21份阳性血清，117份阴性血清。20份两种方法检测均为阳性，113份两种方法检测均为阴性。由此计算得出，这两种方法的相对敏感性为83.3%（20/24），相对特异性为99.1%（113/114），两种方法检测结果的符合率为96.4%（133/138）。
商品化cELISA试剂盒操作方法（现有技术）:
（1）将PPRV抗原用PBS1:3000倍稀释，包被酶标板，每孔50μL，置于湿盒37℃包被1h；
（2）PBST洗涤3次，按照说明书内铺板方式，在孔内分别加入阳性血清，阴性血清，弱阳性血清和待检血清。每孔加入血清5μL，封闭液45μL，最后加入1:150倍稀释的由商品化试剂盒提供的单抗稀释液50μL，震荡混合均匀，置于湿盒内37℃反应1h；
（3）PBST洗涤3次，每孔加入1:1000倍稀释的由商品化试剂盒提供的酶标二抗50μL，置于湿盒内37℃反应1h；
（4）每孔加入底物溶液TMB50μL，置于暗盒中37℃反应20分钟；
（5）每孔加入2M硫酸50μL，终止反应。
（6）用酶标检测仪检测各孔OD 450值，根据够公式计算各样品抑制率（PI）值，PI=[1－样品孔的OD 450值/单抗对照孔的OD 450值]x100%，阴阳性结果判断标准为：PI＞50%，抗体阳性；PI＜50%，抗体阴性；PI＝50%，判定阳性可疑，重复检测一次，如果仍然为50%，判定为阳性，如果不等于50%需再次检测，或用其它方法检测。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>中国农业科学院兰州兽医研究所
<120>用于检测小反刍兽疫病毒血凝素蛋白抗体的试剂盒及其使用方法
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>1653
<212>DNA
<213>小反刍兽疫病毒血凝素蛋白基因胞外区核苷酸序列
<400>1
cttcaccgagccaccgttgggactgcggagatccagagtcggctgaataccaacattgag60
ttgaccgaatccattgatcatcaaactaaggatgtcttaactcccctgtttaaaatcatt120
ggtgatgaagtcggcatcagaattccacagaagttcagtgatcttgtcaagttcatctcc180
gataagattaagttcctcaaccctgacagagaatatgattttagggatctccggtggtgt240
atgaatccccctgagagagtcaaaattaactttgaccagttttgtgaatacaaagccgca300
gtcaagtcagttgaacatatatttgagtcatcactcaacaggtcagaaaggttgcgatta360
ttgactcttgggcccggaacaggctgtctcggcaggacagtaacaagagctcagttctca420
gagcttacgctgaccctgatggacctggatctcgagataaagcacaacgtgtcctcagtg480
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gtgagagatctcgagctgggtgcccctattttccatatgaccaactacctcacagtaaac660
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cctaccactgaccccacggtggagaaactctatttatcctcacatagggggattatcaaa900
gataacgaggccaattgggtagtaccgtcgaccgatgttcgtgatcttcaaaacaaagga960
gaatgtctggtggaagcatgcaagactcgacctccttcattttgcaatggcacaggaata1020
ggcccatggtcagaggggagaatccctgcctacggggtgatcagggtcagtcttgactta1080
gctagtgacccgggtgtagttatcacttcagtgtttggcccattgatacctcacctatcc1140
ggtatggatctttacaacaatccgttttcaagagctgcatggttggctgtaccaccttat1200
gagcagtcatttctaggaatgataaatacaattggcttcccggacagagcagaggttatg1260
ccgcacattttgaccacagagatcagagggcctcgaggtcgttgtcatgttcctatagag1320
ttgtccagcaggattgatgatgatatcaagatcgggtccaacatggttgtattgccgacg1380
aaggacctgaggtacataacagccacttatgatgtttccaggagcgagcatgcaatcgtg1440
tactatatctatgacacgggtcgctcatcatcttacttctacccagtccgattgaatttc1500
aggggcaatcctctctctctgaggatagagtgttttccctggtatcataaggtgtggtgc1560
taccatgattgtcttatatacaacaccataacaaacgaagaagtccacacgagagggctg1620
accggtatagaggtaacatgtaatccagtctga1653
<210>2
<211>550
<212>PRT
<213>小反刍兽疫病毒血凝素蛋白基因胞外区氨基酸序列
<400>2
LeuHisArgAlaThrValGlyThrAlaGluIleGlnSerArgLeuAsn
151015
ThrAsnIleGluLeuThrGluSerIleAspHisGlnThrLysAspVal
202530
LeuThrProLeuPheLysIleIleGlyAspGluValGlyIleArgIle
354045
ProGlnLysPheSerAspLeuValLysPheIleSerAspLysIleLys
505560
PheLeuAsnProAspArgGluTyrAspPheArgAspLeuArgTrpCys
65707580
MetAsnProProGluArgValLysIleAsnPheAspGlnPheCysGlu
859095
TyrLysAlaAlaValLysSerValGluHisIlePheGluSerSerLeu
100105110
AsnArgSerGluArgLeuArgLeuLeuThrLeuGlyProGlyThrGly
115120125
CysLeuGlyArgThrValThrArgAlaGlnPheSerGluLeuThrLeu
130135140
ThrLeuMetAspLeuAspLeuGluIleLysHisAsnValSerSerVal
145150155160
PheThrValValGluGluGlyLeuPheGlyArgThrTyrThrValTrp
165170175
ArgSerAspThrGlyLysProSerThrSerProGlyIleGlyHisPhe
180185190
LeuArgValPheGluIleGlyLeuValArgAspLeuGluLeuGlyAla
195200205
ProIlePheHisMetThrAsnTyrLeuThrValAsnMetSerAspAsp
210215220
TyrArgSerCysLeuLeuAlaValGlyGluLeuLysLeuThrAlaLeu
225230235240
CysThrProSerGluThrValThrLeuSerGluSerGlyValProLys
245250255
ArgGluProLeuValValValIleLeuAsnLeuAlaGlyProThrLeu
260265270
GlyGlyGluLeuTyrSerValLeuProThrThrAspProThrValGlu
275280285
LysLeuTyrLeuSerSerHisArgGlyIleIleLysAspAsnGluAla
290295300
AsnTrpValValProSerThrAspValArgAspLeuGlnAsnLysGly
305310315320
GluCysLeuValGluAlaCysLysThrArgProProSerPheCysAsn
325330335
GlyThrGlyIleGlyProTrpSerGluGlyArgIleProAlaTyrGly
340345350
ValIleArgValSerLeuAspLeuAlaSerAspProGlyValValIle
355360365
ThrSerValPheGlyProLeuIleProHisLeuSerGlyMetAspLeu
370375380
TyrAsnAsnProPheSerArgAlaAlaTrpLeuAlaValProProTyr
385390395400
GluGlnSerPheLeuGlyMetIleAsnThrIleGlyPheProAspArg
405410415
AlaGluValMetProHisIleLeuThrThrGluIleArgGlyProArg
420425430
GlyArgCysHisValProIleGluLeuSerSerArgIleAspAspAsp
435440445
IleLysIleGlySerAsnMetValValLeuProThrLysAspLeuArg
450455460
TyrIleThrAlaThrTyrAspValSerArgSerGluHisAlaIleVal
465470475480
TyrTyrIleTyrAspThrGlyArgSerSerSerTyrPheTyrProVal
485490495
ArgLeuAsnPheArgGlyAsnProLeuSerLeuArgIleGluCysPhe
500505510
ProTrpTyrHisLysValTrpCysTyrHisAspCysLeuIleTyrAsn
515520525
ThrIleThrAsnGluGluValHisThrArgGlyLeuThrGlyIleGlu
530535540
ValThrCysAsnProVal
545550

Claims (10)

1.一种用于检测小反刍兽疫病毒血凝素蛋白抗体的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒以小反刍兽疫病毒血凝素蛋白基因胞外区序列编码的重组蛋白为包被抗原。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述重组蛋白的制备方法为：将小反刍兽疫病毒血凝素蛋白基因胞外区序列扩增后克隆至pET-30a(+)表达载体的多克隆位点处，获得重组表达质粒，将重组质粒转入宿主感受态细胞中，在IPTG诱导下表达，纯化后得到重组蛋白。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述重组蛋白的制备方法为：（1）合成引物，上游引物：5'GGGATCCATGAGGCTTCACCGAGCCACC3'，下游引物：5'CCAAGCTTCTAGACTGGATTACATGTTACCTC3'；（2）通过RT-PCR方法从小反刍兽疫病毒RNA中获得长度为1653bp的片段，将该片段构建到原核表达载体pET-30a(+)中得重组质粒pET-30a(+)-tH；（3）将重组质粒转化BL-21宿主菌，用IPTG诱导表达，纯化得到重组蛋白。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述重组蛋白的氨基酸序列参见SEQIDNo.2。
5.根据权利要求1-4任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括酶标二抗，所述酶标二抗为鼠抗羊酶标二抗，所述酶为辣根过氧化物酶；优选地，所述酶标二抗的稀释度为1:30000。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包被抗原的包被量为1.0μg/孔。
7.权利要求1-6任一所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：步骤如下：
（1）包被酶标板：用纯化后的重组蛋白包被酶标板，洗涤；
（2）封闭酶标板，洗涤；封闭剂优选含有5%脱脂奶粉的PBST；
（3）加入待检血清，反应后洗涤；优选地，稀释倍数为1:80；
（4）加入酶标二抗，反应后洗涤；所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的鼠抗羊酶标二抗；优选地，稀释倍数为1:30000倍；
（5）显色，终止，在酶标仪上读取OD 450的光吸收值；
（6）结果判定：当待检血清的OD 450值≥0.57时，则判为阳性；当待检血清的OD 450值＜0.47时，则判为阴性；当0.47≤待检血清的OD 450值＜0.57时，为可疑阴性。
8.小反刍兽疫病毒血凝素蛋白基因胞外区序列编码的重组蛋白在检测小反刍兽疫病毒中的应用，所述应用不以活的人体或动物体为检测对象。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述重组蛋白的氨基酸序列参见SEQIDNo.2。
10.小反刍兽疫病毒血凝素蛋白抗体的检测方法，其特征在于：步骤如下：
（1）包被酶标板：用纯化后的重组蛋白包被酶标板，洗涤；
（2）封闭酶标板，洗涤；封闭剂优选含有5%脱脂奶粉的PBST；
（3）加入待检血清，反应后洗涤；优选地，稀释倍数为1:80；
（4）加入酶标二抗，反应后洗涤；所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的鼠抗羊酶标二抗；优选地，稀释倍数为1:30000倍；
（5）显色，终止，在酶标仪上读取OD 450的光吸收值；
（6）结果判定：当待检血清的OD 450值≥0.57时，则判为阳性；当待检血清的OD 450值＜0.47时，则判为阴性；当0.47≤待检血清的OD 450值＜0.57时，为可疑阴性。
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Application publication date: 20151216

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