CN107236047A

CN107236047A - 重组小反刍兽疫病毒h‑f融合蛋白的可溶性表达方法

Info

Publication number: CN107236047A
Application number: CN201710480572.8A
Authority: CN
Inventors: 宋晓晖; 孙雨; 杨林; 王传彬; 董浩; 杨天意
Original assignee: CHINA ANIMAL BLIGHT PREVENTION AND CONTROL CENTER
Current assignee: CHINA ANIMAL BLIGHT PREVENTION AND CONTROL CENTER
Priority date: 2017-06-22
Filing date: 2017-06-22
Publication date: 2017-10-10
Anticipated expiration: 2037-06-22
Also published as: CN107236047B

Abstract

本发明公开了重组小反刍兽疫病毒H‑F融合蛋白的可溶性表达方法。该方法，包括使蛋白质的编码基因在生物中进行表达得到所述蛋白质的步骤；所述生物为微生物、植物或非人动物；所述蛋白质为a)或b)的蛋白质：a)由SEQ ID No.2的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的可溶性蛋白质。本发明的重组小反刍兽疫病毒H‑F融合蛋白的可溶性表达方法的重组小反刍兽疫病毒H‑F融合蛋白表达水平高，生产成本低，为进一步开发商品化试剂盒奠定了的基础。

Description

重组小反刍兽疫病毒H-F融合蛋白的可溶性表达方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域中重组小反刍兽疫病毒H-F融合蛋白的可溶性表达方法。

背景技术

小反刍兽疫(Peste des Petits Ruminants,PPR)是由小反刍兽疫病毒(Pestedes Petits Ruminants Virus,PPRV)引起的一种急性、热性、接触性传染病，具有高发病率和高死亡率的特点。疫病的控制和消灭，离不开有效的疫苗和快速敏感的检测手段作为技术支撑，因此加大快速有效，价格低廉的诊断检测试剂的研发力度，加快推动相关产品上市，能够为我国的全国小反刍兽疫消灭计划的实施提供有力的技术支撑。

PPRV基因组共编码6种结构蛋白，即核蛋白(N)、磷蛋白(P)、多聚酶大蛋白(L)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)和血凝素蛋白(H)。其中，H基因全长1852bp,由609个氨基酸编码,分子量为68KD。F基因全长2321bp,含有一个ORF,F蛋白含有546个氨基酸,分子量大约为59KD,在麻疫病毒属中高度保守。F基因全长2321bp,含有一个ORF,F蛋白含有546个氨基酸,分子量大约为59KD,在麻疫病毒属中高度保守。H和F蛋白的抗原性稳定，在病毒感染的动物血清中针对H、F融合蛋白的抗体占主导地位，是两个很好的作为诊断抗原的靶基因。但是，多数研究表达的小反刍兽疫H、F蛋白表达产物通常以不溶性的单价蛋白的包涵体形式存在，具有可溶性的H-F融合活性蛋白表达尚未见报道。单价的包涵体蛋白的表达由于存在表达量不足以及空间结构存在错误折叠，不能形成高级蛋白结构与天然空间构象表位，导致其作为诊断抗原不能形成很好的免疫空间表位。同时，单价的包涵体中的表达产物不具有生物学活性，因而需要进行变性与复性处理。蛋白的变性与复性是一个极其复杂的过程，不同蛋白的复性条件各异，复性率往往很难提高。这是限制其应用的主要制约因素

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是如何实现重组小反刍兽疫病毒H-F融合蛋白的可溶性表达。

为解决上述技术问题，本发明提供了重组小反刍兽疫病毒H-F融合蛋白的可溶性表达方法。

本发明所提供的重组小反刍兽疫病毒H-F融合蛋白的可溶性表达方法，包括使蛋白质的编码基因在生物中进行表达得到所述蛋白质的步骤；所述生物为微生物、植物或非人动物；

所述蛋白质为a)或b)的蛋白质：

a)由SEQ ID No.2的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的可溶性蛋白质。

上述方法中，a)的蛋白质名称为rmHF1-Y(又称rmHF1)，是重组串联的PPRV H-F蛋白。SEQ ID No.2由1184个氨基酸残基组成。

上述方法中，使所述蛋白质的编码基因在生物中进行表达包括将所述的蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达所述蛋白质的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到所述蛋白质。

上述方法中，所述受体微生物可为C1)-C4)中的任一种:

C1)原核微生物；

C2)革兰氏阴性细菌；

C3)埃希氏菌属细菌；

C4)大肠杆菌BL21(DE3)。

上述方法中，所述蛋白质的编码基因为如下1)或2)所示的DNA分子：

1)编码序列是SEQ ID No.1第4-3558位所示的DNA分子；

2)与1)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码rmHF1-Y的DNA分子。

其中，SEQ ID No.1由3564个核苷酸组成，SEQ ID No.1第4-3558位为rmHF1-Y基因的核苷酸序列，SEQ ID No.1第4-3558位所示的rmHF1-Y基因编码氨基酸序列是SEQ IDNo.2的蛋白质rmHF1-Y。

上述方法中，2)具体可为核苷酸序列与1)具有至少91％、92％、95％、96％、98％或99％的同一性的DNA分子。

上述方法中，所述重组微生物为将pET30a-rmHF1-Y导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的表达氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质的重组微生物，所述重组微生物命名为BL21(DE3)/pET30a-rmHF1-Y，所述pET30a-rmHF1-Y是用SEQ ID No.1所示的DNA替换pET30a(+)的Nde I和XhoI识别位点间的片段(包括Nde I识别位点和XhoI识别位点在内的小片段)，保持pET30a(+)的其它序列不变，得到的rmHF1-Y基因重组表达载体。

上述方法中，所述表达为诱导表达，所述诱导表达是用0.75mM的IPTG在16℃诱导13-16小时或13-24小时或13小时或16小时。

上述方法在制备检测小反刍兽疫病毒抗体的试剂盒中的应用、在制备小反刍兽疫诊断抗原中的应用、或在制备小反刍兽疫诊断试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明将小反刍兽疫病毒H和F蛋白基因进行密码子优化后融合串联后在大肠杆菌中获得了可溶性融合高表达抗原rmHF1-Y(重组串联的PPRV H-F蛋白)：本发明用SEQ IDNo.1所示的DNA替换pET30a(+)的Nde I和XhoI识别位点间的片段(包括Nde I识别位点和XhoI识别位点在内的小片段)，保持pET30a(+)的其它序列不变，得到的rmHF1-Y基因重组表达载体pET30a-rmHF1-Y，将pET30a-rmHF1-Y导入大肠杆菌BL21(DE3)获得了可溶性的目的蛋白rmHF1。用0.75mM的IPTG在16℃诱导16小时，rmHF1的含量达到菌体总蛋白的45％，表达的rmHF1 63％可溶。本发明的重组小反刍兽疫病毒H-F融合蛋白的可溶性表达方法的重组小反刍兽疫病毒H-F融合蛋白表达水平高，生产成本低，为进一步开发商品化试剂盒奠定了的基础。实验证明，将rmHF1-Y作为包被抗原建立的间接ELISA检测小反刍兽疫病毒抗体的方法具有较高的特异性、敏感性和良好的精确度,且能快速、简便的操作,有利于临床上对小反刍兽疫的监测。将rmHF1-Y作为包被抗原建立的间接ELISA检测小反刍兽疫病毒抗体的方法与法国ID-VET的小反刍兽疫抗体检测试剂盒符合率为94.5％，而以重组PPRV H蛋白rmH作为包被抗原建立的间接ELISA检测小反刍兽疫病毒抗体的方法与法国ID-VET的小反刍兽疫抗体检测试剂盒的符合率只有83.3％，以重组PPRV F蛋白rmF作为包被抗原建立的间接ELISA检测小反刍兽疫病毒抗体的方法与法国ID-VET的小反刍兽疫抗体检测试剂盒的符合率只有72.6％。说明将rmHF1-Y作为包被抗原建立的间接ELISA检测小反刍兽疫病毒抗体的方法与法国ID-VET的小反刍兽疫抗体检测试剂盒的符合率显著高于以重组PPRV H蛋白rmH作为包被抗原建立的间接ELISA检测小反刍兽疫病毒抗体的方法和以重组PPRV F蛋白rmF作为包被抗原建立的间接ELISA检测小反刍兽疫病毒抗体的方法。将rmHF1-Y作为包被抗原建立的间接ELISA检测小反刍兽疫病毒抗体的方法的敏感性显著高于以重组PPRV H蛋白rmH作为包被抗原建立的间接ELISA检测小反刍兽疫病毒抗体的方法和以重组PPRV F蛋白rmF作为包被抗原建立的间接ELISA检测小反刍兽疫病毒抗体的方法。将rmHF1-Y作为包被抗原建立的间接ELISA检测小反刍兽疫病毒抗体的方法不仅可用于小反刍兽疫的诊断,而且可评价疫苗免疫效果,此外,该方法可快速准确的检测小反刍兽疫,从而为我国更好的控制小反刍兽疫的传播将会产生积极作用。

附图说明

图1为各菌株表达蛋白的SDS-PAGE电泳图谱。

图中，M为Marker，从上到下分别为 180kDa、150kDa、130kDa、92kDa、62kDa、43kDa、26kDa、10kDa；1、诱导表达的受体菌全菌蛋白液体，2、诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-rmHF1-Y含蛋白上清液，3、诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-rmHF1-Y含蛋白沉淀，4、诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-rmHF1-Y的全菌蛋白液体，5、镍柱纯化后的上清可溶性蛋白，6、分子筛纯化后的上清可溶性蛋白，7、诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-rmHF1-W全菌蛋白液体，8、诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-rmHF2-Y全菌蛋白液体。

图2为重组蛋白rmHF1-Y的分子筛纯化鉴定与结构鉴定。箭头所指的为纯化的目的蛋白峰。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

pET30a(+)为Novagen公司产品。pET28a(+)为Novagen公司产品。

实施例1、可溶性表达rmHF1

1、合成基因

本申请设计了3种小反刍兽疫病毒H和F蛋白融合基因，分别为SEQ ID No.1第4-3558位所示的rmHF1-Y基因、SEQ ID No.3第1-3684位所示的rmHF2-Y基因和SEQ ID No.5第4-3558位所示的rmHF1-W基因。rmHF1-Y基因和rmHF2-Y基因在核苷酸序列上的区别仅在于5'端不同，SEQ ID No.1第24-3564位和SEQ ID No.3的第150-3690位核苷酸相同。

rmHF1-Y基因和rmHF1-W基因均编码SEQ ID No.2所示的蛋白质rmHF1，rmHF2-Y基因编码SEQ ID No.3所示的蛋白质rmHF2。rmHF1和rmHF2在氨基酸序列上的区别仅在于氨基端不同，SEQ ID No.2第8-1184位和SEQ ID No.3第51-1227位氨基酸残基相同。

2、重组表达载体和重组菌的构建

用SEQ ID No.1所示的DNA替换pET30a(+)的Nde I和XhoI识别位点间的片段(包括Nde I识别位点和XhoI识别位点在内的小片段)，保持pET30a(+)的其它序列不变，得到rmHF1-Y基因重组表达载体，命名为pET30a-rmHF1-Y。pET30a-rmHF1-Y含有rmHF1-Y基因，rmHF1-Y基因的核苷酸序列是SEQ ID No.1的第4-3558位核苷酸，rmHF1-Y基因编码SEQ IDNo.2所示的蛋白质rmHF1。

用SEQ ID No.5所示的DNA替换pET30a(+)的Nde I和XhoI识别位点间的片段(包括Nde I识别位点和XhoI识别位点在内的小片段)，保持pET30a(+)的其它序列不变，得到rmHF1-W基因重组表达载体，命名为pET30a-rmHF1-W。pET30a-rmHF1-W含有rmHF1-W基因，rmHF1-W基因的核苷酸序列是SEQ ID No.5的第4-3558位核苷酸，rmHF1-W基因编码SEQ IDNo.2所示的蛋白质rmHF1。

用SEQ ID No.3第145-3690位所示的DNA替换pET30a(+)的BamHI和XhoI识别位点间的片段(包括BamHI识别位点和XhoI识别位点在内的小片段)，保持pET30a(+)的其它序列不变，得到rmHF2-Y基因重组表达载体，命名为pET30a-rmHF2-Y。pET30a-rmHF2-Y含有rmHF2-Y基因，rmHF2-Y基因的核苷酸序列是SEQ ID No.3的第1-3684位核苷酸，rmHF2-Y基因编码SEQ ID No.4所示的蛋白质rmHF2。

将pET30a-rmHF1-Y、pET30a-rmHF1-W和pET30a-rmHF2-Y分别单独转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。将其均匀涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃培养16小时。单菌落振荡培养过夜，提取质粒进行测序，将测序结果表明含有pET30a-rmHF1-Y的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET30a-rmHF1-Y，将测序结果表明含有pET30a-rmHF1-W的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET30a-rmHF1-W，将测序结果表明含有pET30a-rmHF2-Y的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET30a-rmHF2-Y。

3、蛋白表达形式的分析与鉴定

将BL21(DE3)/pET30a-rmHF1-Y、BL21(DE3)/pET30a-rmHF1-W、BL21(DE3)/pET30a-rmHF2-Y和大肠杆菌BL21(DE3)(简称受体菌)这四个菌株分别单独接种于含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基(在LB液体培养基中加入卡那霉素至卡那霉素的浓度为50μg/ml得到的培养基)中，37℃，采用Thermo MaxQ6000型全温振荡器200rpm振荡培养至0D₆₀₀值(以含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基为空白对照)达到0.6时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。上述四株菌的诱导表达均是用0.75mM的IPTG在16℃诱导16小时(该诱导表达条件是经过对温度、时间、IPTG浓度等条件进行优化得到的高效可溶性诱导表达条件)。

取诱导表达发酵液用于蛋白表达形式分析。具体步骤为，取1m L发酵液置于1.5mL离心管中，做好标记，4℃条件下8500rpm/min离心45min，弃掉上清液，收集菌体沉淀。加入1m L PBS重悬沉淀，8000rpm/min离心5min，弃掉上清液。向洗涤好的菌体沉淀中加入200μLPBS，高压破碎菌体，裂解至菌液不再粘稠，得到全菌蛋白液体。将全菌蛋白液体于4℃离心机中18000rpm/min离心45min，分别收集上清液(命名为含蛋白上清液)和沉淀(命名为含蛋白沉淀)，向含蛋白沉淀中加入50μL PBS重悬洗涤沉淀。向全菌蛋白液体、含蛋白上清液和含蛋白沉淀中加入10μL 5×SDS-PAGE loading Buffer，充分混匀后，置沸水浴中煮沸5min，待样品冷却后，用掌式离心机瞬离。取6μL用于SDS-PAGE电泳分析，并且结合蛋白灰度分析软件初步分析蛋白含量。将电泳后的凝胶转印于NC膜，以抗His标签的羊抗鼠抗体为结合抗体DAB显色，进行Western-blot鉴定。将上述全菌蛋白液体和含蛋白上清液用0.22μm滤膜过滤后上样至预先用溶液1(溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mM NaCl，溶剂是水，pH8.0的溶液)平衡好的镍柱。将镍柱接入AKTA机器上，分别用10个柱体积的溶液1与10个柱体积的溶液2(溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mM NaCl、50mM咪唑，溶剂是水，pH8.0的溶液)清洗镍柱中的杂质蛋白，并在AKTA机器上监测蛋白峰。用溶液3(溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mM NaCl、300mM咪唑，溶剂是水，pH8.0的溶液)冲洗挂在镍柱上的目的蛋白，并使用AKTA收集出现目的蛋白峰的洗脱样品，将该样品称为镍柱纯化目的蛋白样品。

将镍柱纯化的目的蛋白样品用GE公司生产的Superdex200凝胶柱通过分子筛进一步纯化。流动相使用溶液1。通过分子筛纯化后可以除去样品中的含有的大量咪唑，收集洗脱峰，得到分子筛纯化的目的蛋白样品，使用NanoDrop2000超微量分光光度计(ND2000)对得到的分子筛纯化的目的蛋白样品中蛋白(即可溶性目的蛋白)的含量进行定量分析。并用NanoDrop2000超微量分光光度计(ND2000)测定全菌蛋白液体中的蛋白质含量，得到菌体总蛋白含量。将含蛋白沉淀用尿素溶解后，用NanoDrop2000超微量分光光度计(ND2000)测定含蛋白沉淀中的蛋白质的含量。

结果表明诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-rmHF1-Y的全菌蛋白液体、含蛋白上清液和含蛋白沉淀中均含有大小为131kDa的目的蛋白rmHF1；诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-rmHF1-Y的全菌蛋白液体中的目的蛋白rmHF1占菌体总蛋白(全菌总蛋白)的45％，诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-rmHF1-Y的含蛋白上清液中的目的蛋白rmHF1占诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-rmHF1-Y的全菌蛋白液体中目的蛋白HF-his的63％，该63％的目的蛋白rmHF1为可溶性蛋白；诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-rmHF1-Y的含蛋白沉淀中的目的蛋白rmHF1占诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-rmHF1-Y的全菌蛋白液体中目的蛋白rmHF1的37％，该37％的目的蛋白rmHF1为不溶性包涵体蛋白；说明诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-rmHF1-Y的目的蛋白rmHF1占菌体总蛋白的45％，BL21(DE3)/pET30a-rmHF1-Y表达的目的蛋白rmHF1中63％为可溶性蛋白，37％为不溶性包涵体蛋白。诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-rmHF1-W的全菌蛋白液体中不含有大小为131kD的目的蛋白rmHF1，说明BL21(DE3)/pET30a-rmHF1-W没有表达目的蛋白rmHF1。诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-rmHF2-Y的全菌蛋白液体中不含有大小为131kD的目的蛋白rmHF2，说明BL21(DE3)/pET30a-rmHF2-Y没有表达目的蛋白rmHF2。诱导表达的大肠杆菌BL21(DE3)的全菌蛋白液体不含有大小为131kD的目的蛋白rmHF1和大小为131kD的目的蛋白rmHF2；说明大肠杆菌BL21(DE3)没有表达目的蛋白rmHF1和rmHF2(图1)。可见，虽然采用同一种表达载体pET30a(+)和同一种宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)，不同的外源目的基因的表达情况相差很大，将rmHF1-Y基因通过pET30a(+)导入大肠杆菌BL21(DE3)可获得rmHF1-Y基因的高效可溶性表达，将rmHF1-W基因通过pET30a(+)导入大肠杆菌BL21(DE3)中，rmHF1-W基因却没有表达，将rmHF2-Y基因通过pET30a(+)导入大肠杆菌BL21(DE3)中，rmHF2-Y基因也没有表达。

另外，按照上述方法，将pET28a(+)的限制性内切酶NheI和NotI位点之间的序列替换为SEQ ID No.1第4-3558位所示的rmHF1-Y基因，保持pET28a(+)的其它序列不变，得到含有rmHF1-Y基因的重组表达载体，将该重组表达载体命名为pET28a-rmHF1-Y。将pET28a-rmHF1-Y转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将得到的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET28a-rmHF1-Y。将BL21(DE3)/pET28a-rmHF1-Y接种于含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基(在LB液体培养基中加入卡那霉素至卡那霉素的浓度为50μg/ml得到的培养基)中，37℃，采用Thermo MaxQ6000型全温振荡器200rpm振荡培养至0D₆₀₀值(以含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基为空白对照)达到0.6时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。该诱导表达是用0.75mM的IPTG在16℃诱导16小时。取诱导表达的发酵液按照上述方法进行蛋白表达形式分析。结果表明，诱导表达的BL21(DE3)/pET28a-rmHF1-Y全菌蛋白液体中没有目的蛋白的表达。可见，虽然采用同一种外源目的基因(rmHF1-Y基因)和同一种宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)，在不同的BL21(DE3)表达载体-pET28a(+)和pET30a(+)中，外源目的基因的表达情况相差很大，将rmHF1-Y基因通过pET30a(+)导入大肠杆菌BL21(DE3)可获得rmHF1-Y基因的高效可溶性表达，将rmHF1-Y基因通过pET28a(+)导入大肠杆菌BL21(DE3)中，rmHF1-Y基因却没有表达。

4、rmHF1的可溶性表达及纯化

将BL21(DE3)/pET30a-rmHF1-Y接种于含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基(在LB液体培养基中加入卡那霉素至卡那霉素的浓度为50μg/ml得到的培养基)中，37℃，采用Thermo MaxQ6000型全温振荡器200rpm振荡培养至0D₆₀₀值(以含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基为空白对照)达到0.6时，加入IPTG进行诱导表达。该诱导表达用0.75mM的IPTG在16℃诱导16h。取IPTG诱导表达16h后的发酵液收集菌体沉淀。加入PBS重悬沉淀，8000rpm/min离心5min，弃掉上清液。向洗涤好的菌体沉淀中加入PBS，高压破碎菌体，裂解至菌液不再粘稠，于4℃离心机中16000rpm/min离心30min，收集上清液(命名为含蛋白上清液)，弃沉淀。将含蛋白上清液用0.22μm滤膜过滤后上样至预先用溶液1(溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mM NaCl，溶剂是水，pH8.0的溶液)平衡好的镍柱。将镍柱接入AKTA机器上，分别用10个柱体积的溶液1与10个柱体积的溶液2(溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mM NaCl、50mM咪唑，溶剂是水，pH8.0的溶液)清洗镍柱中的杂质蛋白，并在AKTA机器上监测蛋白峰。用溶液3(溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mM NaCl、300mM咪唑，溶剂是水，pH8.0的溶液)冲洗镍柱挂在镍柱上的目的蛋白，并使用AKTA收集出现目的蛋白峰的洗脱样品，将该样品称为镍柱纯化的rmHF1蛋白(镍柱纯化目的蛋白样品)。

将镍柱纯化的rmHF1蛋白用GE公司生产的Superdex200凝胶柱通过分子筛进一步纯化，得到分子筛纯化的rmHF1蛋白。该分子筛纯化中的流动相使用上述溶液1。通过分子筛纯化后可以除去样品中的含有的大量咪唑，rmHF1蛋白的结构为单体结构(图2)。收集单体结构的洗脱峰，得到分子筛纯化的rmHF1蛋白(分子筛纯化目的蛋白样品)，使用NanoDrop2000超微量分光光度计(ND2000)对得到的蛋白的纯度进行定量分析。

将分子筛纯化的rmHF1蛋白进行质谱分析其氨基酸序列，结果表明rmHF1的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

实施例2、以rmHF1蛋白为包被抗原间接ELISA方法检测小反刍兽疫病毒抗体

本实施例中的相关溶液如下：

浓度为0.01M，pH值为7.4的PBS缓冲液的配制：8.5g NaCl、0.2g KCl、2.9gNa₂HPO₄·12H₂O、0.59g NaH₂PO₄·2H₂O，1L去离子水。

包被缓冲液：0.05mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH9.6)，溶剂为水，溶质及其浓度如下：Na₂CO₃ 1.59g/L和NaHCO₃ 2.93g/L。

洗涤液:0.5％吐温洗涤液。0.5％吐温洗涤液按照如下方法配制：在浓度为0.01M，pH值为7.4的PBS缓冲液中加入吐温20和叠氮化钠至叠氮化钠的含量为5g/L、吐温20的含量为5mL/L，得到0.5％吐温洗涤液。

封闭液：1％BSA封闭液。1％BSA封闭液按照如下方法配制：在浓度为0.01M，pH值为7.4的PBS缓冲液中加10％的BSA溶液，稀释至1％(体积百分含量)，得到1％BSA封闭液。

二抗稀释液：在浓度为0.01M，pH值为7.4的PBS缓冲液中加入BSA至BSA的含量为1％(体积百分含量)，得到二抗稀释液。

1、间接ELISA反应条件的建立与优化

采用棋盘方阵滴定法确定实施例1中分子筛纯化的rmHF1蛋白(以下简称rmHF1蛋白)最适包被浓度和最佳血清稀释度，以不同浓度的BSA封闭酶标板确定最佳封闭液浓度，确定血清和酶标二抗最佳工作时间，优化酶标二抗工作浓度，判定标准为：阳性血清与阴性血清的OD₄₅₀比值(P/N)最大的孔所对应的反应条件为ELISA方法的最佳反应条件。

将实施例1中分子筛纯化的rmHF1蛋白梯度稀释后包被酶标板，采用棋盘方阵滴定法确定rmHF1蛋白的包被量和血清稀释度；并在抗原最佳包被浓度和血清稀释度基础上优化ELISA检测条件。结果如表1所示，rmHF1蛋白的质量浓度为1.0μg/mL，待测血清稀释倍数为1:20时，P/N值最大，因此确定抗原(rmHF1蛋白)的最佳包被浓度为1.0μg/mL，待测血清稀释倍数为1:20。同时本实验确定HRP标记的兔抗山羊IgG按1:20000的比例稀释，37℃作用0.5h，加入TMB显色液10min后OD值最佳。

表1、ELISA检测方法的反应条件优化结果

	包被的抗原	封闭条件	待测血清	二抗IgG-HRP
					优化稀释度	1.0μg/mL	1％BSA	1:20	1:20000
反应条件	4℃/16h	37℃/2h	37℃/1h	37℃/0.5h

该步骤确定的以rmHF1蛋白为包被抗原间接ELISA方法检测小反刍兽疫病毒抗体的优化实验方法(以下简称重组rmHF1优化间接ELISA方法)如下：

1.1包被：用包被缓冲液稀释实施例1中分子筛纯化的rmHF1蛋白(以下简称rmHF1蛋白)至rmHF1蛋白的浓度为1.0μg/ml，得到包被原溶液，用该包被原溶液包被实验孔，100μL/孔加至酶标板，4℃孵育16h。

1.2洗涤：倾去孔内包被原溶液，用0.5％吐温洗涤液洗涤5次，每次3min；拍干。

1.3封闭：加入1％BSA封闭液，100ul/孔，37℃孵育2h。

1.4加样：

1.4.1样品孔

用包被缓冲液将PPRV阳性血清稀释20倍，得到待测血清。将100μL待测血清加到酶标板上，37℃反应1h，倾去孔内液体，然后用洗涤液洗涤5次，每次3min。其中，阳性血清为法国ID-VET的小反刍兽疫抗体检测试剂盒(ID PPR Competition小反刍兽疫抗体检测试剂盒，产品编号为PPRC-4P)检测为PPRV抗体阳性的羊血清。

1.4.2空白对照孔

与1.4.1的区别仅在于将待测血清替换为等体积的高纯水，其它步骤不变。

1.5加酶标二抗：加入用二抗稀释液进行1:20000稀释的HRP标记兔抗山羊IgG，100ul/孔，37℃30min。

1.6显色：加入TMB，100ul/孔，反应10min。

1.7终止：加入0.2mol/L H₂SO₄溶液终止反应，100ul/孔。

1.8测定：用酶标仪读取各孔OD_450nm数值。

2、ELISA阴阳性临界值的确定

将中国动物疫病预防控制中心草食动物与人畜共患病室保存的1000份经法国ID-VET的小反刍兽疫抗体检测试剂盒(ID PPR Competition小反刍兽疫抗体检测试剂盒，产品编号为PPRC-4P)检测为PPRV阴性的羊血清采用步骤1的重组rmHF1优化间接ELISA方法(将1.4.1中的PPRV阳性血清分别替换为该1000份PPRV阴性血清，其它操作相同)进行间接ELISA检测，计算该1000份PPRV阴性血清的平均值(X)和标准偏差(SD)。判为阳性；判为阴性。

结果表明，该1000份PPRV阴性血清平均值为0.162，SD为0.053，因此阴阳性临界值为0.321。

3、特异性试验

利用步骤1的重组rmHF1优化间接ELISA方法对10份羊副结核病、羊布病、结核病、产气荚膜梭菌病和口蹄疫阳性血清进行检测，观察与其它疾病有无交叉反应。其中，将1.4.1中的PPRV阳性血清分别替换为上述血清，其它操作相同。结果表明该重组rmHF1优化间接ELISA方法对几种羊源的病原(羊副结核病、羊布病、结核病、产气荚膜梭菌病和口蹄疫阳性血清)阳性血清进行检测，其OD₄₅₀值分别为：0.169、0.171、0.122、0.194、0.226，均小于临界值0.321，表明rmHF1蛋白与羊副结核病、羊布病、结核病、产气荚膜梭菌病和口蹄疫阳性血清均无交叉反应，步骤1的重组rmHF1优化间接ELISA方法具有良好的特异性。

4、敏感性试验

将步骤1的优化间接ELISA方法中的rmHF1替换为重组H蛋白rmH，其它操作不变，建立重组H蛋白rmH优化间接ELISA方法。

将步骤1的优化间接ELISA方法中的rmHF1替换为重组F蛋白rmF，其它操作不变，建立重组F蛋白rmF优化间接ELISA方法。

其中，上述重组H蛋白rmH按照实施例1步骤4中rmHF1的可溶性表达及纯化方法制备，区别仅在于将进行可溶性诱导表达的重组大肠杆菌由重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET30a-rmHF1-Y替换为重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET30a-rmH-Y。重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET30a-rmH-Y是将pET30a-rmH-Y导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的重组菌。pET30a-rmH-Y是用rmH-Y替换pET30a(+)的Nde I和XhoI识别位点间的片段(包括Nde I识别位点和XhoI识别位点在内的小片段)，保持pET30a(+)的其它序列不变，得到的rmH-Y基因重组表达载体，命名为pET30a-rmH-Y。

pET30a-rmH-Y含有rmH-Y基因，rmH-Y基因是将SEQ ID No.1第1852-3555位核苷酸缺失，其它核苷酸不变得到的DNA，rmH-Y基因编码蛋白质rmH。rmH是将SEQ ID No.3的第617-1184位氨基酸残基缺失其它氨基酸残基不变得到的蛋白质。

上述重组F蛋白rmF按照实施例1步骤4中rmHF1的可溶性表达及纯化方法制备，区别仅在于将进行可溶性诱导表达的重组大肠杆菌由重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET30a-rmHF1-Y替换为重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET30a-rmF-Y。重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET30a-rmF-Y是将pET30a-rmF-Y导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的重组菌。pET30a-rmF-Y是用rmF-Y替换pET30a(+)的Nde I和XhoI识别位点间的片段(包括Nde I识别位点和XhoI识别位点在内的小片段)，保持pET30a(+)的其它序列不变，得到的rmF-Y基因重组表达载体，命名为pET30a-rmF-Y。pET30a-rmF-Y含有rmF-Y基因，rmF-Y基因是将SEQ ID No.1第25-1896位核苷酸缺失，其它核苷酸不变得到的DNA，rmF-Y基因编码蛋白质rmF。rmF是将SEQ ID No.3的第8-631位氨基酸残基缺失其它氨基酸残基不变得到的蛋白质。

将经法国ID-VET的小反刍兽疫抗体检测试剂盒(ID PPR Competition小反刍兽疫抗体检测试剂盒，产品编号为PPRC-4P)检测为PPRV阳性的羊血清进行倍比稀释，采用步骤1的重组rmHF1优化间接ELISA方法进行检测，同时采用重组H蛋白rmH优化间接ELISA方法、重组F蛋白rmF优化间接ELISA方法和该法国ID-VET的小反刍兽疫抗体检测试剂盒作对比，得出阳性临界值时的最大稀释度。

结果表明将PPRV阳性的羊血清从1：25开始进行倍比稀释，采用步骤1的重组rmHF1优化间接ELISA方法进行检测，PPRV阳性的羊血清的稀释度为1∶1600时仍呈阳性；采用重组H蛋白rmH优化间接ELISA方法进行检测，PPRV阳性的羊血清的最大稀释度为1:800；采用重组F蛋白rmF优化间接ELISA方法进行检测，PPRV阳性的羊血清的最大稀释度为1:800；表明步骤1的重组rmHF1优化间接ELISA方法敏感性较好，明显高于重组H蛋白rmH和重组F蛋白rmF作为包被抗原时检测方法的敏感性。

5、重复性试验

采用步骤1的重组rmHF1优化间接ELISA方法对6份羊血清在同批次板和不同批次板上分别进行检测，平行测定5次，计算批内、批间变异系数(CV)。结果显示，批内重复变异系数在2％～8％之间，批间重复变异系数小于9％(表2)。结果表明，步骤1的重组rmHF1优化间接ELISA方法具有良好的重复性。

表2步骤1的重组rmHF1优化间接ELISA方法重复性试验

6、符合性试验

采用步骤1的重组rmHF1优化间接ELISA方法进行检测，同时采用步骤4的重组H蛋白rmH优化间接ELISA方法、步骤4的重组F蛋白rmF优化间接ELISA方法和法国ID-VET的小反刍兽疫抗体检测试剂盒(ID PPR Competition小反刍兽疫抗体检测试剂盒，产品编号为PPRC-4P)对中国动物疫病预防控制中心草食动物与人畜共患病室保存的500份羊血清进行检测，计算前三者与法国ID-VET的小反刍兽疫抗体检测试剂盒的符合率。

结果表明采用步骤1的重组rmHF1优化间接ELISA方法检测该500份羊血清的阳性率为44.19％；法国ID-VET的小反刍兽疫抗体检测试剂盒检测阳性率为42.25％，步骤1的重组rmHF1优化间接ELISA方法与法国ID-VET的小反刍兽疫抗体检测试剂盒符合率为94.5％。而步骤4的重组H蛋白rmH优化间接ELISA方法与法国ID-VET的小反刍兽疫抗体检测试剂盒的符合率只有83.3％，步骤4的重组F蛋白rmF优化间接ELISA方法与法国ID-VET的小反刍兽疫抗体检测试剂盒的符合率只有72.6％。说明将rmHF1-Y作为包被抗原建立的间接ELISA检测小反刍兽疫病毒抗体的方法与法国ID-VET的小反刍兽疫抗体检测试剂盒的符合率显著高于以重组PPRV H蛋白rmH作为包被抗原建立的间接ELISA检测小反刍兽疫病毒抗体的方法和以重组PPRV F蛋白rmF作为包被抗原建立的间接ELISA检测小反刍兽疫病毒抗体的方法。

<110> 中国动物疫病预防控制中心

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3564

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> CDS

<222> (4)..(3558)

<223>

<400> 1

catatgcacc atcaccacca tcacatgagc gcacaacgcg aacgcatcaa cgcgttctac 60

aaagacaacc tgcacaacaa aacccatcgc gttatcctgg atcgcgaacg tctgaccatt 120

gaacgtccgt atatcctgct gggggttctg ctggttatgt ttctgagcct gatcggtctg 180

ctggcaattg ctggtattcg tctgcatcgc gcaaccgttg gtaccgcaga aattcaaagc 240

cgtctgaaca ccaacatcga actgaccgaa agcatcgacc atcagaccaa agacgttctg 300

accccgctgt ttaaaatcat cggcgacgaa gtcggcattc gtattccgca gaaattcagc 360

gacctggtca aattcatcag cgacaaaatc aaattcctga acccggaccg cgaatacgat 420

tttcgcgatc tgcgttggtg tatgaatccg ccggaacgcg tcaaaatcaa cttcgaccag 480

ttctgcgaat acaaagcggc ggttaaaagc gtcgaacaca tcttcgaaag cagcctgaac 540

cgttctgaac gtctgcgtct gctgaccctg ggtccgggta ccggttgtct gggtcgtacc 600

gttacccgtg cacaatttag cgaactgacc ctgaccctga tggatctgga cctggagatg 660

aaacataacg tcagcagcgt ctttaccgtt gtggaagaag gtctgtttgg ccgtacctat 720

accgtttggc gttctgatac cggtaaaccg agtaccagtc cgggtattgg tcattttctg 780

cgcgtcttcg aaattggtct ggttcgcgat ctggaactgg gcgctccgat ttttcacatg 840

accaactacc tgaccgtcaa catgagcgac gattaccgtt cttgtctgct ggcagttggc 900

gaactgaaac tgaccgcact gtgtaccccg tctgaaaccg ttaccctgtc tgaatctggc 960

gttccgaaac gcgaaccgct ggttgtcgtt attctgaatc tggcaggtcc gaccctgggc 1020

ggcgaactgt attctgttct gccgaccacc gatccgaccg ttgaaaaact gtatctgagc 1080

agccatcgcg gtatcatcaa agacaacgaa gcgaattggg ttgttccgtc taccgacgtt 1140

cgtgatctgc aaaacaaagg cgagtgcctg gttgaagctt gtaaaacccg tccgccgagc 1200

ttttgtaacg gtaccggtat tggtccgtgg tctgaaggtc gtattccggc ttacggcgtt 1260

attcgcgttt ctctggatct ggcatctgat ccgggcgtag ttattaccag cgtttttggt 1320

ccgctgattc cgcatctgtc tggcatggac ctgtataata atccgtttag ccgcgcggct 1380

tggctggcag ttccgccgta cgaacagtct tttctgggca tgatcaacac cattggtttt 1440

ccggatcgcg ctgaagttat gccgcatatt ctgaccaccg aaattcgcgg tccgcgcggt 1500

cgttgtcatg ttccgattga actgagcagc cgtatcgacg acgacatcaa aatcggcagc 1560

aacatggttg tcctgccgac caaagatctg cgttatatca ccgcgaccta cgacgtttct 1620

cgtagcgaac acgcgatcgt ctactacatc tacgataccg gccgtagcag cagctatttt 1680

tacccggttc gtctgaactt tcgcggtaat ccgctgtctc tgcgtattga gtgctttccg 1740

tggtaccaca aagtctggtg ttaccacgac tgcctgatct acaacaccat caccaacgaa 1800

gaagtgcata cccgcggtct gaccggtatt gaagtcacct gcaacccggt tggtggcggt 1860

ggaatcggag gtggtggaag cggaggaggt ggaagcatgc accatcacca ccatcacatg 1920

acccgcgttg cgaccctggt ctttctgttt ctgttcccga acaccgttac ctgtcagatt 1980

cattggggca acctgagcaa aatcggcatt gttggtaccg gtagcgcttc ctacaaagtt 2040

atgacccgtc cgagtcatca gaccctggtt atcaaactga tgccgaacat caccgcgatt 2100

gataactgca ccaaaagcga gatcagcgag tacaaacgtc tgctgatcac cgttctgaaa 2160

ccggttgaag acgcactgag cgtcatcacc aaaaacgtcc gtccgattca aaccctgacc 2220

ccgggtcgtc gtacccgtcg ttttgtaggc gctgttctgg caggtgttgc actgggcgtt 2280

gcaaccgcag cacaaattac cgcaggcgtt gcactgcatc agtctctgat gaacagccag 2340

gcgattgaaa gcctgaaaac cagcctggag aaaagcaacc aggcaattga agaaatccgt 2400

ctggcgaaca aagaaaccat cctggcagtt cagggcgtcc aggattacat caacaacgag 2460

ctggtcccgt ctgttcatcg tatgagctgc gaactggtcg gtcataaact gagcctgaaa 2520

ctgctgcgct actacaccga gatcctgagc atctttggtc cgagtctgcg cgatccgatt 2580

gcagcggaaa ttagcattca ggcgctgagt tacgcgctgg gcggcgatat taacaaaatc 2640

ctggacaaac tgggctattc tggcggcgat tttctggcga ttctggaatc caaaggcatc 2700

aaagcgcgcg ttacctacgt tgatacccgc gattatttca tcatcctgag cattgcgtat 2760

ccgaccctga gcgaaatcaa aggcgttatc gtccacaaaa tcgaggcgat cagctacaac 2820

atcggcgctc aagagtggta taccacgatt ccgcgttacg ttgcgaccca gggttatctg 2880

attagcaact tcgacgagac cagctgcgtt tttaccccgg aaggtaccgt ttgtagccaa 2940

aacgctctgt atccgatgag tccgctgctg caagagtgtt ttcgcggtag caccaaaagt 3000

tgcgcacgta ccctggtttc tggtaccacc agtaatcgct tcatcctgag caaaggcaac 3060

ctgatcgcaa attgcgcctc tgttctgtgc aaatgctaca ccaccgaaac cgtcatcaac 3120

caggatccgg ataaactgct gaccgttatt gcctctgata aatgcccggt agttgaagtt 3180

gacggcgtca ccattcaggt tggtagccgc gaatatccgg atagcgtcta tctgcacgag 3240

attgatctgg gtccggcaat ttctctggag aaactggatg tcggtaccaa tctgggtaac 3300

gcagttacgc gtctggaaaa cgcaaaagaa ctgctggacg cgagcgatca gattctgaaa 3360

accgttaaag gcgttccgtt cagcggtaac atctacattg ccctggcagc ttgtattggc 3420

gttagtctgg gtctggttac cctgatttgc tgttgcaaag gccgttgtcg caacaaagag 3480

attccggcaa gcaaaattaa tccgggcctg aaaccggatc tgaccggtac cagcaaaagc 3540

tacgttcgta gcctgtaact cgag 3564

<210> 2

<211> 1184

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

Met His His His His His His Met Ser Ala Gln Arg Glu Arg Ile Asn

1 5 10 15

Ala Phe Tyr Lys Asp Asn Leu His Asn Lys Thr His Arg Val Ile Leu

20 25 30

Asp Arg Glu Arg Leu Thr Ile Glu Arg Pro Tyr Ile Leu Leu Gly Val

35 40 45

Leu Leu Val Met Phe Leu Ser Leu Ile Gly Leu Leu Ala Ile Ala Gly

50 55 60

Ile Arg Leu His Arg Ala Thr Val Gly Thr Ala Glu Ile Gln Ser Arg

65 70 75 80

Leu Asn Thr Asn Ile Glu Leu Thr Glu Ser Ile Asp His Gln Thr Lys

85 90 95

Asp Val Leu Thr Pro Leu Phe Lys Ile Ile Gly Asp Glu Val Gly Ile

100 105 110

Arg Ile Pro Gln Lys Phe Ser Asp Leu Val Lys Phe Ile Ser Asp Lys

115 120 125

Ile Lys Phe Leu Asn Pro Asp Arg Glu Tyr Asp Phe Arg Asp Leu Arg

130 135 140

Trp Cys Met Asn Pro Pro Glu Arg Val Lys Ile Asn Phe Asp Gln Phe

145 150 155 160

Cys Glu Tyr Lys Ala Ala Val Lys Ser Val Glu His Ile Phe Glu Ser

165 170 175

Ser Leu Asn Arg Ser Glu Arg Leu Arg Leu Leu Thr Leu Gly Pro Gly

180 185 190

Thr Gly Cys Leu Gly Arg Thr Val Thr Arg Ala Gln Phe Ser Glu Leu

195 200 205

Thr Leu Thr Leu Met Asp Leu Asp Leu Glu Met Lys His Asn Val Ser

210 215 220

Ser Val Phe Thr Val Val Glu Glu Gly Leu Phe Gly Arg Thr Tyr Thr

225 230 235 240

Val Trp Arg Ser Asp Thr Gly Lys Pro Ser Thr Ser Pro Gly Ile Gly

245 250 255

His Phe Leu Arg Val Phe Glu Ile Gly Leu Val Arg Asp Leu Glu Leu

260 265 270

Gly Ala Pro Ile Phe His Met Thr Asn Tyr Leu Thr Val Asn Met Ser

275 280 285

Asp Asp Tyr Arg Ser Cys Leu Leu Ala Val Gly Glu Leu Lys Leu Thr

290 295 300

Ala Leu Cys Thr Pro Ser Glu Thr Val Thr Leu Ser Glu Ser Gly Val

305 310 315 320

Pro Lys Arg Glu Pro Leu Val Val Val Ile Leu Asn Leu Ala Gly Pro

325 330 335

Thr Leu Gly Gly Glu Leu Tyr Ser Val Leu Pro Thr Thr Asp Pro Thr

340 345 350

Val Glu Lys Leu Tyr Leu Ser Ser His Arg Gly Ile Ile Lys Asp Asn

355 360 365

Glu Ala Asn Trp Val Val Pro Ser Thr Asp Val Arg Asp Leu Gln Asn

370 375 380

Lys Gly Glu Cys Leu Val Glu Ala Cys Lys Thr Arg Pro Pro Ser Phe

385 390 395 400

Cys Asn Gly Thr Gly Ile Gly Pro Trp Ser Glu Gly Arg Ile Pro Ala

405 410 415

Tyr Gly Val Ile Arg Val Ser Leu Asp Leu Ala Ser Asp Pro Gly Val

420 425 430

Val Ile Thr Ser Val Phe Gly Pro Leu Ile Pro His Leu Ser Gly Met

435 440 445

Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Phe Ser Arg Ala Ala Trp Leu Ala Val Pro

450 455 460

Pro Tyr Glu Gln Ser Phe Leu Gly Met Ile Asn Thr Ile Gly Phe Pro

465 470 475 480

Asp Arg Ala Glu Val Met Pro His Ile Leu Thr Thr Glu Ile Arg Gly

485 490 495

Pro Arg Gly Arg Cys His Val Pro Ile Glu Leu Ser Ser Arg Ile Asp

500 505 510

Asp Asp Ile Lys Ile Gly Ser Asn Met Val Val Leu Pro Thr Lys Asp

515 520 525

Leu Arg Tyr Ile Thr Ala Thr Tyr Asp Val Ser Arg Ser Glu His Ala

530 535 540

Ile Val Tyr Tyr Ile Tyr Asp Thr Gly Arg Ser Ser Ser Tyr Phe Tyr

545 550 555 560

Pro Val Arg Leu Asn Phe Arg Gly Asn Pro Leu Ser Leu Arg Ile Glu

565 570 575

Cys Phe Pro Trp Tyr His Lys Val Trp Cys Tyr His Asp Cys Leu Ile

580 585 590

Tyr Asn Thr Ile Thr Asn Glu Glu Val His Thr Arg Gly Leu Thr Gly

595 600 605

Ile Glu Val Thr Cys Asn Pro Val Gly Gly Gly Gly Ile Gly Gly Gly

610 615 620

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met His His His His His His Met Thr

625 630 635 640

Arg Val Ala Thr Leu Val Phe Leu Phe Leu Phe Pro Asn Thr Val Thr

645 650 655

Cys Gln Ile His Trp Gly Asn Leu Ser Lys Ile Gly Ile Val Gly Thr

660 665 670

Gly Ser Ala Ser Tyr Lys Val Met Thr Arg Pro Ser His Gln Thr Leu

675 680 685

Val Ile Lys Leu Met Pro Asn Ile Thr Ala Ile Asp Asn Cys Thr Lys

690 695 700

Ser Glu Ile Ser Glu Tyr Lys Arg Leu Leu Ile Thr Val Leu Lys Pro

705 710 715 720

Val Glu Asp Ala Leu Ser Val Ile Thr Lys Asn Val Arg Pro Ile Gln

725 730 735

Thr Leu Thr Pro Gly Arg Arg Thr Arg Arg Phe Val Gly Ala Val Leu

740 745 750

Ala Gly Val Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly

755 760 765

Val Ala Leu His Gln Ser Leu Met Asn Ser Gln Ala Ile Glu Ser Leu

770 775 780

Lys Thr Ser Leu Glu Lys Ser Asn Gln Ala Ile Glu Glu Ile Arg Leu

785 790 795 800

Ala Asn Lys Glu Thr Ile Leu Ala Val Gln Gly Val Gln Asp Tyr Ile

805 810 815

Asn Asn Glu Leu Val Pro Ser Val His Arg Met Ser Cys Glu Leu Val

820 825 830

Gly His Lys Leu Ser Leu Lys Leu Leu Arg Tyr Tyr Thr Glu Ile Leu

835 840 845

Ser Ile Phe Gly Pro Ser Leu Arg Asp Pro Ile Ala Ala Glu Ile Ser

850 855 860

Ile Gln Ala Leu Ser Tyr Ala Leu Gly Gly Asp Ile Asn Lys Ile Leu

865 870 875 880

Asp Lys Leu Gly Tyr Ser Gly Gly Asp Phe Leu Ala Ile Leu Glu Ser

885 890 895

Lys Gly Ile Lys Ala Arg Val Thr Tyr Val Asp Thr Arg Asp Tyr Phe

900 905 910

Ile Ile Leu Ser Ile Ala Tyr Pro Thr Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val

915 920 925

Ile Val His Lys Ile Glu Ala Ile Ser Tyr Asn Ile Gly Ala Gln Glu

930 935 940

Trp Tyr Thr Thr Ile Pro Arg Tyr Val Ala Thr Gln Gly Tyr Leu Ile

945 950 955 960

Ser Asn Phe Asp Glu Thr Ser Cys Val Phe Thr Pro Glu Gly Thr Val

965 970 975

Cys Ser Gln Asn Ala Leu Tyr Pro Met Ser Pro Leu Leu Gln Glu Cys

980 985 990

Phe Arg Gly Ser Thr Lys Ser Cys Ala Arg Thr Leu Val Ser Gly Thr

995 1000 1005

Thr Ser Asn Arg Phe Ile Leu Ser Lys Gly Asn Leu Ile Ala Asn

1010 1015 1020

Cys Ala Ser Val Leu Cys Lys Cys Tyr Thr Thr Glu Thr Val Ile

1025 1030 1035

Asn Gln Asp Pro Asp Lys Leu Leu Thr Val Ile Ala Ser Asp Lys

1040 1045 1050

Cys Pro Val Val Glu Val Asp Gly Val Thr Ile Gln Val Gly Ser

1055 1060 1065

Arg Glu Tyr Pro Asp Ser Val Tyr Leu His Glu Ile Asp Leu Gly

1070 1075 1080

Pro Ala Ile Ser Leu Glu Lys Leu Asp Val Gly Thr Asn Leu Gly

1085 1090 1095

Asn Ala Val Thr Arg Leu Glu Asn Ala Lys Glu Leu Leu Asp Ala

1100 1105 1110

Ser Asp Gln Ile Leu Lys Thr Val Lys Gly Val Pro Phe Ser Gly

1115 1120 1125

Asn Ile Tyr Ile Ala Leu Ala Ala Cys Ile Gly Val Ser Leu Gly

1130 1135 1140

Leu Val Thr Leu Ile Cys Cys Cys Lys Gly Arg Cys Arg Asn Lys

1145 1150 1155

Glu Ile Pro Ala Ser Lys Ile Asn Pro Gly Leu Lys Pro Asp Leu

1160 1165 1170

Thr Gly Thr Ser Lys Ser Tyr Val Arg Ser Leu

　　 1175 1180

<210> 3

<211> 3690

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(3684)

<223>

<400> 3

atgcaccatc atcatcatca ttcttctggt ctggtgccac gcggttctgg tatgaaagaa 60

accgctgctg ctaaattcga acgccagcac atggacagcc cagatctggg taccgacgac 120

gacgacaagg ccatggctga tatcggatcc atgagcgcac aacgcgaacg catcaacgcg 180

ttctacaaag acaacctgca caacaaaacc catcgcgtta tcctggatcg cgaacgtctg 240

accattgaac gtccgtatat cctgctgggg gttctgctgg ttatgtttct gagcctgatc 300

ggtctgctgg caattgctgg tattcgtctg catcgcgcaa ccgttggtac cgcagaaatt 360

caaagccgtc tgaacaccaa catcgaactg accgaaagca tcgaccatca gaccaaagac 420

gttctgaccc cgctgtttaa aatcatcggc gacgaagtcg gcattcgtat tccgcagaaa 480

ttcagcgacc tggtcaaatt catcagcgac aaaatcaaat tcctgaaccc ggaccgcgaa 540

tacgattttc gcgatctgcg ttggtgtatg aatccgccgg aacgcgtcaa aatcaacttc 600

gaccagttct gcgaatacaa agcggcggtt aaaagcgtcg aacacatctt cgaaagcagc 660

ctgaaccgtt ctgaacgtct gcgtctgctg accctgggtc cgggtaccgg ttgtctgggt 720

cgtaccgtta cccgtgcaca atttagcgaa ctgaccctga ccctgatgga tctggacctg 780

gagatgaaac ataacgtcag cagcgtcttt accgttgtgg aagaaggtct gtttggccgt 840

acctataccg tttggcgttc tgataccggt aaaccgagta ccagtccggg tattggtcat 900

tttctgcgcg tcttcgaaat tggtctggtt cgcgatctgg aactgggcgc tccgattttt 960

cacatgacca actacctgac cgtcaacatg agcgacgatt accgttcttg tctgctggca 1020

gttggcgaac tgaaactgac cgcactgtgt accccgtctg aaaccgttac cctgtctgaa 1080

tctggcgttc cgaaacgcga accgctggtt gtcgttattc tgaatctggc aggtccgacc 1140

ctgggcggcg aactgtattc tgttctgccg accaccgatc cgaccgttga aaaactgtat 1200

ctgagcagcc atcgcggtat catcaaagac aacgaagcga attgggttgt tccgtctacc 1260

gacgttcgtg atctgcaaaa caaaggcgag tgcctggttg aagcttgtaa aacccgtccg 1320

ccgagctttt gtaacggtac cggtattggt ccgtggtctg aaggtcgtat tccggcttac 1380

ggcgttattc gcgtttctct ggatctggca tctgatccgg gcgtagttat taccagcgtt 1440

tttggtccgc tgattccgca tctgtctggc atggacctgt ataataatcc gtttagccgc 1500

gcggcttggc tggcagttcc gccgtacgaa cagtcttttc tgggcatgat caacaccatt 1560

ggttttccgg atcgcgctga agttatgccg catattctga ccaccgaaat tcgcggtccg 1620

cgcggtcgtt gtcatgttcc gattgaactg agcagccgta tcgacgacga catcaaaatc 1680

ggcagcaaca tggttgtcct gccgaccaaa gatctgcgtt atatcaccgc gacctacgac 1740

gtttctcgta gcgaacacgc gatcgtctac tacatctacg ataccggccg tagcagcagc 1800

tatttttacc cggttcgtct gaactttcgc ggtaatccgc tgtctctgcg tattgagtgc 1860

tttccgtggt accacaaagt ctggtgttac cacgactgcc tgatctacaa caccatcacc 1920

aacgaagaag tgcatacccg cggtctgacc ggtattgaag tcacctgcaa cccggttggt 1980

ggcggtggaa tcggaggtgg tggaagcgga ggaggtggaa gcatgcacca tcaccaccat 2040

cacatgaccc gcgttgcgac cctggtcttt ctgtttctgt tcccgaacac cgttacctgt 2100

cagattcatt ggggcaacct gagcaaaatc ggcattgttg gtaccggtag cgcttcctac 2160

aaagttatga cccgtccgag tcatcagacc ctggttatca aactgatgcc gaacatcacc 2220

gcgattgata actgcaccaa aagcgagatc agcgagtaca aacgtctgct gatcaccgtt 2280

ctgaaaccgg ttgaagacgc actgagcgtc atcaccaaaa acgtccgtcc gattcaaacc 2340

ctgaccccgg gtcgtcgtac ccgtcgtttt gtaggcgctg ttctggcagg tgttgcactg 2400

ggcgttgcaa ccgcagcaca aattaccgca ggcgttgcac tgcatcagtc tctgatgaac 2460

agccaggcga ttgaaagcct gaaaaccagc ctggagaaaa gcaaccaggc aattgaagaa 2520

atccgtctgg cgaacaaaga aaccatcctg gcagttcagg gcgtccagga ttacatcaac 2580

aacgagctgg tcccgtctgt tcatcgtatg agctgcgaac tggtcggtca taaactgagc 2640

ctgaaactgc tgcgctacta caccgagatc ctgagcatct ttggtccgag tctgcgcgat 2700

ccgattgcag cggaaattag cattcaggcg ctgagttacg cgctgggcgg cgatattaac 2760

aaaatcctgg acaaactggg ctattctggc ggcgattttc tggcgattct ggaatccaaa 2820

ggcatcaaag cgcgcgttac ctacgttgat acccgcgatt atttcatcat cctgagcatt 2880

gcgtatccga ccctgagcga aatcaaaggc gttatcgtcc acaaaatcga ggcgatcagc 2940

tacaacatcg gcgctcaaga gtggtatacc acgattccgc gttacgttgc gacccagggt 3000

tatctgatta gcaacttcga cgagaccagc tgcgttttta ccccggaagg taccgtttgt 3060

agccaaaacg ctctgtatcc gatgagtccg ctgctgcaag agtgttttcg cggtagcacc 3120

aaaagttgcg cacgtaccct ggtttctggt accaccagta atcgcttcat cctgagcaaa 3180

ggcaacctga tcgcaaattg cgcctctgtt ctgtgcaaat gctacaccac cgaaaccgtc 3240

atcaaccagg atccggataa actgctgacc gttattgcct ctgataaatg cccggtagtt 3300

gaagttgacg gcgtcaccat tcaggttggt agccgcgaat atccggatag cgtctatctg 3360

cacgagattg atctgggtcc ggcaatttct ctggagaaac tggatgtcgg taccaatctg 3420

ggtaacgcag ttacgcgtct ggaaaacgca aaagaactgc tggacgcgag cgatcagatt 3480

ctgaaaaccg ttaaaggcgt tccgttcagc ggtaacatct acattgccct ggcagcttgt 3540

attggcgtta gtctgggtct ggttaccctg atttgctgtt gcaaaggccg ttgtcgcaac 3600

aaagagattc cggcaagcaa aattaatccg ggcctgaaac cggatctgac cggtaccagc 3660

aaaagctacg ttcgtagcct gtaactcgag 3690

<210> 4

<211> 1227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser

1 5 10 15

Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp

20 25 30

Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met Ala Asp Ile

35 40 45

Gly Ser Met Ser Ala Gln Arg Glu Arg Ile Asn Ala Phe Tyr Lys Asp

50 55 60

Asn Leu His Asn Lys Thr His Arg Val Ile Leu Asp Arg Glu Arg Leu

65 70 75 80

Thr Ile Glu Arg Pro Tyr Ile Leu Leu Gly Val Leu Leu Val Met Phe

85 90 95

Leu Ser Leu Ile Gly Leu Leu Ala Ile Ala Gly Ile Arg Leu His Arg

100 105 110

Ala Thr Val Gly Thr Ala Glu Ile Gln Ser Arg Leu Asn Thr Asn Ile

115 120 125

Glu Leu Thr Glu Ser Ile Asp His Gln Thr Lys Asp Val Leu Thr Pro

130 135 140

Leu Phe Lys Ile Ile Gly Asp Glu Val Gly Ile Arg Ile Pro Gln Lys

145 150 155 160

Phe Ser Asp Leu Val Lys Phe Ile Ser Asp Lys Ile Lys Phe Leu Asn

165 170 175

Pro Asp Arg Glu Tyr Asp Phe Arg Asp Leu Arg Trp Cys Met Asn Pro

180 185 190

Pro Glu Arg Val Lys Ile Asn Phe Asp Gln Phe Cys Glu Tyr Lys Ala

195 200 205

Ala Val Lys Ser Val Glu His Ile Phe Glu Ser Ser Leu Asn Arg Ser

210 215 220

Glu Arg Leu Arg Leu Leu Thr Leu Gly Pro Gly Thr Gly Cys Leu Gly

225 230 235 240

Arg Thr Val Thr Arg Ala Gln Phe Ser Glu Leu Thr Leu Thr Leu Met

245 250 255

Asp Leu Asp Leu Glu Met Lys His Asn Val Ser Ser Val Phe Thr Val

260 265 270

Val Glu Glu Gly Leu Phe Gly Arg Thr Tyr Thr Val Trp Arg Ser Asp

275 280 285

Thr Gly Lys Pro Ser Thr Ser Pro Gly Ile Gly His Phe Leu Arg Val

290 295 300

Phe Glu Ile Gly Leu Val Arg Asp Leu Glu Leu Gly Ala Pro Ile Phe

305 310 315 320

His Met Thr Asn Tyr Leu Thr Val Asn Met Ser Asp Asp Tyr Arg Ser

325 330 335

Cys Leu Leu Ala Val Gly Glu Leu Lys Leu Thr Ala Leu Cys Thr Pro

340 345 350

Ser Glu Thr Val Thr Leu Ser Glu Ser Gly Val Pro Lys Arg Glu Pro

355 360 365

Leu Val Val Val Ile Leu Asn Leu Ala Gly Pro Thr Leu Gly Gly Glu

370 375 380

Leu Tyr Ser Val Leu Pro Thr Thr Asp Pro Thr Val Glu Lys Leu Tyr

385 390 395 400

Leu Ser Ser His Arg Gly Ile Ile Lys Asp Asn Glu Ala Asn Trp Val

405 410 415

Val Pro Ser Thr Asp Val Arg Asp Leu Gln Asn Lys Gly Glu Cys Leu

420 425 430

Val Glu Ala Cys Lys Thr Arg Pro Pro Ser Phe Cys Asn Gly Thr Gly

435 440 445

Ile Gly Pro Trp Ser Glu Gly Arg Ile Pro Ala Tyr Gly Val Ile Arg

450 455 460

Val Ser Leu Asp Leu Ala Ser Asp Pro Gly Val Val Ile Thr Ser Val

465 470 475 480

Phe Gly Pro Leu Ile Pro His Leu Ser Gly Met Asp Leu Tyr Asn Asn

485 490 495

Pro Phe Ser Arg Ala Ala Trp Leu Ala Val Pro Pro Tyr Glu Gln Ser

500 505 510

Phe Leu Gly Met Ile Asn Thr Ile Gly Phe Pro Asp Arg Ala Glu Val

515 520 525

Met Pro His Ile Leu Thr Thr Glu Ile Arg Gly Pro Arg Gly Arg Cys

530 535 540

His Val Pro Ile Glu Leu Ser Ser Arg Ile Asp Asp Asp Ile Lys Ile

545 550 555 560

Gly Ser Asn Met Val Val Leu Pro Thr Lys Asp Leu Arg Tyr Ile Thr

565 570 575

Ala Thr Tyr Asp Val Ser Arg Ser Glu His Ala Ile Val Tyr Tyr Ile

580 585 590

Tyr Asp Thr Gly Arg Ser Ser Ser Tyr Phe Tyr Pro Val Arg Leu Asn

595 600 605

Phe Arg Gly Asn Pro Leu Ser Leu Arg Ile Glu Cys Phe Pro Trp Tyr

610 615 620

His Lys Val Trp Cys Tyr His Asp Cys Leu Ile Tyr Asn Thr Ile Thr

625 630 635 640

Asn Glu Glu Val His Thr Arg Gly Leu Thr Gly Ile Glu Val Thr Cys

645 650 655

Asn Pro Val Gly Gly Gly Gly Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

660 665 670

Gly Ser Met His His His His His His Met Thr Arg Val Ala Thr Leu

675 680 685

Val Phe Leu Phe Leu Phe Pro Asn Thr Val Thr Cys Gln Ile His Trp

690 695 700

Gly Asn Leu Ser Lys Ile Gly Ile Val Gly Thr Gly Ser Ala Ser Tyr

705 710 715 720

Lys Val Met Thr Arg Pro Ser His Gln Thr Leu Val Ile Lys Leu Met

725 730 735

Pro Asn Ile Thr Ala Ile Asp Asn Cys Thr Lys Ser Glu Ile Ser Glu

740 745 750

Tyr Lys Arg Leu Leu Ile Thr Val Leu Lys Pro Val Glu Asp Ala Leu

755 760 765

Ser Val Ile Thr Lys Asn Val Arg Pro Ile Gln Thr Leu Thr Pro Gly

770 775 780

Arg Arg Thr Arg Arg Phe Val Gly Ala Val Leu Ala Gly Val Ala Leu

785 790 795 800

Gly Val Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Val Ala Leu His Gln

805 810 815

Ser Leu Met Asn Ser Gln Ala Ile Glu Ser Leu Lys Thr Ser Leu Glu

820 825 830

Lys Ser Asn Gln Ala Ile Glu Glu Ile Arg Leu Ala Asn Lys Glu Thr

835 840 845

Ile Leu Ala Val Gln Gly Val Gln Asp Tyr Ile Asn Asn Glu Leu Val

850 855 860

Pro Ser Val His Arg Met Ser Cys Glu Leu Val Gly His Lys Leu Ser

865 870 875 880

Leu Lys Leu Leu Arg Tyr Tyr Thr Glu Ile Leu Ser Ile Phe Gly Pro

885 890 895

Ser Leu Arg Asp Pro Ile Ala Ala Glu Ile Ser Ile Gln Ala Leu Ser

900 905 910

Tyr Ala Leu Gly Gly Asp Ile Asn Lys Ile Leu Asp Lys Leu Gly Tyr

915 920 925

Ser Gly Gly Asp Phe Leu Ala Ile Leu Glu Ser Lys Gly Ile Lys Ala

930 935 940

Arg Val Thr Tyr Val Asp Thr Arg Asp Tyr Phe Ile Ile Leu Ser Ile

945 950 955 960

Ala Tyr Pro Thr Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile

965 970 975

Glu Ala Ile Ser Tyr Asn Ile Gly Ala Gln Glu Trp Tyr Thr Thr Ile

980 985 990

Pro Arg Tyr Val Ala Thr Gln Gly Tyr Leu Ile Ser Asn Phe Asp Glu

995 1000 1005

Thr Ser Cys Val Phe Thr Pro Glu Gly Thr Val Cys Ser Gln Asn

1010 1015 1020

Ala Leu Tyr Pro Met Ser Pro Leu Leu Gln Glu Cys Phe Arg Gly

1025 1030 1035

Ser Thr Lys Ser Cys Ala Arg Thr Leu Val Ser Gly Thr Thr Ser

1040 1045 1050

Asn Arg Phe Ile Leu Ser Lys Gly Asn Leu Ile Ala Asn Cys Ala

1055 1060 1065

Ser Val Leu Cys Lys Cys Tyr Thr Thr Glu Thr Val Ile Asn Gln

1070 1075 1080

Asp Pro Asp Lys Leu Leu Thr Val Ile Ala Ser Asp Lys Cys Pro

1085 1090 1095

Val Val Glu Val Asp Gly Val Thr Ile Gln Val Gly Ser Arg Glu

1100 1105 1110

Tyr Pro Asp Ser Val Tyr Leu His Glu Ile Asp Leu Gly Pro Ala

1115 1120 1125

Ile Ser Leu Glu Lys Leu Asp Val Gly Thr Asn Leu Gly Asn Ala

1130 1135 1140

Val Thr Arg Leu Glu Asn Ala Lys Glu Leu Leu Asp Ala Ser Asp

1145 1150 1155

Gln Ile Leu Lys Thr Val Lys Gly Val Pro Phe Ser Gly Asn Ile

1160 1165 1170

Tyr Ile Ala Leu Ala Ala Cys Ile Gly Val Ser Leu Gly Leu Val

1175 1180 1185

Thr Leu Ile Cys Cys Cys Lys Gly Arg Cys Arg Asn Lys Glu Ile

1190 1195 1200

Pro Ala Ser Lys Ile Asn Pro Gly Leu Lys Pro Asp Leu Thr Gly

1205 1210 1215

Thr Ser Lys Ser Tyr Val Arg Ser Leu

1220 1225

<210> 5

<211> 3564

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

catatgcatc atcaccatca ccatatgtcc gcacaaaggg aaaggatcaa tgccttctac 60

aaagacaatc ttcataataa gacccatagg gtaatcctgg atagggaacg cttaactatt 120

gaaagaccct acatcttact tggagtccta ctggtaatgt ttctgagtct aatcgggctg 180

ctggccattg cagggatcag gcttcaccga gccaccgttg ggactgcgga gatccagagt 240

cggctgaata ccaacattga gttgaccgaa tccattgatc atcaaactaa ggatgtctta 300

actcccctgt ttaaaatcat tggtgatgaa gtcggcatca gaattccaca gaagttcagt 360

gatcttgtca agttcatctc cgataagatt aagttcctca accctgacag agaatatgat 420

tttagggatc tccggtggtg tatgaacccc cctgagagag tcaaaattaa ctttgaccag 480

ttttgtgaat acaaagccgc agtcaagtca gttgaacata tatttgagtc atcactcaac 540

aggtcagaaa ggttgcgatt attgactctt gggcccggaa caggctgtct cggcaggaca 600

gtaacaagag ctcagttctc agagcttacg ctgaccctga tggacctgga tctcgagatg 660

aagcacaacg tgtcctcagt gtttaccgta gtcgaagagg gattattcgg aagaacatat 720

actgtctgga gatccgacac cggaaaaccg agcaccagtc caggtattgg ccatttttta 780

agagtcttcg agatcgggct ggtgagagat ctcgagctgg gtgcccctat tttccatatg 840

accaactacc tcacagtaaa catgagtgat gactatcgga gctgtctttt agcagtaggg 900

gagttgaagc tgacagccct atgcacccca tctgagactg tgactctgag tgagagtgga 960

gttccaaaga gagagcctct tgtggttgtg atactcaacc tagctgggcc tactctaggg 1020

ggcgaactat acagtgtatt gcctaccact gaccccacgg tggagaaact ctatttatcc 1080

tcacataggg ggattatcaa agataacgag gccaattggg tagtaccgtc gaccgatgtt 1140

cgtgatcttc aaaacaaagg agaatgtctg gtggaagcat gcaagactcg acctccttca 1200

ttttgcaatg gcacaggaat aggcccatgg tcagagggga gaatccctgc ctacggggtg 1260

atcagggtca gtcttgactt agctagtgac ccgggtgtag ttatcacttc agtgtttggc 1320

ccattgatac ctcacctatc cggtatggat ctttacaaca atccgttttc aagagctgca 1380

tggttggctg taccacctta tgagcagtca tttctaggaa tgataaatac aattggcttc 1440

ccggacagag cagaggttat gccgcacatt ttgaccacag agatcagagg gcctcgaggt 1500

cgttgtcatg ttcctataga gttgtccagc aggattgatg atgatatcaa gatcgggtcc 1560

aacatggttg tattgccgac gaaggacctg aggtacataa cagccactta tgatgtttcc 1620

aggagcgagc atgcaatcgt gtactatatc tatgacacgg gtcgctcatc atcttacttc 1680

tacccagttc gattgaattt caggggcaat cctctctctc tgaggataga gtgttttccc 1740

tggtatcata aggtgtggtg ctaccatgat tgtcttatat acaacaccat aacaaacgaa 1800

gaagtccaca cgagagggct gaccggtata gaggtaacat gtaatccagt cggtggcggt 1860

ggaatcggag gtggtggaag cggaggaggt ggaagcatgc atcatcacca tcaccatatg 1920

acacgggtcg caaccttagt atttctgttt cttttcccaa acactgtcac gtgccagatt 1980

cactggggca atctatccaa gatcgggatt gtaggaacgg ggagtgccag ctacaaggtg 2040

atgactaggc caagccacca aactctggtc ataaagttga tgccaaatat aacagccatc 2100

gacaattgta cgaaatcaga gatttcagag tacaaaagat tgctgatcac agtgttaaag 2160

cctgtagagg atgccctgtc agtgataacc aagaatgtaa gaccaattca aactctaaca 2220

cctgggcgca ggacccgccg ttttgtcggg gctgttctgg ccggagtagc acttggagtc 2280

gcgacagccg ctcaaataac tgccggagtc gcactccatc agtcattgat gaattcccaa 2340

gcaattgaaa gtttaaaaac cagtcttgag aagtcgaatc aggcaataga agaaatcaga 2400

cttgcaaata aggagaccat actggcggta cagggcgtcc aagactatat caacaatgag 2460

cttgtcccct ctgttcatag aatgtcatgt gagcttgtag gtcacaaact cagtctcaag 2520

ctccttaggt attataccga gatcctgtct atattcgggc ctagccttcg agacccgata 2580

gctgctgaaa tatcaatcca ggcactcagc tatgcattag gcggagacat caataaaatt 2640

ctggacaagc ttgggtatag cggcggggat ttccttgcta tcctagaaag caaggggata 2700

aaggcccggg tcacatatgt ggacacaaga gattacttta taattcttag catagcctac 2760

ccaaccttat ctgagatcaa gggggtgata gttcataaga tagaagctat atcctacaat 2820

attggggcac aggaatggta tactactatc cctagatatg tagccactca gggatatctg 2880

atatcgaatt tcgatgagac gtcatgcgtc ttcactccag aggggacagt ctgcagccag 2940

aatgcgttgt atccaatgag cccattgctt caggaatgct tcagggggtc gacaaaatcg 3000

tgcgccagaa ccctagtttc agggaccaca agtaatagat ttatcctatc aaaagggaac 3060

ttgattgcaa attgtgcgtc agttttgtgc aagtgttaca caacggagac agttatcaac 3120

caagatcctg ataaactact aactgttata gcctccgata agtgtcccgt agtcgaggtg 3180

gatggagtga caatacaggt cggcagtcga gagtacccag attctgtata cctacatgaa 3240

atagacttag gcccagccat ctccctggag aaactggatg taggcaccaa tttaggcaat 3300

gcagtcacaa gactggagaa tgcaaaggag ctactagatg catcagacca gatactgaag 3360

actgttaaag gggtaccttt cagtggcaat atatacatag cactggcagc ttgcattggg 3420

gtatccctag ggcttgtcac attaatatgc tgctgtaagg ggagatgtag gaacaaggag 3480

attcctgcct ccaaaatcaa cccagggctc aaacccgacc taaccgggac ttcaaagtcg 3540

tacgtgagat cactgtagct cgag 3564

Claims

1.制备蛋白质的方法，包括使蛋白质的编码基因在生物中进行表达得到所述蛋白质的步骤；所述生物为微生物、植物或非人动物；

所述蛋白质为a)或b)的蛋白质：

a)由SEQ ID No.2的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述使蛋白质的编码基因在生物中进行表达包括将权利要求1中所述的蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达权利要求1中所述蛋白质的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到权利要求1中所述蛋白质。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述受体微生物为原核微生物。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述原核微生物为革兰氏阴性细菌。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述革兰氏阴性细菌为埃希氏菌属细菌。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述埃希氏菌属细菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因为如下1)或2)所示的DNA分子：

1)编码序列是SEQ ID No.1第4-3558位所示的DNA分子；

2)与1)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1中所述蛋白质的DNA分子。

8.根据权利要求2-7中任一所述的方法，其特征在于：所述重组微生物为将pET30a-rmHF1-Y导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的表达氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质的重组微生物，所述重组微生物命名为BL21(DE3)/pET30a-rmHF1-Y，所述pET30a-rmHF1-Y是用SEQID No.1所示的DNA替换pET30a(+)的Nde I和XhoI识别位点间的片段，保持pET30a(+)的其它序列不变，得到的重组表达载体。

9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于：所述表达为诱导表达；所述诱导表达是用0.75mM的IPTG在16℃诱导13-16小时或13-24小时或13小时或16小时。

10.权利要求1-9中任一所述的方法在制备检测小反刍兽疫病毒抗体的试剂盒中的应用、在制备小反刍兽疫诊断抗原中的应用、或在制备小反刍兽疫诊断试剂盒中的应用。