CN101422607A - 小反刍兽疫重组山羊痘病毒活载体疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供小反刍兽疫重组山羊痘病毒活载体疫苗，其包括：(1)GPV弱毒疫苗，其作为载体；(2)PPRV疫苗的病毒囊膜表面融合蛋白F基因或血凝素蛋白H基因，其作为目的免疫基因；和(3)筛选基因，其包括gpt，和报告基因eGFP。这两种疫苗分别命名为GPV－PPRV－F(CGMCC No.2621)和GPV－PPRV－H(CGMCC No.2619)。本发明还提供所述疫苗的制备方法和应用。本发明的重组山羊痘病毒活载体疫苗可以联合使用，用于同时预防GP、绵羊痘和PPR。

Description

小反刍兽疫重组山羊痘病毒活载体疫苗

技术领域

本发明涉及重组病毒疫苗领域，更具体地涉及小反刍兽疫重组山羊痘病毒活载体疫苗。本发明还涉及所述疫苗的制备方法及其应用。本发明利用我国自行培育并得到广泛应用的GPV弱毒株，分别构建了表达PPRV囊膜蛋白F和H的重组山羊痘病毒，分别命名为GPV-PPRV-F(CGMCC No.2621)和GPV-PPRV-H(CGMCC No.2619)，并对其免疫效力进行了初步评估。

背景技术

小反刍兽疫(Peste des petits of ruminants，PPR)和山羊痘(Goat pox，GP)为分别由小反刍兽疫病毒(peste des petits of ruminants virus，PPRV)和山羊痘病毒(Goat pox virus，GPV)引起的危害山羊、绵羊等小反刍动物的两种重大疫病，均为OIE发布A类烈性传染病。PPR长期以来一直在非洲、中东、中亚、南亚及东南亚地区危害流行，2007年传入我国西部边境地区，导致局部疫情，对我国的畜牧养殖业形成严重威胁。GP多年来在我国局部地区表现为地方流行性，给我国养羊业造成一定危害。我国山羊和绵羊的饲养量数以亿计，PPR和GP这两种烈性传染病的防控意义重大。

PPRV属副粘病毒科麻疹病毒属成员，与牛瘟病毒(Rinderpest virus，RPV)同属，基因组进化与抗原性关系密切，具有共同的中和抗体表位。病毒囊膜表面的融合蛋白(F)和血凝素蛋白(H)为PPRV诱导中和抗体形成的主要免疫原。

GPV为正痘病毒科GPTV属成员。GPV弱毒疫苗预防GP安全有效。采用GP弱毒疫苗为载体构建PPR—GP重组二联活疫苗，可同时预防GP、绵羊痘和PPR，实现一种活毒疫苗预防多种烈性传染病，具有极为突出的优点。

山羊痘病毒基因组庞大，遗传稳定，其胸苷激酶(TK)基因编码区为复制非必需区，可允许大容量的外源基因插入和表达；GPV感染宿主谱狭窄，仅局限于牛羊等反刍兽；GP弱毒疫苗生产成本低廉，储运无需冷冻、使用方便；尤其重要的，利用重组表达除血凝素蛋白和融合蛋白以外的蛋白为抗原，小反刍兽疫重组山羊痘病毒活载体疫苗免疫反应可以很方便地与PPRV野毒感染相区别，不干扰血清学监测，克服了现有PPR弱毒疫苗的重大缺陷，对我国广大内地非疫区极为重要。

发明内容

本发明的一个目的是提供小反刍兽疫重组山羊痘病毒活载体疫苗。本发明利用我国自行培育并得到广泛应用的GPV弱毒株，分别构建了表达PPRV囊膜蛋白F和H的重组山羊痘病毒，分别命名为GPV-PPRV-F和GPV-PPRV-H，分别于2008年7月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国北京朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，100101)，保藏登记号分别为：CGMCC No.2621和2619，并对其免疫效力进行了初步评估。

本发明的另一个目的是提供所述疫苗的制备方法。

按照本发明的一些实施方案，提供了本发明的小反刍兽疫重组山羊痘病毒活载体疫苗的制备方法，其包括下述步骤：

(1)采用适当的引物，通过常规RT-PCR从PPRV弱毒疫苗75/1株(Nigeria/75/1)的基因组RNA分别扩增基因PPRV血凝素蛋白H基因和PPRV融合蛋白F基因；

(2)通过基因重组技术，分别构建表达PPRV融合蛋白F的pTK-gig-PPRV-F重组载体和表达PPRV血凝素蛋白H的pTK-gig-PPRV-H重组载体；

(3)将步骤(2)中的重组载体分别转染感染了GPV病毒液的细胞，通过在荧光倒置显微镜下监测绿色荧光而判断转染是否成功，转染成功后，表达PPRV-F和H蛋白的重组病毒载体与GPV病毒基因组的同源基因发生了同源重组，然后利用gpt和eGFP纯化筛选重组病毒克隆；和

(4)鉴定已经纯化的重组山羊痘病毒DNA，分别命名为GPV-PPRV-F和GPV-PPRV-H；

其中步骤(3)中所用的细胞是原代山羊睾丸细胞，即LT细胞。

按照本发明的另一个实施方案，利用本发明获得的重组病毒GPV-PPRV-H和GPV-PPRV-F，以及阴性对照GPV感染初代LT细胞，在荧光倒置显微镜下观察到感染本发明的重组病毒的LT细胞自发产生绿色荧光(图5)。进一步以鼠抗PPRV的H蛋白和F蛋白高免血清为一抗，以红色荧光素(TRITC)标记的羊抗鼠IgG(Sigma)为二抗进行免疫荧光检测，结果重组病毒GPV-PPRV-H和GPV-PPRV-F分别显示特异的红色免疫荧光(图6B和6C)，而野生型GPV则表现为红色荧光阴性反应(图6A)。本发明的重组病毒的这种特异性免疫荧光反应为重组病毒的克隆纯化、传代生产过程中遗传稳定性观察等提供了极大的便利。

按照本发明的其它实施方案，用本发明的重组病毒免疫山羊，免疫后每天观察注射部位的反应和精神状态并测量体温。首次免疫后28天用相同剂量途径进行二次免疫。分别于首次免疫前及免疫后第21天和第28天，二次免疫后第7天、14天及28天采集静脉血，分离血清，56℃ 30分钟灭活，—20℃冻存，用于血清GPV及PPRV特异中和抗体滴度的检测。由于中和抗体反应能够较为客观地反映弱毒疫苗的免疫保护效果，我们研制的重组山羊痘病毒候选疫苗株能够诱导显著的中和抗体反应，从而能够参照PPRV弱毒疫苗的办法，直接采用中和抗体检测进行重组痘病毒免疫效力评估，确保该重组疫苗在未来疫苗生产质量控制及现地生产应用评估中具有充分的技术可行性。

本发明的另一个目的是提供本发明的重组山羊痘病毒活载体疫苗的应用。本发明的重组山羊痘病毒活载体疫苗可以用于同时预防或治疗GP、绵羊痘和PPR，可以同时使用表达H和F蛋白的重组痘病毒进行联合免疫。本发明的重组山羊痘病毒活载体疫苗主要用于小反刍兽类动物，包括牛、羊等。

此外，本发明的重组山羊痘病毒活载体疫苗还可以用于制备用于预防或治疗GP、绵羊痘和PPR的试剂盒。

因此，本发明的另一个目的是提供一种用于预防或治疗GP、绵羊痘和PPR的试剂盒，其包括本发明所述的重组山羊痘病毒活载体疫苗。

本发明的一个优点在于，山羊痘病毒疫苗株(CVCC AV41)是由我国分离驯化的，符合中国的痘病毒流行情况，能够提供针对国内流行的痘病毒更有效的免疫保护。

本发明的另一个优点在于，本发明构建的表达F蛋白的重组GPV和表达H蛋白的重组GPV均诱导显著的中和抗体反应，特别地，单次免疫后2周均能诱导显著的中和抗体反应；并且，表达H和F蛋白的重组痘病毒联合免疫，能诱导更加显著的、同时针对H和F抗原表面多种中和表位的中和抗体，因而提高更加全面、持续的免疫保护，这一点在针对存在一定程度基因变异的流行野毒株时，更有意义。

本发明还有一个优点在于，与现有技术相比较，本发明的免疫原基因H或F仍采用P7.5强启动子，但gpt则采用相对较弱的痘病毒晚期启动子p11，这样虽然有可能增加重组病毒筛选的难度，但更加有利于目的抗原基因的表达，因而诱导更加显著的中和抗体反应，我们的实验结果证明了我们这种构建策略在免疫效果上的优势。

本发明的另一个优点在于，通过IRES序列串联作用，p11启动子同时转录表达gpt和绿色荧光报告基因eGFP(二者都是筛选基因)，重组病毒带有绿色荧光标签，使得重组病毒的克隆纯化、传代生产过程中遗传稳定性观察、毒价滴定等变得极为方便、快捷，从而克服了GPV弱毒免疫株在LT细胞上本身病变出现较慢，重组病毒在TK缺失后细胞病变效应进一步较削弱，以及野生型病毒与重组型病毒难以分离纯化的缺点。

尤其重要的，利用重组表达除血凝素蛋白和融合蛋白以外的蛋白为抗原来检测PPRV野毒感染动物后产生的抗体，小反刍兽疫重组山羊痘病毒活载体疫苗免疫反应可以很方便地与PPRV野毒感染相区别，不干扰血清学监测，克服了现有PPR弱毒疫苗的重大缺陷，对我国广大内地非疫区极为重要。

附图说明

从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：

图1.重组GPV的纯化鉴定和重组GPV-PPRV-H和GPV-PPRV-F的H和F基因整合鉴定，其中，图1A：重组GPV的纯化鉴定，M.DL2000标记；P.GPV；F.GPV-F；H.GPV-H；图1B：重组GPV-PPRV-H和GPV-PPRV-F的H和F基因整合鉴定，M.DL2000标记；1.GPV+F基因的鉴定引物；2.GPV-PPRV-F+F基因的鉴定引物；3.GPV+H基因的鉴定引物；4.GPV-PPRV-H+H基因的鉴定引物。

图2.表达绿色荧光蛋白重组GPV构建的同源重组质粒pTK-gpt-ires-egfp。2A，质粒图谱；2B，质粒序列(SEQ ID No.1)，其中：正常印刷体：psp72骨架；单直线下划线：tk-L tk左同源壁；波浪下划线：tk-R tk右同源壁；阴影：ires-egfp基因；方框：gpt基因；阴影加虚线下划线：p7.5启动子；阴影加单直线下划线：p11启动子；双下划线：PstI；斜体加双下划线：SalI；斜体加方框：XbaI；斜体加单直线下划线：EcoRI。

图3.用于表达PPRV H基因重组GPV构建的同源重组质粒pTk-gig-PPRV-H。3A，质粒图谱；3B，质粒序列(SEQ ID No.2)，其中：正常印刷体：psp72骨架；单直线下划线：tk-L tk左同源壁；波浪下划线：tk-R tk右同源壁；阴影：ires-egfp基因；方框：gpt基因；阴影加虚线下划线：p7.5启动子；阴影加单直线下划线：p11启动子；双下划线：PstI；斜体加双下划线：SalI；斜体加方框：XbaI；斜体加单直线下划线：EcoRI；黑色粗体加下划线：PPRV囊膜蛋白H基因ORF(SEQ ID No.4)。

图4.用于表达PPRV F基因重组GPV构建的同源重组质粒pTk-gig-PPRV-F。4A，质粒图谱；4B，质粒序列(SEQ ID No.3)，其中：正常印刷体：psp72骨架；单直线下划线：tk-L tk左同源壁；波浪下划线：tk-R tk右同源壁；阴影：ires-egfp基因；方框：gpt基因；阴影加虚线下划线：p7.5启动子；阴影加单直线下划线：p11启动子；双下划线：PstI；斜体加双下划线：SalI；斜体加方框：XbaI；斜体加单直线下划线：EcoRI；黑色粗体加下划线：PPRV囊膜蛋白F基因ORF(SEQ ID No.5)。

图5.表达增强绿色荧光蛋白(eGFP)的重组病毒感染LT细胞在荧光倒置显微镜下显示自发绿色荧光。从左至右：A.感染GPV的LT细胞(阴性对照)，B.感染表达PPRV H基因及eGFP的重组GPV(GPV-PPRV-H)的LT细胞，C.感染表达PPRV F基因及eGFP的重组GPV(GPV-PPRV-F)的LT细胞。

图6.重组病毒感染LT细胞免疫荧光检测。从左至右：A.感染GPV的LT细胞(阴性对照)，B.表达PPRV H基因重组GPV(GPV-PPRV-H)的LT细胞，C.表达PPRV F基因重组GPV(GPV-PPRV-F)的LT细胞。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明的小反刍兽疫重组山羊痘病毒活载体疫苗GPV-PPRV-F和GPV-PPRV-H。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。本领域的技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所限定的本发明的范围和精神的前体下，可以对本发明进行修改和改进。

1.材料与方法

病毒与细胞

GPV温度敏感弱毒疫苗株(CVCC AV41)及PPRV弱毒疫苗75/1株(Nigeria/75/1)均购自中国兽医兽药监察所。原代山羊睾丸细胞(LT)采用1月龄公绵羊睾丸经常规方法制备，与Vero细胞一样均采用含5％胎牛血清(Hyclone)MEM(Invitrogen)培养或继代；野生型或重组GPV及PPRV弱毒株的扩增与滴定均采用含2％胎牛血清(Hyclone)MEM(Invitrogen)，分别在LT细胞和Vero细胞进行。

基因扩增与质粒构建

高保真pfu(Takara公司)扩增质粒pIRES2-egfp(质粒来源：Clontech)上666bp～1973bp的ires-egfp序列。上游引物ir-f：5′-aaactgcaggcccctctccctcccccc-3′，下游引物ir-r：5′-aaactgcagttacttgtacagctcgtc-3′，均引入Pst I位点。将PCR产物克隆至pBluescript-II(质粒来源：Stratagene)的EcoR V位点，经序列测定准确无误后命名为pBlue-ires-egfp。用Pst I从pBlue-ires-egfp上切下ires-egfp基因，插入pTK-gpt-gfp^[1]上的Pst I位点，鉴定插入方向正确，命名为pTK-gpt-ires-egfp-gfp。再用Sal I切下pTK-gpt-ires-egfp-gfp上的一个GFP后使其自连，构建成pTK-gpt-ires-egfp(图2)。

用PPRV弱毒疫苗75/1株(Nigeria/75/1)接种Vero细胞上清，经Trizol(Invitrogen)处理提取PPRV基因组RNA，采用上、下游引物PPRV-Hf：5′-GGTTTAAACGCCGCCACCATGTCCGCACAAAG-3′和PPRV-Hr：5′-TGCGTTTAAACTCAGACTGGATTACATG-3′(上下游分别引入Pme I酶切位点)，经过常规RT—PCR扩增约1.85kb的PPRV血凝素蛋白(H)基因(SEQIDNo.4)；采用上、下游引物PPRV-Ff：5′-AT

GCCGCCACCATGACACGGGTCGCA-3′和PPRV-Fr：5′-TA

CTACAGTGATCTCACGT-3′(上、下游引物分别引入Xho I酶切位点)，经过常规RT—PCR扩增约1.65kb的PPRV融合蛋白(F)基因(SEQ ID No.5)。同时，扩增的H和F基因阅读框架(ORF)(即分别为SEQID No.4和SEQ ID No.5)均在起始密码ATG前引入kozak序列(GCCGCCACC)。将扩增的F和H基因PCR产物分别克隆到pBluescript-II(Strategene)的EcoRV位点，分别为pB-PPRV-F和pB-PPRV-H，序列测定无误后，用Xho I切下pB-PPRV-F上F基因ORF，插入到上述的pTK-gpt-ires-egfp的Sal I位点，鉴定正反向，命名为pTK-gig-PPRV-F(图4)；用Pme I切下pB-PPRV-H上H基因ORF，插入到Sal I酶切并末端补平的pTK-gpt-ires-eGFP中，鉴定正反向，命名为pTK-gig-PPRV-H(图3)。构建重组病毒质粒所用引物的序列总结在表1中。

表1.构建重组病毒质粒所用的引物

病毒重组及重组病毒纯化、鉴定

将初代次LT细胞生长于在35mm孔培养板板(Nunc)中，至密度约80％时，按0.05的感染复数(M.O.I.)值接种GPV病毒液100μl，感作1小时后，再采用钙转染试剂盒(Invitrogen)按操作说明书转染pTK-gig-PPR-H和pTK-gig-PPR-F，12小时后用10％DMSO(PBS溶解，pH7.2)休克2.5分钟，24小时后，在倒置荧光显微镜(ZEISS，型号：AxioObserver D1；德国)下观察是否有绿色荧光出现。待90％的细胞出现细胞病变(cytopathic effect，CPE)并出现绿色荧光时，收取LT细胞及培养上清，反复冻融三次，超声裂解3次，每次30秒，低速离心弃去细胞碎片，上清作10倍连续梯度稀释，接种初代次培养与35mm孔培养板的LT细胞，培养液添加霉酚酸(MPA，购自：sigma)25μg/ml，，黄嘌呤(Xanthine，购自：sigma)250μg/ml，，次黄嘌呤(Hypoxanthine，购自：sigma)15μg/ml，，37℃培养10天后，收获出现细胞病变高稀释倍数细胞及上清，反复冻融三次，超声裂解3次，每次30秒。离心弃去细胞碎片，上清作10倍连续梯度稀释，继续接种35mm培养孔内LT细胞，每孔100μl，感作1小时后覆盖含1％低熔点琼脂糖培养液，进行常规病毒蚀斑纯化克隆。通过连续多代次克隆纯化，挑取表达绿色荧光并形成面积较大蚀斑的重组病毒克隆，接种LT细胞上扩增，待细胞病变或绿色荧光阳性细胞达90％以上时，收获接种培养上清液，采用SDS—蛋白酶K消化方法提取重组病毒DNA，利用分别位于TK基因同源臂两侧的特异引物，通过PCR鉴定确认克隆病毒不含野生型GPV，已经为纯化的重组病毒。PPRV的H基因重组病毒命名为GPV-PPRV-H，F基因重组病毒命名为GPV-PPRV-F。

免疫荧光

以最后克隆获得重组病毒按MOI 0.05感染培养于24孔板的初代LT细胞，待细胞病变阳性或绿色免疫荧光阳性LT细胞接近50％时，弃去上清，PBST洗涤3遍。3％多聚甲醛(购自：天津科密欧)室温下固定20分钟，吸去固定液，PBST洗涤3遍。选取1个野生型GPV感染细胞孔和1个未感染细胞孔为对照。分别加入用PBST(含0.1％胎牛血清白蛋白(购自：sigma))稀释50倍的鼠抗PPRV的H蛋白和F蛋白特异单因子高免血清(本实验室按本领域公知的常规方法制备)100μl，室温下作用30分钟后，PBST洗涤3遍。加入以PBST按200倍稀释红色荧光素(TRITC)标记的羊抗鼠IgG(Sigma)100μl，室温作用30分钟，PBST洗涤3遍，荧光倒置显微镜((ZEISS，型号：Axio Observer D1，德国)下观察结果。

免疫试验

免疫试验动物选用12只0.5～2岁的山羊，随机分为3组并编号。其中，第一组(1～6号)接种表达H蛋白免疫原的重组山羊痘病毒，第二组(7～9号)接种表达F蛋白免疫原的重组山羊痘病毒，第三组(10—12号)为接种亲本野生型GPV疫苗株。免疫接种方法如下，每只羊接种剂量为无血清MEM稀释病毒液0.5ml，含2×10⁶PFU病毒量，左右腹股沟内侧皮内途径各一注射点，每点注射250μl。免疫后每天观察注射部位的反应和精神状态并测量体温。首次免疫后28天用相同剂量途径进行二次免疫。分别于首次免疫前及免疫后第21天和28天，二次免疫后7天、14天及28天采集静脉血，分离血清，56℃30分钟灭活，—20℃冻存，用于血清GPV及PPRV特异中和抗体滴度的检测。

中和抗体检测

血清GPV及PPRV特异中和抗体滴度的检测分别采用GPV疫苗株和PPRV疫苗株，按固定病毒量，血清连续梯度稀释方法在96孔微量培养板(购自：Corning)进行，具体操作术式及结果判断，按O.I.E.推荐方法进行(World Organisation for Animal Health.Manual of Diagnostic Tests andVaccines for Terrestrial Animals，2004)。

2.结果

利用gpt和eGFP作为筛选基因，通过连续多代次蚀斑克隆，选取表达eGFP阳性噬斑克隆病毒在LT细胞上扩增，提取重组GPV核酸DNA，利用分别位于TK基因同源臂两侧的特异引物^[1]进行PCR扩增鉴定TK基因，用特异扩增PPRV-H(上游引物PPRV-Hf′：5′-AAT GGC ACA GGA ATAGGC-3′，下游引物PPRV-Hr′：5′-GAG CGA CCC GTG TCA TAG-3′)和PPRV-F(上游引物PPRV-Ff′：5′-AGC CAG AAT GCG TTG TAT-3′，下游引物PPRV-Fr′：5′-AAG CTG CCA GTG CTA TGT-3′)基因的引物鉴定目的基因的插入，用野生型GPV作为对照。结果，用TK基因特异引物鉴定，野生型GPV扩增出740bp条带，而重组毒未扩增出相同条带(图1A)，而以PPRV-H和PPRV-F特异鉴定引物分别扩增出461bp和468bp条带(图1B)。结果表明分别构建并获得了纯化的H基因和F基因重组GPV，克隆病毒中不含野生型GPV，已经为纯化的重组病毒。PPRV的H基因重组病毒命名为GPV-PPRV-H，F基因重组病毒命名为GPV-PPRV-F。其中鉴定目的基因插入所用的引物总结在表2中。

表2.鉴定目的基因插入所用的引物

 

引物名称	引物序列	作用
			PPRV-Hf′PPRV-Hr′	5′-AAT GGC ACA GGA ATA GGC-3′5′-GAG CGA CCC GTG TCA TAG-3′	特异扩增PPRV-H基因
PPRV-Ff′PPRV-Fr′	5′-AGC CAG AAT GCG TTG TAT-3′5′-AAG CTG CCA GTG CTA TGT-3′	特异扩增PPRV-F基因

分别以GPV、GPV-PPRV-H和GPV-PPRV-F感染初代LT细胞，结果，GPV-PPRV-H和GPV-PPRV-F两种重组病毒分别在荧光倒置显微镜下观察到自发绿色荧光反应(图5B和5C)，而野生型GPV则为阴性(图5A)；进一步以鼠抗PPRV的H蛋白和F蛋白高免血清为一抗，以红色荧光素(TRITC)标记的羊抗鼠IgG(Sigma)为二抗进行免疫荧光检测，结果重组病毒GPV-PPRV-H和GPV-PPRV-F分别显示特异的红色免疫荧光阳性反应(图6B和6C)，而野生型GPV则表现为红色荧光阴性反应(图6A)。

野生型GPV和重组病毒GPV-PPRV-H和GPV-PPRV-F分别以2×10⁶TCID50剂量，间隔4周两次接种GPV中和抗体阴性山羊。结果，两次免疫后羊均未见明显异常临床表现及体温升高；接种部位发痘情况程度符合山羊痘弱毒疫苗安全性评估要求。

免疫前后GPV及PPRV特异中和抗体均为阴性(≤1：10)。第一次免疫后2周，所有免疫羊GPV中和抗体全部转阳(32～128)。

接种表达H蛋白重组病毒GPV-PPRV-H山羊一次免疫第2周，PPRV中和抗体滴度分别为80，80，80，40，40，10；一次免疫后第4周PPRV中和抗体转阳率为6/6，滴度分别为80，80，80，80，40，20，20；二次免疫后第1周，PPRV中和抗体转阳率为6/6，滴度分别为80，80，80，80，80，80，80；二次免疫后第4周PPRV中和抗体转阳率为6/6，滴度分别为40，80，40，40，40，40，40(表1)。

接种表达F蛋白重组病毒GPV-PPRV-F山羊一次免疫第2周，PPRV中和抗体转阳率为3/3，滴度分别为40，40，40；二次免疫后第1周，滴度分别为20，80，20(表1)。

野生型GPV免疫山羊所有时间点检测PPRV特异中和抗体均为阴性(≤1：10)(表3)。

表3.重组病毒免疫后PPRV特异中和抗体检测结果

NT：未检测。

3.讨论

按OIE标准，PPRV弱毒疫苗效力检验合格要求为免疫后3～4周中和抗体100％转阳(≥1：10)。我们构建的表达H和F抗原蛋白重组山羊痘病毒一次免疫山羊，4周PPRV中和抗体转阳率即可达100％(分别为6/6和3/3)。相比法国、英国两个实验室联合发表的一份研究报告^[2，3]，该研究构建的表达PPRV的F抗原重组山羊痘病毒分别以1个～10000个PFU剂量免疫羊，免疫后均未检测到明显的PPRV抗体反应，但对PPRV强毒攻击均具有免疫保护作用，即使0.1个PFU剂量也可形成完全的免疫保护，这种保护机制可能与重组山羊痘病毒疫苗在接种后可诱导强烈的特异性细胞免疫反应有关；另外，该研究构建的表达PPRV的H抗原重组山羊痘病毒分别以10个PFU或更多病毒量免疫山羊，免疫后能够检测到PPRV抗体反应。然而，我们研制的重组山羊痘病毒候选疫苗株在诱导中和抗体反应较国外报道取得显著改进，即使是表达PPRV的F抗原重组山羊痘病毒一次免疫即可诱导显著的中和抗体反应，预计其具有对PPRV强毒攻击的完全免疫保护作用。

由于PPRV为OIE规定A类烈性传染病，强毒病原操作需要严格的生物安全实施。由于中和抗体反应能够较为客观地反映弱毒疫苗的免疫保护效果，因此OIE推荐采用中和抗体检测为PPRV弱毒疫苗保护效力评估指标。目前我国同样无法采用攻毒试验对PPRV疫苗效力进行评估，我们研制的重组山羊痘病毒候选疫苗株能够诱导显著的中和抗体反应，从而能够参照PPRV弱毒疫苗的办法，直接采用中和抗体检测进行重组痘病毒免疫效力评估，确保该重组疫苗在未来疫苗生产质量控制及现地生产应用评估中具有充分的技术可行性。

山羊痘病毒疫苗株(CVCC AV41)是由我国分离驯化的，符合中国的痘病毒流行情况，能够提供针对国内流行的痘病毒更有效的免疫保护。

很多情况下，副粘病毒的受体识别囊膜蛋白H、HN或G蛋白往往诱导更为显著的中和抗体反应^[4]。因此我们在构建表达F蛋白重组GPV的同时，构建了表达H蛋白的重组GPV，结果证明二者均诱导显著的中和抗体反应；并且，表达H和F蛋白的重组痘病毒联合免疫，能诱导更加显著的、同时针对H和F抗原表面多种中和表位的中和抗体，因而提高更加全面、持续的免疫保护，这一点在针对存在一定程度基因变异的流行野毒株时，更有意义。

先前，法国、英国两个实验室联合发表了表达PPRV的H和F抗原重组山羊痘病毒的研究报告^[3]，筛选基因gpt均采用了痘病毒早晚期强启动子p7.5，另外表达H和F抗原的强启动子分别为PS和p7.5；我们认为重组病毒同时存在两个强启动子，尽管使得gpt抗性基因获得高效表达，而有利于重组病毒的纯化克隆，但有可能不利于目的免疫原基因的转录表达，因而影响到中和抗体的诱导水平。为此我们采用不同的构建策略，即目的免疫原基因H或F仍采用P7.5强启动子，但gpt则采用相对较弱的痘病毒晚期启动子p11，这样虽然有可能增加重组病毒筛选的难度，但更加有利于目的抗原基因的表达，因而诱导更加显著的中和抗体反应，我们的实验结果证明了我们这种构建策略在免疫效果上的优势。

GPV弱毒免疫株在LT细胞上本身病变出现较慢，重组病毒在TK缺失后细胞病变效应进一步较削弱。同时，山羊痘病毒具有较明显的细胞结合特性，反复冻融次数及超声仍难于分散，使得野生型病毒与重组型病毒紧密相伴，由于野生型重组病毒的复制生长较重组型具有相对优势，给重组病毒的克隆纯化带来极大困难。因此我们通过IRES序列串联作用，p11启动子同时转录表达gpt和绿色荧光报告基因eGFP，重组病毒带有绿色荧光标签，使得重组病毒的克隆纯化、传代生产过程中遗传稳定性观察、毒价滴定等变得极为方便、快捷。

参考文献：

[1]程小文，胡森，王喜军，等.表达外源绿荧光蛋白重组山羊痘病毒的构建及纯化[J].农业生物技术学报，2006，14(5)：798-802

[2]Diallo A，Minet C，Berhe G，et al.Goat immune response tocapripox vaccine expressing the hemagglutinin protein of peste des petitsruminants[J].Ann N Y Acad Sci，2002，969：88-91

[3]Berhe G，Minet C，Le Goff C，et al.Development of a dualrecombinant vaccine to protect small ruminants againstpeste-des-petits-ruminants virus and capripoxvirus infections[J].J Virol，2003，77(2)：1571-1577

[4]王喜军，王清华，葛金英，等.表达尼帕病毒G囊膜糖蛋白重组牛痘病毒的研究[J].微生物学报，2006，46(4)：644-648，I0005

SEQUENCE LISTING

<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

<120>小反刍兽疫重组山羊痘病毒活载体疫苗

<130>IB085340

<160>5

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>5326

<212>DNA

<213>人工的

<400>1

<210>2

<211>7173

<212>DNA

<213>人工的

<400>2

<210>3

<211>6982

<212>DNA

<213>人工的

<400>3

<210>4

<211>1830

<212>DNA

<213>人工的

<400>4

<210>5

<211>1641

<212>DNA

<213>人工的

<400>5

Claims (10)

1.重组山羊痘病毒活载体疫苗GPV-PPRV-F(CGMCC No.2621)和GPV-PPRV-H(CGMCC No.2619)，其中GPV-PPRV-F包括：(1)GPV弱毒疫苗，其作为载体；(2)PPRV的病毒囊膜表面融合蛋白F基因，其作为目的免疫基因；和(3)筛选基因；和GPV-PPRV-H包括：(1)GPV弱毒疫苗，其作为载体；(2)PPRV疫苗的血凝素蛋白H基因，其作为目的免疫基因；和(3)筛选基因。

2.权利要求1所述的重组山羊痘病毒活载体疫苗，其中所述F和H基因阅读框架ORF均在起始密码子ATG前加入kozak序列GCCGCCACC。

3.权利要求1所述的重组山羊痘病毒活载体疫苗，其中所述筛选基因包括gpt和报告基因eGFP。

4.权利要求1所述的重组山羊痘病毒活载体疫苗，其中所述免疫基因是插入到GPV弱毒疫苗基因组的胸苷激酶(TK)基因编码区。

5.权利要求1-4任一项中所述的重组山羊痘病毒活载体疫苗，其中所述的筛选基因gpt和绿色荧光报告基因eGFP同时受痘病毒晚期启动子p11控制，两者之间以IRES相连接；目的免疫基因H或F受痘病毒早晚期强启动子p7.5控制。

6.权利要求1-5中任一项所述的重组山羊痘病毒活载体疫苗的制备方法，其包括下述步骤：

(1)采用适当的引物，通过常规RT-PCR从PPRV弱毒疫苗75/1株(Nigeria/75/1)的基因组RNA分别扩增基因PPRV血凝素蛋白H基因和PPRV融合蛋白F基因；

(2)通过基因重组技术，分别构建表达PPRV融合蛋白F的pTK-gig-PPRV-F重组载体和表达PPRV血凝素蛋白H的pTK-gig-PPRV-H重组载体；

(3)将步骤(2)中的重组载体分别转染感染了GPV病毒液的细胞，通过在荧光倒置显微镜下监测绿色荧光而判断转染是否成功，转染成功后，表达PPRV-F和H蛋白的重组病毒载体与GPV病毒基因组的同源基因发生了同源重组，然后利用gpt和eGFP纯化筛选重组病毒克隆；和

(4)鉴定已经纯化的重组山羊痘病毒DNA，分别命名为GPV-PPRV-F和GPV-PPRV-H；

其中步骤(3)中所用的细胞是原代山羊睾丸细胞，即LT细胞。

7.权利要求1-5中任一项所述的重组山羊痘病毒活载体疫苗的应用，其用于同时预防或治疗GP、绵羊痘和PPR。

8.权利要求7所述的应用，其可以同时使用表达H和F蛋白的重组痘病毒进行联合免疫。

9.权利要求7或8所述的应用，其用于小反刍兽类。

10.一种用于预防或治疗GP、绵羊痘和PPR的试剂盒，其包括权利要求1-5中任一项所述的重组山羊痘病毒活载体疫苗。

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