CN102346191B

CN102346191B - 番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂及其制备方法

Info

Publication number: CN102346191B
Application number: CN 201110166777
Authority: CN
Inventors: 陈少莺; 朱小丽; 林锋强; 程晓霞; 陈仕龙; 王劭
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2011-06-17
Filing date: 2011-06-17
Publication date: 2013-09-11
Anticipated expiration: 2031-06-17
Also published as: CN102346191A

Abstract

本发明公开了番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂，其特征在于，制备番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂是用抗GPV杂交瘤细胞株D11株制备抗GPV单克隆抗体，然后用GPV单克隆抗体制备番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂；所述的抗GPV杂交瘤细胞株D11株，保藏在CCTCC，保藏日2011年4月15日，保藏编号：C201120；本发明还公开了番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂建立的乳胶凝集试验(LPA)和乳胶凝集抑制试验(LPAI)在鹅细小病毒抗原鉴定和番鸭小鹅瘟病诊断中的应用与在血清学调查和免疫抗体监测中的应用。

Description

番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂。

背景技术

番鸭小鹅瘟病是由鹅细小病毒(Goose parvovirus，GPV)引起一月龄以内雏番鸭的病毒性传染病，该病1997年以来在福建省莆田、福清等地的番鸭饲养区暴发流行，目前全国各番鸭饲养区均有发生。临床上发病雏番鸭以腹泻、肠粘膜脱落形成栓塞为特征，发病率50％～70％、病死率40％～65％，给养鸭业造成一定的经济损失。临床上该病不仅常与番鸭细小病毒病(三周病)混合感染，且常被基层兽医误诊为番鸭细小病毒病。由于抗小鹅瘟高免血清对该病具有较好的治疗效果，因此快速诊断是有效控制该病减少损失的前提。然而，我国至今尚缺乏商品化的番鸭小鹅瘟病快速诊断试剂，给临床诊断带来很大困难。因此，快速确诊该病的试剂不仅具有较好的应用价值和产业化前景，而且对有效控制该病是必不可少的。

发明内容

本发明的目的就是提供番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂及其制备方法，它是通过如下技术方案来实现的：

取一种来源于人工筛选的抗番鸭源鹅细小病毒(Goose parvovirus，GPV)杂交瘤细胞株D11株(即：抗GPV杂交瘤细胞株D11株)，应用抗GPV杂交瘤细胞株D11株制备抗番鸭源鹅细小病毒单克隆抗体(即：抗GPV单克隆抗体)，然后用抗GPV单克隆抗体标记聚苯乙烯乳胶制备番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂；所述的抗GPV杂交瘤细胞株D11株，保藏在CCTCC(即：中国典型培养物保藏中心)，保藏日2011年4月15日，保藏编号：C201120。

本发明的目的还要提供番鸭小鹅病乳胶凝集试剂的应用。

与现有技术比较，应用本发明的试剂建立的乳胶凝集试验(latex particleagglutination，LPA)可用于临床诊断番鸭小鹅瘟病和鹅细小病毒(GPV)抗原鉴定；同时，根据该凝集试验能被小鹅瘟抗体特异抑制的原理，建立的乳胶凝集抑制试验(latex particle agglutination inhibition，LPAI)还可用于小鹅瘟病的血清学调查和疫苗免疫抗体监测。该试剂具有快速(检测抗原30分钟内出结果，检测抗体60分钟内出结果)、简便(不需仪器、肉眼可判定)、特异性强(不与其它病原发生交叉反应)、敏感性好、重复性和准确率高(与病毒分离的符合率89.3％)、保存期长(4℃～8℃保存一年)等优点。因此，本发明的番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂，既可检测病原，也可检测抗体。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明进一步说明(但不是对本发明的限制)。并通过定性或定量的实验数据证明本发明的技术方案可以实现所述的用途和/或达到预期效果。

番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂的制备方法如下：

将10％聚苯乙烯乳胶用0.1M pH8.2甘氨酸缓冲液(GBS)稀释至1％，6000r/min离心5min，弃上清液，沉淀物用0.1M pH8.2GBS重悬到原体积，加等体积抗GPV单克隆抗体(蛋白浓度0.5～1mg/ml)，充分混匀，置37℃水浴箱中感作40min(每10min摇动数秒钟)后，用含1％牛血清白蛋白(BSA)的0.1M pH8.2GBS洗2次，每次以6000r/min离心5min，沉淀重悬于0.1％BSA-GBS使乳胶终浓度为1％，并加入叠氮钠至终浓度为0.025％，即成番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂。

其中：

1.抗番鸭源鹅细小病毒单克隆抗体的制备：

从液氮中取出抗GPV杂交瘤细胞株D11株，放入预先准备的37℃温水中，使其尽快融化后，1000r/min离心2min，弃冻存液，以细胞营养液(HT-D7777-10％FCS)重悬细胞后，将细胞移至预先加好细胞营养液的培养瓶中，37℃ CO₂ 6.0温箱中培养，经扩大培养到足够数量时，收集细胞离心，调细胞浓度达5×10⁶个细胞/ml。腹腔接种12周龄BALB/c小鼠，5×10⁵个细胞/0.1ml/只，约10天左右小鼠腹部明显臌起，以手触摸时皮肤有紧张感，即可用16～18号消毒针头采集腹水。将腹水10 000r/min离心15min，弃沉淀，收集上清即为抗GPV单克隆抗体，经Commassi brilliant blue(考马斯亮蓝R-250)法测定抗体蛋白浓度，分装，-20℃以下保存备用。

2.乳胶凝集试剂制备

2.1抗体稀释：以0.1M pH8.2甘氨酸缓冲液(GBS)将抗GPV单克隆抗体(腹水)稀释成含蛋白浓度1.0～0.5mg/ml，备用。

2.2乳胶的预处理：将10％聚苯乙烯乳胶用0.1M pH8.2甘氨酸缓冲液(GBS)稀释成为1％，6000r/min离心5min，弃上清液，沉淀用0.1M pH8.2GBS重悬到原体积，备用。

2.3乳胶凝集试剂制备：将上述预处理的聚苯乙烯乳胶2mL加等体积含蛋白浓度1.0～0.5mg/mL的抗GPV单克隆抗体，充分混匀，37℃水浴中感作40min(每10min摇动数秒钟)后，用含1％牛血清白蛋白(BSA)的0.1M pH8.2GBS洗2次，每次以6000r/min离心5min，沉淀重悬于2mL的0.1％BSA-GBS中，并加入叠氮钠至终浓度为0.025％，即成番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂。3乳胶凝集试验(LPA)方法的建立：

3.1样品采集与处理

取濒死病鸭肝、脾、肾、胰等组织，用稀释液研磨成1∶1匀浆，加等体积氯仿振荡3～5min，以6000r/min离心15min，取水相为待检样品。

3.2乳胶凝集试验(LPA)操作方法：用稀释液(pH7.2PBS或生理盐水)将待检样品作连续倍比稀释后，各取10ul不同稀释度的待检样品与等量致敏乳胶在洁净的玻片或96孔细胞培养板板盖上混匀，室温(22±4℃)或37℃水浴温箱中静置5～15min，肉眼观察凝集反应。试验设致敏乳胶对照、抗原对照和抗原加稀释液对照。以能出现“+”凝集的抗原最高稀释度的倒数为该抗原的凝集价。

4乳胶凝集抑制试验(LPAI)方法的建立：

4.1样品的采集与处理：常规采血并分离血清。

4.2抗原凝集工作液制备：

4.2.1抗原凝集价测定：按3.2测定抗原凝集效价。

4.2.2抗原凝集价工作液配制及检验：如果抗原价测定结果为2^-6(举例)，4个凝集单位＝2^-6/2^-2(2^-4)，即将抗原1∶16稀释则为4个凝集单位(4U)。

4.2.2.1配制：稀释液15ml，加病毒抗原1ml，使最终浓度为1∶16(即4U)，将1∶16稀释的抗原加等量稀释液即成2U的病毒抗原。

4.2.2.2抗原凝集价滴定：检查4U的凝集价是否准确，应将抗原分别以0.1ml的量加入稀释液0.1、0.2、0.3、0.4和0.5ml中，使抗原最终稀释度为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5和1∶6，取不同稀释度抗原10ul与等量致敏乳胶混匀，室温(22±4℃)或37℃水浴温箱中静置5～15min，如果配制的抗原液为4U，则1∶4稀释度出现终点；如果高于4U，可能1∶5或1∶6出现终点；如果低于4U，可能1∶3或1∶2出现终点。应根据检验结果做适当调整，使工作液确为4U，同理检查2U的凝集价是否准确。

4.3LPAI的操作方法

在96孔微量细胞培养板上，每排的第1孔加人50uL4凝集单位(4U)抗原；第2孔以后每孔加人50uL 2U抗原。然后在第1孔中加人50uL待检血清或高免血清做连续倍比稀释后，置37℃水浴中感作30min后，每孔取10uL抗原抗体混合液与等量的胶乳试剂混合后，37℃水浴中或室温中静置5～15min肉眼观察结果，以能完全抑制胶乳凝集的血清最高稀释度的倒数为该血清的凝集抑制效价。

5乳胶凝集试剂的特性鉴定

5.1自凝性用等量PBS、生理盐水和GBS分别代替被检抗原，进行乳胶凝集试验，结果乳胶凝集试剂均不会自凝。

5.2特异性和敏感性将乳胶凝集试剂分别与GPV胚液或组织悬液、MPV、MDRV、ARV、PMV、DHV、正常胚液和正常组织悬液进行LPA试验。结果从表1可知，番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂仅与GPV反应出现肉眼可见的凝集颗粒，而不与其它病毒反应，特异性好；同时敏感性测定显示GPV胚液的效价达2⁶，而GPV感染鸭肝脾组织悬液为2²。

表1 乳胶凝集试剂的特异性和敏感性

^*注：GPV为番鸭源鹅细小病毒株、MDRV番鸭呼肠孤病毒、MPV番鸭细小病毒、PMV鸭源副粘病毒和DHV鸭肝炎病毒；表中数据为GPV的LPA效价；+表示阳性；-表示阴性。

5.3保存期：将5批不同时间制备的乳胶凝集试剂置于4℃保存，每隔1个月与特异性抗原做乳胶凝集试验，检测其批内和批间重复性。结果(表2)表明乳胶凝集试剂4℃～8℃保存一年，批内和批间重复性都较好，质量稳定。

表2乳胶凝集试剂的保存期

注：表中数据为GPV的LPA效价

6.番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂的应用：

应用番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂建立乳胶凝集试验(LPA)和乳胶凝集抑制试验(LPAI)。其中LPA方法可用于GPV抗原的鉴定和临床上小鹅瘟病的快速诊断，检测抗原具有快速(30分钟内出结果)、简便(不需仪器、肉眼可判定)、特异性强(不与其它病原发生交叉反应)、重复性和准确率高(与病毒分离符合率89.3％)等优点；LPAI方法可用于小鹅瘟病血清学调查和疫苗免疫后抗体监测，检测抗体具有快速(60分钟内出结果)、简便(不需仪器、肉眼可判定)、敏感性好(比琼脂扩散试验敏感16倍以上)等优点。

6.1鹅细小病毒(GPV)抗原的鉴定：

实验例

按乳胶凝集试验(LPA)操作方法，取乳胶凝集试剂分别与不同抗原和正常细胞培养液反应，结果乳胶凝集试剂只与GPV发生特异性凝集反应，不与其它病毒反应；GPV胚液、病鸭肝和脾组织匀浆的最高凝集价(LPA效价)分别为2⁶和2²(表3)。

表3.应用乳胶凝集试验(LPA)鉴定GPV抗原

注：GPN为GPV胚液毒，GPT为GPV感染鸭肝脾匀浆，MPV番鸭细小病毒，MDRV为番鸭呼肠孤病毒，ARV为禽呼肠孤病毒，PMV为鸭副粘病毒，DHV为鸭肝炎病毒。表中数据为LPA效价，“-”表示阴性。

6.2小鹅瘟病的快速诊断：

实验例

按乳胶凝集试验(LPA)操作方法，检测28份临床送检疑似病鸭肝脾匀浆，阳性率为53.6％(15/28)，阴性率分别为46.4％(13/28)。与病毒分离(VI)比较，两者检测临床疑似病例的总符合率为89.3％(25/28)(见表4)。同时，VI需7天以上出结果，而LPA只需30分钟即可得出结果。

表4 LPA和VI的符合率比较

6.3小鹅瘟疫苗免疫番鸭的血清抗体测定：

实验例

按乳胶凝集抑制试验(LPAI)操作方法，检测了一日龄番鸭GPV疫苗免疫后的抗体水平，结果免疫组PI7d血清中抗GPV LPAI抗体效价达2^3.8，随后逐渐上升并维持在较高水平；而对照组抗体水平随日龄增大而下降，至8日龄(PI 7 d)母源抗体转为阴性(表5)。表明LPAI方法可用于免疫鸭血清抗体监测。

表5.疫苗免疫番鸭血清中抗GPV抗体检测

6.4番鸭小鹅瘟病的血清学调查：

按乳胶凝集抑制试验(LPAI)操作方法，检测了临床不同日龄番鸭血清抗体，从表6可知，不同番鸭群的GPV抗体差异较大，其中1日龄雏番鸭均不同程度的母源抗体；免疫鸭群的抗体水平较为整齐，而发病鸭群的抗体水平差异较大。表明LPAI方法可用于番鸭小鹅瘟病的血清学调查。

表6 番鸭小鹅瘟病的血清学调查

Claims

1.番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂,其特征在于, 制备番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂是应用抗鹅细小病毒杂交瘤细胞株D11株制备抗鹅细小病毒单克隆抗体，然后用抗鹅细小病毒单克隆抗体制备番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂；所述的抗鹅细小病毒杂交瘤细胞株D11株，保藏在CCTCC，保藏日2011年4月15日，保藏编号：C201120。

2.根据权利要求1所述的番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂的应用，其特征在于, 用番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂建立的乳胶凝集试验在鹅细小病毒抗原鉴定中的应用。

3．根据权利要求1所述的番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂的应用, 其特征在于, 用番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂建立的乳胶凝集抑制试验在小鹅瘟病血清学调查和免疫抗体监测中的应用。