CN104628833A - 一种结核感染细胞免疫检测抗原组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于结核感染细胞免疫检测的抗原组合物,由结核分枝杆菌CFP-10、ESAT-6和Rv3873抗原和/或其衍生的抗原表位肽组成。在优选的实施方案中,抗原组合物由结核分枝杆菌CFP-10、ESAT-6和Rv3873抗原包含的全部抗原表位肽组成。本发明还提供了所述抗原组合物在制备用于体外检测结核感染引起的特异性T细胞免疫反应的检测试剂中的应用,包括人或动物的淋巴细胞经过所述抗原组合物的刺激后,检测结核特异性T细胞分泌的细胞因子。
Description
技术领域
本发明涉及一种结核感染特异T细胞免疫检测抗原及其应用。具体地说就是一种结核分枝杆菌抗原及其表位肽组合物,用于结核感染细胞免疫检测,属于结核病检测领域。
背景技术
结核病是由结核分枝杆菌感染引起的人畜共患的慢性传染病。根据世界卫生组织的统计,目前全球有超过1/3的人口感染了结核分枝杆菌,每年有200万人因结核病死亡。我国是全球22个结核病流行严重的国家之一、同时也是全球27个耐多药结核病流行严重的国家之一。我国第五次结核病流行病学抽样调查报告显示,中国结核病年新发病人数约为130万,占全球发病人数的14.3%,位居全球第二位;15岁及以上人群肺结核的患病率为459/10万。结核分枝杆菌除感染人外,还感染50多种哺乳动物和20多种禽类;易感性因动物种类和个体不同而异,家畜中牛是最敏感动物。结核病的流行不仅影响养殖业的发展,更重要的是由于交叉感染,而使人类的健康受到严重威胁。因此,结核病已经成为一个严重的社会经济问题,对我国公民健康、社会安定和经济发展带来严重的危害。
结核病的早期诊断对结核病的控制至关重要,而结核病防治的最大挑战之一就是缺乏早期、快速、敏感和特异的诊断工具。目前所采用的结核感染的诊断方法仍然存在着较大的局限性。经典的结核菌素试验(TST)用于结核病诊断虽然已达一个世纪,但其受卡介苗接种和大多数非结核分枝杆菌感染的干扰,特异性和敏感性均不理想;细菌学培养作为诊断的金标准用于结核病也存在着培养周期过长、阳性率较低、且依赖于标本采集质量等问题;而影像学、血清学等方法,因为较高的假阴性或假阳性,用于结核病诊断的参考价值受限。现有结核病检测试剂灵敏度、特异度均有待提高。
抗结核病的保护性免疫机制目前仍不完全清楚,细胞免疫尤其是循环及感染部位的T淋巴细胞应答被认为起着重要作用。因此能否有效地激发机体的T细胞,尤其是CD4+T细胞免疫反应是机体成功对抗结核感染的关键。被病原菌致敏的T淋巴细胞,再次受到同种抗原刺激后会释放γ干扰素,高水平的γ干扰素反应可以提示该病原菌的感染。近年来,随着免疫学和基因组学的发展,出现了以T细胞为基础的体外γ干扰素反应测定法(IGRA),可用于结核病辅助诊断和结核感染筛查。目前已经有以结核分枝杆菌基因组RD1区编码的结核特异性抗原ESAT-6和CFP-10为刺激物的商品化IGRA试剂,如QuantiFERON-TB Gold test和T-SPOT.TBtest,用于检测外周血中结核特异性释放γ干扰素的T淋巴细胞,呈现较高的灵敏性和特异性。
抗原表位是多肽抗原的一部分,是抗原性的核心基础;抗原通过抗原表位与相应的淋巴细胞表面受体结合从而致敏淋巴细胞、引起免疫应答,即免疫反应的特异性是针对抗原表位,而不是针对整个抗原,抗原表位在抗原诱导免疫应答的过程中起着决定性作用。
基于T细胞分泌γ干扰素的体外检测技术,主要以完整抗原作为相应的刺激源,抗原成分组成较为复杂、灵敏度和特异性有待提高,且相应试剂由于国外公司的专利保护,使得我国在引进相关产品应用时成本较高,不适合目前情况下在我国大范围应用。本发明是在国家传染病重大专项资助下,对结核菌蛋白抗原及其表位充分分析、验证和比较研究的基础上产生,拥有完全的自主知识产权,基于本发明的检测试剂可广泛用于结核病的辅助诊断、流行病学监测与感染筛查等相关领域。
发明内容
本发明在现有的T细胞γ干扰素释放试验技术的基础上,应用RD1区基因Rv3873、Rv3874、Rv3875所编码的Rv3873抗原、CFP-10抗原、ESAT-6抗原和/或其各自所包含的抗原表位肽,形成一个抗原组合物,并结合ELISA方法对结核病例和健康志愿者体内结核特异性T细胞进行检测,从而评价该抗原组合物用于结核检测的灵敏度和特异性。
Rv3873基因作为分枝杆菌核心基因组中的基因在分枝杆菌属中高度保守,其表达产物具有较高的T细胞免疫原性;Rv3874、Rv3875基因的表达产物CFP-10和ESAT-6属于ESAT-6蛋白家族,均具有较强的免疫原性,是重要的结核分枝杆菌免疫保护性抗原;且Rv3873、CFP-10、ESAT-6抗原均存在于大多数分枝杆菌尤其是致病性结核分枝杆菌中,而卡介苗(BCG)及绝大多数环境分枝杆菌均缺失此类抗原。本发明在现有检测试剂常用抗原ESAT-6和CFP-10的基础上,发现Rv3873抗原亦可用于结核感染特异性检测,且使用相应的抗原表位肽替代完整的多肽抗原作为检测标志物,提供了一种包括3种抗原衍生的表位肽库组合物,并与这3种抗原分别组成的单抗原衍生表位肽库或至少2种抗原组成的衍生表位肽库在结核病例及健康志愿者中的反应情况进行比较。
本发明的第一方面提供了一种用于结核感染细胞免疫检测抗原组合物,由以下至少1组抗原,优选至少2组抗原,最优选全部3组抗原组成:
(1)结核分枝杆菌CFP-10抗原和/或其包含的一种或多种抗原表位肽;
(2)结核分枝杆菌ESAT-6抗原和/或其包含的一种或多种抗原表位肽;
(3)结核分枝杆菌Rv3873抗原和/或其包含的一种或多种抗原表位肽。
所述结核分枝杆菌CFP-10抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
所述结核分枝杆菌ESAT-6抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
所述结核分枝杆菌Rv3873抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
所述结核分枝杆菌CFP-10抗原包含的抗原表位肽的氨基酸序列选自SEQID NO:4~59。
所述结核分枝杆菌ESAT-6抗原包含的抗原表位肽的氨基酸序列选自SEQID NO:60~122。
所述结核分枝杆菌Rv3873抗原包含的抗原表位肽的氨基酸序列选自SEQID NO:123~180。
在一个特定的实施方案中,上述抗原组合物由以下至少1组抗原,优选至少2组抗原,最优选全部3组抗原组成:
(1)结核分枝杆菌CFP-10抗原和其包含的全部抗原表位肽;
(2)结核分枝杆菌ESAT-6抗原和其包含的全部抗原表位肽;
(3)结核分枝杆菌Rv3873抗原和其包含的全部抗原表位肽。
在另一个特定的实施方案中,上述抗原组合物由以下至少1组抗原,优选至少2组抗原,最优选全部3组抗原组成:
(1)结核分枝杆菌CFP-10抗原包含的全部抗原表位肽;
(2)结核分枝杆菌ESAT-6抗原包含的全部抗原表位肽;
(3)结核分枝杆菌Rv3873抗原包含的全部抗原表位肽。
抗原组合物中的表位肽可以是上述表位肽的氨基酸序列经过取代、缺失或添加1个氨基酸或几个氨基酸且具有相同抗原性的衍生表位肽或其类似物。
在最优选的实施方案中,所述抗原组合物由氨基酸序列为SEQ ID NO.4~180的表位肽组成。
本发明还提供了编码所述抗原组合物的DNA分子,以及含有该DNA分子的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系和重组菌。
本发明的第二方面提供了所述抗原组合物在制备用于体外检测结核感染引起的特异性T细胞免疫反应的检测试剂中的应用,其特征在于人或动物的淋巴细胞经过所述抗原组合物的刺激后,检测结核特异性T细胞分泌的细胞因子。
在特定的实施方案中,所述结核特异性T细胞分泌的细胞因子选自γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)和肿瘤坏死因子α(TNF-α),优选IFN-γ;所述结核特异性T细胞分泌的细胞因子的检测方法选自酶联免疫斑点试验(ELISPOT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫层析试验、细胞因子内染色和T细胞增殖试验,优选ELISA;所述淋巴细胞来源于外周血、脑脊液、胸水或腹水,优选外周血。
本发明还提供了所述抗原组合物在制备结核检测试剂中的应用,并提供了一种结核检测试剂盒,其基本组成如下:
本发明的抗原组合物;
抗人或动物IFN-γ的小鼠IgG单克隆抗体(一抗);
酶标试剂:辣根过氧化物酶标记的抗人或动物IFN-γ不同表位的另一种小鼠IgG单克隆抗体(二抗);
校准品:含IFN-γ的阳性原料;
培养管:测试培养管中含人工合成的抗原组合物,阳性对照培养管中含结核非特异性刺激抗原,本底对照培养管中含基质液;
其他ELISA检测所需试剂及耗材。
优选地,一抗固定在反应板上。
本发明采用的是双抗体夹心原理检测抗原的ELISA检测方法。基本过程为:反应板上包被的一抗捕捉样本中的IFN-γ,而同一IFN-γ分子进而又被酶标的二抗捕获、显色。虽然反应板上固定的一抗和酶标的二抗均为IFN-γ单克隆抗体,但这两种抗体为识别IFN-γ上不同的抗原表位的单克隆抗体,因此不会相互影响。
本发明的第三方面提供了一种结核疫苗候选材料,其特征在于含有所述的抗原及其表位多肽组合物、DNA分子、重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
本发明对于现有技术存在以下优点:本发明组合了多达3种已被验证的能被T细胞识别的蛋白抗原及其衍生的抗原表位肽,与以往采用单一抗原的检测手段相比,能够减少由于低频率的单一抗原特异性T细胞造成的假阴性,从而提高检测灵敏度;另一方面由于组合了多种抗原,单检测孔的反应强度明显增加,与单抗原相比检测结果的判断更加容易;第三,本发明中所采用的多种抗原的全部衍生表位肽均已被研究证明能够刺激机体产生较强的T细胞免疫反应,因此当使用上述表位作为刺激物进行体外T细胞γ干扰素释放试验时,灵敏度显著提高;第四,人工合成的氨基酸表位作为检测试剂,可以人为地调整各表位的混合浓度进而增强检测反应的强度;第五,采用固相合成的方法合成多肽表位,有利于质量控制,且成本较低,适合大规模商业化生产。
具体实施方式
下面通过实施例来进一步说明本发明,但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1抗原表位肽组合物的构成
用于结核检测的组合物,由CFP-10抗原、ESAT-6抗原、Rv3873抗原衍生的表位肽构成。
所述CFP-10抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述ESAT-6抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述Rv3873抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
所述CFP-10抗原衍生的表位肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO.4~59。
所述ESAT-6抗原衍生的表位肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO.60~122。
所述Rv3873抗原衍生的表位肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO.123~180。
实施例2抗原表位应用于检测试剂盒的开发
本发明的抗原表位肽组合物可用于结核感染的检测,形成临床或实验室诊断用试剂盒。
检测试剂盒包括:
1)实施例1中所述的抗原表位肽组合物;
2)抗人或动物IFN-γ的小鼠IgG单克隆抗体(一抗),所述一抗固定于反应板上;
3)酶标试剂:辣根过氧化物酶标记的抗人或动物IFN-γ不同表位的另一种小鼠IgG单克隆抗体(二抗);
4)校准品:含IFN-γ的阳性原料;
5)培养管:测试培养管中含人工合成的多种抗原衍生的表位多肽,阳性对照培养管中含结核非特异性刺激抗原,本底对照培养管中含基质液
6)其他ELISA检测所需试剂及耗材。
实施例3抗原表位应用于结核感染临床检测
A.外周血淋巴细胞的分离:
本发明所涉及志愿者病例的筛选标准为:
根据卫生部发布的《肺结核诊断标准》国家标准(WS288-2008),临床表现症状、体征及胸部影像学检查诊断为肺结核的患者,其中细菌学阳性或阴性结核病患者是指临床诊断为结核病的患者中,经细菌学检查(痰涂片抗酸染色显微镜检查和/或罗氏固体培养基细菌固体培养)阳性或阴性的结核病患者;以及肺外结核(如骨结核、肾结核、肠结核、淋巴结核等)患者。
健康志愿者的筛选标准为:
无结核临床症状、无其他疾病或感染。
入选的结核病患者为自到结核病院就诊的连续时间样本中随机选取;志愿者为健康的在校学生;结核病患者和志愿者年龄在18~60岁之间。
本发明所用的T淋巴细胞来自个体的外周静脉血。试验开始前,由试验者告知志愿者/结核病患者具体项目的目的、意义、试验流程及所需采集标本及其数量,经同意并签署知情同意书,由临床检验师对其进行采血。最终本项目筛选了129例结核病志愿者及29例健康志愿者,采血时使用无内毒素的肝素抗凝真空采血管采集新鲜全血,每名志愿者采血约20ml。之后:
1)在2小时之内将全血标本轻柔颠倒混匀3~5次后分装到不同的培养管中(空白对照管、样本培养管、阳性对照管),1ml/管。
2)将培养管轻柔颠倒混匀迅速放入37℃培养箱培养22±2小时,培养过程中保持培养馆直立。
3)培养后的全血以3000~5000转/分钟离心10分钟,取血浆进行ELISA检测。注意不可吸到细胞层。
B.抗原表位肽的制备
以固相合成的方法化学合成抗原表位肽。将各合成肽以DMSO溶解。之后按实例1中SEQ ID NO.4~180共计177条多肽等量混合,形成3种抗原组合的CFP-10+ESAT-6+Rv3873表位肽库;将SEQ ID NO.4~122共计119条多肽混合,形成CFP-10+ESAT-6表位肽库;将SEQ ID NO.123~180共计58条多肽混合,形成Rv3873表位肽库;所有表位肽库用含10%胎牛血清的RPIM1640培养基稀释至终浓度。
C.ELISA检测抗原表位肽库特异性T细胞
ELISA板提前12小时以上用磷酸盐缓冲液(pH 7.4)稀释的抗人IFN-γ的小鼠IgG单克隆抗体包被,4℃平放,在加入检测样品前用含10%胎牛血清的RPIM1640培养基室温条件下封闭1小时。
分别在加样孔中加入稀释液20μl(空白对照孔除外),然后再加入待测样品50μl(空白对照孔除外),每个表位肽库刺激设双孔,另设阳性对照孔、本底对照孔;校准品梯度稀释后各加双孔检测。
用封板膜封板后,置于37℃培养箱温育60分钟(温育后保留微孔内液体,不洗涤)。
D.ELISA洗板及结果获取:
1)每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外,轻轻震荡混匀。
2)用封板膜封板后,置于37℃培养箱温育60分钟。
3)小心揭掉封板膜,用洗板机洗涤5遍,最后一次尽量扣干。
4)显色:每孔加显色液后轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟。
5)每孔加终止液50μl,轻轻震荡混匀,10分钟内用酶标仪波长为450nm/600-650nm检测。
以校准品的抗原含量及其对应的吸光度均值做乘幂拟合曲线即标准曲线,求出线性回归方程,将空白对照管(N)、样本培养管(T)、阳性对照管(P)三种培养管培养后血浆标本的吸光度值分别代入回归方程,求得三种管中血浆标本相应的IFN-γ含量。
E.结果分析:
本研究中共涉及经过严格按照标准筛选的结核病患者共计129例,健康志愿者共计29例。
现有的基于IGRA原理进行结核分枝杆菌感染检测的主要抗原是结核分枝杆菌RD1区域基因所编码的ESAT-6和CFP-10抗原。检测灵敏度方面,本发明组合抗原表位肽库(CFP-10+ESAT-6+Rv3873)检测灵敏度为89.92%,与Rv3873抗原表位肽库检测结果相比(65.89%)灵敏度明显提高,与CFP-10+ESAT-6抗原表位肽库检测结果相比(86.82%)灵敏度略有提高,且新增加4例检出病例。已有文献报道,对于结核感染的检测,存在多抗原混合后检出病例数增多的现象,因此推测对于本研究中的新增加检出病例可能是多抗原表位多肽混合后存在协同作用,致使检出病例数增加。(如表1所示)
将CFP-10+ESAT-6、Rv3873这2个独立的表位多肽库的检测结果进行综合评价(CE+Rv3873),即只要其中一个表位多肽库检测结果阳性即判断该个体反应呈阳性;结果表明,其检测阳性率与组合抗原表位多肽库(CFP-10+ESAT-6+Rv3873)相比,检测的灵敏度呈现一定程度的提高,且增加3例新检出病例;可能由于多抗原表位多肽混合后存在协同作用,致使检出病例数增加。同理对健康人的评价中,与组合抗原表位多肽库(CFP-10+ESAT-6+Rv3873)相比,采用CFP-10+ESAT-6、Rv3873这2个独立的表位多肽库的检测结果综合评价的方法增加1例阳性检出。
表1各抗原表位多肽库检测特异性和灵敏度统计
表位多肽库 | 结核病例 | 灵敏度 | 健康志愿者 | 特异性 |
CFP-10+ESAT-6 | 112/129 | 86.82% | 27/29 | 93.1% |
Rv3873 | 85/129 | 65.89% | 27/29 | 93.1% |
CE+Rv3873 | 113/129 | 87.60% | 26/29 | 89.66% |
CFP-10+ESAT-6+Rv3873 | 116/129 | 89.92% | 25/29 | 86.21% |
注:检测灵敏度表示为:(结核病患者检测阳性数/结核病患者总数)×100%;检测特异性表示为:(1-健康志愿者检测阳性数/健康志愿者总数)×100%;CFP-10+ESAT-6、Rv3873为两个独立的抗原表位肽库,前者表示CFP-10和ESAT-6两个抗原表位肽库的组合;CE+Rv3873为对上述两个独立的抗原表位肽库CFP-10+ESAT-6和Rv3873进行分析,一个或一个以上的独立抗原表位肽库阳性即判断为该个体结核分枝杆菌感染;CFP-10+ESAT-6+Rv3873为三个抗原表位肽库的组合。
因此由于Rv3873抗原的加入,应用本发明组合抗原表位多肽库(CFP-10+ESAT-6+Rv3873)在结核病例的检测中,不明显降低特异性的前提下,与2个组合抗原表位多肽库(CFP-10+ESAT-6和Rv3873)相比提高了灵敏度。
阳性反应判断标准:测试培养管(T)含量值=T、本底对照培养管(N)含量值=N、阳性对照培养管(P)含量值=P。(如表2所示)
表2.阳性反应判断标准
Claims (24)
1.一种用于结核感染细胞免疫检测的抗原组合物,由以下至少1组抗原组成:
(1)结核分枝杆菌CFP-10抗原和/或其包含的一种或多种抗原表位肽;
(2)结核分枝杆菌ESAT-6抗原和/或其包含的一种或多种抗原表位肽;
(3)结核分枝杆菌Rv3873抗原和/或其包含的一种或多种抗原表位肽。
2.一种用于结核感染细胞免疫检测的抗原组合物,由以下至少1组抗原组成:
(1)结核分枝杆菌CFP-10抗原和其包含的全部抗原表位肽;
(2)结核分枝杆菌ESAT-6抗原和其包含的全部抗原表位肽;
(3)结核分枝杆菌Rv3873抗原和其包含的全部抗原表位肽。
3.一种用于结核感染细胞免疫检测的抗原组合物,由以下至少1组抗原组成:
(1)结核分枝杆菌CFP-10抗原包含的全部抗原表位肽;
(2)结核分枝杆菌ESAT-6抗原包含的全部抗原表位肽;
(3)结核分枝杆菌Rv3873抗原包含的全部抗原表位肽。
4.根据权利要求1-3任一项所述的抗原组合物,其中,所述组合物由三组抗原中的至少2组组成。
5.根据权利要求1-3任一项所述的抗原组合物,其中,所述组合物由全部三组抗原组成。
6.根据权利要求1-3任一项所述的抗原组合物,其中所述结核分枝杆菌CFP-10抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述结核分枝杆菌ESAT-6抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,所述结核分枝杆菌Rv3873抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示,所述结核分枝杆菌CFP-10抗原包含的抗原表位肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:4~59,所述结核分枝杆菌ESAT-6抗原包含的抗原表位肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:60~122,所述结核分枝杆菌Rv3873抗原包含的抗原表位肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:123~180。
7.根据权利要求4所述的抗原组合物,其中所述结核分枝杆菌CFP-10抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述结核分枝杆菌ESAT-6抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,所述结核分枝杆菌Rv3873抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示,所述结核分枝杆菌CFP-10抗原包含的抗原表位肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:4~59,所述结核分枝杆菌ESAT-6抗原包含的抗原表位肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:60~122,所述结核分枝杆菌Rv3873抗原包含的抗原表位肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:123~180。
8.根据权利要求5所述的抗原组合物,其中所述结核分枝杆菌CFP-10抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述结核分枝杆菌ESAT-6抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,所述结核分枝杆菌Rv3873抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示,所述结核分枝杆菌CFP-10抗原包含的抗原表位肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:4~59,所述结核分枝杆菌ESAT-6抗原包含的抗原表位肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:60~122,所述结核分枝杆菌Rv3873抗原包含的抗原表位肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:123~180。
9.编码权利要求1-8任一项所述的抗原组合物的DNA分子。
10.含有权利要求9所述的DNA分子的重组表达载体。
11.含有权利要求9所述的DNA分子的转基因细胞系。
12.含有权利要求9所述的DNA分子的重组菌。
13.权利要求1-8任一项所述的抗原组合物在制备用于体外检测结核感染引起的特异性T细胞免疫反应的检测试剂中的应用。
14.根据权利要求13所述的应用,其特征在于人或动物的淋巴细胞经过所述的抗原组合物刺激后,检测结核特异性T细胞分泌的细胞因子。
15.根据权利要求14所述的应用,其中所述的动物选自牛、羊或猪。
16.根据权利要求14所述的应用,其中所述的结核特异性T细胞分泌的细胞因子选自γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)。
17.根据权利要求16所述的应用,其中所述的结核特异性T细胞分泌的细胞因子为γ干扰素(IFN-γ)。
18.根据权利要求14所述的应用,其中所述的结核特异性T细胞分泌的细胞因子的检测方法选自酶联免疫斑点试验(ELISPOT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫胶体金试验、细胞因子内染色和T细胞增殖试验。
19.根据权利要求18所述的应用,其中所述的结核特异性T细胞分泌的细胞因子的检测方法为酶联免疫吸附试验(ELISA)。
20.根据权利要求14所述的应用,其中所述的淋巴细胞来源于外周血、脑脊液、胸水或腹水。
21.根据权利要求20所述的应用,其中所述的淋巴细胞来源于外周血。
22.一种结核诊断试剂盒,其组成如下:
(4)权利要求1-8任一项所述的抗原组合物;
(5)抗人或动物IFN-γ的小鼠IgG单克隆抗体;
(6)酶标试剂:辣根过氧化物酶标记的抗人或动物IFN-γ不同表位的另一种小鼠IgG单克隆抗体;
(7)校准品:含IFN-γ的阳性原料;
(8)培养管:测试培养管中含体外合成的抗原表位肽,阳性对照培养管中含结核非特异性刺激抗原,本底对照培养管中含基质液;
(9)其他ELISA检测所需试剂及耗材。
(10)根据权利要求22所述的结核诊断试剂盒,其中,(2)所述的抗人或动物IFN-γ的小鼠IgG单克隆抗体固定在反应板上。
23.一种结核疫苗,含有权利要求1-8任一项所述的抗原组合物,权利要求9所述的DNA分子、权利要求10所述的重组表达载体、权利要求11所述的转基因细胞系或权利要求12所述的重组菌。
24.权利要求1-8任一项所述的抗原组合物在制备结核检测与诊断试剂中的应用。
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