CN105527446B - 一种多肽抗原检测牛结核分枝杆菌抗体的elisa试剂盒 - Google Patents

一种多肽抗原检测牛结核分枝杆菌抗体的elisa试剂盒 Download PDF

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Abstract

一种多肽抗原检测牛结核分枝杆菌抗体的ELISA试剂盒，属于生物技术检测领域，本利用牛结核分支杆菌特异性多肽，体外人工合成作为抗原快速检测牛结核分枝杆菌的抗体。采用人工合成5种多肽抗原作为包被液，有效提高多肽与目标抗体的结合效率，从而显著提高可检测灵敏度，同时显著降低非特异背景读值，特异性高。本发明的牛结核分枝杆菌抗体ELISA检测试剂盒具有操作简单、诊断速度快、在进行大规模检测中经济方便等优点，是一种便于普及的好方法，具有广泛的应用前景。采用本发明的ELISA检测试剂盒检测牛结核分枝杆菌抗体，成本低，有利于推广使用。

Description

一种多肽抗原检测牛结核分枝杆菌抗体的ELISA试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术检测技术领域。
背景技术
牛结核是由牛结核分枝杆菌引起的人兽共患传染病。在国际上已引起巨大经济损失，牛结核可以感染其他反刍动物和人类，野生动物是其储存宿主，给疾病控制与根除造成很大困难。目前，用于牛结核标准诊断方法是用结核菌素进行皮内试验，该方法和其他细胞介导的免疫学检测（如r-IFN试验，淋巴细胞增生试验）均有一些优缺点。首先是由于皮内试验是机体对抗原的迟发型变态反应，敏感性和特异性较低，也不可能确定对结核菌素反应的是牛结核分枝杆菌，还是禽结核分枝杆菌，或是环境中的其他分枝杆菌。其次，在感染早期细菌载量虽然较少，但以细胞介导的免疫反应为主，而在感染严重期细菌载量虽然较高但细胞介导的免疫反应可能缺失，动物可能成为对细胞介导的免疫反应无应答。第三，72小时内需要操作动物个体两次，以获得检测结果。第四，细胞介导的免疫学检测价格昂贵，需要专业培训，解读检测结果。第五，环境中的分枝结核杆菌或BCG疫苗免疫的动物可能使检测结果成为假阳性。因此，需要建立敏感、易操作和应用的检测牛结核的血清学方法，这种方法能够区别牛结核和禽结核，或其他环境分枝结核杆菌。
近年来有一些用于牧场检测的血清学方法，但敏感性较低，特异性也较差，或许是由于使用了病原分支杆菌和环境分支杆菌表达的抗原提取物。这可以通过利用病原唯一抗原进行加以改进，而且已经取得一定进展。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种多肽抗原检测牛结核分枝杆菌抗体的ELISA 试剂盒。
本发明包括牛结核分枝杆菌特异性多肽抗原包被的酶标板、阴性血清、阳性血清、抗体稀释液、用辣根过氧化物酶标记的抗牛IgG酶标抗体、底物显色液、终止液；所述牛结核分枝杆菌特异性多肽抗原为以下五种多肽抗原中的至少任意一种：
bTB-p-1 MAEMKTDAATLAQEAGNFMTEQQWNFAGIEAAAS；
bTB-p-2 QEAGNFERISGDLKTQAGIEAAASAIQGNVTS；
bTB-p-3 VVRFQEAANKQKQELDEIAIQGNVTSIHSLLDEG；
bTB-p-4 NIRQAGVQYSRADEEQQQKWDATATELNNALQNL；
bTB-p-5 RADEEQQQALSSQMGFGQAMASTEGNVTGMFA。
所述五种多肽抗原为利用牛结核分支杆菌特异性多肽，采用体外人工合成方法取得的多肽抗原。
本发明利用人工合成多肽作为抗原，以获得灵敏度高、特异性高、操作简单、并快速检测牛结核分枝杆菌抗体的ELISA 检测试剂盒。
本发明的有益效果：本发明采用牛结核分枝杆菌特异性多肽抗原作为包被抗原，有效提高多肽与目标抗体的结合效率，从而显著提高可检测灵敏度，同时显著降低非特异背景读值，特异性高，本发明的牛结核分枝杆菌抗体的ELISA 试剂盒具有操作简单、诊断速度快、在进行大规模检测中经济方便等优点，是一种便于普及的好方法，具有广泛的应用前景。采用本发明的ELISA 检测试剂盒检测牛结核分枝杆菌抗体，降低了检测成本，有利于推广使用。
进一步地，本发明所述牛结核分枝杆菌特异性多肽抗原包被的酶标板的制备方法是：取96孔酶标板，每孔100μL牛结核分枝杆菌特异性多肽抗原，4℃过夜包被，包被浓度为0.01μg/mL～5μg/mL，用PBST 洗涤液250μl/ 孔洗涤2～4 次后拍干，用封闭液150μl/孔，37℃封闭1h，洗涤液PBST 250μl/ 孔洗涤3 次后拍干，放入真空袋，4℃、抽真空保存。
所述阳性血清为用抗体稀释液按照体积比为1∶20～100 的比例将牛结核分枝杆菌标准阳性血清稀释后取得的稀释阳性血清；所述阴性血清为用抗体稀释液按照体积比为1∶20～100 的比例将牛结核分枝杆菌标准阴性血清稀释后取得的稀释阴性血清。所述标准阳性、阴性血清用于评价试剂盒检测结果的有效性。
所述抗体稀释液为0.1%BSA，以用于保持血清抗体的效价和稳定性，减少非特异性。
所述用辣根过氧化物酶标记的抗牛IgG酶标抗体是用HRP保护液按1：2000-1：5000比例稀释后的抗牛IgG酶标抗体。保护液保护酶标抗体的稳定性和效价。
所述底物显色液为TMB，使阳性样本呈现不同深浅颜色，从而判定阳性的强弱。
所述终止液为0.1SDS%或2M的H2SO4，使酶促反应终止。
具体实施方式
一、本发明中所采用的牛结核分枝杆菌特异性多肽的制备方法：
1、利用牛结核分支杆菌特异性多肽，体外人工合成作为抗原快速检测牛结核分枝杆菌的抗体。
牛结核分枝杆菌多肽抗原的制备过程：
1）称取RINK树脂3 g(取代度0.3 mmol/g）于150 ml的反应器中，用50ml的二氯甲烷（DCM）浸泡。
2）2小时后，用3倍树脂体积的氮-二甲基甲酰胺（DMF）洗涤树脂，然后抽干，如此重复四次，将树脂抽干后待用。
3）向反应器中加入一定量的20%哌啶（哌啶/DMF），放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，然后抽干。
4）取少量树脂用茚三酮（九井水合茚三酮）法检测（检A、检B各两滴，100℃反应1min），树脂有颜色，说明脱保护成功。
5）称取C端第一个氨基酸适量和1-羟基-苯骈三唑（HOBT）适量于50ml的离心管中，加入20ml的DMF将其溶解，然后加入3ml的N,N-二异丙基碳二亚胺（DIC）振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。
6）2小时后，用一定量的醋酸酐封头（醋酸酐 ：DIEA : DCM=1：1：2)半小时，然后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，抽干待用。
7）向反应器中加入一定量的20%哌啶（哌啶/DMF=1:4），放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干。
8）取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮）法检测（检A、检B各两滴，100℃反应1min），树脂有颜色，说明脱保护成功。
9）称取后面第二个氨基酸适量和HOBT适量于50 ml的离心管中，加入25 ml的DMF将其溶解，然后加入2.5 ml的DIC振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。
10）1小时后，取少量树脂检测，用茚三酮法检测（检A、检B各两滴，100℃反应1min），若树脂为无色，说明反应完全；若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应。
11）待反应完全后，用DMF洗涤树脂四次，然后抽干，向反应器中加入一定量的20%哌啶（哌啶/DMF=1:4），放在脱色摇床上摇晃20min,以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干检测保护是否脱去。
12）按照步骤9）至11）依次接上后面的氨基酸。
13）待接上最后一个氨基酸后，脱去保护，用DMF洗涤四次，然后用甲醇将树脂抽干。然后用95切割液（三氟乙酸:1,2乙二硫醇:3，异丙基硅烷:水=95:2:2:1）将多肽从树脂上切割下来（每克树脂加10ml切割液），并用冰乙醚（切割液：乙醚=1:9）离心沉降四次。最后用HPLC分离纯化，再冻干，得到一定纯度的多肽。
2、牛结核分枝杆菌反应原性多肽的筛选：
通过DNAStar、Genebank、ProtScale 等分析软件对牛结核分枝杆菌蛋白的抗原表位进行预测，确定天然抗原的氨基酸序列，然后寻找该肽段所针对的抗原决定簇。使用ELISA 检测不同多肽与牛结核分枝杆菌抗血清的反应，最后选出具有良好反应的牛结核分枝杆菌反应原性多肽。
有效多肽段的选择和确定，通过DNAStar、Genebank、ProtScale 等分析软件对牛牛结核分枝杆菌蛋白的抗原表位进行预测，确定天然抗原的氨基酸序列，然后寻找该肽段所针对的抗原决定簇（epitopes），使用ELISA 检测不同多肽与牛结核分枝杆菌抗血清的反应，最后选出具有良好反应的以下五种牛结核分枝杆菌多肽。
bTB-p-1 MAEMKTDAATLAQEAGNFMTEQQWNFAGIEAAAS
bTB-p-2 QEAGNFERISGDLKTQAGIEAAASAIQGNVTS
bTB-p-3 VVRFQEAANKQKQELDEIAIQGNVTSIHSLLDEG
bTB-p-4 NIRQAGVQYSRADEEQQQKWDATATELNNALQNL
bTB-p-5 RADEEQQQALSSQMGFGQAMASTEGNVTGMFA
二、牛结核分枝杆菌特异性多肽抗原包被的酶标板的制备：
取96孔酶标板，每孔100μL上述任意一种牛结核分枝杆菌特异性多肽抗原，4℃过夜包被，包被浓度为0.01μg/mL～5μg/mL，用PBST 洗涤液250μl/ 孔洗涤2～4 次后拍干，用封闭液150μl/孔，37℃封闭1h，洗涤液PBST 250μl/ 孔洗涤3 次后拍干，放入真空袋中，加入干燥剂，抽真空，4℃保存。
三、组装试剂盒：
各试剂盒包括牛结核分枝杆菌特异性多肽抗原包被液包被的酶标板；阳性血清和阴性血清各1 管，其中阳性血清为牛结核分枝杆菌标准阳性血清，阴性血清为牛结核分枝杆菌标准阴性血清；用辣根过氧化物酶标记的抗牛IgG 的酶标抗体1 瓶；抗体稀释液1 瓶；底物显色液1 瓶；终止液1 瓶。
其中，阳性血清为用抗体稀释液按照体积比为1∶20～100 的比例将牛结核分枝杆菌标准阳性血清稀释后取得的稀释阳性血清。
阴性血清为用抗体稀释液按照体积比为1∶20～100 的比例将牛结核分枝杆菌标准阴性血清稀释后取得的稀释阴性血清。
抗体稀释液为0.1%BSA。
用辣根过氧化物酶标记的抗牛IgG酶标抗体是用HRP保护液按工作浓度比例稀释后的抗牛IgG酶标抗体。
底物显色液为TMB。
终止液为0.1SDS%或2M的H2SO4。
下举两种典型的试剂盒实施例：
实施例1：牛结核分枝杆菌抗体的ELISA 试剂盒，通过以下方法制备：
1）选择上述任一种多肽抗原用包被液按照5μg/mL 的浓度稀释（包被液为1.59gNa2CO3，2.93g NaHCO3 溶于800mL 双蒸水中，调节pH 值至9.6，并定容至1000mL），然后将稀释的多肽抗原包被96 孔酶标板，每孔100μL，4℃过夜包被，次日用PBST 洗涤液250μl/ 孔洗涤3 次后拍干，用封闭液150μl/ 孔，37℃封闭1h，洗涤液PBST 250μl/ 孔洗涤3 次后拍干，适当处理，放入真空袋中，加入干燥剂，抽真空，4℃保存；
2）抗体稀释液（AD）配制：称取 1.0g BSA（0.1%），加PBS 至 1000mL，4℃保存；
3）底物液显色液配制：4mL TMB（50mg TMB 溶于10mL DMSO 中），9.8g 柠檬酸，1.2mL30% H2O2 加蒸馏水定容至1000mL，4℃避光保存；
4）终止液配制（2 mol/L H2SO4）：双蒸水178.3mL，逐滴加入浓硫酸（98%）21.7mL ；
5）阴阳性血清稀释：用抗体稀释液按阳性血清/ 阴性血清与抗体稀释剂按体积比为1:50 稀释，1mL/ 管分装，4℃保存；
6）酶标抗体配制：用HRP保护液按HRP保护液与辣根过氧化物酶标记抗牛IgG 体积比为1:2000 的比例稀释辣根过氧化物酶标记抗牛IgG，4℃保存；
7）试剂盒的组装：将多肽抗原包被的96 孔酶标板1 块、1mL/ 管的阴阳性血清各1管、12mL/ 瓶的抗体稀释液1 瓶、12mL/ 瓶的酶标二抗1 瓶、12mL/ 瓶的底物显色液1 瓶、6mL/瓶的终止液1 瓶、操作说明书一份组装成ELISA 检测试剂盒。
实施例2：牛结核分枝杆菌抗体的ELISA 试剂盒，通过以下方法制备：
1）选择上述任多种多肽抗原用包被液按照0.1μg/mL 的浓度稀释（包被液为1.59gNa2CO3，2.93g NaHCO3 溶于800mL 双蒸水中，调节pH 值至9.6，并定容至1000mL），然后将稀释的 多肽抗原包被96 孔板，每孔100μL，4℃过夜包被，次日用PBST 洗涤液250μl/ 孔洗涤2 次后拍干，用封闭液150μl/ 孔，37℃封闭1h，洗涤液PBST 250μl/ 孔洗涤4 次后拍干，放入真空袋中，加入干燥剂，抽真空，4℃保存；
2）抗体稀释液（AD）配制：称取 1.0g BSA（0.1%），加PBS 至 1000mL，4℃保存；
3）底物液显色液配制：4mL TMB（50mg TMB 溶于10mL DMSO 中），9.8g 柠檬酸，1.2mL30% H2O2 加蒸馏水定容至1000mL，4℃避光保存；
4）终止液配制：双蒸水178.3mL，逐滴加入浓硫酸（98%）21.7mL ；
5）阴阳性血清稀释：用抗体稀释液按阳性血清/ 阴性血清与抗体稀释剂按体积比为1:100 稀释，1mL/ 管分装，4℃保存；
6）酶标二抗配制：用HRP保护液按HRP保护液与辣根过氧化物酶标记抗牛IgG 体积比为1:3000 的比例稀释辣根过氧化物酶标记抗牛IgG，4℃保存；
7）试剂盒的组装：将 多肽抗原包被的96 孔酶标板1 块、1mL/ 管的阴阳性血清各1管、12mL/ 瓶的抗体稀释液1 瓶、12mL/ 瓶的酶标二抗1 瓶、12mL/ 瓶的底物显色液1 瓶、6mL/瓶的终止液1 瓶、操作说明书一份组装成ELISA 试剂盒。
四、检测应用：
1、采用以上实施例1试剂盒进行检测，方法如下：
1） 多肽抗原包被液包被的96 孔板中每孔内加入100μL 已经稀释好的各样本，每个样品必须使用一个独立的枪头，每块板中阴阳性对照血清各设两孔，室温下孵育60 分钟，将各孔的液体弃入废液缸内。
2）用微量移液器取洗涤液，洗涤96 孔板，约250μL/ 孔，洗涤6 次，最后一次加入洗涤液后浸泡洗涤5min，再将板中残留的洗涤液弃入废液缸内，然后用力扣拍到吸水纸上，注意应避免包被板孔干燥。
3）然后在每孔加入100μL 辣根过氧化物酶标记的抗牛IgG抗体，室温下孵育60 分钟；将各孔的液体弃入废液缸内；同上洗涤。
4）每孔加入100μL TMB 底物液，避光显色15 分钟，每孔加入2M HS2O4 50μL 终止液，使反应终止，轻震酶标板，使板内液体混匀；
5）使用酶标仪测定并记录样本和对照样本的A450 吸收值，10min 完成测定。
本实验结果应符合下列条件： 阳性对照的平均值（P）减去阴性对照的平均值（N）必须大于0.15，阴性对照平均值（N）必须小于或等于0.15，抗体的阳性/ 阴性通过计算样品与阳性对照（S/P）的比值进行判定，具体计算方法如下:
如果S/P 值小于0.10，样品应判定为牛分枝结核杆菌抗体阴性（-）。
如果S/P 值在0.10-0.15 之间判定为牛分枝结核杆菌样品可疑（+/-），如果S/P值大于0.15，则判定为样品牛分枝结核杆菌抗体阳性（+）。
2、采用以上类同的方法，以实施例1试剂盒进行检测，结果类同1。
五、不同检测比较：
检测-r干扰素试剂盒检测时，需要采集抗凝血，需要在体外进行血细胞培养24小时，并同时用结核菌素刺激，然后利用试剂盒进行ELISA检测。技术要求较高，操作和解读要求有较好的专业技术。
本发明类似常规ELISA操作，只要采集待检牛血清就可以检测，时间短，操作方便，成本也较低。
两种方法检测效果比较：
奶牛样本 1 2 3 4 5 6 7 8 9
牛r-干扰素检测结果 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 禽结核阳性 阳性 阳性 阴性
多肽ELISA检测结果 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阴性 阳性 阳性 阴性
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种多肽抗原检测牛结核分枝杆菌抗体的ELISA 试剂盒，其特征在于：包括牛结核分枝杆菌特异性多肽抗原包被的酶标板、阴性血清、阳性血清、抗体稀释液、用辣根过氧化物酶标记的抗牛IgG酶标抗体、底物显色液、终止液；所述牛结核分枝杆菌特异性多肽抗原为以下五种多肽抗原中的至少任意一种：
bTB-p-1 MAEMKTDAATLAQEAGNFMTEQQWNFAGIEAAAS；
bTB-p-2 QEAGNFERISGDLKTQAGIEAAASAIQGNVTS；
bTB-p-3 VVRFQEAANKQKQELDEIAIQGNVTSIHSLLDEG；
bTB-p-4 NIRQAGVQYSRADEEQQQKWDATATELNNALQNL；
bTB-p-5 RADEEQQQALSSQMGFGQAMASTEGNVTGMFA；
所述五种多肽抗原为利用牛结核分支杆菌特异性多肽，采用体外人工合成方法取得的多肽抗原。
2.根据权利要求1所述ELISA 试剂盒，其特征在于：所述牛结核分枝杆菌特异性多肽抗原包被的酶标板的制备方法是：取96孔酶标板，每孔100μL牛结核分枝杆菌特异性多肽抗原，4℃过夜包被，包被浓度为0.01μg/mL～5μg/mL，用PBST 洗涤液250μl/ 孔,洗涤2～4 次后拍干，用封闭液150μl/孔，37℃封闭1h，洗涤液PBST 250μl/ 孔洗涤3 次后拍干，放入真空袋，4℃、抽真空保存。
3.根据权利要求1所述ELISA 试剂盒，其特征在于：所述阳性血清为用抗体稀释液按照体积比为1∶20～100 的比例将牛结核分枝杆菌标准阳性血清稀释后取得的稀释阳性血清；所述阴性血清为用抗体稀释液按照体积比为1∶20～100 的比例将牛结核分枝杆菌标准阴性血清稀释后取得的稀释阴性血清。
4.根据权利要求1所述ELISA 试剂盒，其特征在于：所述抗体稀释液为0.1%BSA。
5.根据权利要求1所述ELISA 试剂盒，其特征在于：所述用辣根过氧化物酶标记的抗牛IgG酶标抗体是用HRP保护液按工作浓度比例稀释后的抗牛IgG酶标抗体。
6.根据权利要求1所述ELISA 试剂盒，其特征在于：所述底物显色液为TMB。
7.根据权利要求1所述ELISA 试剂盒，其特征在于：所述终止液为0.1SDS%或2M的H2SO4。
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