CN107860919A - 检测猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA的试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

一种检测猪圆环病毒2型IgM抗体的ELISA试剂盒，包括有：抗原包被微孔板，HRP标记的指示抗原，标准阳性和标准阴性对照血清，底物，洗涤液和终止液；其中抗原包被微孔板，是通过构建串联表位蛋白，用大肠杆菌(E.coli)重组表达，筛选到高亲和活性和特异性的串联表位蛋白CapEpi Ⅱ和CapEpi Ⅳ，将CapEpi Ⅱ作为IgM捕获抗原，以37.5ng/mL的浓度，4℃过夜包被96孔微孔板而得到；HRP标记的指示抗原，是利用HRP标记CapEpi Ⅳ，并通过已知IgM阳性血清滴定其最佳工作浓度，来作为IgM指示抗原。本发明具有较好的敏感性和特异性，无需对待检血清稀释，操作简单，适用于田间大量样品的快速检测；可有效检测PCV2感染后IgM的产生。

Description

检测猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA的试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测猪圆环病毒2型(PCV2)IgM抗体的双抗原夹心ELISA(酶联免疫吸附试验)试剂盒，本发明还涉及应用该试剂盒检测猪圆环病毒2型IgM抗体的双抗原夹心ELISA方法。
背景技术
PCV2是圆环病毒科、圆环病毒属成员，是引起5～18周龄断奶后仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的主要病原，同时该病毒还与多种猪病发生相关，统称这类病为圆环病毒相关疾病(PCVAD)。PCV2在世界多数国家都有流行的报道，在猪群中呈隐性感染和持续性带毒，引起机体免疫功能系统性抑制或紊乱，继而导致继发性感染且可严重干扰多种疫苗免疫效果，加剧规模化猪场疫病流行的复杂性和经济损失，是近年来我国集约化养猪业生产中危害最为严重的病原之一。如果对临床感染病例的准确快速诊断，就能为疾病的有效防控提供指导。因此，研制敏感、特异的PCV2诊断方法，进行准确诊断，对PCVAD的有效防控尤为重要。
PCV2为单股环状DNA病毒，大小约为1.7kb，编码衣壳蛋白(Cap)和复制酶(Rep)蛋白两个主要功能性蛋白。衣壳蛋白是构成病毒衣壳的唯一结构蛋白和最主要免疫原性蛋白。已有研究证实，衣壳蛋白N端核定位信号肽(NLS)序列26～36区段存在一个抗原中和表位，同时氨基酸残基第65～87、113～147、102～107、119～128、157～183、193～233六个区段能够诱导实验动物产生抗衣壳蛋白免疫反应。表明衣壳蛋白上的抗原表位可以作为评价疫苗免疫或PCV2感染的理想候选抗原，可以用于PCV2血清抗体诊断产品的研制。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种操作简单、准确诊断、适用于田间大量样品快速检测的检测猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA的试剂盒；本发明的另一目的是提供一种检测猪圆环病毒2型IgM抗体的双抗原夹心ELISA方法。
本发明实现第一目的所采用的技术方案如下：一种检测猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括有：抗原包被微孔板，HRP标记的指示抗原，标准阳性和标准阴性对照血清，底物，洗涤液和终止液；具体为：
a.本发明试剂盒涉及的抗原包被微孔板，是通过构建串联表位蛋白，用大肠杆菌(E.coli)重组表达，筛选到高亲和活性和特异性的串联表位蛋白CapEpiⅡ和CapEpiⅣ，将CapEpiⅡ作为IgM捕获抗原，以37.5ng/mL的浓度，4℃过夜包被96孔微孔板而得到。
b.本发明试剂盒涉及的HRP标记的指示抗原，是利用HRP标记CapEpiⅣ，并通过已知IgM阳性血清滴定其最佳工作浓度，来作为IgM指示抗原。
c.本发明试剂盒涉及的标准阳性和标准阴性对照血清，是通过PCV2细胞毒(HLJ1501)感染和未感染仔猪，采集血液，分离血清获得。
d.本发明试剂盒涉及的底物，是3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)。
e.本发明试剂盒涉及的洗涤液，是含0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)。
f.本发明试剂盒涉及的终止液，是1.5mol/L的H2SO4。
本发明实现第二目的所采用的技术方案如下：一种检测猪圆环病毒2型IgM抗体的双抗原夹心ELISA方法；其特征在于通过串联表位蛋白捕获和指示血清中PCV2特异性IgM抗体，从而鉴定PCV2感染；具体步骤为：
a.首先用37.5ng/mL的CapEpiⅡ包被微孔板，经固定和封闭处理后，分别加入待检血清样品和标准阴阳性血清，37℃孵育60min；
b.用洗涤液PBST洗涤5次，加入HRP标记的CapEpiⅣ，37℃孵育60min；
c.再次用洗涤液PBST洗涤5次，加入TMB底物，室温避光20min；
d.加入终止液，并读取OD450nm值；
e.结果判定，当标准阳性血清OD450nm/标准阴性血清OD450nm>2.1，且阴性血清OD450nm<0.3时表明实验成立；当样品血清OD450nm/标准阴性血清OD450nm≥2.1为IgM阳性，表明PCV2感染；当样品血清OD450nm/标准阴性血清OD450nm<2.1为IgM阴性，健康。
本发明将PCV2衣壳蛋白上已知的抗原表位，依次串联，表位间利用柔性氨基酸作为接头，并在大肠杆菌(E.coli)中成功获得重组表达蛋白，重组蛋白命名为：CapEpiⅠ、CapEpiⅡ、CapEpiⅢ和CapEpiⅣ。血清学试验证实，这些重组蛋白均具有结合PCV2血清抗体功能，而CapEpiⅡ和CapEpiⅣ具有较高的结合活性和特异性，其氨基酸序列参见SEQUENCELISTING.1和SEQUENCE LISTING.2。将重组CapEpiⅣ抗原通过碘酸钠法标记上辣根过氧化物酶(HRP)，以其作为IgM指示抗体，以CapEpiⅡ为IgM捕获抗体，研制双抗原夹心ELISA方法，可检测血清中PCV2的IgM抗体(参见图1)。
本发明对PCV2细胞毒接种动物血清以及田间样品检测，同时与同类商品化产品比较，结果证实，本发明提供的方法与同类商品化产品具有较高的符合率，能用于田间PCV2感染样品检测，并且本发明提供的方法能检测出更多的IgM阳性样品，表明其具有更好的敏感性。
通过对本发明提供的方法的特异性进行验证，结果显示该方法对PRRSV和CSFV弱毒活苗免疫猪血清，以及已知PCV2 IgG阳性猪血清，进行检测，结果均为阴性，表明其具有较好特异性。
本发明涉及的方法具有较好的敏感性和特异性，同时本发明提供的方法无需对待检血清稀释，操作简单，适用于田间大量样品的快速检测。本发明可有效检测PCV2感染后IgM的产生，为鉴定PCV2感染提供了可靠的检测方法，也为PCV2疫情防控提供科学指导。
附图说明
图1是本发明的检测原理图。
图2是衣壳蛋白上不同表位的串联方式图；将PCV2衣壳蛋白上已知表位，用编码柔性氨基酸的衔接Linker序列串联。
图3是CapEpiⅠ、CapEpiⅡ、CapEpiⅢ和CapEpiⅣ的表达、纯化和western blot验证；泳道1、3、5和7：分别为18℃条件下，CapEpiⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ未诱导对照组菌体裂解后的上清；泳道2、4、6和8：分别为18℃条件下，CapEpiⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ诱导组菌体裂解后的上清；泳道9、11、13和15：分别为37℃条件下，CapEpiⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ未诱导对照组菌体裂解后的上清；泳道10、12、14和16：分别为37℃条件下，CapEpiⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ诱导组菌体裂解后的上清；泳道17-20：分别为CapEpiⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的纯化结果；泳道21-24；分别为CapEpiⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的western blot验证。
图4是标准血清制备检测图；A:ELISA检测，PCV2感染1周和未感染猪血清进行倍比稀释后，用衣壳蛋白作为包被蛋白，以HRP标记的抗猪IgM抗体为第二抗体，进行ELISA检测；B:Western blot检测，泳道1，PCV2感染1周猪血清为第一抗体，HRP标记的抗猪IgM为第二抗体；泳道2，未感染血清猪血清为第一抗体，HRP标记的抗猪IgM为第二抗体。
具体实施方式
1.重组CapEpiⅠ、CapEpiⅡ、CapEpiⅢ与CapEpiⅣ抗原的制备
1.1基因合成
采用人工基因合成方式获得融合PCV2衣壳蛋白抗原表位基因序列。以当前田间主要流行毒株(HLJ1501,GenBank NO.:KY940534)基因序列为参考，将7个抗原结构域区域:“26aa～36aa，47aa～62aa，65aa～87aa，117aa～134aa，157aa～183aa，193aa～210aa，228aa～233aa”,4个一组进行串联，2个抗原结构域区段之间用柔性接头(Linker)序列(ggtggcggaggatccggtggcggaggatccggtggcgg aggatcc，编码氨基酸GGGGSGGGGSGGGGS)连接，确保两个结构域独自发挥功能。序列两端加EcoRI和XhoI限制性酶切位点，序列送上海捷瑞生物工程有限公司进行基因合成，获得4组基因序列CapEpiⅠ、CapEpiⅡ、CapEpiⅢ和CapEpiⅣ，如图2所示。
1.2重组表达载体的构建
用限制性内切酶EcoRI和XhoI，分别将CapEpiⅠ、CapEpiⅡ、CapEpiⅢ与CapEpiⅣ片段和pGEX-6p-1载体酶切，再经过切胶、回收，浓度测定后，按照载体和目的片段摩尔比≈1∶3混合，用T4DNA连接酶16℃连接过夜。转化DH5a感受态细胞，在LB平板(LB固体培养基，抗性/浓度，Amp+/1μg/mL)37℃，培养12～18h。挑取单克隆，LB液体培养基(含Amp+，1μg/mL)增菌后，提取质粒进行EcoRI和XhoI双酶切鉴定和PCR鉴定，鉴定得到的阳性重组质粒分别命名为CapEpiⅠ、CapEpiⅡ、CapEpiⅢ与CapEpiⅣ。
1.3CapEpiⅠ、CapEpiⅡ、CapEpiⅢ与CapEpiⅣ重组蛋白表达、纯化和鉴定
1.3.1.重组蛋白原核表达：将重组质粒CapEpiⅠ、CapEpiⅡ、CapEpiⅢ与CapEpiⅣ分别转化表达菌株BL21(Star)感受态细胞，37℃过夜培养，长出单克隆菌落后，每个样品挑取1个单克隆菌株，接种到5mL LB液体培养中，220r/min，37℃，8-12h振荡培养；然后分别从该管中取菌液，以1:100的比例，相应转接到4个50ml新的LB液体培养基中，220r/min，37℃，培养约3h至OD600nm≈0.5～0.6，在其中的2个管中加入IPTG的终浓度为0.5mmol/L，剩余2管作为未诱导对照，诱导和对照俩个一组，分别置18℃和37℃摇床，200r/min振荡诱导培养12h，然后，12000rpm，离心2min，收获菌体。
1.3.2.SDS-PAGE鉴定：将步骤1.3.1.所得菌体加入1mL pH8.0的Tris-HcL缓冲液重悬，分别进行超声，10000r/min离心15min，留取上清液；取60μL上清液与20μL 4×蛋白上样缓冲液混合，100℃水浴煮10min。配制质量百分比为12％的SDS-PAGE蛋白质电泳凝胶，加入煮过的样品，每个样品10μL，加入标准蛋白分子量Marker 6μL，进行蛋白电泳。然后用考马斯亮蓝染色液染色30min，脱色液脱色后观察到，与对照以及37℃条件诱导组比较，18℃条件下诱导的菌样品上清中出现明显大小与预期大小相符的，约为37kDa的蛋白，表明重组CapEpiⅠ、CapEpiⅡ、CapEpiⅢ与CapEpiⅣ蛋白均得到表达，并且在18℃条件下诱导为可溶性表达，如图3所示。
1.3.3.Western Blot鉴定：将重组蛋白表达菌超声后上清，进行SDS-PAGE电泳，然后转到PVDF膜，利用PCV2抗体阳性血清作为第一抗体，以HRP标记的抗猪单克隆抗体为第二抗体，用ECL发光底物作为显色剂，进行western blot检测。结果均出现与目的蛋白大小相符的目的条带，表明重组CapEpiⅠ、CapEpiⅡ、CapEpiⅢ与CapEpiⅣ蛋白可以被PCV2阳性血清识别，具有抗体结合活性如图3所示。
1.3.4.重组蛋白纯化：扩繁重组蛋白表达菌，18℃，IPTG诱导后，收集菌体，超声裂解，离心收集上清，用GST标签蛋白纯化树脂按操作说明进行目的蛋白纯化，得到大小与预期相符的单一蛋白条带，表明目的蛋白得到纯化，如图3所示。
1.3.5.间接ELISA实验鉴定：结合活性和特异性，将浓度为5μg/mL纯化的CapEpiⅠ、CapEpiⅡ、CapEpiⅢ与CapEpiⅣ重组蛋白分别包被96孔板；同时用重组全长衣壳蛋白包被ELISA板作为阳性对照。检测3份(S1～S3)已知PCV2抗体阳性血清(P)，已知无PCV2特异性抗体的1份阴性血清(N1)作为第一抗体，以1份猪瘟病毒(CSFV)抗体阳性血清(CSF1)，1份猪圆环病毒1型(PCV1)抗体阳性血清(PCV1S1)，1份猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性牛血清(PRRS1)和1份猪细小病毒(PPV)阳性血清(PP1)作为抗原特异性分析样品，上述样品均做1∶20稀释与上述四种抗原相互作用,血清作2孔重复，重复测3次，取平均值。以辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗猪IgG为第二抗体，TMB为底物，酶标仪吸光度OD450nm波长读结果，计算结果见表1。
表1间接ELISA实验鉴定重组CapEpiⅠ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ结合活性和特异性
注：N1血清样品中PCV2、CSFV、PRRSV和PPV特异抗体均为阴性，计算P/N值均依据此血清检测OD450nm值。OD450nm值为3次均值。
依据间接ELISA血清抗体检测方法判断公式：阳性血清判定标准：阳性血清OD450值/阴性血清OD450nm值>2.1(即P/N>2.1)，该血清样品即为阳性。计算这些血清P/N值结果说明，重组表位抗原CapEpiⅠ、CapEpiⅡ、CapEpiⅢ和CapEpiⅣ与完整重组衣壳蛋白具有相近的与阳性血清反应的能力，并且这些重组表位抗原重也同样具有PCV2特异性，适合用于研制CSFV血清抗体的检测方法。同时，比较CapEpiⅠ、CapEpiⅡ、CapEpiⅢ和CapEpiⅣ与这些PCV2抗体阳性和阴性样品反应发现，CapEpiⅡ和CapEpiⅣ与N1，PCV1S1，PRRS1，CSF1和PP1有更低的OD450nm值，具有较高的P/N值，因此拟选择用为检测抗原。CapEpiⅡ和CapEpiⅣ的氨基酸序列参见说明书序列表SEQUENCE LISTING.1和SEQUENCE LISTING.2。
2.HRP-CapEpiIV以及PCV2 IgM标准阴阳性血清的制备
2.1制备HRP标记的CapEpiIV抗原
2.1.1.取2ml纯化获得的浓度为1mg/ml的CapEpiIV，加入透析袋中，在pH9.6的0.2M碳酸盐缓冲液中透析，换液两次以上。
2.1.2.取10mg HRP溶解于2ml蒸馏水中，加入0.1M的新配制的NaIO4溶液0.4ml，避光室温搅拌20min。然后将该溶液装入透析袋，放入1mM，pH4.4的醋酸钠缓冲液中，4℃透析过夜。
2.1.3.加0.2M，pH9.6的碳酸盐缓冲液，调HRP溶液pH值到9.0～9.5。立即与透析好的CapEpiIV混合，室温避光轻轻搅拌2h。
2.1.4.加0.2ml新配的4mg/ml NaBH4溶液，混匀，置4℃，2h；将该溶液装入透析袋中，用0.15M，pH7.4的PBS透析，4℃过夜。
2.1.5.在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，4℃沉淀1h；而后在3000rpm/min，离心30min，弃上清。沉淀物用半饱和(NH4)2SO4洗二次，沉淀物溶于0.15M，pH7.4的PBS中。将所得溶液装入透析袋中，用0.15M，pH7.4的PBS缓冲液透析，用萘氏试剂检测去除铵离子后，10000rpm/min，离心30min去除沉淀，上清液即为酶结合物，用分光光度计测定含量，然后加入体积百分比为40％的甘油，置于-20℃保存。
2.2PCV2 IgM标准阴阳性血清的制备
饲养2头30日龄仔猪，经PCR和血清抗体检测，确定未有PCV2感染。其中1头取血分离血清；另一头用PCV2田间分离毒株(HLJ1501，Genebank NO.KY940534)感染，感染后7天取血收集血清。用重组衣壳蛋白包被酶标板，用HRP标记的抗猪IgM抗体作为第二抗体，检测血清中的PCV2衣壳蛋白特异性IgM抗体。同时用western blot方法进行验证，将重组衣壳蛋白转至PVDF膜，与待测血清孵育，用HRP标记抗猪IgM抗体作为指示抗体，ECL为底物进行显色。结果证实PCV2感染后7天，仔猪体内能够产生IgM抗体，可以作为标准阳性对照血清，而未感染猪则无PCV2特异性IgM抗体，可以作为标准阴性对照血清，如图4所示。
3.一种检测PCV2 IgM抗体的夹心ELISA方法的建立
3.1CapEpiⅡ抗原包被
3.1.1.抗原包被浓度选择
用50mM，pH9.6的碳酸盐缓冲液，将纯化的CapEpiⅡ抗原倍比稀释成10μg/ml-9ng/mL,每个浓度包被4孔，100μl/孔，加入酶标板中，封口膜密封，置4℃过夜包被；洗板后，加入100微升已知IgM阳性和阴性血清，室温孵育1h，再次洗板，加入HRP标记抗猪IgM二抗，室温1h，用TMB底物显色，读取OD450nm值。当包被抗原浓度为37.5ng/mL时，阳性血清样品与阴性血清样品的比值差异最显著，是最适抗原包被量，在此条件下既节约了抗原，也最大程度的降低非特异性反应发生。因此抗原包被浓度选择为37.5ng/mL，对照结果见表2。
表2CapEpiⅡ包被浓度选择
3.1.2.抗原固定
包被过夜的酶标板，用300μl/孔1×PBST(pH 7.2)洗涤液洗涤3次，最后一次拍干。加入50μl/孔的抗原稳定缓冲液：质量浓度为0.01％多聚甲醛，0.01M的PBS，pH7.2，室温作用5min，用1×PBST洗涤5次，拍干。
3.1.3.封闭抗原预包被板
加入200μl/孔的封闭液：0.8％蔗糖(w/v)、1％明胶(w/v)、0.8％酪蛋白(w/v)，1×PBST，pH 7.2，室温作用30min，然后1×PBST洗涤3次，拍干，彻底干燥酶标板后，加入干燥剂和抽真空密封，即为抗原包被板。
3.2待检样品稀释度确定
选择5份PCV2 IgM阳性(S1-S5)和1份PCV2 IgM阴性血清，按照原倍，1:50,1:100,1:200稀释，分别加入到CapEpiⅡ抗原包被微孔板，以HRP标记的抗猪IgM抗体为第二抗体，进行ELISA检测。以满足“检测出的IgM阳性情况与实际完全相符，P/N值>2.1”条件的稀释倍数，作为待检血清的稀释度。结果原倍血清稀释的检测与实际完全相符，P/N值符合要求，因此待检血清样品直接按照原倍检测，省去稀释的步骤，提高了低IgM含量样本的检出效率，对照结果见表3。
表3血清稀释度选择
注：★表示P/N<2.1判定结果为阴性。
3.3HRP-CapEpiIV工作浓度滴定
将PCV2 IgM阳性、阴性血清加入CapEpiⅡ抗原包被微孔板，利用不同倍数稀释的HRP-CapEpiIV作为指示抗体，进行ELISA检测。选择满足“阳性OD450nm值在1.0-2.0之间，阴性OD450nm值小于0.2，同时P/N值最大”条件的稀释度，作为HRP-CapEpiIV最佳工作浓度。试验确定HRP-CapEpiIV工作浓度为1∶10000(HRP-CapEpiIV质量含量为25.5ng/mL)，对照结果见表4。
表4HRP-CapEpiIV工作浓度选择
3.4样品检测流程
3.4.1加样：在CapEpiⅡ抗原包被微孔板中分别加入100μl的标准阴阳性血清(各2孔)和待测血清标本。加样完成后，用封口贴密封微孔板，使用微量振荡器震动30s或者手工在实验操作台上向左右轻轻平行摇晃60s混匀。将已密封微孔板放置于37℃孵育60min。
3.4.2洗涤：孵育完毕后，弃尽微孔内液体，1×PBST洗板5次。洗涤结束后用吸水纸拍干微孔壁内残余液体，并将微孔板外部液体与指纹擦拭干净。
3.4.3加酶结合物：在所有孔中加入100μl/孔酶结合物HRP-CapEpiIV，密封微孔板放置于37℃孵育60min。而后再次洗涤，洗涤方法按照步骤3.4.2进行。
3.4.4TMB底物显色：底物A和底物B按体积比为1∶1比例混匀，底物溶液A：TMB浓度为5mg/mL DMSO溶液；底物B：500ml双蒸水溶解13.608g CH3COONa·3H2O，用1mol/L柠檬酸调pH至6.0，加入1mL体积百分比为30％双氧水，定容至1000ml；100μl/孔，自动或手动混合30s至混匀，室温避光静置20min显色。
3.4.5终止反应：取出微孔板，此时可以明显看到各微孔内呈现不均一的蓝色，每孔加入50μl的1.5mol H2SO4终止液，轻微混匀；此时各微孔内的蓝色渐变为黄色。
3.4.6读值：将已终止反应的微孔板置于酶标仪读数槽内，使用检测波长450nm与参考波长630nm的双波长测量读取各孔的吸光度值；在30min内完成数据读取。
3.4.7结果判定：
3.4.7.1实验成立条件：当阳性标准品OD450nm＞1.0，阴性标准品OD450nm<0.3时，判定实验成立。
3.4.7.2结果判定：血清样品OD450nm值/阴性标准血清OD450nm比值≥2.1血清样品为IgM阳性，判定为PCV2感染；血清样品OD450nm值/阴性标准血清OD450nm比值＜2.1血清样品为阴性，判定为健康。
4.本发明方法的特异性分析
利用商品化的CSFV和PRRSV弱毒活疫苗免疫无PCV2感染仔猪，免疫后7天采血，分离血清，用ELISA方法确定CSFV和PRRSV特异性IgM抗体为阳性(CSFVIgM，PRRSVIgM)。同时用商品化的PCV2特异性IgG抗体检测试剂盒，筛选2份PCV2 IgG阳性血清样品(IgG阳性1和IgG阳性2)。用本发明方法对这些样品进行检测。结果均为阴性，表明本发明方法具有较好的特异性，具体分析结果见表5。
表5特异性分析
注：+表示检测结果为IgM阳性，-表示检测IgM结果为阴性。
5.田间猪血清样品检测实例
用本发明所涉及ELISA检测试剂抽检猪PCV2疫苗未免疫猪场的30日龄仔猪血清样品40份，检测PCV2特异性IgM抗体。依据本试剂盒检测结果发现，PCV2特异性IgM为阳性样品有5份(1705,1706，1707,1712,1725)，占样品总数的12.5％，其余样品均为阴性。用商品化试剂盒检测并比较发现，商品化试剂盒检测出PCV2特异性IgM阳性样品为4份(1705,1707,1712,1725)占样品总数的10％，其余全为阴性，样品检测结果见表6。本发明试剂盒检测5份阳性样品中有1份样品用商品化试剂盒检测为阴性，因此本发明涉及的PCV2 IgM检测ELISA方法具有更高的敏感性，并且与商品化试剂盒的符合率为(38/40)95％，表明该方法适用于临床样品的检测。
表6田间样品检测
注：+表示检测结果为IgM阳性，-表示检测IgM结果为阴性。
我国从2000年开始确定存在猪圆环病毒感染以来，全国各地不断有PCV2发病报道，其感染率居高不下，并且不同阶段猪均可感染，PCV2感染已然成为威胁我国养猪业的背景性疾病。随着对该病的重视，多种疫苗已经投入使用，对PCV2感染得到了一定控制，然而，临床仍常见到野毒株感染。本研究对田间样品IgM检测也证实，30日龄仔猪就开始出现了PCV2感染。本发明涉及的PCV2 IgM检测ELISA方法将为PCV2感染调查和疫苗免疫预防提供指导。
SEQUENCE LISTING 1(CapEpiⅡ)
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 检测猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA的试剂盒及检测方法
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 129
<212> PRT
<213> 猪圆环病毒（porcine circovirus）
<400> 1
Thr Arg Leu Ser Arg Thr Ile Gly Tyr Thr Val Lys Lys Thr Thr Val
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro
20 25 30
Ser Trp Asn Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu Pro
35 40 45
Pro Gly Gly Gly Ser Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp
65 70 75 80
Asn Phe Val Thr Lys Ala Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Ser Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val
100 105 110
Leu Asp Arg Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gln
115 120 125
Leu
SEQUENCE LISTING 2 (CapEpiⅣ)
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 检测猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA的试剂盒及检测方法
<130> 2
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 113
<212> PRT
<213> 猪圆环病毒（porcine circovirus）
<400> 1
Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn Phe Val Thr Lys
1 5 10 15
Ala Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser His Ser Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Arg Thr Ile
35 40 45
Asp Tyr Phe Gln Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Asp His Val Gly
65 70 75 80
Leu Gly Thr Ala Phe Glu Ser Ile Tyr Asp Gln Asp Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Pro Pro Leu Lys
100 105 110
Pro

Claims (2)

1.一种检测猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括有：抗原包被微孔板，HRP标记的指示抗原，标准阳性和标准阴性对照血清，底物，洗涤液和终止液；具体为：
a.本发明试剂盒涉及的抗原包被微孔板，是通过构建串联表位蛋白，用大肠杆菌(E.coli)重组表达，筛选到高亲和活性和特异性的重组蛋白CapEpiⅡ和CapEpiⅣ，其具有SEQUENCE LISTING.1和SEQUENCE LISTING.2所示的氨基酸序列，将CapEpiⅡ作为IgM捕获抗原，以37.5ng/mL的浓度，4℃过夜包被96孔微孔板而得到。
b.本发明试剂盒涉及的HRP标记的指示抗原，是利用HRP标记CapEpiⅣ，并通过已知IgM阳性血清滴定其最佳工作浓度，来作为IgM指示抗原。
c.本发明试剂盒涉及的标准阳性和标准阴性对照血清，是通过PCV2细胞毒(HLJ1501)感染和未感染仔猪，采集血液，分离血清获得。
d.本发明试剂盒涉及的底物，是3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)。
e.本发明试剂盒涉及的洗涤液，是含0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)。
f.本发明试剂盒涉及的终止液，是1.5mol/L的H2SO4。
2.一种应用权利要求1提供的试剂盒检测猪圆环病毒2型IgM抗体的双抗原夹心ELISA方法；其特征在于通过串联表位蛋白捕获和指示血清中PCV2特异性IgM抗体，从而鉴定PCV2感染；具体步骤为：
a.首先用37.5ng/mL的CapEpiⅡ包被微孔板，经固定和封闭处理后，分别加入待检血清样品和标准阴阳性血清，37℃孵育60min；
b.用洗涤液PBST洗涤5次，加入HRP标记的CapEpiⅣ，37℃孵育60min；
c.再次用洗涤液PBST洗涤5次，加入TMB底物，室温避光20min；
d.加入终止液，并读取OD450nm值；
e.结果判定，当标准阳性血清OD450nm/标准阴性血清OD450nm>2.1，且阴性血清OD450nm<0.3时表明实验成立；当样品血清OD450nm/标准阴性血清OD450nm≥2.1为IgM阳性，表明PCV2感染；当样品血清OD450nm/标准阴性血清OD450nm<2.1为IgM阴性，健康。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108802384A (zh) * 2018-06-23 2018-11-13 中牧实业股份有限公司 猪圆环病毒2型合成肽elisa抗体检测试剂盒
CN109001461A (zh) * 2018-06-26 2018-12-14 安阳工学院 Pcv-3免疫评价与野毒感染诊断的免疫速测试剂盒
CN114805501A (zh) * 2022-03-24 2022-07-29 中牧实业股份有限公司 一种猪圆环病毒2型抗原组合物及其在抗原定量方法中的应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030186307A1 (en) * 2000-09-08 2003-10-02 Aventis Behring Gmbh Method for growing or for removing circoviruses from biological material
CN101357945A (zh) * 2008-08-19 2009-02-04 中国动物疫病预防控制中心 检测猪圆环病毒2型特异性抗体的合成肽偶联抗原及试剂
CN101629956A (zh) * 2009-07-09 2010-01-20 湖南农业大学 检测猪圆环病毒2型抗体的elisa试剂盒
WO2010061000A1 (en) * 2008-11-28 2010-06-03 Ceva Sante Animale Novel porcine circovirus type 2b isolate and uses thereof
CN103033614A (zh) * 2012-12-19 2013-04-10 北京伟嘉人生物技术有限公司 猪圆环病毒2型抗体检测elisa试剂盒
CN103267846A (zh) * 2013-06-09 2013-08-28 湖南农业大学 一种检测2型猪圆环病毒IgM抗体的ELISA试剂盒

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030186307A1 (en) * 2000-09-08 2003-10-02 Aventis Behring Gmbh Method for growing or for removing circoviruses from biological material
CN101357945A (zh) * 2008-08-19 2009-02-04 中国动物疫病预防控制中心 检测猪圆环病毒2型特异性抗体的合成肽偶联抗原及试剂
WO2010061000A1 (en) * 2008-11-28 2010-06-03 Ceva Sante Animale Novel porcine circovirus type 2b isolate and uses thereof
CN101629956A (zh) * 2009-07-09 2010-01-20 湖南农业大学 检测猪圆环病毒2型抗体的elisa试剂盒
CN103033614A (zh) * 2012-12-19 2013-04-10 北京伟嘉人生物技术有限公司 猪圆环病毒2型抗体检测elisa试剂盒
CN103267846A (zh) * 2013-06-09 2013-08-28 湖南农业大学 一种检测2型猪圆环病毒IgM抗体的ELISA试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BENJAMIN R. TRIBLE ET AL.: "Antibody recognition of porcine circovirus type 2 capsid protein epitopes after vaccination, infection, and disease", 《CLINICAL AND VACCINE IMMUNOLOGY》 *
CHAO TING XIAO ET AL.: "Global molecular genetic analysis of porcine circovirus type 2 (PCV2) sequences confirms the presence of four main PCV2 genotypes and reveals a rapid increase of PCV2d", 《JOURAL OF GENERAL VIROLOGY》 *
LONG J. GUO ET AL.: "Porcine circovirus type 2 (PCV2): genetic variation and newly emerging genotypes in China", 《VIROLOGY JOURNAL》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108802384A (zh) * 2018-06-23 2018-11-13 中牧实业股份有限公司 猪圆环病毒2型合成肽elisa抗体检测试剂盒
CN108802384B (zh) * 2018-06-23 2020-06-09 中牧实业股份有限公司 猪圆环病毒2型合成肽elisa抗体检测试剂盒
CN109001461A (zh) * 2018-06-26 2018-12-14 安阳工学院 Pcv-3免疫评价与野毒感染诊断的免疫速测试剂盒
CN109001461B (zh) * 2018-06-26 2024-02-02 安阳工学院 Pcv-3免疫评价与野毒感染诊断的免疫速测试剂盒
CN114805501A (zh) * 2022-03-24 2022-07-29 中牧实业股份有限公司 一种猪圆环病毒2型抗原组合物及其在抗原定量方法中的应用

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