CN114805501A - 一种猪圆环病毒2型抗原组合物及其在抗原定量方法中的应用 - Google Patents

一种猪圆环病毒2型抗原组合物及其在抗原定量方法中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪圆环病毒2型抗原组合物及其在抗原定量方法中的应用。所述抗原组合物由序列1所示的多肽、序列2所示的多肽和猪圆环病毒2型Cap蛋白组成；所述定量检测方法为准确定量猪圆环病毒2型抗原的竞争ELISA方法，该定量检测方法试剂盒包括酶标板、猪圆环病毒2型阳性血清、猪圆环病毒2型抗原和酶标二抗。其中所述酶标板为包被有猪圆环病毒2型抗原组合物；猪圆环2型阳性血清为免疫上述猪圆环病毒2型抗原组合物和灭活抗原后所获得的阳性兔血清或豚鼠血清。本发明采用竞争ELISA法，抗原用量少、灵敏性和特异性高，可以高效地检测是否存在不同类型的猪圆环病毒2型抗原，同时还可以准确定量。

Description

一种猪圆环病毒2型抗原组合物及其在抗原定量方法中的 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种猪圆环病毒2型抗原组合物及其在抗原定量方法中的应用。
背景技术
猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)是无囊膜的二十面体病毒，含有单链负义环状DNA基因组，属于圆环病毒科、圆环病毒属，是目前已发现的最小的动物病毒之一。目前已知的PCV血清型主要有四种：PCV1、PCV2、PCV3和PCV4。自1998年发现以来，PCV2被公认为全世界猪群中最重要的病原体之一。PCV2是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎和肾病综合征(PNDS)、增生坏死性肺炎(PNP)、繁殖障碍(Reproductive failure)、围产期心肌炎(Perinatal myocarditis)、仔猪先天性震颤(Congenital tremors)等多种疾病的主要病原体，这些疾病和综合征被统称为猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)，严重影响着猪肉生产。PCV2基因组大小为1767-1768个核苷酸，目前至少已经鉴定出八种不同的基因型(PCV2a-PCV2h)。PCV2包含11个预测的开放阅读框(ORF)，其中ORF2基因编码的Cap蛋白是病毒衣壳的唯一组成部分，分子量约为27kDa，它参与病毒附着，是宿主免疫反应的主要靶点。Cap蛋白能够诱导机体的免疫应答，产生针对PCV2的特异性抗体，是分子水平上诊断PCV的理想靶抗原，序列比较显示所有PCV2 ORF2基因核苷酸序列同源率在91％—100％之间，推导氨基酸同源率在90％—100％之间。
目前商品化的猪圆环疫苗主要包括灭活疫苗、重组嵌合活病毒疫苗以及表达PCV2病毒Cap蛋白的重组亚单位疫苗等。评价一种疫苗的优略性主要是通过该疫苗的免疫效力来进行评估的，因此效力检验是评价疫苗除安全性评价后最重要的评价指标。猪圆环病毒相关疫苗的效力检验主要是通过动物试验(包括仔猪和小鼠)、荧光定量PCR、琼扩试验、相对效力评价、双抗体夹心法测抗原含量等方法。上述方法中，动物试验是通用方法，也是最经典的方法，但是，由于该方法不仅要观察实验仔猪的存活情况，还需要结合体温变化、相对日增重及组织病毒抗原检测几项指标综合判定，十分繁琐，费时费力，并且面临着阴性猪筛选难的问题，也势必造成企业和检验监督机构在疫苗检测和监督的实施上难度加大，在一定程度上会影响产品质量评判，同时也很难达到动物福利的“3R”要求。双抗体夹心法作用范围广、简单有效，但不同毒株之间效价评定差异较大，琼脂扩散实验操作简单但准确性差，荧光定量PCR要求较高且无法检测亚单位疫苗。
PCV2病毒可以在PK15细胞中繁殖，但是无法产生可见的细胞病变(CPE)。因此，PCV2病毒抗原通常使用荧光定量PCR、间接免疫荧光(IFA)或者免疫组化(IHC)方法来检测或定量。此外PCV2病毒抗原的检测方法还包括：SDS-PAGE电泳(包括Western blot分析)、高效液相色谱(HPLC)以及电子显微镜等，但上述方法也存在检测方法不准确，干扰因素较多等诸多不利因素。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪圆环病毒2型抗原组合物及其在抗原定量方法中的应用。所述的抗原定量检测方法即可以准确定量不同类型的猪圆环病毒2型抗原的竞争ELISA方法，该方法利用猪圆环病毒2型抗原表位多肽、猪圆环病毒2型Cap蛋白作为包被抗原，可用于定量检测疫苗、中间产品或细胞培养物中猪圆环病毒2型抗原含量，具有极好的特异性、敏感性和重复性。为了达到上述目的，本发明首先筛选得到了性能优异的猪圆环病毒2型抗原表位多肽组合物和猪圆环病毒2型Cap蛋白，本发明提供的猪圆环病毒2型抗原组合物，包括序列表中序列1所示的多肽和序列表中序列2所示的多肽，优选由猪圆环病毒2型Cap蛋白、序列表中序列1所示的多肽和序列表中序列2所示的多肽组成。当所述猪圆环病毒2型抗原组合物为序列1所示的多肽和序列2所示的多肽时，两种多肽的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选的，它们的质量比为1：1；当所述的猪圆环病毒2型抗原组合物由猪圆环病毒2型Cap蛋白、序列表中序列1所示的多肽和序列表中序列2所示的多肽组成时，三种物质的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选的，它们的质量比为1:1:1。上述序列1所示的多肽序列自左向右为氨基端向羧基端，自氨基端第19位氨基酸的羧基与第20位氨基酸的ε位氨基形成肽键连接。
上述序列2所示的多肽序列自左向右为氨基端向羧基端，自氨基端第19位氨基酸的羧基与第20位氨基酸的ε位氨基形成肽键连接。
具体的，序列1和序列2的序列如下：
序列1：TILISIFSEIGHVKIEKIV-εK-PKPVLDRTIDYFQPNNKRNQL
序列2：TILISIFSEIGHVKIEKIV-εK-KYDQDYNIRITMYVQFREFNLKDPPLNPK
其中，εK是赖氨酸的ε位氨基形成肽键，具体原理如下所示：
每个氨基酸至少包含一个“—COOH”(羧基)和一个“—NH3”(氨基)，连接在α碳原子上的羧基和氨基称为“α羧基”和“α氨基”。一般的肽合成反应为上一个氨基酸的“α氨基”和下一个氨基酸的“α羧基”反应形成酰胺键(肽键)而成。
Lys(赖氨酸)是一种碱性氨基酸，除了正常的“α氨基”和“α羧基”外，在ε位置上还有一个氨基，如下式。
Figure BDA0003562940760000031
εK特指参与成肽反应的氨基是“ε氨基”而不是“α氨基”，因其较长的手臂结构，因此，被用于连接需要共同使用但又不互相影响的表位。
本发明的准确定量猪圆环病毒2型抗原的竞争ELISA试剂盒，所述的试剂盒包含上述的猪圆环病毒2型抗原组合物作为抗原包被的酶联反应板、猪圆环病毒2型阳性血清、猪圆环病毒2型阴性血清、猪圆环病毒2型纯化标准抗原和酶标二抗。
所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板；所述猪圆环病毒2型抗原表位多肽组合物中的多肽均为化学人工合成得到，所述猪圆环病毒2型Cap蛋白为原核系统表达Cap蛋白。
所述酶联反应板的最佳制备方法及条件是将所述猪圆环病毒2型抗原表位多肽或表达Cap蛋白组合物溶于pH 9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔5μg组合物，2～8℃下放置8～12小时，使组合物抗原与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有1％(g/ml)牛血清白蛋白(BSA)pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。
所述猪圆环病毒2型阳性血清为用猪圆环病毒2型病毒灭活病毒、大肠杆菌表达系统表达的猪圆环病毒2型Cap蛋白、多肽组合物中的一种或几种免疫后采集的兔血清或豚鼠血清；所述猪圆环病毒2型阴性血清为SPF豚鼠血清或SPF兔血清。猪圆环病毒2型Cap蛋白的序列可以为序列表中序列3所示的氨基酸序列。
所述猪圆环病毒2型纯化标准抗原为蔗糖密度梯度离心纯化后的灭活抗原、或者层析纯化的大肠杆菌表达系统表达猪圆环病毒2型Cap蛋白(如可以为序列表中序列3所示的氨基酸序列)。
所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体或羊抗豚鼠IgG抗体。
所述方法还包括底物液A、底物液B和终止液，所述底物液A为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述底物液B为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液，使用时两者以1:1的比例混合。所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。所述方法还包括样品稀释液和浓缩洗涤液(20倍)；样品稀释液为含有0.5％(g/ml)酪蛋白的0.01M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；浓缩洗涤液为含有浓度为0.8％～1.2％(ml/ml)的Tween-20的0.01M，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。
本发明方法的检测程序为：
1、平衡：将所有检测相关样品从冷藏环境中取出，置室温平衡30min备用；液体试剂用前混匀。
2、配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液；
3、设定：2个阴性对照孔和2个阳性对照孔，其余为待测样本孔。
4、待测标本预稀释：使用样品稀释液将待检样品灭活猪圆环病毒2型抗原、表达猪圆环病毒2型Cap蛋白等进行合适的比例进行稀释后，按2倍比进行梯度稀释。
5、标准品的稀释：根据不同来源抗原，选择合适的标准品(即灭活抗原选择灭活抗原标准品，表达蛋白选择表达蛋白标准品)进行2倍比梯度稀释。
6、加样：各孔分别按预先设定加50μl阳性血清后再加入50μl按比例稀释的待测样本。加样过程时间跨度应尽量短。
7、温育：震荡混匀，置37℃温箱中，反应30min。
8、洗板：弃去反应液，每孔加300μl稀释后的洗涤缓冲液，浸泡15s，甩弃洗液，连续洗板4次后拍干。
9、加酶：各孔加100μl相应的辣根过氧化物酶标记IgG抗体(兔血清加入羊抗兔IgG抗体，豚鼠血清加入羊抗豚鼠IgG)。
10、温育：置37℃温箱，反应30min。
11、洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗涤缓冲液300μl，浸泡15s，甩弃洗涤液，连续洗板4次后拍干。
12、显色每孔加入100μl底物工作液(将底物液A和底物液B等量混合即为底物工作液，现用现配)，震荡混匀，置37℃温箱中，避光反应15min。
13、每孔加入显色终止液50μl，振荡混匀终止反应。
14、测定每孔的OD450nm值(加终止液的反应板应在15min内读取OD450nm值)。
检测结果的判定：
1、阴性对照OD450nm平均值应该≤0.15，否则无效。
2、阳性对照每个检测值应该在1.5～3.5之间，否则无效。
3、标准曲线的建立：以标准品OD450nm值为横坐标(X轴)，已标准品蛋白浓度为纵坐标(Y轴)，建立标准曲线，R2值应≥0.98.
4.待测样品浓度测定：将待测样品OD450nm值接近于1的两组数据代入标准曲线，计算原始浓度后取平均值即为待测样品浓度。
本发明的上述检测方法，可用于检测不同来源猪圆环病毒2型抗原或疫苗。
本发明的积极效果在于：本发明同时采用大肠杆菌表达Cap蛋白和采用固态合成肽的猪圆环肽段。序列1和序列2所示的肽段集中了抗原表位，使方法兼具灵敏性高、特异性强的优点。
更进一步的，本发明使用序列1和序列2的肽段组成的组合物作为包被原时，其效果大大优于单独使用一种多肽。
本方法具有良好的特异性，与常见猪病CSFV、PPV、PRRSV、PEDV、TGEV、JEV等均无交叉反应；
本方法可以检测不同来源圆环抗原，如猪圆环病毒2型活毒、灭活毒、大肠杆菌表达Cap蛋白、杆状病毒表达Cap蛋白，方法的最低检测限可达0.05ug/ml；可以应用于相应疫苗制备的全过程；
总之，本方法采用化学合成猪圆环病毒2型Cap蛋白主要抗原位点的抗原肽和大肠杆菌表达Cap蛋白包被酶联反应板，抗原用量少、灵敏度高、特异性强，可以有效地检测猪圆环病毒2型不同来源抗原或疫苗。实验结果表明，本发明的检测方法重复性好，特异性强，灵敏度高。能满足不同层次人员的需要，具有广阔的市场前景和良好的经济、社会效益。
本发明试剂盒敏感性高、特异性好、且操作便捷，具有良好的市场前景。
附图说明
图1为纯化猪圆环病毒2型兔阳性血清和豚鼠阳性血清SDS-PAGE图片；
图2间接免疫荧光(IFA)检测兔阳性血清效价图片；
图3间接免疫荧光(IFA)检测豚鼠阳性血清效价图片；
图4为纯化猪圆环病毒2型灭活抗原和杆状病毒表达Cap蛋白SDS-PAGE图片；图中，泳道1为纯化猪圆环病毒2型灭活抗原，泳道2为杆状病毒表达Cap蛋白，M为分子量Marker。
图5为不同大肠杆菌表达猪圆环病毒2型Cap蛋白浓缩纯化SDS-PAGE图片；图中,浓缩是指使用10kDa浓缩管浓缩纯化Cap蛋白，纯1是分子筛3号出峰，纯2分子筛4号出峰。
图6为两种方法检测不同来源猪圆环病毒2型抗原建立的标准曲线。
具体实施方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1猪圆环病毒2型ELISA抗原定量检测试剂盒包被抗原的制备
本发明通过对国内猪圆环病毒2型新近流行毒株的序列测定并结合猪圆环疫苗毒株序列，研究猪圆环病毒2型主要抗原位点的变异情况，针对主要变异的氨基酸位点统计其变异的频率，同时结合计算机辅助进行猪圆环病毒抗原位点的分析预测，对可能的抗原位点肽段进行化学合成，即针对易变异位点根据统计的变异频率，在这些位点使用不同的氨基酸，得到涵盖当前所有可能变异位点的多种候选多肽抗原。进而，通过大量的血清学试验对这些候选多肽抗原进行筛选，得到能够与大多数阳性血清反应，敏感性和特异性均很好的猪圆环病毒2型流行毒多肽抗原。
通过筛选并鉴定的本发明的合成肽抗原可以使用美国PSI300全自动多肽合成仪，利用Merrifield固相合成法制备，其中采用了由9-芴甲氧羰基(Fmoc)修饰的氨基酸，固相载体为天津南开的Rink Amide MBHA树脂。生产过程通常包括多肽抗原的固相合成、多肽的裂解、抗原纯化与除菌保存。
一、包被抗原固相合成
1、合成原料的准备
合成包被抗原氨基酸序列如下：
SEQ ID NO:1：
TILISIFSEIGHVKIEKIV-εK-PKPVLDRTIDYFQPNNKRNQL(序列1)；
SEQ ID NO:2：
TILISIFSEIGHVKIEKIV-εK-KYDQDYNIRITMYVQFREFNLKDPPLNPK(序列2)
其中，εK为赖氨酸的ε位氨基与第19位氨基酸的羧基形成肽键。
依据包被抗原序列以及合成规模准备合适的Fmoc修饰的氨基酸(购自上海吉尔生化)，加入相应的氨基酸试剂瓶中。同样按要求称量Rink Amide MBHA树脂，放入反应腔中，将上下盖子拧紧，贴标签，记录所合成肽的名称、批号、反应腔的皮重及所称树脂的重量。将反应腔装入合成仪。配制合成试剂，包括100％的N-甲基吡咯烷酮(NMP)、3％乙酰咪唑(AIM)、35％哌啶(PIP)、100％甲醇等放置到相对应的试剂瓶中。
2、合成仪状态检测
检查PSI300多肽合成仪是否正常运行。另外检查N2是否充足，系统表压是否正常。合成前应对仪器的性能有所了解，所以要对每种合成试剂的流速进行测定。分别运行A toRV、B to RV、C to RV、D to RV、E to RV、F to RV、A to AA、C to AA。进行测量或观察，若流量不合适，则调节下阀门压力或修改各溶液参数，直至达到要求。
3、合成肽抗原的合成开始
在合成仪的程序中按合成序列编辑Sequence，再编辑具体合成Program，最后把“Sequence”和“Program”组合成为一个“runfile”,保存。再在运行文件中打开，设定氨基酸瓶准备数量，开始运行。
4、合成肽抗原的合成
如上述的多肽序列，合成的时候是从C端开始至N端，依照给定的顺序，依次不断地重复如下合成步骤：
(1)脱保护反应：将上述氨基树脂置于含有体积百分比为15％～30％六氢吡啶的NMP溶液中，在20～28℃条件下反应25～40min脱除氨基树脂上的Fmoc保护基团；
(2)洗涤：氮气吹干，NMP洗涤氨基树脂；
(3)缩合反应：加入HOBT、DIC与Fmoc保护的氨基酸在20～28℃条件下反应0.5-2.5h；
(4)洗涤：氮气吹干，NMP洗涤氨基树脂；
(5)封闭反应：加入重量体积百分比为1.5％～4％的乙酰咪唑的NMP溶液，在20～28℃条件下反应20～40min。
5合成肽抗原合成结束
抗原合成结束后合成仪将自动停止。然后从多肽合成仪上取下反应器，再用100％甲醇洗涤多肽树脂3次，然后在通风橱内吹干，将多肽树脂转移至棕色瓶内，放入-20℃冰箱内，封口膜密封备用。
二、合成肽抗原的裂解及鉴定
1、合成肽抗原的裂解
按照体积比例(三氟乙酸(TFA)/三异丙基硅烷(TIS)/苯酚/H2O＝85/8/6/1)配制裂解液，然后从冰箱内取出合成的多肽树脂，放入圆底烧瓶内，在通风橱内向烧瓶内加入配制好的裂解液和磁搅拌子，然后稳定地放置在磁力搅拌器上，室温下持续搅拌1h直至反应完全。反应结束后，使用带冷阱的旋转蒸发仪持续蒸发30～120min除去粗产品中的TFA。接着使用乙醚收集、沉淀多肽，然后用二甲基甲酰胺(DMF)多次清洗多肽抗原的粗品，最后将混合在一起的树脂用砂芯漏斗过滤出来，即得到多肽抗原。
2、合成肽抗原的鉴定
多肽抗原合成完毕后用基质辅助激光解吸飞行时间质谱法(MALDL-TOF)和反相高压液相色谱法(RP-HPLC)进行定性定量分析。
三、合成肽抗原的纯化除菌
合成肽抗原使用循环式切向过滤膜包在20～28℃条件下进行超滤(TangentialFlow Device循环式切向过滤膜包以及与其配套的蠕动泵)，多肽抗原是大分子不能通过一定孔径的滤膜，而前期合成过程以及后期环化反应形成或引进的小分子杂质则可以通过滤膜。然后再通过孔径为0.2μm过滤器除菌，将最后得到的溶液分装到无菌塑料瓶内，分装后，储存于-20℃或-40℃备用。
四、包被抗原冷冻干燥
为了便于运输和长期保存的需要，将多肽抗原进行冷冻干燥以得到固体状态的多肽。将预先冻好的多肽抗原取出，在Labconco冷冻干燥机上进行干燥，得到固体状态的多肽抗原。
按照专利CN110981945B的方法制备大肠杆菌表达猪圆环2型Cap蛋白(序列表中序列3)，经BCA法定量后-20℃保存。具体方法如下所述：
1)猪圆环病毒2型重组Cap蛋白的诱导表达
序列4所示的优化后的重组Cap基因序列插入到pET-30a(+)的NdeⅠ和XhoⅠ酶识别位点之间，得到表达重组后的Cap蛋白的重组载体，将其命名为pET-CapR。
将表达质粒pET-CapR分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态，将1μL表达质粒加入100μL感受态中，轻轻震荡混匀后，冰浴30min，在42℃水浴锅中热激90s，继续冰浴3min，加入800μL无抗LB培养基，37℃，200rpm培养1h，6000rpm离心5min，弃750μL上清，用剩下的培养基重悬菌体后，均匀涂布于具有卡那抗性的LB平板上，37℃培养过夜。
挑取单菌落进行PCR鉴定，PCR扩增总反应体系25μl，其中含上游引物PCV2-F-1(CATATGAATGGCATCTTCAACACCCG，下划线部分为NdeⅠ酶切位点序列)1μl，下游引物PCV2-R-1(CTCGAGCTTAGGGTTAAGTGGGGG，下划线部分为XhoⅠ酶切位点序列)1μl，PCR酶MIX 12.5μl，无菌蒸馏水9.5μl，模板DNA 1μl。循环反应参数：94℃预变性3分钟；94℃变性45秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共32个循环；最后72℃延伸10分钟。
上述检测阳性的重组工程菌株单菌落37℃下200rpm过夜培养作为种子液，第二天将种子按照1:100的比例接种具有卡那抗性的LB培养基，37℃下200rpm培养2～3h，当菌液OD600达0.6～0.8时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，37℃继续诱导培养5h。
2)菌体收集及破碎
将菌体5000rpm离心10min，收集菌体，用PBS重悬菌体，将重组大肠杆菌进行10倍浓缩，即50mL菌液离心后用5mL PBS进行重悬，超声破碎细菌，超声破碎仪参数设置为：功率190W，工作5s，关闭10s，超声10min，保证菌体完全破碎。
3)包涵体的纯化
将上步超声后菌液以12000rpm低温离心10min，弃上清，用细胞刮子刮去上层灰色菌泥，再用包涵体洗涤液充分重悬包涵体，12000rpm低温离心10min，弃上清，再次刮去菌泥，获得初步纯化的包涵体；
包涵体洗涤液配方如下：0.5％Triton X-100，50mM Tris-HCl，300mM NaCl，pH调至8.0。
4)包涵体的变性及复性
将包涵体称重，并用溶解液以30mg/mL的比例溶解包涵体，过夜充分搅拌，使包涵体完全溶解。取2mL包涵体溶液，缓慢加入200mL复性液中，4℃搅拌复性48h，用浓缩杯浓缩至50mL。
包涵体溶解液配方如下：8M尿素，50mM Tris-HCl，100mM NaCl，10％甘油，10mMEDTA，pH调至8.0。
复性液配方如下：50mM Tris-HCl，400mM L-精氨酸，pH调至8.0。
5)复性液浓缩置换
向复性液中缓慢加入置换液至1L，4℃搅拌并浓缩至50mL，即可获得复性的Cap蛋白(序列表中序列3所示)。置换液配方如下：20mM Tris-HCL，50mM NaCl，pH调至8.0。
6)蛋白纯化
将缓冲液(0.3M NaCl，0.05M NaH2PO4·H2O，0.05M Na2HPO4·12H2O)以0.8ml/min的流速平衡层析柱(Hiload 16 600superdex 200g)，上样5ml经0.22um膜过滤的猪圆环病毒2型Cap蛋白，根据出峰情况，分管收集穿透液；Cap蛋白通过分子筛层析纯化后，蛋白基本都在峰3穿透流出，峰4中也有部分目的蛋白残留。
7)蛋白浓缩
使用3kDa浓缩管对通过分子筛过滤出峰的峰3和峰4混合液进行10倍浓缩，获得蛋白浓缩液。将分子筛纯化收集的目的蛋白进行SDS-PAGE检测纯度(图5)。可见纯化后蛋白较为纯净，浓缩后，蛋白纯度超过90％，浓度测定为222μg/ml。
实施例2、猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒的阴阳性血清制备
一、阳性血清及阴性血清制备方法如下：
1.阴阳性血清初制备
a.阴性血清制备：
免疫程序开始前先兔耳缘静脉采血3ml，将采集的血液4000rpm离心10min，吸取上清后于-20℃保存备用(豚鼠为心脏采血2ml，后处理方法相同)；
b.兔、豚鼠阳性血清制备
选取2只健康且未经免疫的雄性新西兰大白兔或豚鼠(豚鼠为雌性)，用猪圆环病毒2型病毒灭活病毒、大肠杆菌表达系统表达猪圆环病毒2型Cap蛋白、多肽组合物作为抗原免疫新西兰大白兔(或豚鼠)，免疫方案如下：
(1)第一次免疫：将纯化后猪圆环病毒2型病毒灭活病毒(毒株为CN109825480B中公开的猪圆环病毒2型ZM-PCV2-13株，按照CN 109825480 B实施例3所述的方法灭活，经蔗糖密度梯度离心纯化后的灭活抗原)、大肠杆菌表达系统表达猪圆环病毒2型Cap蛋白(序列表中序列3所示)、序列1所示的多肽、序列2所示的多肽以质量比为1:1:1:1比例混合均匀，使每种抗原含量均为0.1mg/ml)与等体积的弗式完全佐剂充分混合后乳化完全，于兔背部皮下多点注射1ml上述乳化液(豚鼠为腿部肌肉注射免疫，0.5ml/头)；
(2)第二次免疫：一免后第14天，将上述组合物(步骤(1)中所述的四种质量比为1:1:1:1的抗原)与等体积的弗式不完全佐剂混合后乳化完全，于兔背部皮下多点注射1ml上述乳化液；
(3)第三次免疫：二免后第14天，重复(2)操作；
(4)三免后第7天，采集血液并进行间接ELISA检测，若测定的血清中抗体效价满足条件，则不需要加强免疫，直接采血，收集血清备用；若不满足条件，则在继续加强免疫至合格效价。
2.多抗的纯化及鉴定
使用Protein G Sepharose亲和纯化层析柱对上述合格效价的兔血清或豚鼠血清纯化。将免疫后制备的血清与PBS缓冲液等量混合后缓慢上柱，待抗原抗体结合完全后，用甘氨酸洗脱缓冲液进行洗脱，收集纯化后的抗体。向收集的纯化抗体中加入适量PBS缓冲液，于4℃过夜透析，次日取出纯化后的抗体，即为多克隆抗体，分装后于-80℃保存备用。
通过SDS-PAGE分析(图1)，观察纯化抗体的纯度，利用BCA蛋白定量试剂盒，测定多克隆抗体浓度，利用间接免疫荧光法(IFA)测定多抗效果及效价，间接免疫荧光法(IFA)测定结果如图2和图3所示。
实施例3、包被抗原的筛选及特异性鉴定
一、包被抗原的筛选
将制备的抗原溶于pH 9.6的碳酸盐溶液，使其浓度为1mg/ml，然后用pH9.6的碳酸盐溶液将实施例1中的2种多肽抗原(序列1所示的多肽和序列2所示的多肽)、1种大肠杆菌表达Cap蛋白均进行适当稀释，使其质量比为1：1：1，混合后总蛋白含量为50μg/ml，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔100μl，即每孔含总蛋白5μg，同时设置多肽抗原组(质量比为1：1，总蛋白含量为50μg/ml)和大肠杆菌表达Cap蛋白对照组(仅包被上述蛋白，5μg/孔)和空白板，2～8℃下放置8～12小时，使抗原组合物与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有1％(g/ml)牛血清白蛋白(BSA)pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。
按照常规方法进行竞争ELISA检测，其中实施例2种兔多抗稀释度为1:5000，豚鼠多抗为1:3000，阳性血清组仅加入与稀释液1:1混合的阳性血清；酶标二抗：是以辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体(购自EARTH公司，货号E030120-02)或羊抗豚鼠IgG抗体(购自Sigma公司，货号A5545)以辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体作为原液进行1:30000稀释后制得，2瓶(12ml/瓶)羊抗豚鼠IgG抗体作为原液进行1:8000稀释后制得，2瓶(12ml/瓶)。灭活病毒为猪圆环病毒2型病毒(授权公告号为CN109825480 B所述的猪圆环病毒2型ZM-PCV2-13株)灭活后经蔗糖密度梯度离心纯化后的灭活抗原，蛋白测定浓度为80μg/ml，检测时使用PBS进行1:20倍稀释；大肠杆菌表达Cap蛋白为层析纯化的大肠杆菌表达系统表达猪圆环病毒2型Cap蛋白(见实施例1)，蛋白测定浓度为200μg/ml，检测时使用PBS进行1:200倍稀释；猪圆环病毒多抗抗原为自制多肽(见实施例1)，蛋白测定浓度为1mg/ml，检测时使用PBS进行1:300倍稀释；杆状病毒表达Cap蛋白为勃林格圆环疫苗(生产企业：勃林格殷格翰动物保健(美国)有限公司；货号3091494A)，检测时采用PBS进行10倍比稀释。检测结果如表1所示，结果表明，使用2种多肽抗原和1种大肠杆菌表达Cap蛋白混合包被效果远远优于单独包被上述抗原，三者结合产生了协同增效的作用，因此包被抗原选择上述3种抗原混合包被，且质量比为1:1:1。
表1.竞争ELISA方法不同包被抗原筛选试验
Figure BDA0003562940760000131
Figure BDA0003562940760000141
注：“－”表示未检测出蛋白浓度。
二、特异性鉴定
用建立好的两种方法分别检测猪圆环病毒2型病毒(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒毒(PRRSV)、猪肺炎支原体(Mhp)、猪圆环病毒1型(PCV1)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪口蹄疫病毒(FMDV)等病毒的反应性，结果表明，两种方法中只有PCV2的检测结果低于0.5，其余病毒结果均高于2.5，表明方法特异性良好，结果见下表2：
表2.竞争ELISA方法特异性检测结果
Figure BDA0003562940760000142
Figure BDA0003562940760000151
注：“－－”表示未检测出蛋白浓度。
实施例4、猪圆环病毒2型阳性血清为兔血清或豚鼠血清的2种竞争ELISA检测试剂盒的制备及使用方法
一、猪圆环病毒2型阳性血清为兔血清或豚鼠血清的2种竞争ELISA检测试剂盒的制备方法
猪圆环病毒2型合成肽ELISA抗体检测试剂盒包括：
(1)包被有猪圆环病毒2型抗原组合物的96孔可拆聚苯乙烯酶联反应板；2×96孔。
(2)标准品：猪圆环病毒2型纯化标准抗原为蔗糖密度梯度离心纯化后的灭活抗原(授权公告号为CN109825480 B所述的猪圆环病毒2型ZM-PCV2-13株灭活后经蔗糖密度梯度离心纯化后的灭活抗原)、层析纯化的猪圆环病毒2型纯化标准抗原为实施例1中制备的大肠杆菌表达猪圆环2型Cap蛋白(序列表中序列3)。
纯化猪圆环病毒2型灭活抗原和杆状病毒表达Cap蛋白SDS-PAGE图片如图4所示；
(3)猪圆环病毒2型阳性血清；实施例2制备的兔血清或豚鼠血清；
(4)阴性对照血清：是无特定病原体(SPF)兔血清或豚鼠血清，作为试剂盒的阴性对照血清(1管，1.5ml/管)。
(5)酶标二抗：是以辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体(购自EARTH公司，货号E030120-02)或羊抗豚鼠IgG抗体(购自Sigma公司，货号A5545)以辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体作为原液进行1:30000稀释后制得，2瓶(12ml/瓶)羊抗豚鼠IgG抗体作为原液进行1:8000稀释后制得，2瓶(12ml/瓶)。
(6)样品稀释液：为含有0.5％(g/100ml)酪蛋白的0.01mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，1瓶(24ml/瓶)。
(7)底物液A：为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液(1瓶，12ml/瓶)
(8)底物液B：为0.2mg/ml的四甲基联苯胺(TMB)溶液(1瓶，12ml/瓶)。
(9)终止液：2mol/L的硫酸溶液(1瓶，12ml/瓶)。
(10)20倍浓缩洗涤液：为含有浓度为0.8％～1.2％(ml/ml)的Tween-20的0.01M，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(50ml/瓶，2瓶)。
根据需要，试剂盒中还可以有血清稀释板(2块，96孔/块)，用于血清样品的稀释。
其中，包被有猪圆环病毒2型抗原的96孔可拆聚苯乙烯酶联反应板的制备方法为：
将制备的多肽抗原溶于pH 9.6的碳酸盐溶液，使其浓度为1mg/ml，然后用pH 9.6的碳酸盐溶液将上述序列1所述的多肽抗原、序列2所述的多肽、大肠杆菌表达Cap蛋白均进行适当稀释，使其质量比为1：1：1，混合后总蛋白含量为5μg，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔5μg蛋白，2～8℃下放置8～12小时，使抗原组合物与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有1％(g/ml)牛血清白蛋白(BSA)pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。
二、猪圆环病毒2型阳性血清为兔血清或豚鼠血清的2种竞争ELISA检测试剂盒的检测程序为：
1、平衡：将所有检测相关样品从冷藏环境中取出，置室温平衡30min备用；液体试剂用前混匀。
2、配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液；3、设定：2个阴性对照孔和2个阳性对照孔，其余为待测样本孔。
4、待测标本预稀释：使用样品稀释液将待检样品灭活猪圆环病毒2型抗原、表达猪圆环病毒2型Cap蛋白等进行合适的比例进行稀释后，按2倍比进行梯度稀释。
5、标准品的稀释：根据不同来源抗原，选择合适的标准品(即灭活抗原选择灭活抗原标准品，表达蛋白选择表达蛋白标准品)进行2倍比梯度稀释。
6、加样：各孔分别按预先设定加50μl阳性血清后再加入50μl按比例稀释的待测样本。加样过程时间跨度应尽量短。
7、温育：震荡混匀，置37℃温箱中，反应30min。
8、洗板：弃去反应液，每孔加300μl稀释后的洗涤缓冲液，浸泡15s，甩弃洗液，连续洗板4次后拍干。
9、加酶：各孔加100μl相应的辣根过氧化物酶标记IgG抗体(兔血清加入羊抗兔IgG抗体，豚鼠血清加入羊抗豚鼠IgG)。
10、温育：置37℃温箱，反应30min。
11、洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗涤缓冲液300μl，浸泡15s，甩弃洗涤液，连续洗板4次后拍干。
12、显色每孔加入100μl底物工作液(将底物液A和底物液B等量混合即为底物工作液，现用现配)，震荡混匀，置37℃温箱中，避光反应15min。
13、每孔加入显色终止液50μl，振荡混匀终止反应。
14、测定每孔的OD450nm值(加终止液的反应板应在15min内读取OD450nm值)。
检测结果的判定：
1、阴性血清对照OD450nm平均值应该≤0.15，否则无效。
2、阳性血清对照每个检测值应该在1.5～3.5之间，否则无效。
3、标准曲线的建立：以标准品OD450nm值为横坐标(X轴)，已标准品蛋白浓度为纵坐标(Y轴)，建立标准曲线，R2值应≥0.98.
4.待测样品浓度测定：将待测样品OD450nm值接近于1的两组数据代入标准曲线，计算原始浓度后取平均值即为待测样品浓度。
实施例5、两种检测方法灵敏度的测定
取蔗糖密度梯度离心后纯化灭活猪圆环病毒抗原(授权公告号为CN109825480B所述的猪圆环病毒2型ZM-PCV2-13株)、纯化后大肠杆菌表达猪圆环Cap蛋白(实施例1制备)及纯化后杆状病毒表达猪圆环Cap蛋白(勃林格圆环疫苗)分别验证上述两种方法的灵敏度(上述纯化抗原最初浓度采用BCA和SDS-PAGE进行标定后取平均值)，结果如下表3，两种方法检测不同来源猪圆环病毒2型抗原建立的标准曲线如图6所示：
表3.两种竞争ELISA方法敏感性检测
Figure BDA0003562940760000181
实施例6、两种方法在检测猪圆环病毒抗原半成品中的应用
用建立好的两种方法分别检测现有的猪圆环病毒2型灭活病毒疫苗生产各个过程样品和大肠杆菌表达Cap蛋白生产过程各个样品，结果如表4所示，表明两种方法在上述抗原生产中有良好的监测作用(大肠杆菌表达猪圆环2型Cap有2种，一种为上清表达，一种为实施例1种的包涵体表达方式)。
表4.竞争ELISA试剂盒在猪圆环病毒半成品检测中的应用
Figure BDA0003562940760000182
Figure BDA0003562940760000191
注：“－”表示未检测出蛋白浓度。
<110> 中牧实业股份有限公司
<120> 一种猪圆环病毒2型抗原组合物及其在抗原定量方法中的应用
<130> WHOI220015
<170> Patent-In 3.5
<160> 4
<210> 1
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
Thr Ile Leu Ile Ser Ile Phe Ser Glu Ile Gly His Val Lys Ile Glu
1 5 10 15
Lys Ile Val Lys Pro Lys Pro Val Leu Asp Arg Thr Ile Asp Tyr Phe
20 25 30
Gln Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu
35 40
<210> 2
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
Thr Ile Leu Ile Ser Ile Phe Ser Glu Ile Gly His Val Lys Ile Glu
1 5 10 15
Lys Ile Val Lys Lys Tyr Asp Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Ile Thr Met
20 25 30
Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro
35 40 45
Lys
<210> 3
<211> 193
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg Leu Ser Arg Thr Ile Gly Tyr Thr Val
1 5 10 15
Lys Lys Thr Thr Val Arg Thr Pro Ser Trp Asn Val Asp Met Met Arg
20 25 30
Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Leu
35 40 45
Thr Val Pro Phe Glu Tyr Tyr Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe
50 55 60
Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr Gln Asn Gly Arg Gly Val Gly Ser Thr
65 70 75 80
Ala Val Ile Leu Asp Ile Asn Phe Val Thr Lys Ala Asn Ala Leu Ile
85 90 95
Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro
100 105 110
Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Arg
115 120 125
Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu
130 135 140
Arg Leu Gln Thr Thr Gly Asn Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala
145 150 155 160
Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Ile Thr Met
165 170 175
Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro
180 185 190
Lys
<210> 4
<211> 579
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aatggcatct tcaacacccg cctctcccgc accatcggtt atactgtcaa gaaaaccaca 60
gtcagaacgc cctcctggaa tgtggacatg atgagattta atattaatga ttttcttccc 120
ccaggagggg gctcaaaccc cctcactgtg ccctttgaat actacagaat aaggaaggtt 180
aaggttgaat tctggccctg ctccccaatc acccagaatg gtaggggagt gggctccact 240
gctgttattc tagatattaa ctttgtaaca aaggccaatg ccctaatcta tgacccctat 300
gtaaactact cctcccgcca taccataacc cagcccttct cctaccactc ccggtacttt 360
accccgaaac ctgtccttga taggacaatc gattacttcc aacccaataa caaaagaaat 420
caactctggc tgagactaca aactactgga aatgtagacc atgtaggcct cggcactgcg 480
ttcgaaaaca gtatatacga ccaggactac aatatccgta taaccatgta tgtacaattc 540
agagaattta atcttaaaga ccccccactt aaccctaag 579

Claims (10)

1.猪圆环病毒2型抗原组合物，包括序列表中序列1所示的多肽和序列表中序列2所示的多肽。
2.根据权利要求1所示的猪圆环病毒2型抗原组合物，所述猪圆环病毒2型抗原组合物由猪圆环病毒2型Cap蛋白、序列表中序列1所示的多肽和序列表中序列2所示的多肽组成。
3.根据权利要求1所示的猪圆环病毒2型抗原组合物，所述猪圆环病毒2型Cap蛋白的序列为序列表中序列3所示。
4.根据权利要求1或2所述的猪圆环病毒2型抗原组合物，其特征在于，当所述组合物为序列1和序列2的多肽中的两种时，两种多肽的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选的，它们的质量比为1:1；当所述的抗原组合物为由猪圆环病毒2型Cap蛋白、序列表中序列1所示的多肽和序列表中序列2所示的多肽组成时，两种物质的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选的，它们的质量比为1:1:1。
优选的，其中序列1所示的多肽片段，自氨基端第18位氨基酸的羧基与第19位氨基酸的ε位氨基形成肽键连接；序列2所示的多肽片段，自氨基端第18位氨基酸的羧基与第19位氨基酸的ε位氨基形成肽键连接。
5.权利要求1所述的猪圆环病毒2型抗原组合物在制备准确定量猪圆环病毒2型抗原的竞争ELISA检测试剂盒中的应用。
6.一种准确定量猪圆环病毒2型抗原的竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含猪圆环病毒2型抗原组合物作为抗原包被的酶联反应板猪圆环病毒2型阳性血清、猪圆环病毒2型阴性血清、猪圆环病毒2型纯化标准抗原和酶标二抗；所述猪圆环病毒2型抗原表位组合物，为权利要求1-5中任意一项所述的猪圆环病毒2型抗原表位组合物。
7.根据权利要求6所述的竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述酶联反应板的制备方法是将权利要求1-5中任意一项所述的猪圆环病毒2型抗原表位组合物溶于100μl的pH9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔各5μg猪圆环病毒2型抗原表位组合物，2～8℃下放置8～12小时，使猪圆环病毒2型抗原表位组合物与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有0.01g/ml牛血清白蛋白pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。
8.根据权利要求6所述的竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述猪圆环病毒2型阳性血清为用猪圆环病毒2型病毒灭活病毒、猪圆环病毒2型Cap蛋白、序列表中序列1所述的多肽和序列表中序列2所示的多肽中的一种或几种免疫后采集的兔血清或豚鼠血清；所述猪圆环病毒2型阴性血清为SPF豚鼠血清或SPF兔血清。
9.根据权利要求6所述的竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述猪圆环病毒2型纯化标准抗原为蔗糖密度梯度离心纯化后的灭活抗原、或者层析纯化的大肠杆菌表达系统表达的猪圆环病毒2型Cap蛋白；
和/或，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体或羊抗豚鼠IgG抗体。
和/或，所述试剂盒还包括底物液A、底物液B和终止液，所述底物液A为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述底物液B为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液，使用时两者以1:1的比例混合；所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
和/或，所述试剂盒还包括样品稀释液和浓缩洗涤液；样品稀释液为含有0.005g/ml酪蛋白的0.01mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；浓缩洗涤液为含有体积百分浓度为0.8％～1.2％的Tween-20的0.01mol/L，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。
10.猪圆环病毒2型抗原表位多肽，为序列表中序列1所示的多肽或序列表中序列2所示的多肽。
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