CN108196065B - 猪圆环病毒3型elisa抗体检测试剂盒 - Google Patents

猪圆环病毒3型elisa抗体检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪圆环病毒3型ELISA抗体检测试剂盒。该试剂盒包括酶标板、阳性对照血清、阴性对照血清和酶标二抗，其中所述酶标板包被有猪圆环病毒3型抗原表位多肽组合物。该抗原表位多肽组合物为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽或序列表中序列3所示的多肽中的一种或两种以上的任意组合。本发明采用间接法ELISA，使用化学合成抗原肽包被酶标板，抗原用量少、灵敏性和特异性高，可以高效地检测是否存在猪圆环病毒3型抗体。本发明试剂盒敏感性高、特异性好、且操作便捷，具有良好的市场前景。

Description

猪圆环病毒3型ELISA抗体检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，更具体地，本发明涉及一种猪圆环病毒3型ELISA抗体检测试剂盒。
背景技术
猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是目前已发现的最小的动物病毒，是圆环病毒科圆环病毒属的重要成员之一。根据其抗原性、核苷酸序列及致病性，可将其分成两个基因型(genotype)：1型和2型，即PCV1和PCV2。其中PCV1无致病性，广泛存在于猪体内及猪源传代细胞系中，而PCV2则是目前对世界养猪业危害极大的病原体之一，给全球的养殖业带来了巨大的经济损失，可引发断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemicwasting syndrome，PMWS)、仔猪先天性震颤、猪皮炎肾病综合征、猪呼吸道综合征、母猪繁殖障碍和肠道疾病。
PCV成熟的病毒粒子由60个核衣壳蛋白质(Cap)亚基组装成一个直径为17～20nm的正二十面体的球形颗粒，病毒的基因组包裹其中，编码两个主要的开放阅读框(Openreading frame，ORFs)：cap和rep(复制相关酶)。Cap蛋白是其唯一的结构蛋白和主要抗原，能诱导机体产生有效的免疫保护反应。
2016年10月，美国Kansas州立大学和加州大学几乎同时报道一个新的PCV基因型，称为PCV3。该病毒从出现病症的母猪或仔猪中分离得到，同时检测PCV2为阴性，基因序列分析显示，PCV3基因组包括2000碱基，Cap蛋白由214个氨基酸残基组成，比PCV2Cap蛋白少19～20个氨基酸。
目前，我国已陆续有有关PCV3的报道，分别在广东、福建、河南、江西、重庆、安徽、湖北、辽宁等地利用PCR的检测方法检测到PCV3存在，因此研发操作简单、特异性好、敏感性高，可大规模推广的PCV3血清抗体检测试剂盒成为检测PCV3抗体的可靠途径之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测猪圆环病毒3型抗体的间接ELISA检测试剂盒，该试剂盒利用猪圆环病毒3型抗原表位多肽作为包被抗原，建立了一种特异性、敏感性和重复性好的间接ELISA方法，用于检测猪血清中是否含有猪圆环病毒3型抗体。
为了达到上述目的，本发明首先筛选得到了性能优异的猪圆环病毒3型抗原表位多肽组合物，本发明提供的猪圆环病毒3型抗原表位多肽组合物，为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽或序列表中序列3所示的多肽中的一种或两种以上的任意组合。当所述多肽组合物为序列1所示的多肽、序列2所示的多肽或序列3所示的多肽中的两种时，两种多肽的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选的，它们的质量比为1：1；当所述多肽组合物由序列1所示的多肽、序列2所示的多肽和序列3所示的多肽组成时，它们的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选的，它们的质量比为1：1：1。
其中，猪圆环病毒3型抗原表位多肽也是本发明的保护范围，所述猪圆环病毒3型抗原表位多肽为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2或序列表中序列3所示的多肽。
本发明的猪圆环病毒3型ELISA抗体检测试剂盒，包括酶联反应板、阳性对照血清、阴性对照血清和酶标二抗，其中所述酶联反应板包被有猪圆环病毒3型抗原表位多肽组合物。
所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板；所述猪圆环病毒3型抗原表位多肽组合物中的多肽均为化学人工合成得到。
所述酶联反应板的最佳制备方法及条件是将所述猪圆环病毒3型抗原表位多肽组合物溶于pH 9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔150ng多肽(其中序列表中序列1所示的多肽为50ng，序列表中序列2所示的多肽为50ng，序列表中序列3所示的多肽为50ng)，2～8℃下放置8～12小时，使多肽抗原与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有1％(g/ml)牛血清白蛋白(BSA)pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。
所述阳性对照血清为所述猪圆环病毒3型灭活病毒免疫后采集的猪血清；所述阴性对照血清为无特定病原体(SPF)的猪血清，即无猪圆环病毒的猪血清，包括如无猪圆环病毒的健康猪血清。
所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG抗体。
所述试剂盒还包括底物液A、底物液B和终止液，所述底物液A为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述底物液B为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液，使用时两者以1:1的比例混合。所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
所述试剂盒还包括样品稀释液和浓缩洗涤液(20倍)；样品稀释液为含有0.5％(g/ml)酪蛋白的0.01M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；浓缩洗涤液为含有浓度为0.8％～1.2％(ml/ml)的Tween-20的0.01M，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。
本发明试剂盒的检测程序为：
1、平衡：将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30min备用；液体试剂用前混匀。
2、配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液；
3、设定：2个阴性对照孔和2个阳性对照孔，其余为待测样本孔。
4、待测标本预稀释：使用样品稀释液将待检样品血清、阴性对照血清、阳性对照血清按照1：20的比例稀释。
5、加样：各孔分别按预先设定加100μl稀释的待测样本。加样过程时间跨度应尽量短。
6、温育：震荡混匀，置37℃温箱中，反应30min。
7、洗板：弃去反应液，每孔加300μl稀释后的洗涤缓冲液，浸泡15s，甩弃洗液，连续洗板4次后拍干。
8、加酶：各孔加100μl辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG抗体。
9、温育：置37℃温箱，反应30min。
10、洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗涤缓冲液300μl，浸泡15s，甩弃洗涤液，连续洗板4次后拍干。
11、显色每孔加入100μl底物工作液(将底物液A和底物液B等量混合即为底物工作液，现用现配)，震荡混匀，置37℃温箱中，避光反应15min。
12、每孔加入显色终止液50μl，振荡混匀终止反应。
13、测定每孔的OD450nm值(加终止液的反应板应在15min内读取OD450nm值)。
检测结果的判定：
1、阴性对照OD450nm平均值应该≤0.15，否则无效。
2、阳性对照每个检测值应该在1.0～2.5之间，否则无效。
3、临界值的计算：临界值＝0.18×阳性对照OD450nm值平均值。
待检血清测定OD450nm值≥临界值者判为阳性；待检血清测定OD450nm值<临界值者判为阴性。
本发明的上述试剂盒，可用于检测猪圆环病毒3型抗体，以判断被检动物是否存在感染后产生的猪圆环病毒3型抗体。
在制备检测是否感染猪圆环病毒3型病的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围；
本发明的积极效果在于：本发明采用生物信息学方法对猪圆环病毒3型Cap蛋白的抗原表位进行精确分析筛选出适合ELISA检测用的肽段。该肽段集中了抗原表位，具有灵敏性高、特异性强的优点。
同时，采用先进的固相合成肽技术合成多肽抗原用于包被酶标反应板的制备。
另外，由于试剂盒中使用的包被抗原是化学合成多肽，不含杂蛋白，纯度高，进一步提高了检测猪圆环病毒3型抗体的效率，以判断被检动物是否感染猪圆环病毒3型。
总之，本试剂盒采用化学合成猪圆环病毒3型Cap蛋白主要抗原位点的抗原肽包被酶联反应板，抗原用量少、灵敏度高、特异性强，可以有效地检测猪圆环病毒3型感染后产生的Cap蛋白抗体，以判断被检动物是否感染猪圆环病毒3型。实验结果表明，本发明的试剂盒重复性好，特异性强，灵敏度高。能满足不同层次人员的需要，具有广阔的市场前景和良好的经济、社会效益。
本发明所涉及的猪圆环病毒3型酶联免疫吸附试验诊断试剂盒用于检测动物是否感染猪圆环病毒3型，能够有效地对猪圆环病毒3型引起的疫病进行快速诊断。
具体实施方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、猪圆环病毒3型ELISA抗体检测试剂盒包被抗原的制备
本试验采用生物信息学方法对猪圆环病毒3型Cap蛋白的主要抗原表位进行精确分析，筛选出合适的肽段，用全自动多肽合成仪分别合成出三条肽，序列分别为序列表中序列1、序列2和序列3所示，制成纯度约80％的更新更全的包被抗原，能够覆盖猪圆环病毒3型的主要中和抗原表位，提高抗体阳性的检出率。多肽合成方法可为常规方法，本发明使用如下方法合成本发明的三条多肽，作为本发明试剂盒的包被原。
本发明的包被抗原可使用Applied Biosystem全自动多肽合成仪(型号433A)制备。运用Merrifield固相合成法，采用的是Fmoc(9-fluorenylmethyloxycarbonyl，9-芴甲氧羰基)修饰的氨基酸，使用Rink Amide MBHA树脂做为固相载体。生产过程包括多肽抗原固相合成、多肽裂解和鉴定、抗原纯化、冷冻干燥以及保存五部分。以下分别进行说明：
一、包被抗原固相合成
1、合成试剂的准备
合成包被抗原氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
SEQ ID NO:1：MRHRAIFRRRPRPRRRRRHRRRYARRRLF；
SEQ ID NO:2：LQDDPYAESSTRKVMTSKKKHSRYFT；
SEQ ID NO:3：EKTGMTDFYGTKEVWIRYKSVL。
依据包被抗原序列以及合成规模准备合适的Fmoc修饰的氨基酸(购自NOVA公司)，加入至相应的Cartridge中。同样按要求合成规模称树脂5g，放入反应腔，将上下盖子拧紧，贴标签，记录所合成肽的名称，批号，反应腔的TARE及所称树脂的重量。将反应腔装入合成仪。配制适量的合成试剂包括100％的NMP、3％的AIM(已酰咪唑)、35％的PIP(哌啶)、100％的MeOH(甲醇)等放置到相对应的试剂瓶中。
2、合成仪状态的检测
检查433A多肽合成仪器是否正常运行，开机后，运行Run Self Test程序，仪器自检各项指标是否正常。另外检查氮气是否充足，系统表压是否正常(433A正常表压10.2psi)。合成前应对仪器的性能有所了解，所以要对每种合成试剂的流速进行测定。433A合成仪：发送Flow Rate1-18到合成仪，选择Main Menu—Module Test—按Prer或next找Module A、ModuleD、ModuleI、ModuleI、Module A)—按Start—按more进行测量或观察，若流量不合适，则调节下阀门压力，直至达到要求(具体检测要求见下表1)。
表1.多肽合成仪流速检测标准表
试剂 瓶号 Module 标准范围
35％Piperidine 1 A 1.0～1.2ml
3％AIM 4 D 1.0～1.2ml
100％MeOH 9 I 3.5～4.0ml
DIC 8 I 0.45～0.55g
100％NMP 10 A 2.6～2.8ml
3、包被抗原合成开始
在433A合成仪的程序中将要合成的氨基酸序列发送Std Fmoc 1.0Sol DIC90到合成仪上。File-New-Sequence-编辑合成肽的序列，保存。File-New-Run，检查Chemistry是否为Std Fmoc 1.0Sol DIC 90；Sequence是否为所存名字；设定Cycles；保存。最后发送到合成仪上。
Main Menu—Cycle Monitor—begin，开始运行。
4、包被抗原合成进行
Fmoc基团的脱除，Fmoc基团的芴环系的吸电子作用使9-H具有酸性，易被较弱碱除去，反应时用哌啶(PIP)进攻9-H,β消除形成二苯芴烯，很容易被二级环胺进攻形成稳定的加成物。Fmov基团的脱除后暴露出“－NH2”基团以进行合成反应。然后加入活化的下一个Fmoc基团保护的氨基酸和1-羟基苯并三唑(1-hydroxybenzotriazole，HOBT)至反应器内。
如上述的多肽序列，合成的时候是从C端开始至N端，依照特定的顺序，依次不断地重复合成步骤(合成仪按程序自动完成，具体循环步骤如下表2)。期间观察记录试剂用量及运行情况。
表2.包被抗原合成循环步骤
Figure BDA0001538269870000071
5、包被抗原合成结束
包被抗原合成结束后合成仪将自动停止，并且肽树脂(肽现在还连接在树脂上)基本洗涤干净。然后从多肽合成仪上取下反应器，再用100％甲醇洗涤肽树脂3次后，在通风橱内吹干，然后将多肽树酯全部转移至棕色的聚乙烯瓶内，放入-20℃冰箱内，封口膜密封备用。
二、包被抗原的裂解及鉴定
1、多肽抗原的裂解
经上述反应所得到的多肽是与固相载体通过化学键结合在一起的，必须通过特定的有机强酸的酸解把多肽与固相载体分离。酸解的同时也除去了各个氨基酸官能团上的保护基。步骤如下：
从冰箱内取出合成的多肽树酯(指肽还连接在树脂上)，放入一只2L的圆底烧瓶内，在通风橱内向烧瓶中加入90ml三氟乙酸(Trifluoroacetic acid,TFA)、10ml的三丙基硅烷(TIS)和磁搅拌子，然后稳定地将烧瓶放置在磁力搅拌器上，室温下持续搅拌1h至反应完全。反应结束后，使用带冷阱的旋转蒸发仪持续蒸发30～120min除去粗产品中的TFA。然后用二甲基甲酰氨(DMF)多次清洗多肽抗原的粗品，最后将混合在一起的树脂用砂心漏斗过滤出来，既得到包被抗原。
2、包被抗原的鉴定
多肽抗原合成完毕后用基质辅助激光解吸飞试时间质谱法(MODAL-TOF)和反相高压液相色谱法(RP-HPLC)进行定性定量分析，用常见的氨基酸分析来鉴定所合成的肽。
3、包被抗原纯化
将环化后的多肽抗原使用循环式切向过滤膜包进行超滤(用PALL公司生产的Tangential Flow Device循环式切向过滤膜包以及与其配套的蠕动泵)，多肽抗原作为大分子不能通过一定孔径的滤膜，而前期合成过程以及后期环化反应形成或引进的小分子杂质则可以通过滤膜。然后再通过孔径为0.2μm过滤器除菌，将最后所得溶液分装到无菌塑料瓶内，贴上标签。标签上注明多肽的名称、编号、生产批号、浓度、生产日期、保存期限及保存条件，分装后，储存于-20℃或-40℃备用。
4、包被抗原冷冻干燥
为了便于长期保存和运输，需要将包被抗原进行冷冻干燥以得到固体状态的多肽。将预先冷冻好的包被抗原放置于Labconco的冷冻干燥机上进行干燥，得到固体状态的包被抗原。包装后贴上标签。标签上注明多肽的名称、编号、生产批号、浓度、生产日期、保存期限及保存条件。
实施例2、猪圆环病毒3型ELISA抗体检测试剂盒的制备
猪圆环病毒3型ELISA抗体检测试剂盒包括：
(1)包被有猪圆环病毒3型抗原的96孔可拆聚苯乙烯酶联反应板；2×96孔。
(2)阳性对照血清：是以猪圆环病毒3型病毒灭活病毒免疫后采集的猪血清，作为试剂盒的阳性对照血清(1管，1.5ml/管)。
(3)阴性对照血清：是无特定病原体(SPF)猪血清，作为试剂盒的阴性对照血清(1管，1.5ml/管)。
(4)酶标二抗：是以辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG(购自sigma公司，货号A5670)作为原液进行1:30000稀释后制得，2瓶(12ml/瓶)。
(5)样品稀释液：为含有0.5％(g/100ml)酪蛋白的0.01M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，1瓶(24ml/瓶)。
(6)底物液A：为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液(1瓶，12ml/瓶)
(7)底物液B：为0.2mg/ml的四甲基联苯胺(TMB)溶液(1瓶，12ml/瓶)。
(8)终止液：2mol/L的硫酸溶液(1瓶，12ml/瓶)。
(9)20倍浓缩洗涤液：为含有浓度为0.8％～1.2％(ml/ml)的Tween-20的0.01M，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(50ml/瓶，2瓶)。
根据需要，试剂盒中还可以有血清稀释板(2块，96孔/块)，用于血清样品的稀释。
其中，包被有猪圆环病毒3型抗原的96孔可拆聚苯乙烯酶联反应板的制备方法为：1.将实施例1制备的多肽抗原溶于pH 9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔150ng多肽(当以单肽作为包被抗原时，序列1所示的多肽、序列2所示的多肽或序列3所示的多肽分别为150ng；当以序列1所示的多肽、序列2所示的多肽和序列3所示的多肽混合作为包被抗原时，序列表中序列1所示的多肽为50ng，序列表中序列2所示的多肽为50ng，序列表中序列3所示的多肽为50ng，)，2～8℃下放置8～12小时，使多肽抗原与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有1％(g/ml)牛血清白蛋白(BSA)pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。
实施例3、猪圆环病毒3型ELISA抗体检测试剂盒的敏感性试验
一、猪圆环病毒3型ELISA抗体检测试剂盒的使用方法
1、平衡：将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30min备用；液体试剂用前混匀。
2、配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液；
3、设定：2个阴性对照孔和2个阳性对照孔，其余为待测样本孔。
4、待测标本预稀释：使用样品稀释液将待检样品血清、阴性对照血清、阳性对照血清按照1：20的比例稀释。
5、加样：各孔分别按预先设定加100μl稀释的待测样本。加样过程时间跨度应尽量短。
6、温育：震荡混匀，置37℃温箱中，反应30min。
7、洗板：弃去反应液，每孔加300μl稀释后的洗涤缓冲液，浸泡15s，甩弃洗液，连续洗板4次后拍干。
8、加酶：各孔加100μl辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG抗体。
9、温育：置37℃温箱，反应30min。
10、洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗涤缓冲液300μl，浸泡15s，甩弃洗涤液，连续洗板4次后拍干。
11、显色每孔加入100μl底物工作液(将底物液A和底物液B等量混合即为底物工作液，现用现配)，震荡混匀，置37℃温箱中，避光反应15min。
12、每孔加入显色终止液50μl，振荡混匀终止反应。
13、测定每孔的OD450nm值(加终止液的反应板应在15min内读取OD450nm值)。
检测结果的判定：
1、阴性对照OD450nm平均值应该≤0.15，否则无效。
2、阳性对照每个检测值应该在1.0～2.5之间，否则无效。
3、临界值的计算：临界值＝0.18×阳性对照OD450nm值平均值。
待检血清测定OD450nm值≥临界值者判为阳性；待检血清测定OD450nm值<临界值者判为阴性。
二、对已知阳性血清的敏感性试验
使用按照实施例2的方法制备的猪圆环病毒3型ELISA抗体检测试剂盒(分别以序列1所示的多肽、序列2所示的多肽、序列3所示的多肽或混合肽作为包被抗原)，分别依照上述猪圆环病毒3型ELISA抗体检测试剂盒使用方法对猪圆环病毒3型感染猪血清35份(具有PDNS和流产症状，病料经RT-PCR扩增PCV3-Cap蛋白鉴定为阳性的动物)进行敏感性试验，实验结果见表3，以序列1作为包被抗原的试剂盒对35份已知阳性血清的敏感性为85.7％，以序列2作为包被抗原的试剂盒对35份已知阳性血清的敏感性为71.4％，以序列3作为包被抗原的试剂盒对35份已知阳性血清的敏感性为80.0％，以混合3条肽作为包被抗原的试剂盒对35份已知阳性血清的敏感性为94.3％。
表3.猪圆环病毒3型ELISA抗体检测试剂盒的敏感性检测结果
试剂盒批号 检出率 敏感性
序列1单肽 30/35 85.7％
序列2单肽 25/35 71.4％
序列3单肽 28/35 80.0％
3条肽混合肽 33/35 94.3％
三、最低检测限量试验
选取猪圆环病毒3型抗体阳性的猪血清1份，进行倍比稀释1:20、1:40～1:320，使用实施例2制备的猪圆环病毒3型ELISA抗体检测试剂盒(分别以序列1所示的多肽、序列2所示的多肽、序列3所示的多肽或混合肽作为包被抗原)，依照上述猪圆环病毒3型ELISA抗体检测试剂盒使用方法对倍比稀释猪血清进行检测，结果表明，以序列1所示的多肽制备的试剂盒可以检测到1:160倍稀释的阳性血清，以序列2所示的多肽制备的试剂盒可以检测到1:40倍稀释的阳性血清，以序列3所示的多肽制备的试剂盒可以检测到1:160倍稀释的阳性血清，以混合肽制备的试剂盒可以检测到1:320倍稀释的阳性血清。表4中，阳性对照：是以猪圆环病毒3型病毒灭活病毒免疫后采集的猪血清，作为试剂盒的阳性对照血清(1管，1.5ml/管)。阴性对照：是无特定病原体(SPF)猪血清，作为试剂盒的阴性对照血清(1管，1.5ml/管)。临界值(Cut-off值)＝0.18×阳性对照OD450nm值平均值。
表4.猪圆环病毒3型ELISA抗体检测试剂盒的最低检测限量试验检测结果
Figure BDA0001538269870000111
Figure BDA0001538269870000121
实施例4、猪圆环病毒3型ELISA抗体检测试剂盒的特异性试验
使用实施例2中的试剂盒(分别以序列1所示的多肽、序列2所示的多肽、序列3所示的多肽或混合肽作为包被抗原)依照实施例3中所述的猪圆环病毒3型ELISA抗体检测试剂盒的使用方法对50份健康猪血清(中牧实业股份有限公司提供)、2份猪圆环病毒2型阳性血清(中牧实业股份有限公司提供)、2份猪口蹄疫病毒阳性血清(中牧实业股份有限公司提供)、2份猪瘟阳性血清(购自中国兽医药品监察所)、2份猪繁殖与呼吸综合征阳性血清(中牧实业股份有限公司提供)，分别进行检测。
试剂盒的特异性检测结果如下表(表5)显示，对50份健康猪血清的检测结果显示，以序列1所示多肽制备的试剂盒特异性为100.0％，以序列2所示多肽制备的试剂盒特异性为100.0％，以序列3所示多肽制备的试剂盒特异性为100.0％，以混合肽制备的试剂盒特异性为100.0％。对2份猪圆环2型阳性血清(PCV2)、2份猪口蹄疫阳性血清(FMDV)、2份猪瘟阳性血清(HC)、2份猪繁殖与呼吸综合征阳性血清(PRRS)的检测结果，所有试剂盒检测结果均为阴性，因此所有试剂盒对这8份相关病原阳性血清检测的特异性均为100％。
表5猪圆环病毒3型ELISA抗体检测试剂盒特异性检测结果
Figure BDA0001538269870000122
Figure BDA0001538269870000131
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
序列表
<110> 中牧实业股份有限公司
<120> 猪圆环病毒3型ELISA抗体检测试剂盒
<130> WHOI180001
<170> Patent-In 3.5
<160> 3
<210> 1
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
Met Arg His Arg Ala Ile Phe Arg Arg Arg Pro Arg Pro Arg Arg Arg
1 5 10 15
Arg Arg His Arg Arg Arg Tyr Ala Arg Arg Arg Leu Phe
20 25
<210> 2
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
Leu Gln Asp Asp Pro Tyr Ala Glu Ser Ser Thr Arg Lys Val Met Thr
1 5 10 15
Ser Lys Lys Lys His Ser Arg Tyr Phe Thr
20 25
<210> 3
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
Glu Lys Thr Gly Met Thr Asp Phe Tyr Gly Thr Lys Glu Val Trp Ile
1 5 10 15
Arg Tyr Lys Ser Val Leu
20

Claims (9)

1.一种猪圆环病毒3型Cap蛋白ELISA抗体检测试剂盒，包含猪圆环病毒3型Cap蛋白抗原表位多肽组合物作为抗原包被的酶联反应板、阳性对照血清、阴性对照血清和酶标二抗；所述猪圆环病毒3型Cap蛋白抗原表位多肽组合物，由序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示的多肽组成。
2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒3型Cap蛋白ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述序列1所示的多肽、序列2所示的多肽和序列3所示的多肽的质量比为(0.5~1.5)：(0.5~1.5)：(0.5~1.5)。
3.根据权利要求2所述的猪圆环病毒3型Cap蛋白ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述序列1所示的多肽、序列2所示的多肽和序列3所示的多肽的质量比为1：1：1。
4.根据权利要求3所述的猪圆环病毒3型Cap蛋白ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述酶联反应板的制备方法是将所述的猪圆环病毒3型Cap蛋白抗原表位多肽组合物溶于100μl的 pH 9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔150ng猪圆环病毒3型Cap蛋白抗原表位多肽组合物，2~8℃下放置8~12小时，使猪圆环病毒3型Cap蛋白抗原表位多肽组合物与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有0.01g/ml牛血清白蛋白pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2~3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。
5.根据权利要求3所述的猪圆环病毒3型Cap蛋白ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照血清为用猪圆环病毒3型病毒灭活病毒免疫后采集的猪血清。
6.根据权利要求3所述的猪圆环病毒3型Cap蛋白ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照血清为无猪圆环病毒的猪血清。
7.根据权利要求3所述的猪圆环病毒3型Cap蛋白ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG抗体。
8.根据权利要求3所述的猪圆环病毒3型Cap蛋白ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括底物液A、底物液B和终止液，所述底物液A为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述底物液B为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液，使用时两者以1:1的比例混合；所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
9.根据权利要求3所述的猪圆环病毒3型Cap蛋白ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样品稀释液和浓缩洗涤液；样品稀释液为含有0.5%酪蛋白的0.01mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；浓缩洗涤液为含有体积百分浓度为0.8％~1.2％的Tween-20的0.01mol/L，pH 值为7.4的磷酸盐缓冲液。
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猪圆环病毒3型检测及其Cap结构序列和抗原性预测分析;湛洋等;《畜牧兽医学报》;20171231;第48卷(第6期);摘要，1077页右栏，1078-1082页1.5-1.7、2.2、2.4节，表2，图4、6 *

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