CN109678935A - PCV3Cap蛋白抗原多肽、抗PCV3 Cap蛋白的多克隆抗体及其应用 - Google Patents

PCV3Cap蛋白抗原多肽、抗PCV3 Cap蛋白的多克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种PCV3 Cap蛋白抗原多肽、抗PCV3 Cap蛋白的多克隆抗体及其应用，所述PCV3 Cap蛋白抗原多肽序列为SEQ ID NO:1。PCV3 Cap蛋白多肽的设计及合成：根据GenBank上的PCV3 Cap蛋白序列获得PCV3 Cap蛋白序列，含有157个氨基酸；用DNAstar软件分析Cap蛋白特性，该蛋白的分子量为16871道尔顿，等电点为6.59，为酸性蛋白；用IEDB软件分析Cap蛋白免疫原性、亲疏水性及表面可及性，结果表明PCV3 Cap蛋白30aa‑45aa有16个氨基酸抗原性、亲水性及表面可及性较强；Cap抗原多肽筛选。

Description

PCV3Cap蛋白抗原多肽、抗PCV3 Cap蛋白的多克隆抗体及其 应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种PCV3 Cap蛋白抗原多肽、抗PCV3Cap蛋白的多克隆抗体及其应用。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是一种环形单链DNA病毒，属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)成员。PCV无囊膜，呈球状的二十面体对称结构，由衣壳蛋白(Cap)和基因组组成。Cap蛋白是PCV的唯一结构蛋白，与其免疫有关。PCV基因组大小约1.7kb，至少含11个开放阅读框。目前，在病毒分类上将无致病性的PCV命名为PCV1，而与断奶仔猪多系统衰竭综合征相关的PCV命名为PCV2。2015年美国学者从猪群中检测到一种能引起母猪皮炎肾病综合征与繁殖障碍的PCV3，随后在我国辽宁、江西、重庆和广东等地也发现有PCV3感染。PCV3是否与PCV2一样也是引起猪群免疫抑制性疾病的主要病原之一，尚有待进一步研究证实。PCV3 Cap蛋白与蝙蝠圆环病毒有35％的同源性，与PCV1和PCV2的同源性则更低。研究表明，PCV2和PCV3的Cap蛋白结构及抗原性存在明显差异，PCV2和PCV3间无交叉免疫保护特性。PCV3毒株与PCV2毒株的Cap蛋白同源性比对分析结果显示，二者间的同源性仅为34.0％，且在PCV2毒株Cap蛋白的抗原表位上二者无任何相似性，说明PCV3毒株和PCV2毒株的抗原交叉保护性比较极低，现有的PCV2疫苗无法为PCV3感染提供有效的免疫保护作用，已商品化的PCV2血清抗体ELISA检测试剂盒也无法对PCV3感染抗体滴度进行检测。因此，制备具有抑制Cap活性的抗体意义非常重大，不仅可以为该蛋白的功能研究奠定基础，同时为PCV3防控提供技术支持。
综上所述，现有技术存在的问题是：现有的PCV2疫苗无法为PCV3感染提供有效的免疫保护作用，已商品化的PCV2血清抗体ELISA检测试剂盒也无法对PCV3感染抗体滴度进行检测。
解决上述技术问题的难度和意义：对于PCV3血清抗体尚无商品化的检测试剂盒，因此制备具有抑制Cap活性的抗体意义非常重大，不仅可以为该蛋白的功能研究奠定基础，同时为PCV3防控提供技术支持。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种PCV3 Cap蛋白抗原多肽、抗PCV3Cap蛋白的多克隆抗体及其应用。
本发明是这样实现的，一种PCV3 Cap蛋白抗原多肽，所述PCV3 Cap蛋白抗原多肽序列为SEQ ID NO:1。
本发明的另一目的在于提供一种所述PCV3 Cap蛋白抗原多肽的制备方法，所述PCV3Cap蛋白抗原多肽的制备方法包括：
步骤一，PCV3 Cap蛋白多肽的设计及合成：根据GenBank上的PCV3 Cap蛋白序列获得PCV3 Cap蛋白序列，含有157个氨基酸；
步骤二，用DNAstar软件分析Cap蛋白特性，该蛋白的分子量为16871道尔顿，等电点为6.59，为酸性蛋白；
步骤三，用IEDB软件分析Cap蛋白免疫原性、亲疏水性及表面可及性，结果表明PCV3 Cap蛋白30aa-45aa有16个氨基酸抗原性、亲水性及表面可及性较强；
步骤四，Cap抗原多肽筛选。
本发明的另一目的在于提供一种包含所述PCV3Cap蛋白抗原多肽的多克隆抗体。
本发明的另一目的在于提供一种所述多克隆抗体的制备方法，所述多克隆抗体的制备方法包括：Cap抗原多肽与马来酰胺活化的匙孔血蓝载体蛋白KLH偶联，经脱盐纯化后作为免疫原与佐剂混合免疫BALB/c小鼠，进行三次以上免疫，待ELISA检测血清抗体效价达1：100000后，采集小鼠血清，经过纯化、ELISA和westernblot鉴定后，得到抗Cap的多克隆抗体。
本发明的另一目的在于提供一种所述PCV3 Cap蛋白抗原多肽在PCV3 Cap蛋白检测中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种所述PCV3 Cap蛋白抗原多肽在PCV3 Cap蛋白的多克隆抗体在ELISA检测中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种所述PCV3 Cap蛋白抗原多肽在western-blot检测中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种所述PCV3 Cap蛋白抗原多肽在免疫荧光检测中的应用。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明对PCV3 Cap蛋白氨基酸序列的二级结构、免疫原性、亲疏水性、表面可及性等进行分析，确定合适的一段胞內区肽序列进行人工合成；将合成的多肽与马来酰亚氨活化的载体KLH偶联，将此偶联产物进行脱盐柱纯化后免疫BALB/c小鼠；经过多次免疫的小鼠血清用ELISA法对抗体效价进行检测，效价达理想值后收集免疫小鼠血清，并用Protein G蛋白纯化柱纯化抗体；对纯化后抗体进行ELISA、Western bot等鉴定。鉴定结果表明该多克隆抗体可特异性识别PCV3 Cap蛋白。化学合成的多肽抗原是小分子，本身很难具有好的抗原性，只能诱导动物产生很弱的免疫反应，因而与载体蛋白交联是很重要的。载体蛋白含有很多抗原决定基，能够刺激T辅助细胞，进而诱导B细胞反应。用于与多肽交联的载体蛋白有多种，其中最普遍使用的载体是匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemacyanin，KLH)，牛血清白蛋白(bovine serumalbumin，BSA)，卵清蛋白(ovalbumin，OVA)和牛甲状腺球蛋白(bovine thyroglobulin，THY)。KLH具有更高的抗原性，与本发明的Cap抗原多肽交联后免疫原性最强，因此本发明选用KLH作为偶联载体蛋白。BSA也常用来作为多肽载体，但由于BSA经常被用做检测试验的阻断剂而使得该方法生产的抗体在应用上存在着一定的局限性。PCV3 Cap蛋白的多克隆抗体在ELISA、western-blot、免疫荧光等PCV3 Cap蛋白检测实验中的应用。
本发明将此纯化抗体用于进行PCV3的ELISA、Westernbot、免疫荧光染色等实验证明其能识别Cap蛋白。此Cap蛋白的多克隆抗体为进一步研究PCV3 Cap蛋白的功能奠定了基础。
附图说明
图1是本发明实施例提供的PCV3 Cap蛋白抗原多肽的制备方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
现有的PCV2疫苗无法为PCV3感染提供有效的免疫保护作用，已商品化的PCV2血清抗体ELISA检测试剂盒也无法对PCV3感染抗体滴度进行检测。本发明将此纯化抗体用于进行PCV3的ELISA、Westernbot、免疫荧光染色等实验证明其能识别Cap蛋白。此Cap蛋白的多克隆抗体为进一步研究PCV3 Cap蛋白的功能奠定了基础。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
本发明实施例提供的PCV3 Cap蛋白抗原多肽序列为：SLENHPDGFNFK(30aa-45aa，SEQ ID NO:1)。
如图1所示，本发明实施例提供的PCV3 Cap蛋白抗原多肽的制备方法包括以下步骤：
S101：PCV3 Cap蛋白多肽的设计及合成：根据GenBank上的PCV3 Cap蛋白序列(登录号：KY418606.1)获得PCV3 Cap蛋白序列，含有157个氨基酸；
S102：用DNAstar软件分析Cap蛋白特性，该蛋白的分子量为16871道尔顿，等电点为6.59，为酸性蛋白；
S103：用IEDB软件分析Cap蛋白免疫原性、亲疏水性及表面可及性，结果表明PCV3Cap蛋白30aa-45aa有16个氨基酸抗原性、亲水性及表面可及性较强；
S104：Cap抗原多肽筛选：经过上述分析，筛选多肽序列为：SLENHPDGFNFK。
抗Cap的多克隆抗体的制备方法包括：Cap抗原多肽与马来酰胺活化的匙孔血蓝载体蛋白KLH偶联，经脱盐纯化后作为免疫原与佐剂混合免疫BALB/c小鼠，期间进行三次以上免疫，待ELISA检测血清抗体效价达1：100000后，采集小鼠血清，经过纯化、ELISA和westernblot鉴定后，得到抗Cap的多克隆抗体。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。
实施例1制备PCV3 Cap蛋白抗原多肽
1.PCV3 Cap蛋白多肽的设计及合成：根据GenBank上的PCV3 Cap蛋白序列(登录号：KY418606.1)获得PCV3 Cap蛋白序列，含有157个氨基酸。
2.用DNAstar软件分析Cap蛋白特性，分析结果见表1，该蛋白的分子量为16871道尔顿，等电点为6.59，为酸性蛋白。
表1
分析项目(Analysis) 全蛋白(Whole Protein)
分子量(Molecular Weight) 25.44333kDa
长度(Length) 214aa
1microgram＝ 11.724pMoles
摩尔消光系数(Molar Extinction coefficient) 95770
1A(280)＝ 1.10mg/mL
等电点(Isoelectric Point) 10.907
电荷(Charge at pH 7) 28.067
3.用IEDB软件分析Cap蛋白免疫原性、亲疏水性及表面可及性，结果表明PCV3 Cap蛋白30aa-45aa有16个氨基酸抗原性、亲水性及表面可及性较强。
4.Cap抗原多肽筛选：经过上述分析，最终筛选多肽序列为：SLENHPDGFNFK(30aa-45aa，SEQ ID NO:1)。
实施例2Cap蛋白抗原多肽制备及与载体蛋白偶联
1.Cap蛋白抗原多肽：SLENHPDGFNFK由上海吉尔生化公司合成。多肽C端为一个半胱氨酸，便于与载体蛋白偶联。
2.多肽与载体蛋白偶联
a.用200μL超纯水稀释一管马来酰亚胺活化的mcKLH，稀释成10mg/mL的溶液。(注：上述溶液呈蓝白色半透明状，不得振荡或加热，否则会导致mcKLH沉淀。)
b.用相当于步骤a中溶液1.0～2.5倍体积的偶联缓冲液溶解含巯基的半抗原(即Cap蛋白抗原多肽)。例如：将2mg半抗原用200～500μL偶联缓冲液溶解，加入到mcKLH。如果多肽是易溶的，可以以固体加入到mcKLH悬液中。(注：如果半抗原不易溶，可以加入DMSO增加溶解。DMSO在偶联溶解液中浓度低于30％，否则载体蛋白易变性)。
c.立即混匀多肽、mcKLH溶液，然后在室温反应2h。
3.偶联产物纯化
通过凝胶层析脱盐柱来纯化偶联物。如果偶联物在一周以内注射，用PBS纯化。如果偶联物冻存，用纯化缓冲盐纯化，如果在偶联时形成沉淀，离心，收集上清，保留沉淀。仅纯化上清。将纯化的偶联物与沉淀结合。
a.溶解一瓶纯化缓冲盐，加入60mL脱气的超纯水，4℃保存。
b.拿去脱盐柱的顶和底的盖子，使存储液排出。一脱盐柱可纯化0.5mL样品。
c.用3～5倍柱体积(15～25mL)的纯化缓冲液冲洗柱子。
d.将0.5mL的多肽载体混合物直接加入柱中心。加入0.5mL的纯化缓冲液，在分离管中收集各峰。
e.在280nm下测定吸光度以确定哪部分含有偶联物。在第一个吸收峰检测出的将是半抗原偶联物。混合所有含偶联物的部分。
f.在含有偶联物的部分出现后，继续向柱内加入缓冲液，收集没有偶联的半抗原。
g.将偶联物过滤除菌，无菌保存在-80℃。
结果:考马斯亮兰法测得偶联后蛋白浓度和含量，每管250μg分装，-80℃保存。
实施例3抗Cap多肽BALB/c小鼠多克隆抗体制备及纯化
1.动物免疫
偶联产物免疫4～5周龄雄性BALB/c小鼠。弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂购自Sigma公司。
免疫程序见表2，先用PBS稀释100μg抗原，至0.3mL，用等体积佐剂混匀，旋涡振荡100min，检测乳化结果，取一滴抗原滴于水上，一分钟内不溶解扩散即可进行免疫。免疫前尾静脉取血，4℃静置后取血清，-80℃保存，作阴性对照血清。
表2具体免疫程序
抗体效价ELISA检测
(1)实验试剂
a.磷酸盐缓冲液(PBS)(10×浓缩)：氯化钠(NaCl)50g，氯化钾(KCl)1.25g，磷酸二氢钾(KH 2PO4)1.25g，磷酸氢二钠(Na2HPO 4·12H2O)18.1g，蒸馏水加至1000mL，用1M HCl调pH至7.2。
b.封闭液：正常牛血清10mL，1×PBS(不含吐温)90mL。
c.洗涤缓冲液：吐温20(Tween20)0.2mL，1×PBS 1000mL。
d.底物显色A液：醋酸钠(CH3COONa)13.6g，柠檬酸(C6H8O7·H2O)1.6g，双氧水(H2O230％)0.3mL，蒸馏水加至500mL。
e.底物显色B液：乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)0.2g，柠檬酸(C6H8O7·H2O)0.95g，甘油(C3H8O3)50mL，四甲基联苯胺(TMB)0.2g，蒸馏水加至500mL。
f.终止液(2M H2SO4)：取浓H2SO427.62mL，缓缓加入到473mL的蒸馏水中，混匀即可。
g.抗原包被液(0.1M碳酸盐缓冲液)：pH 9.6，碳酸钠(Na2CO3)1.59g，碳酸氢钠(NaHCO3)2.93g，叠氮钠(NaN3)0.2g，蒸馏水加至1000mL。
h.辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(北京康为试剂生物科技有限公司)。
(2)实验步骤
a.抗原包被：纯多肽抗原终浓度一般为4μg/mL，用包被液稀释后取100μL
加入聚苯乙烯酶联检测板各孔中，4℃过夜后，洗液洗涤3次。
b.封闭：每孔加200μL或加满封闭液，4℃过夜或37℃两小时后，洗涤3次，拍干。置4℃冰箱保存备用。
c.ELISA检测
①加待测样品：小鼠尾静脉采血后分离血清，用PBS倍比稀释，50～100μL/孔加样到包被好的酶标板中，同时，分别选取免疫前小鼠血清为阴性对照，37℃孵育60min，洗涤3次，拍干。
②加二抗：根据酶标二抗的效价选择稀释倍数，100μL/孔，37℃孵育60min，洗涤3次，拍干。
③显色：加入底物显色A、B液各50μL/孔，37℃显色15min。
④终止：加入终止液100μL/孔。
⑤读数：以450nm单波长测定各孔OD值，以与阴性对照孔OD值的比值(P/N)大于2.5为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点。
小鼠血清收集：
采用眼眶放血法，非抗凝小鼠全血收集后在37℃孵育2h。
2.抗体纯化
(1)饱和硫酸铵沉淀法
a.配制饱和硫酸铵溶液(SAS)：将767g(NH4)2SO4边搅拌边慢慢加到1L蒸馏水中。
用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0。此即饱和度为100％的硫酸铵溶液(4.1mol/L,25℃)。
b.沉淀
①样品(血清)20000×g离心30min，除去细胞碎片；
②保留上清液并测量体积；
③边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中，终浓度为1:1；
④将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜(4℃)，使蛋白质充分沉淀。
c.透析
①蛋白质溶液10000×g离心30min(4℃)。弃上清保留沉淀；
②将沉淀溶于少量(10～20mL)PBS-0.2g/L叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对PBS-0.2g/L叠氮钠透析24～48小时(4℃)，每隔3～6小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨；
③透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。
(2)蛋白G亲和纯化
所需试剂和特殊设备：1.0mol/L Tris(pH8.0)；100mmol/L Tris(pH8.0)；10mmol/L Tris(pH8.0)；50mmol/L甘氨酸(pH3.0)；柱状色谱仪。操作步骤：
a.加入1/10体积的1.0mol/L Tris(pH8.0)调含抗体样品(血清，组织培养上清液或腹水)的pH值至8.0。
b.将抗体溶液通过蛋白A或蛋白G微球柱。这些柱中，每毫升的湿微球能结合大约10～20mL抗体(1个蛋白A或蛋白G微球分子结合2分子抗体)。记录装柱微球的大约体积。因为微球柱的体积决定使用清洗和洗脱缓冲液的量。
c.用10倍柱体积的100mmol/L Tris(pH8.0)洗涤微球。
d.用10倍柱体积的10mmo1/L Tris(pH8.0)洗涤微球。
e.用50mmol/L甘氨酸(pH3.0)洗脱微球柱，每次加入约1/2柱体积的缓冲液，分次加入。用含1/10柱体积的1mol/L Tris(pH8.0)的试管收集洗脱液，将各管缓慢摇匀，使其pH值恢复至中性。
f.将含抗体的收集管混合，用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色测总蛋白。
结果：抗体纯化后经SDS-PAGE蛋白电泳鉴定，紫外分光光度计测定抗体
浓度为0.4mg/mL。纯化后抗体保存于-20℃，0.01M PBS缓冲液中，溶液中含有40％甘油和0.5％BSA。
实施例4：抗Cap的多克隆抗体的鉴定
1.抗Cap的多克隆抗体的ELISA鉴定
以合成的Cap多肽为检测抗原，包被酶标板，以1：2000稀释的未免疫小鼠兔血清作
为阴性对照，将小鼠血清及纯化后的抗体倍比稀释，应用ELISA方法检测，以与阴性血清的比值大于2.1判断为阳性，计算多抗效价。
结果，纯化的抗Cap抗体的效价达到1:128000(表3)。
表3抗Cap抗体效价(k＝1000)
2.抗Cap的多克隆抗体的Western Blot鉴定
收集感染了PCV3的PK15细胞，将其制成细胞裂解蛋白，用2×SDS裂解缓冲液裂解后上样，进行10％SDS-PAGE电泳，参照《分子克隆》中所述的免疫印迹方法，电转移条件为100V电泳1h，封闭液为含5％脱脂奶粉的TBST，一抗为本发明中的抗Cap的多克隆抗体(终浓度0.1μg/mL)，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体，通过ECL显色系统进行免疫印迹分析。
结果：本发明中的抗Cap的多克隆抗体可在PK15细胞裂解液中检测到25KD大小左右的蛋白条带，与PCV3 Cap蛋白分子量大小相符。
3.抗Cap的多克隆抗体的免疫荧光鉴定。
PCV3感染PK15细胞48h，4％多聚甲醛固定15min，滴加0.25％TritonX100，室温孵育10min，使细胞膜具有渗透性，以便抗体进入。PBS洗涤三次，含1％BSA的PBST室温封闭2h。PBS洗涤3次，然后用本发明中的抗Cap的多克隆抗体(PBST 1:500稀释)室温孵育1.5h。PBS洗涤3次，用FITC(绿色荧光)标记的羊抗鼠IgG(PBST 1:1000稀释)室温孵育1h。PBS洗涤后DAPI染色(蓝色)10min。PBS洗片后，荧光显微镜下观察。同时用正常小鼠血清作阴性对照。
结果：经本发明中的抗Cap的多克隆抗体染色的PK15细胞质中均观察到绿色荧光，证明本发明中的抗Cap抗体可识别PK15细胞中的Cap蛋白。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广西壮族自治区兽医研究所
<120> PCV3Cap蛋白抗原多肽、抗PCV3 Cap蛋白的多克隆抗体及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ser Leu Glu Asn His Pro Asp Gly Phe Asn Phe Lys
1 5 10

Claims (8)

1.一种PCV3 Cap蛋白抗原多肽，其特征在于，所述PCV3Cap蛋白抗原多肽序列为SEQ IDNO:1。
2.一种如权利要求1所述PCV3 Cap蛋白抗原多肽的制备方法，其特征在于，所述PCV3Cap蛋白抗原多肽的制备方法包括：
步骤一，PCV3 Cap蛋白多肽的设计及合成：根据GenBank上的PCV3 Cap蛋白序列获得PCV3 Cap蛋白序列，含有157个氨基酸；
步骤二，用DNAstar软件分析Cap蛋白特性，该蛋白的分子量为16871道尔顿，等电点为6.59，为酸性蛋白；
步骤三，用IEDB软件分析Cap蛋白免疫原性、亲疏水性及表面可及性，结果表明PCV3Cap蛋白30aa-45aa有16个氨基酸抗原性、亲水性及表面可及性较强；
步骤四，Cap抗原多肽筛选。
3.一种包含权利要求1所述PCV3 Cap蛋白抗原多肽的多克隆抗体。
4.一种如权利要求3所述多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述多克隆抗体的制备方法包括：Cap抗原多肽与马来酰胺活化的匙孔血蓝载体蛋白KLH偶联，经脱盐纯化后作为免疫原与佐剂混合免疫BALB/c小鼠，进行三次以上免疫，待ELISA检测血清抗体效价达1：100000后，采集小鼠血清，经过纯化、ELISA和western blot鉴定后，得到抗Cap的多克隆抗体。
5.一种如权利要求3所述PCV3 Cap蛋白抗原多肽在PCV3 Cap蛋白检测中的应用。
6.一种如权利要求3所述PCV3 Cap蛋白抗原多肽在PCV3 Cap蛋白的多克隆抗体在ELISA检测中的应用。
7.一种如权利要求3所述PCV3 Cap蛋白抗原多肽在western-blot检测中的应用。
8.一种如权利要求3所述PCV 3Cap蛋白抗原多肽在免疫荧光检测中的应用。
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