CN104744580B - 一种TgVP1胞外区抗原多肽、抗TgVP1的多克隆抗体及其应用 - Google Patents

一种TgVP1胞外区抗原多肽、抗TgVP1的多克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种弓形虫TgVP1胞外区抗原多肽、抗弓形虫TgVP1的多克隆抗体及其应用。该弓形虫TgVP1胞外区抗原多肽氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示或在其N端连接一个半胱氨酸。以该弓形虫TgVP1抗原多肽为免疫原免疫新西兰兔制备得到了抗弓形虫TgVP1的多克隆抗体，鉴定结果表明该多克隆抗体可特异性识别弓形虫TgVP1蛋白，可用于ELISA、Western blot、免疫荧光等试验中弓形虫TgVP1蛋白的检测，为该蛋白功能的基础研究及其作为潜在抗弓形虫病药物靶点的研究提供有力工具，应用前景广阔。

Description

一种TgVP1胞外区抗原多肽、抗TgVP1的多克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及一种TgVP1胞外区抗原多肽，抗TgVP1的多克隆抗体及其应用。
背景技术
V-H+-PPase是一种独特的质子泵,在多种动植物中都存在。它能够水解无机焦磷酸盐的磷酸酐键，并利用所释放的能量转运质子，产生跨膜的电化学梯度，发挥和质子泵ATP酶类似的作用。V-H+-PPase能使储存的能量高效转化为H+和/或电转膜梯度，用于多种不同的细胞内转运过程。V-PPases最早被发现存在于植物和光合细菌中，近期研究表明锥虫、利什曼原虫、弓形虫、恶性疟原虫也存在这种酶。值得关注的是，在这些寄生虫的动物宿主中均不存在这种酶类，因此V-PPases作为寄生虫病潜在的药物靶点具有重要的研究价值。弓形虫的V-PPases主要分布于酸性钙体及质膜，根据结构和功能的不同可分为两种类型，VP1和VP2。TgVP1需要K+激活其生物学活性。当弓形虫入侵细胞时，TgVP1组成圈状结构分布于弓形虫外缘，并随着弓形虫的侵入在虫体内迁移。当弓形虫完成侵袭过程时，TgVP1重新回到弓形虫的顶端。TgVP1含有17个跨膜域，N端具有信号肽序列，可以指导TgVP1进入弓形虫的分泌途径，但具体作用机制尚不明确。有研究表明弓形虫焦磷酸酶活性可抑制弓形虫在细胞内的复制。因此，TgVP1有作为潜在的弓形虫病临床诊断和治疗靶标的可能，制备TgVP1的抗体具有十分重要的意义，可以为该蛋白功能的研究奠定基础，同时为其作为疾病标志物的可行性提供实验数据支持。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能用于ELISA、western-blot、免疫荧光检测的抗弓形虫TgVP1蛋白的多克隆抗体。
本发明的目的在于提供一种弓形虫TgVP1胞外区抗原多肽。
本发明的另一目的是提供一种抗TgVP1的多克隆抗体。
本发明的又一目的是提供上述抗TgVP1的多克隆抗体的应用。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
一种弓形虫TgVP1胞外区抗原多肽，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或在SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列N端连接一个半胱氨酸。在N端加入半胱氨酸是为了便于与载体蛋白偶联。
一种抗TgVP1的多克隆抗体，是以前述TgVP1抗原多肽为免疫原，免疫动物制备而成。
上述抗TgVP1的多克隆抗体的制备方法，步骤如下：TgVP1抗原多肽与马来酰胺活化的匙孔血蓝载体蛋白KLH偶联，经脱盐纯化后作为免疫原与佐剂混合免疫新西兰兔，期间进行两次以上免疫，待ELISA检测血清抗体效价达1:100000后，采集兔血清，经过纯化、ELISA和western blot鉴定后，得到抗TgVP1的多克隆抗体。
化学合成的多肽抗原是小分子，本身很难具有好的抗原性，只能诱导动物产生很弱的免疫反应，因而与载体蛋白交联是很重要的。载体蛋白含有很多抗原决定基，能够刺激T辅助细胞，进而诱导B细胞反应。用于与多肽交联的载体蛋白有多种，其中最普遍使用的载体是匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemacyanin，KLH)，牛血清白蛋白(bovine serumalbumin，BSA)，卵清蛋白(ovalbumin，OVA)和牛甲状腺球蛋白(bovine thyroglobulin，THY)。KLH具有更高的抗原性，与本发明的TgVP1抗原多肽交联后免疫原性最强，因此本发明选用KLH作为偶联载体蛋白。BSA也常用来作为多肽载体，但由于BSA经常被用做检测试验的阻断剂而使得该方法生产的抗体在应用上存在着一定的局限性。
弓形虫TgVP1的多克隆抗体在ELISA、western-blot、免疫荧光等实验中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明对弓形虫TgVP1蛋白氨基酸序列的二级结构、免疫原性、亲疏水性、表面可及性、跨膜域等进行分析，确定合适的一段胞外区肽序列进行人工合成；将合成的多肽与马来酰亚氨活化的载体mcKLH偶联，将此偶联产物进行脱盐柱纯化后免疫新西兰兔；经过多次免疫的兔血清用ELISA法对抗体效价进行检测，效价达理想值后收集免疫兔血清，并用Protein G蛋白纯化柱纯化抗体；对纯化后抗体进行ELISA、Western bot等鉴定。鉴定结果表明该多克隆抗体可特异性识别弓形虫TgVP1蛋白。
本发明将此纯化抗体用于进行弓形虫的ELISA、Western bot、免疫荧光染色等实验证明其能识别天然的TgVP1蛋白。此TgVP1的多克隆抗体为进一步研究弓形虫TgVP1的功能奠定了基础，为验证其作为潜在抗弓形虫病药物靶点提供了有力的工具。
附图说明
图1.抗TgVP1的多克隆抗体经protein G凝胶柱纯化后的SDS-PAGE电泳(12％)检测结果。泳道1：蛋白Marker；泳道2：纯化后的抗TgVP1的多克隆抗体。
图2.抗TgVP1的多克隆抗体的western-blot鉴定结果。泳道1：上样为OFTu细胞裂解蛋白；泳道2：上样为弓形虫速殖子裂解蛋白；泳道M：蛋白Marker。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于解释本发明，而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明的技术方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动都将落入本发明的权利要求范围之内。
实施例1制备弓形虫TgVP1抗原多肽
1.弓形虫TgVP1多肽的设计及合成：根据GenBank上的弓形虫TgVP1序列(登录号：EPT25031.1)获得弓形虫TgVP1蛋白序列，含有816个氨基酸。
2.用DNAstar软件分析TgVP1蛋白特性，分析结果见表1，该蛋白的分子量为85296道尔顿，等电点为4.83，为酸性蛋白。
表1
分析项目(Analysis) 全蛋白(Whole Protein)
分子量(Molecular Weight) 85.296kDa
长度(Length) 816aa
1microgram＝ 11.724pMoles
摩尔消光系数(Molar Extinction coefficient) 95770
1A(280)＝ 1.10mg/mL
等电点(Isoelectric Point) 4.83
电荷(Charge at pH 7) -16.1
3.用TMHMM软件分析TgVP1蛋白的跨膜域，IEDB软件分析TgVP1蛋白免疫原性、亲疏水性及表面可及性，结果表明弓形虫TgVP1蛋白39-53aa有15个氨基酸抗原性、亲水性及表面可及性较强，该肽段位于TgVP1蛋白胞外区。
4.TgVP1胞外区抗原多肽筛选：经过上述分析，最终筛选多肽序列为：SSSPESEGDRFQVTA(39-53aa，SEQ ID NO:1)。
实施例2TgVP1抗原多肽制备及与载体蛋白偶联
1.多肽合成
为便于与载体蛋白偶联，在TgVP1胞外区抗原多肽N端增加一个半胱氨酸，即：CSSSPESEGDRFQVTA。多肽由上海吉尔生化公司合成。
2.多肽与载体蛋白偶联
a.用200μL超纯水稀释一管马来酰亚胺活化的mcKLH，稀释成10mg/mL的溶液。(注：上述溶液呈蓝白色半透明状，不得振荡或加热，否则会导致mcKLH沉淀。)
b.用相当于步骤a中溶液1.0～2.5倍体积的偶联缓冲液溶解含巯基的半抗原(即TgVP1抗原多肽)。例如：将2mg半抗原用200～500μL偶联缓冲液溶解，加入到mcKLH。如果多肽是易溶的，可以以固体加入到mcKLH悬液中。(注：如果半抗原不易溶，可以加入DMSO增加溶解。DMSO在偶联溶解液中浓度低于30％，否则载体蛋白易变性)。
c.立即混匀多肽、mcKLH溶液，然后在室温反应2h。
3.偶联产物纯化
通过凝胶层析脱盐柱来纯化偶联物。如果偶联物在一周以内注射，用PBS纯化。如果偶联物冻存，用纯化缓冲盐纯化，如果在偶联时形成沉淀，离心，收集上清，保留沉淀。仅纯化上清。将纯化的偶联物与沉淀结合。
a.溶解一瓶纯化缓冲盐，加入60mL脱气的超纯水，4℃保存。
b.拿去脱盐柱的顶和底的盖子，使存储液排出。一脱盐柱可纯化0.5mL样品。
c.用3～5倍柱体积(15～25mL)的纯化缓冲液冲洗柱子。
d.将0.5mL的多肽载体混合物直接加入柱中心。加入0.5mL的纯化缓冲液，在分离管中收集各峰。
e.在280nm下测定吸光度以确定哪部分含有偶联物。在第一个吸收峰检测出的将是半抗原偶联物。混合所有含偶联物的部分。
f.在含有偶联物的部分出现后，继续向柱内加入缓冲液，收集没有偶联的半抗原。
g.将偶联物过滤除菌，无菌保存在-80℃。
结果:考马斯亮兰法测得偶联后蛋白浓度和含量，每管250μg分装，-80℃保存。
实施例3抗TgVP1多肽兔多克隆抗体制备及纯化
1.动物免疫
偶联产物免疫两只新西兰雄兔，体重2～2.5kg。弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂购自Sigma公司。
免疫程序见表2，先用PBS稀释100μg抗原，至1.25mL，用等体积佐剂混匀，旋涡振荡100min，检测乳化结果，取一滴抗原滴于水上，一分钟不溶解扩散。免疫前耳静脉取血，4℃静置后取血清，-80℃保存，作阴性对照血清。
表2 具体免疫程序
抗体效价ELISA检测
(1)实验试剂
a.磷酸盐缓冲液(PBS)(10×浓缩)：氯化钠(NaCl)50g，氯化钾(KCl)1.25g，磷酸二氢钾(KH2PO4)1.25g，磷酸氢二钠(Na 2HPO4·12H2O)18.1g，蒸馏水加至1000mL，用1M HCl调pH至7.2。
b.封闭液：正常牛血清10mL，1×PBS(不含吐温)90mL。
c.洗涤缓冲液：吐温-20(Tween 20)0.2mL，1×PBS 1000mL。
d.底物显色A液：醋酸钠(CH3COONa)13.6g，柠檬酸(C6H8O7·H2O)1.6g，双氧水(H2O230％)0.3mL，蒸馏水加至500mL。
e.底物显色B液：乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)0.2g，柠檬酸(C6H8O7·H2O)0.95g，甘油(C3H8O3)50mL，四甲基联苯胺(TMB)0.2g，蒸馏水加至500mL。
f.终止液(2M H2SO4)：取浓H2SO427.62mL，缓缓加入到473mL的蒸馏水中，混匀即可。
g.抗原包被液(0.1M碳酸盐缓冲液)：pH 9.6，碳酸钠(Na2CO3)1.59g，碳酸氢钠(NaHCO3)2.93g，叠氮钠(NaN3)0.2g，蒸馏水加至1000mL。
h.辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(已商品化)。
(2)实验步骤
a.抗原包被：纯多肽抗原终浓度一般为1～2μg/mL，用包被液稀释后取100μL加入聚苯乙烯酶联检测板各孔中，4℃过夜后，洗液洗涤3次。建议4℃包被过夜。
b.封闭：每孔加200μL或加满封闭液，4℃过夜或37℃两小时后，洗涤3次，拍干。置4℃冰箱保存备用。
c.ELISA检测
①加待测样品：兔耳静脉采血后分离血清，用PBS倍比稀释，50～100μL/孔加样到包被好的酶标板中，同时，分别选取免疫前兔血清为阴性对照，37℃孵育30min，洗涤3次，拍干。
②加二抗：根据酶标二抗的效价选择稀释倍数，100μL/孔，37℃孵育30min，洗涤3次，拍干。
③显色：加入底物显色A、B液各80μL/孔，37℃显色15min。
④终止：加入终止液80μL/孔。
⑤读数：以450nm单波长测定各孔OD值，以与阴性对照孔OD值的比值(P/N)大于2.5为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点。
兔血清收集：
采用颈动脉放血法，非抗凝兔全血收集后在37℃孵育2h。
2.抗体纯化
(1)饱和硫酸铵沉淀法
a.配制饱和硫酸铵溶液(SAS)：将767g(NH4)2SO4边搅拌边慢慢加到1L蒸馏水中。用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0。此即饱和度为100％的硫酸铵溶液(4.1mol/L,25℃)。
b.沉淀
①样品(血清)20000×g离心30min，除去细胞碎片；
②保留上清液并测量体积；
③边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中，终浓度为1:1；
④将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜(4℃)，使蛋白质充分沉淀。
c.透析
①蛋白质溶液10000×g离心30min(4℃)。弃上清保留沉淀；
②将沉淀溶于少量(10～20mL)PBS-0.2g/L叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对PBS-0.2g/L叠氮钠透析24～48小时(4℃)，每隔3～6小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨；
③透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。
(2)蛋白G亲和纯化
所需试剂和特殊设备：1.0mol/L Tris(pH8.0)；100mmol/L Tris(pH8.0)；10mmol/L Tris(pH8.0)；50mmol/L甘氨酸(pH3.0)；柱状色谱仪。
操作步骤：
a.加入1/10体积的1.0mol/L Tris(pH8.0)调含抗体样品(血清，组织培养上清液或腹水)的pH值至8.0。
b.将抗体溶液通过蛋白A或蛋白G微球柱。这些柱中，每毫升的湿微球能结合大约10～20mL抗体(1个蛋白A或蛋白G微球分子结合2分子抗体)。记录装柱微球的大约体积。因为微球柱的体积决定使用清洗和洗脱缓冲液的量。
c.用10倍柱体积的100mmol/L Tris(pH8.0)洗涤微球。
d.用10倍柱体积的10mmo1/L Tris(pH8.0)洗涤微球。
e.用50mmol/L甘氨酸(pH3.0)洗脱微球柱，每次加入约1/2柱体积的缓冲液，分次加入。用含1/10柱体积的1mol/L Tris(pH8.0)的试管收集洗脱液，将各管缓慢摇匀，使其pH值恢复至中性。
f.将含抗体的收集管混合，用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色测总蛋白。
结果:抗体纯化后经SDS-PAGE蛋白电泳鉴定(图1)，紫外分光光度计测定抗体浓度为0.4mg/mL。纯化后抗体保存于-20℃，0.01M PBS缓冲液中，溶液中含有40％甘油和0.5％BSA。
实施例4：抗TgVP1的多克隆抗体的鉴定
1.抗TgVP1的多克隆抗体的ELISA鉴定
以合成的TgVP1多肽为检测抗原，包被酶标板，以1：2000稀释的未免疫兔血清作为阴性对照，将兔血清及纯化后的抗体倍比稀释，应用ELISA方法检测，以与阴性血清的比值大于2.1判段为阳性，计算单抗效价。
结果，纯化的抗TgVP1抗体的效价达到1:128000(表3)。
表3 抗TgVP1抗体效价(k＝1000)
稀释倍数 1:2k 1:4k 1:8k 1:16k 1:32k 1:64k 1:128k 1:256k 1:512k 阴性对照 PBS
OD值 2.119 1.788 1.604 1.562 0.940 0.654 0.331 0.245 0.172 0.139 0.055
2.抗TgVP1的多克隆抗体的Western-Blot鉴定
分别收集弓形虫速殖子和OFTu细胞，将其裂解后制成弓形虫裂解蛋白和OFTu裂解蛋白，用2×SDS裂解缓冲液裂解后上样，进行10％SDS-PAGE电泳，参照《分子克隆》中所述的免疫印迹方法，电转移条件为100V电泳1h，封闭液为含5％脱脂奶粉的TBST，一抗为本发明中的抗TgVP1的多克隆抗体(终浓度0.1μg/mL)，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体，通过ECL显色系统进行免疫印迹分析。
结果：本发明中的抗TgVP1的多克隆抗体可在弓形虫裂解蛋白中检测到85KD大小左右的蛋白条带，与弓形虫TgVP1蛋白分子量大小相符(图2)。
3.抗TgVP1的多克隆抗体的免疫荧光鉴定
制备弓形虫涂片，4％多聚甲醛固定15min，滴加0.25％TritonX100，室温孵育10min，使细胞膜具有渗透性，以便抗体进入。PBS洗涤三次，含1％BSA的PBST室温封闭2h。PBS洗涤3次，然后用本发明中的抗TgVP1的多克隆抗体(PBST 1:500稀释)室温孵育1.5h。PBS洗涤3次，用Alexa Fluor 546(红色荧光)标记的羊抗兔IgG(PBST 1:1000稀释)室温孵育1h。PBS洗涤后DAPI染色(蓝色)10min。PBS洗片后，荧光显微镜下观察。同时用正常兔血清作阴性对照。
结果：经本发明中的抗TgVP1的多克隆抗体染色的弓形虫细胞质中均观察到红色荧光，证明本发明中的抗TgVP1抗体可识别天然的TgVP1蛋白。

Claims (1)

1.一种弓形虫TgVP1胞外区抗原多肽，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列N端连接一个半胱氨酸。
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"Characterization of a novel organelle in Toxoplasma gondii with similar composition and function to the plant vacuole";Kildare Miranda et al.;《Mol Microbiol》;20100601;第76卷(第6期);1358-1375 *
弓形虫液泡型质子焦磷酸酶单克隆抗体的制备及其功能鉴定;佟澄碧等;《2013年全国寄生虫学与热带医学学术研讨会论文集》;20131110;66 *

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