CN102633864B

CN102633864B - 一种gpc3抗原多肽，抗gpc3的多克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN102633864B
Application number: CN 201210086010
Authority: CN
Inventors: 徐伟文; 陈立勇; 李明
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2012-03-28
Filing date: 2012-03-28
Publication date: 2013-12-25
Anticipated expiration: 2032-03-28
Also published as: CN102633864A

Abstract

本发明公开了一种GPC3抗原多肽，抗GPC3的多克隆抗体及其应用。该GPC3抗原多肽氨基酸序列如SEQIDNO:1所示或在其C端连接一个半胱氨酸。以该GPC3抗原多肽为免疫原免疫新西兰兔制备得到了抗GPC3的多克隆抗体，鉴定结果表明该多克隆抗体可特异性识别GPC3蛋白，可用于检测肝癌细胞表达的GPC3蛋白，为肝癌诊断提供帮助，并能指导其临床预后判断和治疗方案的选择，应用前景广阔。

Description

一种GPC3抗原多肽,抗GPC3的多克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及一种GPC3抗原多肽，抗GPC3的多克隆抗体及其应用。

背景技术

磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 (glypican-3, GPC3) 是膜性硫酸乙酰肝素多糖蛋白，在胎儿肝脏表达丰富，在成人肝脏不表达，于肝癌发生时常常再激活，是肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC）发生发展中的一个重要物质，它不但在肿瘤组织中特异性高表达，同时也可在外周血中被检测，其量的变化又与HCC病灶的存在与否、病情的严重程度密切关联（可反映手术前后的状态及治疗效果，较AFP敏感）。尤其是，GPC3在AFP阴性肝癌中特异性表达，联合检测AFP和GPC3，可显著提高HCC的诊断检测率和准确性，因此被认为是一种极具潜能的新颖肝癌标志物。免疫组化结果显示，在70％～80％的肝细胞癌中可以检测到GPC3过表达，而正常肝细胞、胆管细胞、血管内皮细胞及成纤维细胞均未见表达，癌旁组织不表达GPC3蛋白。阳性染色主要位于细胞质和细胞膜，呈细颗粒状。阳性细胞常簇集形成克隆样区域，和阴性细胞形态明显不同。假如癌旁组织中发现该蛋白表达，可能要考虑已有转移性卫星灶存在。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肝癌标志物GPC3抗原多肽。

本发明的另一目的是提供一种抗GPC3的多克隆抗体。

本发明的又一目的是提供上述抗GPC3的多克隆抗体的应用。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种GPC3抗原多肽，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列C端连接一个半胱氨酸。在C端加入半胱氨酸是为了便于与载体蛋白偶联。

一种抗GPC3的多克隆抗体，是以前述GPC3抗原多肽为免疫原，免疫动物制备而成。

上述抗GPC3的多克隆抗体的制备方法，步骤如下：GPC3抗原多肽与马来酰胺活化的匙孔血蓝载体蛋白KLH偶联，经脱盐纯化后作为免疫原与佐剂混合免疫新西兰兔，期间进行两次以上免疫，待ELISA检测血清抗体效价达1:8000后，采集兔血清，经过纯化、ELISA和western blot鉴定后，得到抗GPC3的多克隆抗体。

化学合成的多肽抗原是小分子，本身很难具有好的抗原性，只能诱导动物产生很弱的免疫反应，因而与载体蛋白交联是很重要的。载体蛋白含有很多抗原决定基，能够刺激T辅助细胞，进而诱导 B细胞反应。用于与多肽交联的载体蛋白有多种，其中最普遍使用的载体是匙孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemacyanin，KLH)，牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），卵清蛋白（ovalbumin，OVA）和牛甲状腺球蛋白（bovine thyroglobulin，THY)。KLH具有更高的抗原性，与本发明的GPC3抗原多肽交联后免疫原性最强，因此本发明选用KLH作为偶联载体蛋白。BSA也常用来作为多肽载体，但由于BSA经常被用做检测试验的阻断剂而使得该方法生产的抗体在应用上存在着一定的局限性。

GPC3的多克隆抗体在制备肝癌诊断试剂中的应用，所述肝癌为肝细胞性肝癌。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明对GPC3蛋白氨基酸序列的二级结构、免疫原性、亲疏水性、表面可及性等进行分析，确定合适的一段肽序列进行人工合成；将合成的多肽与马来酰亚氨活化的载体mcKLH偶联，将此偶联产物进行脱盐柱纯化后免疫新西兰兔；经过多次免疫的兔血清用ELISA法对抗体效价进行检测，效价达理想值后收集免疫兔血清，并用Protein G蛋白纯化柱纯化抗体；对纯化后抗体进行ELISA、western bot等鉴定。鉴定结果表明该多克隆抗体可特异性识别GPC3蛋白，可用于检测肝癌细胞表达的GPC3蛋白，为肝癌诊断提供帮助，并能指导其临床预后判断和治疗方案的选择。

附图说明

图1. 经DNAstar软件分析GPC3免疫原性、亲疏水性及表面可及性，方框中显示的是选用合成的多肽序列片段。

图2. 抗GPC3的多克隆抗体经protein G凝胶柱纯化后的SDS-PAGE电泳(12%)检测结果。泳道 1：蛋白Marker；泳道2：上样峰；泳道3：流穿峰；泳道4：平衡峰；泳道5：洗脱上峰；泳道6：洗脱下峰。

图3. 抗GPC3的多克隆抗体的western-blot鉴定结果，上样为HepG2细胞（人肝癌细胞系）裂解液。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于解释本发明，而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明的技术方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1 制备GPC3抗原多肽

1. GPC3多肽的设计及合成：根据GenBank上的GPC3序列（登录号：P51654）获得人GPC3蛋白序列，含有580个氨基酸。

2. 用DNAstar软件分析GPC3蛋白特性，分析结果见表2，该蛋白的分子量为65561.91道尔顿，等电点为6.18，为酸性蛋白。

表2

分析项目（Analysis）	全蛋白（Whole Protein）
		分子量（Molecular Weight）	65561.91 m.w
长度（Length）	580
		1 microgram=	15.253 pMoles
摩尔消光系数（Molar Extinction coefficient）	50520
		1 A(280)=	1.30 mg/mL
等电点（Isoelectric Point）	6.18
		电荷（Charge at pH 7）	-6.42

3. 用DNAstar软件分GPC3蛋白免疫原性、亲疏水性及表面可及性，结果表明人GPC3蛋白近C端有15个氨基酸抗原性、亲水性及表面可及性较强。

4. GPC3抗原多肽筛选：经过上述分析，最终筛选多肽序列为：VDDAPGNSQQATPKD（532aa-546aa，SEQ ID NO:1）。

实施例2 GPC3抗原多肽制备及与载体蛋白偶联

1. 多肽合成

为便于与载体蛋白偶联，在GPC3抗原多肽C端增加一个半胱氨酸，即：VDDAPGNSQQATPKDC。多肽由上海吉尔生化公司合成。

2. 多肽与载体蛋白偶联

a. 用200μL超纯水稀释一管马来酰亚胺活化的mcKLH，稀释成10 mg/mL的溶液。（注：上述溶液呈蓝白色半透明状，不得振荡或加热，否则会导致mcKLH沉淀。）

b. 用相当于步骤1中溶液1.0~2.5倍体积的偶联缓冲液溶解含巯基的半抗原（即GPC3抗原多肽）。例如：将2 mg半抗原用200~500μL偶联缓冲液溶解，加入到mcKLH。如果多肽是易溶的，可以以固体加入到mcKLH悬液中。（注：如果半抗原不易溶，可以加入DMSO增加溶解。DMSO在偶联溶解液中浓度低于30%，否则载体蛋白易变性）。

c.立即混匀多肽、mcKLH溶液，然后在室温反应2h。

3. 偶联产物纯化

通过凝胶层析脱盐柱来纯化偶联物。如果偶联物在一周以内注射，用PBS纯化。如果偶联物冻存，用纯化缓冲盐纯化，如果在偶联时形成沉淀，离心，收集上清，保留沉淀。仅纯化上清。将纯化的偶联物与沉淀结合。

a．溶解一瓶纯化缓冲盐，加入60mL 脱气的超纯水，4℃保存。

b．拿去脱盐柱的顶和底的盖子，使存储液排出。一脱盐柱可纯化0.5mL样品。

c．用3~5倍柱体积（15~25mL）的纯化缓冲液冲洗柱子。

d．将0.5mL的多肽载体混合物直接加入柱中心。加入0.5mL的纯化缓冲液，在分离管中收集各峰。

e．在280nm下测定吸光度以确定哪部分含有偶联物。在第一个吸收峰检测出的将是半抗原偶联物。混合所有含偶联物的部分。

f．在含有偶联物的部分出现后，继续向柱内加入缓冲液，收集没有偶联的半抗原。

g．将偶联物过滤除菌，无菌保存在-80℃。

结果: 考马斯亮兰法测得偶联后蛋白浓度和含量，每管250μg分装，-80℃保存。

实施例3 抗GPC3多肽兔多克隆抗体制备及纯化

1. 动物免疫

偶联产物免疫两只新西兰雄兔，体重2~2.5kg。偶联产物与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂购自Sigma公司。

免疫程序见表3，先用PBS稀释100μg抗原，至1.25mL，用等体积佐剂混匀，旋涡振荡100min，检测乳化结果，取一滴抗原滴于水上，一分钟不溶解扩散。免疫前耳静脉取血，4℃静置后取血清，-80℃保存，作阴性对照血清。

表3 具体免疫程序

免疫次数	天数	抗原剂量	免疫途径
				第一次	第1天	400μg+完全佐剂（共1 mL）	脊柱两侧皮下多点注射，6个点
第二次	第15天	200μg+不完全佐剂（共1 mL）	脊柱两侧皮下多点注射，6个点
					第22天	第一次ELISA检测	取血2 mL制备血清，ELISA检测
第三次	第29天	200μg+不完全佐剂（共1 mL）	脊柱两侧皮下多点注射，6个点
					第36天	第二次ELISA检测	取血2 mL制备血清，ELISA检测
第四次	第43天	200μg	静脉注射
					第48天	第三次ELISA检测	先检测，合格后（效价达1:8000及以上）大量放血

抗体效价ELISA检测

（1）实验试剂

a.磷酸盐缓冲液（PBS）（10×浓缩）：氯化钠（NaCl）50g，氯化钾（KCl）1.25g，磷酸二氢钾（KH₂PO₄）1.25g，磷酸氢二钠（Na₂HPO₄·12H₂O）18.1g，蒸馏水加至 1000mL，用1M HCl调pH至7.2。

b. 封闭液：正常牛血清 10mL，1×PBS（不含吐温）90mL。

c. 洗涤缓冲液：吐温-20（Tween 20）0.2mL，1×PBS 1000mL。

d. 底物显色A液：醋酸钠（CH₃COONa）13.6g，柠檬酸（C₆H₈O₇·H₂O）1.6g，双氧水（H₂O₂ 30%）0.3mL，蒸馏水加至500mL。

e．底物显色B液：乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na₂）0.2g，柠檬酸（C₆H₈O₇·H₂O）0.95g，甘油（C₃H₈O₃）50mL，四甲基联苯胺（TMB）0.2g，蒸馏水加至500mL。

f．终止液（2M H₂SO₄）：取浓H₂SO₄ 27.62mL，缓缓加入到473mL的蒸馏水中，混匀即可。

g．抗原包被液（0.1M碳酸盐缓冲液）：pH 9.6，碳酸钠（Na₂CO₃）1.59g，碳酸氢钠（NaHCO₃）2.93g，叠氮钠（NaN₃）0.2g，蒸馏水加至 1000mL。

h．辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG（已商品化）。

（2）实验步骤

a．抗原包被：纯多肽抗原终浓度一般为1~2μg/mL，用包被液稀释后取100μL加入聚苯乙烯酶联检测板各孔中，4℃过夜后，洗液洗涤3次。建议4℃包被过夜。

b．封闭：每孔加200μL或加满封闭液，4℃过夜或37℃两小时后，洗涤3次，拍干。置4℃冰箱保存备用。

c．ELISA检测

①加待测样品：兔耳静脉采血后分离血清，用PBS倍比稀释，50~100μL/孔加样到包被好的酶标板中，同时，分别选取免疫前兔血清为阴性对照，37℃孵育30min，洗涤3次，拍干。

②加二抗：根据酶标二抗的效价选择稀释倍数，100μL/孔，37℃孵育30min，洗涤3次，拍干。

③显色：加入底物显色A、B液各80μL/孔，37℃显色15min。

④终止：加入终止液80μL/孔。

⑤读数：以450nm单波长测定各孔OD值，以与阴性对照孔OD值的比值（P/N）大于2.5为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点。

兔血清收集：

采用颈动脉放血法，非抗凝兔全血收集后在37℃孵育2h。

2. 抗体纯化

（1）饱和硫酸铵沉淀法

a．配制饱和硫酸铵溶液（SAS）：将 767g (NH₄)₂SO₄边搅拌边慢慢加到 1L 蒸馏水中。用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0。此即饱和度为100%的硫酸铵溶液（4.1 mol/L, 25℃）。

b. 沉淀

① 样品（血清）20 000×g 离心30 min，除去细胞碎片；

② 保留上清液并测量体积；

③ 边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中，终浓度为1:1；

④ 将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜（4℃），使蛋白质充分沉淀。

c. 透析

① 蛋白质溶液 10 000×g 离心30 min（4℃）。弃上清保留沉淀；

② 将沉淀溶于少量（10~20mL）PBS-0.2g/L叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对PBS-0.2g /L叠氮钠透析24~48小时（4℃），每隔3~6小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨；

③ 透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。

（2）蛋白G亲和纯化

所需试剂和特殊设备：1.0mol/L Tris(pH8.0)；100mmol/L Tris(pH8.0)；10mmol/L Tris(pH8.0)；50mmol/L甘氨酸(pH3.0)；柱状色谱仪。

操作步骤：

a.加入1/10体积的1.0mol/L Tris(pH8.0) 调含抗体样品(血清，组织培养上清液或腹水)的pH值至8.0。

b.将抗体溶液通过蛋白A或蛋白G微球柱。这些柱中，每毫升的湿微球能结合大约10~20mL抗体(1个蛋白A或蛋白G微球分子结合2分子抗体)。记录装柱微球的大约体积。因为微球柱的体积决定使用清洗和洗脱缓冲液的量。

c.用10倍柱体积的100mmol/L Tris(pH8.0)洗涤微球。

d.用10倍柱体积的10mmo1/L Tris(pH8.0)洗涤微球。

e.用50mmol/L甘氨酸(pH3.0)洗脱微球柱，每次加入约1/2柱体积的缓冲液，分次加入。用含1/10柱体积的1mol/L Tris(pH8.0)的试管收集洗脱液，将各管缓慢摇匀，使其pH值恢复至中性。

f.将含抗体的收集管混合，用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色测总蛋白。

结果: 抗体纯化后经SDS-PAGE蛋白电泳鉴定（图2），紫外分光光度计测定抗体浓度为0.4mg/mL。纯化后抗体保存于-20℃，0.01M PBS缓冲液中，溶液中含有40%甘油和0.5%BSA。

实施例4：抗GPC3的多克隆抗体的鉴定

1. 抗GPC3的多克隆抗体的ELISA鉴定

以合成的GPC3多肽为检测抗原，包被酶标板，以1：2000稀释的未免疫兔血清作为阴性对照，将兔血清及纯化后的抗体倍比稀释，应用ELISA方法检测，以与阴性血清的比值大于2.1判段为阳性，计算单抗效价。

结果，纯化的抗GPC3抗体的效价达到1：8000（表4）。

表4 抗GPC3抗体效价

	GPC3
				稀释倍数	抗血清	蛋白G	空白对照
1:2000	2.452	2.056	0.077
				1:4000	2.005	1.525	0.056
1:8000	1.505	0.892
				1:1.6万	0.942	0.685
1:3.2万	0.608	0.355
				1:6.4万	0.364	0.175

2. 抗抗GPC3的多克隆抗体的Western-Blot鉴定

收集HepG2细胞1×10⁷个，将其裂解后，裂解液进行10% SDS-PAGE电泳，参照《分子克隆》中所述的免疫印迹方法，电转移条件为100 V电泳1 h，封闭液为含5%脱脂奶粉的TBST，一抗为本发明中的抗GPC3的多克隆抗体（终浓度0.1 μg/mL），二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体，通过ECL显色系统进行免疫印迹分析。

结果：本发明中的抗GPC3的多克隆抗体可在HepG2细胞裂解液中检测到66KD大小左右的蛋白条带，与人GPC3蛋白分子量大小相符（图3）。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方医科大学

<120> 一种GPC3抗原多肽，抗GPC3的多克隆抗体及其应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Val Asp Asp Ala Pro Gly Asn Ser Gln Gln Ala Thr Pro Lys Asp

1 5 10 15

Claims

1.一种GPC3抗原多肽，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列C端连接一个半胱氨酸。

2. 一种抗GPC3的多克隆抗体，其特征在于步骤如下：权利要求1所述GPC3抗原多肽与马来酰胺活化的匙孔血蓝载体蛋白KLH偶联，经脱盐纯化后作为免疫原与佐剂混合免疫新西兰兔，期间进行两次以上免疫，待ELISA检测血清抗体效价达1:8000后，采集兔血清，经过纯化、ELISA和western blot鉴定后，得到抗GPC3的多克隆抗体。

3. 权利要求2所述抗GPC3的多克隆抗体在制备肝癌诊断试剂中的应用。

4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述肝癌为肝细胞性肝癌。