ES2247633T3 - Metodos para determinar la presencia de la proteina del cerebro s-100 beta. - Google Patents

Metodos para determinar la presencia de la proteina del cerebro s-100 beta.

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ES2247633T3 ES97932092T ES97932092T ES2247633T3 ES 2247633 T3 ES2247633 T3 ES 2247633T3 ES 97932092 T ES97932092 T ES 97932092T ES 97932092 T ES97932092 T ES 97932092T ES 2247633 T3 ES2247633 T3 ES 2247633T3
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Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO DE ENSAYO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE LA PROTEINA CEREBRAL S-100 EN UNA MUESTRA CLINICA, EL CUAL EMPLEA ANTICUERPOS DIRIGIDOS CONTRA EPITOPOS INCLUIDOS EN LA REGION COMPRENDIDA ENTRE SER 1 Y ASN38 Y ENTRE YHR82 Y GLU93 DE LA SECUENCIA AMINOACIDA DE LA SUBUNIDAD BE DE LA PROTEINA S-100B HUMANA.

Description

Métodos para determinar la presencia de la proteína del cerebro S-100\beta.
La presente invención se refiere a métodos para el diagnóstico y seguimiento de pacientes con disfunción cerebral así como melanoma, determinando la presencia de la proteína del cerebro S-100. La invención también se refiere a anticuerpos monoclonales que se unen a péptidos que comprenden determinantes antigénicos útiles de S-100.
Como se sabe, el sistema nervioso contiene varias proteínas exclusivas de sus diversos elementos celulares. La alteración celular del tejido nervioso y células de origen neuronal, mediante algún proceso patogénico, trauma o por enfermedades neurológicas, da como resultado la liberación de proteínas citoplasmáticas endógenas solubles normales dentro del fluido extracelular cerebral y en última instancia en otros fluidos corporales incluyendo el fluido cerebroespinal (CSF) y la sangre (suero y plasma). Se pueden encontrar ejemplos de proteínas de pequeño peso molecular solubles representativas de este tipo, en la familia de proteínas S100. Un análisis de esta familia se puede encontrar en Zimmer et al., Brain Research Bulletin, Vol. 37, págs. 417- 429, 1995.
Tras la alteración de las membranas celulares, estas proteínas se liberan dentro del fluido extracelular conforme a un transcurso de tiempo y en cantidades relativas a la patogénesis del proceso de la enfermedad o de la extensión de los daños tisulares del cerebro. Las proteínas se difunden dentro del CSF y luego en la sangre o directamente dentro de la sangre. La alteración anteriormente mencionada de la membrana celular se refleja mediante los niveles plasmáticos o séricos sanguíneos de uno o más de estos antígenos y marcadores. Estos antígenos de proteína tienen la ventaja de ser estables y específicos, no sólo para el cerebro, sino para los componentes celulares en el cerebro. Siguiendo la liberación relativa de los diversos antígenos de proteína del sistema nervioso, es posible deducir la clase de proceso destructivo que ocurre en el transcurso de enfermedades neurológicas y/o la extensión de posibles daños tisulares del cerebro. La información de este tipo permite el diagnóstico, la evaluación de la gravedad y el ritmo de progresión de los daños y enfermedades anteriormente mencionados.
Ya se sabe determinar la cantidad de polipéptidos de S-100 en una muestra clínica. El documento USA-A-4654313 describe un método de análisis radioinmunológico para la proteína S-100. El documento de patente no menciona nada de diferentes clases de polipéptidos-S100 ni de los epítopos en que está basado el método de análisis. El límite de detección que se declara es 0,20 ng/ml pero se requieren concentraciones entre 1,5 y 2,5 ng/ml para tener menos de 10% de falsos positivos. Esta concentración es bastante alta. Además, en algunos países no se permite usar métodos radioactivos en análisis clínicos.
También se sabe determinar polipéptidos de S-100 usando métodos referidos a ELISA. El documento GB-A-2109931 describe un método de inmunoanálisis de fase sólida que comprende el uso de antígenos marcados-enzima y partículas recubiertas con proteína A sobre las que se unen los anticuerpos. Las proteínas S-100 sólo se mencionan en la reivindicación 8 y no se revela nada de la sensibilidad del método.
El documento JP-A-6/109737 describe un método apropiado para analizar polipéptidos de S-100 que usa un primer anticuerpo policlonal fijado a partículas magnéticas, y un segundo anticuerpo policlonal marcado. El método requiere dos enzimas diferentes, a saber peroxidasa de nabo y fosfatasa alcalina, y comprende al menos diez etapas consecutivas. El límite de detección mínimo que se indica es 0,02 ng/ml para fluido cerebroespinal y 0,06 ng/ml para cerebro de bovino.
La complejidad de las muestras clínicas es a menudo un serio problema. Un método de análisis puede dar excelentes resultados con muestras artificiales en el laboratorio pero se podrían obtener resultados poco fiables cuando se ensaya el método bajo condiciones clínicas. Cuando esto ocurre con análisis inmunológicos los problemas se causan a menudo por una selección inapropiada de determinantes antigénicos. Un anticuerpo en un análisis que comprende el uso de dos anticuerpos diferentes, puede ser un obstáculo para el otro anticuerpo cuando se une al antígeno a determinar. Una selección inapropiada del epítopo para un anticuerpo implicado en el proceso de detección puede dar como resultado que el grupo de detección quede completamente o parcialmente embebido en un complejo de proteína y no disponible para la detección. Las diferentes proteínas presentes en la muestra podrían interferir. Es más, un método que comprende muchas etapas consecutivas puede dar resultados inciertos para muestras clínicas complejas porque las posibilidades de interferencia aumentan con el número de etapas y componentes extra añadidos.
Hay siempre una necesidad de mejora de los métodos para analizar sustancias de interés médico en muestras clínicas. Un método de análisis clínico ideal debe ser rápido, exacto y capaz de llevarse a cabo con todo tipo de muestras clínicas sin degeneración de la exactitud para ciertos tipos de muestras. También debe requerir un mínimo de compo-
nentes extra. Esto se aplica a la determinación de polipéptidos de S-100 así como a otras sustancias de interés médico.
Compendio de la invención
Ahora ha resultado que usando anticuerpos dirigidos a epítopos en la región desde ser 1 a asn 38 y desde thr 82 a glu 93 de la secuencia de aminoácidos del polipéptido humano S-100\beta, se obtiene un método de análisis clínico mejorado para determinar polipéptidos de S-100 y particularmente la subunidad \beta o su isoforma. Por ende que el principal objeto de la presente invención sea un método de análisis que use anticuerpos monoclonales dirigidos a estos epítopos. Aún otro objeto de la presente invención se refiere a kits analíticos para realizar los métodos de análisis.
Descripción detallada de la invención
Como ya se mencionó anteriormente a menudo es muy difícil perfilar métodos para analizar muestras clínicas. Es necesario que el método tenga una alta sensibilidad y que de resultados exactos. También es muy importante que los constituyentes conocidos y desconocidos de la muestra, aparte del analito, no influyan en los resultados. La presente invención se refiere a un método de análisis inmunológico para determinar la presencia y/o contenido de polipéptido humano de S-100 basado en una selección de epítopos de S-100 apropiados y los correspondientes anticuerpos que cumplan los requerimientos anteriormente mencionados.
Ha resultado que las combinaciones de epítopo seleccionadas proporcionan ensayos y kits de ensayos donde:
1. se consigue una alta sensibilidad;
2. los anticuerpos del kit se unen igual de fuerte al patrón interno que al analito en la muestra clínica;
3. se eligen los epítopos de tal manera que los diferentes anticuerpos no interfieren entre ellos cuando se unen al analito, i.e. que los epítopos se sitúan suficientemente distantes entre ellos.
Los epítopos de la presente invención están todos comprendidos en el polipéptido humano S-100\beta. Se prefieren los epítopos presentes dentro de las secuencias de aminoácidos: SELEKAMVALIDVFHQYSGREGDKHKLKKSELKE
LINN SEQ. ID. NO. 2) y TACHEFFEHE (SEQ. ID. NO. 3). Son particularmente preferidos los epítopos comprendidos dentro del péptido AMVALIDVFHQYSGREGDKHKLKKSELKELINN (SEQ. ID. NO. 4) y especialmente dentro de los péptidos REGDKHKLKKSELKEL (SEQ. ID. NO. 5) y EFFEHE (SEQ. ID. NO. 6).
Los epítopos descritos, entre otros, se usan para construir péptidos para inducir la formación de anticuerpos apropiados sobre los que se basa el método de análisis reivindicado. Estos péptidos en su mayoría consisten en hasta 38 aminoácidos. Toda la secuencia de aminoácidos de un péptido útil en la presente invención procede del S-100\beta humano. Estos péptidos pueden comprender variantes en las que la secuencia original de aminoácidos se modifica o altera mediante inserción, adición, sustitución, inversión o eliminación que preferiblemente muestren al menos 90% de homología con la secuencia de SEQ. ID. NO. 2 y SEQ. ID. NO. 3 y mantengan esencialmente las mismas propiedades inmunológicas. Los péptidos pueden también comprender múltitud de ciertos epítopos y en este caso sus longitudes de secuencia pueden exceder los 38 aminoácidos.
Mediante la expresión "sub-fragmento" se quiere decir una secuencia de polipéptido que tiene una longitud de al menos 6 aminoácidos.
Los epítopos se pueden usar también para construir péptidos de fusión que comprenden al menos dos epítopos distintos que, entre todos, se pueden usar como patrón interno en los inmunoanálisis.
Abreviaturas
Se usan las siguientes abreviaturas:
S100
-S100\beta
RT
-Temperatura Ambiente
BSA
-Albúmina de Suero Bovino
Mab(s)
-Anticuerpo(s) monoclonal(es)
kD
-kiloDalton
ECL
-Análisis de Quimioluminiscecia Potenciado
CBB
-Azul de Coomassie
LIA
-Luminoinmunoanálisis
IRMA
-Inmunoradioanálisis
ELISA
-Enzimoinmunoanálisis
SDS-PAGE
-Dodecilsulfato sódico - Electroforesis en geles de poliacrilamida
PBS
-Fosfato Tamponado Salino
RLU
-Unidades de Luz Relativa
NHS
-N-HidroxiSuccinimida
EDC
-N-etil-N'-(dimetilaminopropil)-carbodiimida
RAMFc
-Anticuerpo de Anti - RatónFc de conejo
EDTA
-Ácido EtilenDiaminoTetraAcético
NaCl
-Cloruro Sódico
NaN_{3}
-Azida Sódica
iv.
-intravenosamente
aa.
- aminoácido
ng
-nanogramo
ml
-mililitro
mg
-miligramo
HRP
-Peroxidasa de nabo
h
-hora(s)
min
-minuto(s)
sec
-segundo(s)
Detalles experimentales comunes a todos los procedimientos de ensayo
Los péptidos se prepararon mediante los métodos descritos en Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc., vol. 85, p 2149; Gutte et al.(1971), J. Biol Chem vol. 246, p.1922; y Carpino et al. (1970), J Am Chem Soc vol. 92, p. 5748.
Los anticuerpos monoclonales se prepararon mediante el método según Köhler et al.(1975), Nature vol. 256, p. 495; y Harlow et al.(1988), Antibodies. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, p. 139.
Antígeno y preparaciones Patrón
El procedimiento para la preparación y purificación del antígeno de S100 anterior a la inmunización de ratones Balb/c fue según Moore (Biochim. Biophys. Res. Comm. 1965, 19:739-744) con una ligera modificación según Haglid & Stavrou (J. Neurochem. 1973, 20:1523-1532). Brevemente, se homogeneizó cerebro de bovino en tampón Tris, pH 7,2. El homogeneizado se centrifugó a 10.000 r.p.m. y el sobrenadante transparente se usó para purificación adicional mediante precipitación con sulfato de amonio. La fracción aún soluble tras saturación mediante sulfato de amonio se dializó y purificó mediante separación en una columna cromatográfica Sephadex G150 Sepharose (Pharmacia Biotech AB, Uppsala Suecia) seguido por separación en una columna DEAE-Sephadex (intercambio iónico) (Pharmacia Biotech AB, Uppsala Suecia). Se recogió la fracción eluida mediante NaCl 0,3 - 0,4 M, se desaló, se liofilizó y se usó para experimentos adicionales.
Construcción del hibridoma
Se inmunizaron intraperitonealmente ratones Balb/c con S100\beta\beta purificado en adyuvante completo de Freund y se dieron iv dosis de refuerzo 6 semanas más tarde durante 3 días consecutivos. Se retiró el bazo el cuarto día tras la última inyección y se preparó para la fusión. Se usó la línea celular de mieloma Sp2/0-Ag14 para la fusión de células del bazo de Balb/c.
Purificación del anticuerpo y determinación de la subclase
Los anticuerpos monoclonales se identificaron, se extrajeron y se purificaron a partir del sobrenadante de hibrodoma según Harlow & Lane Eds. en ANTIBODIES A LABORATORY MANUAL. Cold Spring Harbour Laboratory Press. Nueva York 298-299 & 311. Brevemente, los clones de hibridoma positivos que llevaban sobrenadante con los anticuerpos específicos se identificaron usando ELISA con pocillos de placas de microtitulación recubiertos con S100\beta\beta. Las inmunoglobulinas se precipitaron usando sulfato de amonio saturado y se dializaron a Glicina 1,5 M, NaCl 3 M, pH 8,9. El material dializado se purificó con cromatografía de afinidad en una columna de proteína-A Sepharosa (Pharmacia Biotech AB. Uppsala Suecia). Las fracciones se neutralizaron mediante la adición de pequeños volúmenes de Tris 1M, pH 8,0.
Mapeo del epítopo
Se investigaron epítopos de S100\beta (monómero) para el anticuerpo respectivo mediante el uso de una librería de péptido sintético. Los péptidos se enlazaron a membrana de filtro de nitro-celulosa vía un enlace amida, según el fabricante (Research Genetics, Estados Unidos) y cubre todos los noventa y un aminoácidos en la proteína. En total la librería consistió en treinta y uno, todos excepto uno que eran péptidos sintéticos de restos de diez aa. Cada péptido se movió consecutivamente tres aa hacia el extremo terminal -COOH de la proteína. La unión positiva de anticuerpo se indicó mediante el uso de un segundo anticuerpo anti-ratón conjugado con HRP y se detectó usando un análisis ECL (Amersham, Reino Unido).
Resultados
Se encontraron dos secuencias de unión:
Epítopo 1
AMVALIDVFQYSGREGDKHKLKKSELKELINN (restos 6-38) (SEQ. ID. NO. 4)
y
Epítopo 2
EFFEHE (restos Nº86-91) (SEQ. ID. NO. 6)
Reactividad del anticuerpo
Los anticuerpos purificados que reaccionaron con los epítopos se examinaron para ver la reactividad y la afinidad usando el sistema BIAcore^{TM} (Pharmacia Biosensor AB. Uppsala Suecia). Brevemente, para ensayar la especificidad de los anticuerpos, el RAMFc se inmovilizó en la superficie activada éster-NHS del chip del sensor CM5, según el procedimiento estándar, para proporcionar aproximadamente 600 RLU. Luego cada Mab se unió a la superficie del RAMFc para proporcionar aproximadamente 300 RLU, seguido por el S100\alpha\alpha y el S100 patrón (que consistía en S-100\alpha\beta al 50% y S100\beta\beta al 50%) en experimentos separados. Todas las reacciones se realizaron en flujo continuo del tampón fosfato. Las cinéticas entre anticuerpos y antígeno se hicieron similarmente. Se añadió antígeno de S100 a los chips a 200-450 nM para las medidas de reactividad del anticuerpo deseado para la fase sólida y a 1000-1500 nM para las medidas del anticuerpo deseado para trazadores. Las cinéticas se determinaron usando la aplicación BIAcore^{TM} Kinetic evaluation 2.1 (Pharmacia Biosensor AB. Uppsala. Suecia). Se puede concluir a partir del perfil de reactividad que los anticuerpos reactivos con los epítopos son específicos para las formas que contienen \beta de S100 y no para la forma que contiene \alpha.
Ejemplo 1 Desarrollo de un procedimiento inmunoluminométrico
Se conjugó anticuerpo trazador con luminol. Brevemente, se enlazó ABEI (Sigma. St Louis, Ms) con un éster diactivado (Bisetilenglicol-succimidil succinato, EGS). Luego se mezcló el conjugado ABEI-EGS con anticuerpo-antiS100 monoclonal en aproximadamente una relación molar 50:5 en 100 \mul de PBS pH 7,4, que contenían acetonitrilo al 15% y se incubaron 1 h a temperatura ambiente. Se purificó el anticuerpo conjugado-ABEI en una columna de filtración en gel Sephacryl®S 300 HR (Pharmacia Biotech AB, Uppsala Suecia), y se agruparon y diluyeron las fracciones apropiadas en tampón fosfato.
Preparación de tubos recubiertos de anticuerpo para LIA
Se incubaron tubos de poliestireno (Greiner, Alemania) durante la noche a temperatura ambiente con 3 \mug de anticuerpos-S100 en 300 \mul de PBS pH 7,5. Se lavaron los tubos con Tween20® al 0,1% en PBS. Luego, se bloquearon los tubos con una solución que contenía BSA al 0,9% y sacarosa al 4% y se incubaron durante 24 h. Se aspiró la solución y se dejaron secar los tubos.
Procedimiento de ensayo LIA
El ensayo se llevó a cabo en un procedimiento de dos etapas incubando 100 \mul de fluido del cuerpo del paciente en tubos recubiertos de anticuerpo, o patrón de S100 con 100 \mul de diluyente (PBS + BSA al 5%) y se incubaron a temperatura ambiente. Después de lavar se añadieron 200 \mul del anticuerpo marcado-luminol y se llevaron a cabo 2 h adicionales de incubación antes de la medida. Tras otro lavado se desarrolló la luminiscencia usando el kit de servicio iniciador LIA-mat (Byk-Sangtec. Diezenbach Alemania) e inmediatamente se midió como integrales a lo largo de 5 seg en luminómetro (Berthold, Alemania). Para convertir la señal de luz obtenida en concentración de S100 se compararon las medidas en muestras de paciente con las medidas en soluciones con concentraciones conocidas de S-100 (patrones). El límite de detección (cero estándar + 3 desviaciones estándar) fue aproximadamente
0,01 \mug/l.
Preparación de una curva Patrón
Se obtuvo proteína S100B a partir de Medisera, Lund. Suecia, y se diluyó en PBS + BSA al 5%. Las diluciones contenían: 0,10, 0,40, 2,00, 8,00 y 20,00 \mug/l, de una preparación de S100 que consistía en 50% de la forma \beta\beta y 50% de la forma \alpha\beta. Se usó PBS + BSA al 5% como estándar 0. Se realizaron tres medidas para cada dilución. Los resultados medidos así como los cálculos estadísticos se presentan en la tabla 1 de abajo:
TABLA 1
Concentración Cuentas Media Concentración Media
calculada
Estándar 0 1996 0 \mug/l
2024 0 \mug/l
2053 0,0019 \mug/l
2024 0 \mug/l
0,10 \mug/l 3142 0,135 \mug/l
2760 0,0647 \mug/l
2988 0,105 \mug/l
2963 0,10 \mug/l
0,40 \mug/l 5494 0,394 \mug/l
5620 0,405 \mug/l
5579 0,401
5564 0,40 \mug/l
2,00 \mug/l 21430 2,049 \mug/l
21028 1,988 \mug/l
20869 1,966 \mug/l
21109 2,00 \mug/l
8,00 \mug/l 68389 7,823 \mug/l
67013 7,677 \mug/l
74791 8,494 \mug/l
70064 8,00 \mug/l
20,00 \mug/l 175560 22,12 \mug/l
155141 18,54 \mug/l
161052 19,51 \mug/l
163918 20,00 \mug/l
El límite de detección más bajo se definió como tres determinaciones de estándar 0 más 3X el valor de desviación estándar. Para esta medida, se calculó que era 0,006 \mug/l.
Determinaciones clínicas de S100 en suero
Se determinó la concentración de S100 en suero de pacientes que recibieron cirugía de bypass de corazón y que estaban conectados a una máquina de pulmón-corazón. Los resultados se presentan en la tabla 2 de abajo:
TABLA 2
Paciente Cuantas Media Concentración Media
1 94698 10,61 \mug/l
98104 10,99 \mug/l
96401 10,80 \mug/l
2 1716 No detectado
1478 No detectado
1597 No detectado
TABLA 2 (continuación)
Paciente Cuantas Media Concentración Media
3 3762 0,23 \mug/l
3799 0,23 \mug/l
3780 0,23 \mug/l
4 13158 1,04 \mug/l
14183 1,15 \mug/l
13670 1,10 \mug/l
5 8788 0,66 \mug/l
8580 0,64 \mug/l
8684 0,65 \mug/l
6 10301 0,78 \mug/l
10100 0,77 \mug/l
10200 0,77 \mug/l
Ejemplo 2 Desarrollo de un procedimiento de ensayo ELISA
Se usó como anticuerpo trazador anticuerpo de antiS100 monoclonal conjugado con \beta-galactosidasa según Harlow & Lane Eds, en ANTIBODIES A LABORATORY MANUAL. Cold Spring Harbour Laboratory Press, Nueva York página 351.
Preparación de pocillos de microtitulación recubiertos de anticuerpo para ELISA
Se incubaron pocillos de placas de microtitulación (Corning, Dinamarca) durante la noche a +4ºC con 2,5 \mug de. Finalmente se lavaron los pocillos de microtitulación tres veces con Tween20® al 0,05% y se secaron al aire antes de usar.
Procedimiento de ensayo ELISA
Se llevó a cabo el ELISA en un procedimiento de incubación de etapa múltiple.
Se añadieron 100 \mul de muestra de paciente diluida al 1:1 ó 100 \mul de patrón de S100 (0 - 20 \mug/ml) a los pocillos.
Se incubó la placa durante 1,5 h a RT bajo agitación.
Se lavaron las placas tres veces con 300 \mul de Tween20® al 0,05% en PBS.
Se añadieron 100 \mul de anticuerpo trazador conjugado con fosfatasa alcalina y se llevó a cabo una 1,5 h adicional de incubación en un agitador.
Luego se lavaron los pocillos tres veces con Tween20® al 0,05% en PBS.
Se añadieron 100 \mul de una solución de sustrato de o-nitro-fenil-\beta-galactosidasa al 5% y se incubaron las placas con el sustrato durante otros cuarenta y cinco minutos y se desarrolló el color.
El desarrollo del color se paró mediante la adicción de 100 \mul de Na_{2}CO_{3} 0,66M. Se leyó cada pocillo de la placa a 405 nm en un lector de placa de microtitulación patrón. Para convertir la señal de color obtenida en concentración de S100, se compararon las medidas en las muestras de paciente con las medidas en soluciones con concentraciones conocidas de S100 (patrones). El límite de detección (cero estándar + 3 desviaciones estándar) fue aproximadamente 0,2 \mug/l.
Resultado
Patrón (\mug/l) 0 0,5 1,5 5 15
A 405 0,088 0,147 0,244 0,675 1,196
Ejemplo 3 Desarrollo de un procedimiento de ensayo inmunoradiométrico (IRMA) Conjugación del anticuerpo trazador IRMA
Se conjugó un anticuerpo de antiS100 monoclonal con Yodo usando el método de Cloramina T según Greenwood et al. (Biochem, J.1963. 89:114-123). Se determinó que la actividad específica era 520 \pm 80 MBq/mg.
Preparación del recubierto de anticuerpo para gotas de poliestireno
Se acoplaron anticuerpos de antiS100 monoclonales a gotas de poliestireno mediante el método de acoplamiento del Glutaraldehído según Harlow & Lane Eds. en ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL. Cold Spring Harbour Laboratory Press. Nueva York, 533 & 536-537. El bloqueo final fue mediante BSA al 1%, NaN_{3} al 0,1% en PBS pH 7,5.
Procedimiento de ensayo IRMA
Se añadieron 100 \mul de muestra de paciente o patrón a tubos de poliestireno junto con 100 \mul de diluyente PBS. Se añadió una gota de poliestireno recubierta a cada tubo seguido por incubación durante 1 h a RT en un agitador. Luego se lavaron las gotas una vez con 2 ml de agua desmineralizada y se añadieron 200 \mul de anticuerpo trazador marcado de I-125 y se incubaron los tubos unas 2 h adicionales en un agitador. Después de lavar se midió la señal radiactiva sobre la gota en un contador-\gamma estándar. Para convertir la señal radioactiva obtenida en concentración de S100, se compararon las medidas en las muestras de paciente con las medidas en soluciones con concentraciones conocidas de S100 (patrones). El límite de detección (cero estándar + 3 desviaciones estándar) fue aproximadamente 0,1 \mug/l.
Ejemplo 4 Uso del procedimiento de ensayo IRMA para análisis de S100 en suero de pacientes de melanoma
Se aplicó el procedimiento de ensayo basado en S100 en cuestiones clínicas relacionadas con melanoma. Se recogieron muestras de sangre de pacientes con melanoma de diversos estadios de progresión de cáncer en tubos colectores de suero. Luego se congelaron las muestras y se trataron según el procedimiento de ensayo descrito anteriormente en el Ejemplo 3.
Resultados Relación con la escala
Estadio Clínico I vs Estadio Clínico II. En un estudio de 577 pacientes se encontró que la media geométrica para el Estadio I era 0,12 \mug/l y para el Estadio II se encontró que la media geométrica era 0,33 \mug/l.
Valor-p < 0,001.
Ejemplo 5 Uso del procedimiento de ensayo IRMA para análisis de S100 en suero de pacientes de melanoma
Se aplicó el procedimiento de ensayo basado en S100 en cuestiones clínicas relacionadas con melanoma. Se recogieron muestras de sangre de pacientes con melanoma de diversos estadios de progresión de cáncer en tubos colectores de suero. Luego se congelaron las muestras y se trataron según el procedimiento de ensayo descrito anteriormente en el Ejemplo 3.
Resultados Relación con la supervivencia
Estadio Clínico I vs Estadio Clínico II y III. En un estudio con respecto a la supervivencia llevado a cabo en 643 pacientes se calculó el peligro relativo y el intervalo de confianza de 95%. Se encontró que el peligro relativo era 12,3 y el intervalo de confianza 5,6 - 27,2 con un valor-p < 0,001.
Ejemplo 6 Uso del método-LIA de S100 para evaluación de la influencia del equipo de circulación extra corporal sobre el cerebro
Se aplicó el procedimiento de ensayo basado en S100 en el Ejemplo 1 sobre el daño cerebral monitorizado que siguió a la circulación extra corpórea (ECC). Las muestras de sangre de pacientes que sufrieron circulación extra corpórea se recogieron en tubos de suero y se trataron según "Procedimiento de ensayo".
Resultados
Antes del comienzo Final de ECC 1 día después 2 días después
de ECC de la cirugía de la cirugía
Niveles de S100 \mug/l 0 1,67 0,21 0,13
En este grupo de pacientes el nivel de S100 en suero se elevó durante al menos 2 días después de la cirugía.
Los casos no complicados deben volver a niveles normales dentro de las primeras 24 h (Ref P. Jonson et al. J. Cardiothor. Vasc. Anaesthesia, 9:6 (1995) 694-99).
Ejemplo 7 Uso del procedimiento de ensayo LIA para análisis de S100 en suero de pacientes de melanoma
Se aplicó el procedimiento de ensayo basado en S100 en cuestiones clínicas relacionadas con melanoma. Se recogieron muestras de sangre de pacientes con melanoma de diversos estadios de progresión de cáncer y de donantes de sangre en tubos colectores de suero. Las muestras se congelaron y trataron según el procedimiento de ensayo descrito anteriormente en el Ejemplo 1.
Resultado: De 136 pacientes con diversos estadios de melanoma 25 tuvieron un nivel de S100 por debajo de 0,08 y de 100 donantes de sangre ensayados en la misma ocasión 7 tuvieron un nivel igual a o superior a 0,08 \mug/l.
Ejemplo 8
Se investigaron la fiabilidad del ensayo y del marcador de polipéptido S100\beta per se cuando se diagnosticó el melanoma. En 252 pacientes con melanoma, el suero se derritió antes de que se comenzara el tratamiento y se llevó a cabo la determinación del nivel de polipéptido S100\beta mediante el método de análisis descrito en el ejemplo 1. Cuando se usó un valor de corte de 0,16 \mug/l, el tiempo de supervivencia medio de pacientes que tenían una concentración de S100\beta superior al valor de corte fue 7 meses, mientras que el tiempo de supervivencia medio fue más que 12 meses para pacientes que tenían una concentración de S100\beta por debajo del valor de corte.
En un paciente diagnosticado con melanoma maligno considerado sin evidencia de la enfermedad y monitorizado mediante el método de análisis inmunoradiométrico como se describe en el ejemplo 3, se encontraron niveles elevados de S100\beta que se registraron 2 meses antes a la aparición de metástasis de piel y 6 meses antes de la metástasis en órganos.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: AB Sangtec Medical
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: P.O. Box 20045
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Bromma
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Suecia
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): 16102
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
TELÉFONO: +46 8 635 12 00
\vskip0.500000\baselineskip
(H)
TELEFAX: +46 8 29 21 81
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Métodos para determinar antígenos de cerebro.
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 8
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA DE LECTURA DEL ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
APLICACIÓN: PatentIn Release # 1.0, Versión #1 30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 91 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Homo sapiens 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
1
2 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 38 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: extremo-N
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Homo sapiens 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Glu Leu Glu Lys Ala Met Val Ala Leu Ile Asp Val Phe His Gln}
\sac{Tyr Ser Gly Arg Glu Gly Asp Lys His Lys Leu Lys Lys Ser Glu Leu}
\sac{Lys Glu Leu Ile Asn Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Homo sapiens 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Ala Cys His Glu Phe Phe Glu His Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Homo sapiens 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Met Val Ala Leu Ile Asp Val Phe His Gln Tyr Ser Gly Arg Glu}
\sac{Gly Asp Lys His Lys Leu Lys Lys Ser Glu Leu Lys Glu Leu Ile Asn}
\sac{Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Homo sapiens 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Glu Gly Asp Lys His Lys Leu Lys Lys Ser Glu Leu Lys Glu Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Homo sapiens 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Phe Phe Glu His Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Homo sapiens 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Lys His Lys Leu Lys Lys Ser Glu Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Homo sapiens 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Leu Lys Lys Ser Glu Leu Lys Glu Leu}

Claims (8)

1. Un anticuerpo monoclonal o un fragmento de tal anticuerpo que se une específicamente a S100-beta y a cualquiera de las secuencias de aminoácidos SEQ. ID. NO. 2, 3, 5, 6, 7 u 8.
2. El uso de un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos como se describe en SEQ. ID. NO. 2, 3, 5, 6, 7 u 8, en métodos de análisis inmunológicos in vitro.
3. Un método para determinar la presencia de polipéptido S-100 beta humano en una muestra que comprende las etapas de:
permitir a la muestra que se analiza reaccionar inmunológicamente con un primer anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, siendo dicho primer anticuerpo acoplado a un vehículo;
permitir a la muestra reaccionar inmunológicamente con un segundo anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, que es diferente de dicho primer anticuerpo, estando dicho segundo anticuerpo monoclonal provisto de medios de detección;
lavar y
detectar la cantidad de polipéptido S-100 beta en la muestra.
4. Un método según la reivindicación 3 caracterizado porque el medio de detección es un grupo que tiene la capacidad de emitir luminiscencia.
5. Un método según la reivindicación 3 ó 4, caracterizado porque el vehículo es una partícula magnética.
6. Un kit para determinar la presencia de polipéptido S-100\beta en una muestra, que comprende un anticuerpo según la reivindicación 1.
7. Un kit según la reivindicación 6 que comprende un primer anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 y un segundo anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, que es diferente de dicho primer anticuerpo monoclonal, estando dicho primer anticuerpo monoclonal acoplado a un vehículo y estando dicho segundo anticuerpo monoclonal provisto de un medio de detección.
8. Un kit según la reivindicación 6 ó 7, en el que dicho vehículo es una partícula magnética y dicho medio de detección es un grupo que tiene la capacidad de emitir luminiscencia, tal como luminol.
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