JPH05501204A

JPH05501204A - 糸球体腎炎の診断

Info

Publication number: JPH05501204A
Application number: JP2515868A
Authority: JP
Inventors: アーナアウト，エム・アミン; マクラスキー，ロバート・ティー; ナイルズ，ジョン・エル
Original assignee: ザ・ゼネラル・ホスピタル・コーポレーション
Priority date: 1989-10-27
Filing date: 1990-10-29
Publication date: 1993-03-11
Also published as: CA2071530A1; EP0497897A1; US5091303A; EP0497897A4; AU6738190A; WO1991006572A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】糸球体腎炎の診断発明の背景本発明は、糸球体腎炎の診断に関する。

糸球体腎炎は腎臓の糸球体内の左右の炎症性変化により特徴づけられる腎臓疾患である。進行の早い糸球体腎炎（ＲＰＧＮ）は幾つかの根源的症状のあらゆるものにより引き起こされうるが、その症状には不十分免疫沈着物もしくは非免疫沈着物をもつ、壊死性および／または半月形の糸球体腎炎（免疫不足（ｐａｕｃｉ −ｉｍｍｕｎｅ）ＮＣＧＮ）　、抗−系球体基底膜腎炎（抗−〇ＢＭ腎炎）、ＩｇＡネフロバノー、ループス腎炎、および溶血性連鎖球菌感染後糸球体腎炎を含む。さらに、糸球体腎炎以外の特定の疾患、例えば溶血尿毒症症候群または急性間質性腎炎はＲＰＧＮの診断画像を生じるかもしれない。免疫不足ＮＣＧＮは腎臓に限定できるか（初期ＮＣＧＮ）、またはウニシナ−肉芽腫または微視的結節性多発性動脈炎としてしばしば分類される全身性疾患と関連しつる。

ＲＰＧＮを引き起こす条件の診断は、腎機能の悪化の予防または逆転のための適切な治療の開始のために不可欠である。腎臓の生体組織検査はＲＰＧＮの患者における最も確実な治療法であると考えられてきた。しかしながら、この方法は危険を含み、ときには確実な治療を施しそこなうが、それはＮＣＧＮの病巣がしばしば限局的であり、小片の生体組織検体が足りないことによる（マディオ（Ｍａｄｉｏ）、Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ、３８：５２９．１９９０）。さらに、初期ＮＣＧＮの幾つかの症状は明確に分類できない。

血清学的試験は幾つかの形態のＲＰＧＮにおいて診断的価値がある。特に、ＲＰＧＮの患者は好中球および単球に対する循環自己抗体をしばしば有する。これら自己抗体の存在は通常、抗−好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）と呼ばれ、診断手段として使用されてきた。ＡＮＣＡは間接的免疫蛍光アッセイにより、基質としてエタノール固定正常ヒト好中球を使用して検出される。

２つの染色パターン、即ち（１）細胞質、および（２）核または核周囲が記述された（アントラシー（Ａｎｄｒａｓｓｙ）ら、Ｎｅｐｈｒｏｎ　４９．２５７− ２５８．１９８８）。細胞質のパターンは能動性ウニシナ−肉芽腫のを者のほとんどにおいて検出され（ファンデル　ラード（Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｗｏｕｄｅ）ら、Ｌａｎｃｅｔ　１：８０６．１９８５）、初期ＮＣＧＮまたは微視的結節性多発性動脈炎の他の患者においてときおり見られる（ジエ不ソト（Ｊｅｎｎｅｔｔｅ）ら、Ａｍ、Ｊ、Ｐａｔｈｏｌ、１３５：９２１．１９８７、コーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら、Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ、３７：７９９．１９９０）。細胞質染色パターンに関連した自己抗体は、−次または二次顆粒画分に位置する２７−２９キロドルトン（ｋ　Ｄ）の可溶性蛋白質である（グロス（Ｇｒｏｓｓ）ら、Ｌａｎｃｅｔ　１：１４８８．１９８７：ゴールドンユメデイング（Ｇｏｌｄｓｃｈｍｅｄｉｎｇ）、Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ、３２ニア７９，１９８７）。対照的に、核または核周囲の染色パターンはウニシナ−肉芽腫と診断された患者のほんの数パーセントにのみ見られる。好中球の製造において人工的に再分配される抗原であるミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）に対する抗体によりしばしばもたらされ　。

るこのパターン（フォーク（Ｆｏ　Ｉ　ｋ）ら、Ｎ、Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ、３１８：１６５１）は、初期ＮＣＧＮまたは微視的結節性多発性動脈炎の患者何人かにおいて見られる（アンドラン−（Ａｎｄｒａｓｓｙ）ら、ＣＩ　ｉｎ、Ｎｅｐｈｒ。

１．３２：１５９，１９８９；ガング（Ｇａｎｓ）ら、Ｌａｎｃｅｔ　１：２６９．１９８９）。これらの明白な染色パターンのために、間接的免疫蛍光アッセイは有用な診断手段になりうる。しかしながら、染色パターンの解析は難しく、そして−人の染色パターンを定量化して解釈する前に少なくとも１０００の血清試料を試験することが推奨される（ラスムラセン（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ）ら、Ｌａｎｃｅｔ　１ニア０６．１９８８）。より単純に５倍以上容易に定量できる、これらの条件と関連した自己抗体のためのアッセイは、素早くかつより正確な診断をさせ、初期治療の関与を促進する。正確な診断は特に重要であるが、それはこれらの疾患の治療が潜在的に有害な薬剤を含み、そして確実な診断なしに医師が治療を嫌うかもしれないからである。より正確な診断は、これらの明らかに関連する疾患の病原の理解に貢献するデータも提供するかもしれない。

質（ｐ　２９）に関する。該蛋白質は５ＤＳ−ＰＡＧＥにおける測定により約２９ｋＤの大きさであり、ンイソプロビルフルオロリン酸に結合することができ、約９２から約９．４の等電点を有し、ウニシナ−肉芽腫の患者の血清に存在する自己抗体に結合でき、そしてＮ末端のアミノアツル配列１１ｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ −Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−ＧＩＵ−＾１ａ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−！Ｔｉ５−３ｅｒ−＾ｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−＾１．ａ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｍｅｔ−＾ｒｇ|Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｔ−Ｈｉｓ　（配列番号、１）を有する。実質的に純粋とは重量で９５％またはそれ以上純粋で、蛋白質が天然状態で結合している蛋白質、− 脂質、および炭水化物を実質的に含まないことを意味する。

他の見地において、本発明はｐ２９と免疫複合体を形成することができるモノクローナル抗体に関する。

他の見地において、本発明はウニシナ−肉芽腫の診断に役立つ自己抗体を検出する方法に関する。この方法は、試験される生物学的液体をｐ２９に接触させる段階を含む。形成されるあらゆる免疫複合体は、ウニノナ−肉芽腫の診断に役立つ、生物学的液体中の自己抗体の存在を指示するものとして検出され、かつ使用される。

他の見地において、本発明はウニシナ−肉芽腫の診断に役立つ自己抗体を検出する方法に関する。この方法は＝　（ａ）本発明のモノクローナル抗体と該モノクローナル抗体と反応する抗原との免疫複合体を提供し、（ｂ）試験される生物学的液体と該免疫複合体を接触させ、そして（Ｃ）ウエンナー肉芽腫の診断に役立つ、生物学的液体中の自己抗体の存在を指示するものとして、免疫複合体に対する自己抗体の結合を検出する段階を含む。

他の見地において、本発明はｐ２９蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含むベクターに関する。

他の見地において、本発明は免疫不足性壊死および／または半月形の糸球体腎炎の診断に役立つ自己抗体の検出法に関する。この方法は＝　（ａ）本発明の蛋白質と試験される生物学的液体を接触させ、（ｂ）　ミニロバ−オキシダーゼと試験される生物学的液体を接触させ、そして（Ｃ）段階（ａ）または段階（ｂ）において形成される免疫複合体を検出することからなり、該免疫複合体の形成が免疫不足性壊死および／または半月形の糸球体腎炎の診断に役立つ自己抗体の指標となる。

他の見地において、本発明は免疫不足性壊死および／または半月形の糸球体腎炎の診断に役立つ自己抗体を検出する方法に関する。この方法は、（ａ）本発明のモノクローナル抗体と該モノクローナル抗体と反応する抗原との免疫複合体を提供し、（ｂ）　ミエロパーオキシダーゼと、ミエロパーオキシダーゼと反応するモノクローナル抗体との免疫複合体を提供し、（Ｃ）段階（ａ）の免疫複合体と試験される生物学的液体を接触させ、（ｄ）段階（ｂ）の免疫複合体と試験される生物学的液体を接触させ、そして（ｅ）段階（ａ）または（ｂ）の免疫複合体に対する自己抗体の結合を検出することからなり、段階（ａ）または（ｂ）の免疫複合体に対する自己抗体の結合が、免疫不足性壊死および／または半月形の糸球体腎炎の診断に役立つ自己抗体の存在の指標となる。

他の見地において、本発明は生物学的液体試料中の自己抗体の検出のための診断用キットに関するが、該自己抗体は免疫不足性壊死および／または半月形の糸球体腎炎の診断に役立ち、該キットはｐ２９蛋白質およびミニロバ−オキシダーゼを含む。

他の見地において、本発明は生物学的液体試料中の自己抗体の検出のための診断用キットに関するが、該自己抗体は免疫不足性壊死および／または半月形の糸球体腎炎の診断に役立ち、該キットは二本発明の蛋白質、本発明のモノクローナル抗体、ミニロバ−オキシダーゼ、およびミニロバ−オキシダーゼに対するモノクローナル抗体を含む。

他の見地において、本発明は生物学的液体試料中の抗体の検出のための診断用キットに関するが、該抗体は糸球体腎炎の診断に役立ち、該キットは二本発明の蛋白質、ミニロバ−オキシダーゼ、補体Ｃ３、連鎖状球菌抗原、タイプ■ｖコラーゲンのα３鎖のＮＣＩドメイン、およびＤＮＡを含む。

「免疫不足性壊死および／または半月形の糸球体腎炎」という言葉は、ウニシナ −肉芽腫、微視的結節性多発性動脈炎、および初期壊死および／または半月形の糸球体腎炎を含む意味である。

本発明の化合物および方法は、免疫不足ＮＣＧＮ　（これらの症状はウニシナ− 肉芽腫、微視的結節性多発性動脈炎、および初期ＮＣＧＮを含む）と、特異的であり、容易に解釈されそして容易に定量されるその他の形態の糸球体腎炎とに関連する幾つかの症状の特徴的自己抗体の検出手段を提供する。抗−好中球細胞質自己抗体の通常の検出法は、自己抗体染色および間接免疫蛍光を用いる。間接免疫蛍光の知見の判断は相当の経験を必要とし、そして結果は研究室によって異なるかもしれない。本発明のアッセイにおける結果の解釈は、慣用的な固相または液相のイムノアッセイのような方法に依存する。これらの技術による結果は、固定された細胞構造に結合した抗体のパターンの極めて微妙な違いが同定および区別されなけわばならない場合に、従来技術である間接的免疫蛍光アッセイで得られた値よりもはるかに単純に解釈さねる。さらに、間接的免疫蛍光アッセイと異なり、本発明のアッセイは定量できる。

本発明の方法によるこねら疾患の検出は、疾患に特徴的な自己抗体に結合する精製抗原またはこれら抗原に対するモノクローナル抗体のいずれかを使用する。

検出が、精製ｐ２９または精製ミエロベーオキシダーゼの使用に基づいている方法の場合は、精製度のおとる抗原調製物を使用するアッセイを用いた場合に見られるような、異なる抗原のバッチが自己抗体の結合のための異なる標的を提供する危険がない。モノクローナル抗体を使用する方法においては、結果は同様に特異的である。

本発明の他の特徴および利点は以下の好ましい態様の記載および請求の範囲から明らかになる。

好ましい態様の説明最初に図面の簡単な説明を記述した後、本発明の好ましい態様を言己述する。

図面図１は、ｐ２９蛋白質および幾つかのセリンプロテアーゼのＮ末端の配列を表す。

図２から５は、免疫不足ＮＣＧ＼の直接固相イムノアッセイの結果を表す。

以下の概要はウエンナー肉芽腫に存在する自己抗体を検出するための２つの方法である。第一の方法は、自己抗体により認識される抗原ｐ２９を使用し、第二の方法は、ｐ２９およびｐ　２９に対するモノクローナル抗体を使用し、抗−ｐ２９モノクロ−光ル抗体の生産が記述される。ウニシナ−肉芽腫、微視的結節性多発性動脈炎、および初期ＮＣＧＮを含む免疫不足ＮＣＧＮに関連した症状の自己抗体の特徴を検出するための２つの方法も提供する。第一の方法は自己抗体により認識される２つの抗原、ｐ２９およびミエロパーオキシダーゼを使用し、第二の方法はこれら２つの抗原並びにそれら各々に対して特異的なモノクローナル抗体を使用する。抗〜ミエロパーオキシダーゼモノクローナル抗体を調製する方法を記述する。

２９ｋＤ蛋白質に対するモノクローナル抗体の調製２９ｋＤに対するモノクローナル抗体は、６連軸のメスＢａ１ｂ／’ｃマウスの下肢の皮肉に完全フロイトアンユバンド中の好中球酸抽出物１−０μｇを免疫することにより生じた。

好中球酸抽出物はロックウッド（１，ｏ　ｃ　ｋｗｏ　ｏ　ｄ）らの方法（Ｌａｎｃｅｔ］、：　７１６．１９８７）にし７たがって調製された。蘭単に言えば、ｌＸｌ０’の細胞を洗浄Ｉ５、次に０．２Ｍ酢酸ナト１１ウム緩衝液（ｐＨ４，２）中で０℃において５分間音波処理した。（細胞をジイソプロピルフルオロリン酸で標識する場合は５ｍＭで添加し、て洗浄前に細胞を１０分間氷上に放置する。）　２０．　０００ｇで２０分間、４℃において遠心分離後、上清をｐＨ７，４にするかまたはリン酸緩衝塩、ｐＨ７，４（ＰＢＳ）に対して透析した。

試料中の蛋白質濃度はローリ−（Ｌｏｗｒｙ）　ら（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、１９２：２６５．１９５１）の方法により測定した。

２週間にわたって３回ブーストした後、注射されたマウスの腋窩リンパ節を単離した。リンパ節は、コーラ−（Ｋｏｈ　］　ｅ　ｒ）ら（Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５−４９７．１９７５）に記述されているとおりに、ＮＳＩマウスプラズマセルライン（アメリカンタイブカルチャーコレクンヨン）と融合した。ＨＡＴ選択培地中で１０−１４日間生育後、ハイブリドーマからの培地上清に関して、ウェスタンプロット分析により抗−好中球活性を試験した。ウニシナ−肉芽腫自己抗体のウェスタンプロット分析は以下のとおりに実施された。上記のとおりに調製された酸抽出物（２５ｕ　ｇ／レーン）をレムリ（Ｌａｅｍｍｌ　１）（Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０．１９７０）により記述されたドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）電気泳動により退離した。トウビン（Ｔｏｗｂｉｎ）　ら　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．　、へｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７６：４３５０．１９７９）の方法により、未染色のケルからの蛋白質を電Ｚ泳動的にニトロセルロースフィルター摸に転写した。膜を紐状に切り、そして轡者の血清（１・１０希釈）で染色し、さらにビすチン化二次抗体で染色し、そしてアビノン−ビオチン−パーオキ／ダーゼ複合体を形成した。結合した抗体はパーオキソダーゼの基質であるクロモゲ＞３−アミノ−９エチルカルバゾールにより検出した。

ウニシナ−肉芽腫自己抗体（血清からの）により同定されたバンドで相互に移動した２９ｋＤバンド（ｐ２９）を染めるモノクローナル抗体が選択された。所望の活性を有するハイブリドーマは２回サブクローン化され、そして一つのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）　、ＩＦ５の単離に成功した。

モノクローナル抗＝ｐ２９抗体、ＩＦ５の特徴ｍ、Ａｂ、ＩＦ５は、ウェスタンプロットにおいて好中球由来の２９ｋＤのノくンドと反応し、轡者の血清からの自己抗体と同一の間接免疫蛍光染色＜ターンを生じた１゜間接免疫蛍光分析は、以下のとおりに実施された。抗−好中球細胞質抗体は、細胞遠心分離およびエタノール固定による正常人の好中球を使用して間接免疫蛍光により検出された。好中球は、フィコルー／Ｓイバツクグラデイエント（Ｆｉｃｏ１トーＨｙｐａｑｕｅ　ｇｒａｄｉｅｎｔｓ）（ファルマシア社、ビスカタウｘイ、ＮＪ）で遠心分離され、次１ニボイウム（Ｂｏｙｕｍ）（Ｓｃａｎｄ、ＪＣｌｉｎ、Ｌａｂ、Ｉｎｖｅｓｔ、９７：７７．１９６８）に記述されたとおりに低張性溶解により退離した。細胞遠心分離調製物はノヤンドンサザン（Ｓｈａｎｄｏｎ　５ｏｕｔｈｅｒｎ）細胞遠心分離機（チェーシ＋　（Ｃｈｅｓｈ　ｉ　ｒｅ）社、英国）を使用して作られた。各調製物は１００％エタノール中で５分間固定さね、乾燥され、そして血清（１１６希釈）と室温（ＲＴ）で１時間インキ。

ベートした。、２回洗浄後、細胞は蛍光化ヒツジ抗−ヒトＩｇ（メロイ（Ｍｅｍ。

ｙ）、スブリ〉グツイールド、ＶＡ、）で室温において６０分間染色し、洗浄し、そして次に蛍光顕微鏡により観察した。

血清は、ウニシナ−肉芽腫であると診断された１０人の轡者から得られた。臨床的には、すべての轡者は、進行の速い腎咳の機能不全の有無にかかわらず、上気道または上気道の疾患（鼻びらん、副鼻腔炎、喀血）を有した。病理的には、３人の轡者が鼻の生体組織検査において壊死性肉芽腫症の病巣の特徴を有した。

残りの７入の患者は、不十分もしくは無イムノグロブリシ付着物を伴うか伴わない、壊死性または半月形の糸球体腎炎の有無にかかわらず鼻の脈管炎または肺毛細管炎の病的証拠を有した。血清は正常なボランティアからも得られた。すべての血清は使用まで一２０８Ｃにおいて保存された。

ウニノナ−肉芽腫の密番１０入からの血清について、上記のとおり正常好中球溶解物と反応性の自己抗体の存在をスクリーニングした。すべての患者の血清は１月以内の組織検体で得られた。１０人すべてのを者の血清は２９ｋＤ抗原（ｐ２９）に対する自己抗体を含み、そしてエタノール固定好中球において細胞質染色パターンを生じた。２００人の正常人からの血清はいずれも抗−ｐ２９抗体を有さなかった。

２９ｋＤ抗原（ｐ　２９）の精製ｍＡｂ　ＩＦ５を利用する二とにより、ノユナイダ−（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）らの方法（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５７：１０７６６、コ９８２）を使用してｐ２９を親和性により精製した。］、Ｅ８（ＩｇＧ１サブクラスの）は、ジメチルビメリミデートとカップリングしたセファロ−スープロチビンＡビーズに結合した。固定された、モノクローナル抗体を誘導したセファロースビーズの１０ｍ１のカラムを大まかに洗浄し、次に３０ｍｇの好中球酸抽出物（詳細な点は上記の通りに調製された）と共に室温において３時間インキュベートした。カラムは５倍のベッドボリュームのＰＢＳで洗浄し、次に５００ｍＭの塩化ナトリウムを含む５倍のベッドボリュームのＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳで再平衡化後、カラムを０．２Ｍクエン酸、ｐＨ２，７５で］、ｍｌの両力に溶出し、モしてトリス塩基を用いて直後に中和し７た。溶出された蛋白質はＯＤ　２８０において分光光度計により検出した。所望の両分をプールし、そしてプロティンＡ−セファロースと共にインキュベートした（影響を及ぼす量の混在ｍＡｂを除去するため）。

プールされた両分を濃縮し、そしてコロノオシバ・ソゲを用いて蒸留水に対して透析した。

７００ｇｇの蛋白質が溶出物中に回収された。

１Ｅ８により認識され、親和性により精製された抗原は、非還元条件下において５ＤＳ−ＰＡＧＥで２９ｋＤの主要成分と共に３つの接近したバンドとして移動した。精製された抗原はウェスタンブロッティングにおいて患者の血清がらの自己抗体と反応したが、このことからウニシナ−肉芽腫の自己抗体とＩＦ５により認識されるものとが同一であることが確認された。等電点ゲルにおいて、ｐ２９は９２から９．４の等電点を有した。

ｐ２９は、以下のとおり新規なセリンブロティナーゼであることが示された。

アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社モデル４７０Ａンークエ不一夕一を使用して、１０μｇの精製ｐ２９を２０サイクルのエドマン分解に供した。一つのＮ末端配列が得られた（図１）ことから、５ＤＳ−ＰＡＧＥ上での精製蛋白質の分子の不均一性は一つの蛋白質のイソフオームを反映しているかもしれないことが示唆された。ナショナルバイオメディカルリサーチファウンデーション（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）およびスイスプロテインデータバンクス（Ｓｗｉｓｓ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｄａｔａ、ｂａｎｋｓ）によるホモロジーサーチから、推論される配列がセリンブロティナーゼ属と顕著な相同性をもつ新規蛋白質であることが明らかになった。特に、すべてのセリンブロティナーゼの触媒作用を有する鎖のＮ末端にみられるように、２つの疎水性残基（イソロイシンおよびバリン）がＮ末端に存在する。さらに、非可変残基グリシン（４番目）およびプロリン（１３番目）がｐ２９に存在する。ｐ２９は初期顆粒に存在する２つの好中球セリンプロティナーゼ、白血球エラスターゼおよびカテブンンＧとは明らかに異なっていた。白血球エラスターゼおよびカテプシンＧのようにｐ２９は上記の放射性標識ＤＦＰにも結合した。

Ｎ末端の配列の決定は以下のとおりに実施された。１００μｇの精製ｐ２９を蒸留水に対して無尽蔵に透析し、２００μｍにａ縮して２０μｍを５ＤＳ−ＰＡＧＥ、イモピロン−Ｐ（ミリボア社）上に乾燥プロットし、そしてインドインクによる染色に供した。主要なｐ２９のバンドを安全カミソリの刃で切り出し、そしてアブライドバイオンステムズ社モデル４７０Ａシークエネーターを用いて、２０サイクルのエドマン分解に供した。ＰＴＨ誘導体はジノ（Ｃｙ　ｎ　ｏ）カラム（１８Ｍ社）およびパーマフェーズ（Ｐｅｒｍａｐｈａｓｅ）ＥＴＨプレカラムを使用して、勾配溶出（溶剤Ａニア０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５，５，５％Ｖ／Ｖテトラヒドロフラン、溶剤Ｂ　アセトニトリル：勾配：］、１−４８％で２０分間、流速１ｍｌ／分）によりＨＰＬＣで解析した。切り出されたバンドから得られたＮ末端配列は親和性精製蛋白質の直接の配列決定により得られた配列と同一であった。

３Ｈ−ＤＦＰ結合アッセイは以下のとおりに実施された。モノクローナル抗体ＩＥ８をサンドウィンチラジオイムノアッセイにおいて使用することにより、３Ｈ −ＤＦＰのｐ２９に対する結合を検出した。ＩＥ８腹水の酢酸ナトリウムカット（ｃｕｔ）をＰＢＳ中１０ｕｇ／ｍｌに希釈して、３５μｌ／ウエルを１時間３７℃において９６ウエルのポリビニルマイクロタイタープレート中でインキュベートした。未結合の結合部位は１％非脂肪乾燥ミルクでブロックした。上記のようにＤＦＰを含まずに調製された好中球の酸抽出物を１００μｇ／ｍｌに希釈し、そして’Ｈ−ＤＦＰ　（３ｕＣｉ／μＭを３．３ｎＭ、ＮＥＮ社）を用いて、３０分間室温でインキュベートした。次に、抽出物（３５μｌ／ウエル）は、ＩＦ５で予めコートされたウェル、または無関連のｍＡｂあるいは抗＝ＭＰＯｍＡｂで予めコートされたウェルに、対照として添加された。室温で４時間インキュベートした後、ウェルをＰＢＳで洗浄し、乾燥し、切り出しそしてベータ蛍光浸漬しそしてベータカウンターで計数した。トリチウム化したＤＦＰはｍＡｂ　ＩＦ５を含むウェルのみに結合した。

等電点電気泳動は、領　７５ｍｍの厚さのゲル中で水平ゲル装置（ホエフ７−（）（０６ｆｆｅｒ）サイエンティフィック社）を使用して、ｐＨ範囲を３，５− １１にして実施した。ゲルは２．５ｍＡ定電流で１６時間４℃において泳動じ、固定し、クマジーブルーＲ−２５０で染色し、そして脱色した。

酸抽出物から蛋白質を入手し、洗浄後入手した蛋白質を試験血清に暴露した。停留した自己抗体はマーカーと結合した抗−ヒト自己抗体を用いて検出される。

マイクロタイターウェルはｍＡｂ　ＩＦ５の硫酸アンモニウムカットで予めコートされ、好中球−酸抽出物（上記のように抽出された）に暴露し、そして４時間インキュベートする。ウェルをＰＢＳで洗浄し、そして全量３５μｍ中で１１００に希釈して試験血清に暴露する。室温で６０分後、ウェルをＰＢＳで洗浄し、そして１２５１−標識ヒツジ抗−ヒトｒｇ抗体（マウスＩｇＧに予め中和された）で発色させる。ウェルを切り出し、乾燥し、モしてガンマカウンターで計数する。″５Ｉ−標識ヒツシ抗−ヒトＩｇ抗体は、酵素と結合した抗−ヒト自己抗体または他の放射様マーカーまたは非放射様マーカーに置き換えてもよい。

このアッセイはマイクロタイターウェルに結合したｍＡｂ　ＩＦ５　（または同様の基質）、陽性対照試料（例えば、ウニシナ−肉芽腫と診断された患者からの血清）、およびアッセイを実施するのに必要な他の試薬を含むキットとして提供このアッセイにおいては、精製ｐ２９を使用して、試験血清から自己抗体を入手する。そして入手された自己抗体はマーカーを結合した抗−ヒト自己抗体を用いて検出される。

ｐ２９は上記のとおり好中球−酸抽出物から親和性により精製される。精製されたｐ２９はマイクロタイターウェル上にコートされる。患者からの血清（１：１００希釈の３５μｍ）をマイクロタイターウェルに添加し、そして６０分間インキュベートした。マイクロタイターウェルをＰＢＳで洗浄し、そして放射標識、酵素の結合、または他の標識による抗−自己抗体で発色した。

このアッセイは、マイクロタイターウェルに結合したｐ２９（または他の適切な基質）、陽性対照試料（例えば、ウニシナ−肉芽腫と診断された患者からの血清）、およびアッセイを実施するのに必要な他の試薬を含むキットとして提供される。

ｐ２９蛋白質に対する追加のモノクローナル抗体の生産状々の発見は、ウニシナ −肉芽腫の患者の血清中の循環自己抗体が我々の同定した蛋白質ｐ２９に対するものであり、ｐ２９に特異的なモノクローナル抗体の日常の生産を可能にすることである。そのような抗体は上記の方法により、または以下の対等の類似法により生産できる。

ウニノナ−肉芽腫のあらゆる患者に由来する血清を溶解好中球、およびその結果得られる免疫沈殿物に接触させ、この沈殿物がｐ２９蛋白質と抗体との複合体を含む。この免疫沈殿物を使用することにより、動物、例えばマウスを免疫するが、それらの動物の多くはｐ２９蛋白質に対する抗体を産生する。次に、そのような免疫に基づいて作られたハイブリドーマからの培養液の上清の中から、正常好中球からの溶解物に結合するモノクローナル抗体を含むものをスクリーニングした。ＰＢＳ蛋白質の認識は、上記のとおりウェスタンブロッティングにより確認される。

ＰＢＳ遺伝子のクローニング上述の、ｐ２９のＮ末端のアミノ酸配列の情報は、該蛋白質をコードする遺伝子のクローニングを、特に小さいサイズの該蛋白質の点から日常的なものにする。

標準的技術、即ち、好中球からｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、Ｎ末端配列の情報を使用することにより、合成オリゴヌクレオチドが作られ、該オリゴヌクレオチドを使用することにより、ｐ２９蛋白質をコードするｃＤＮＡが得られる。

発性動脈炎および初期ＮＣＧＮ）のいずれかの自己抗体の特徴は、抗−ｐ２９自己抗体のためのアッセイと、抗−ミニロバ−オキシダーゼ自己抗体のためのアッセイを組み合わせることにより検出できる。

−リング（ＣａｌＢｊｏｃｈｅｍ　Ｂｅｈｒｉｎｇ）社、サンディエゴ、ＣＡ）を使用することにより、上記のとおり概略した抗−ｐ２９モノクローナル抗体のための抗−ＭＰＯ抗体を調製できる。精製された抗−ＭＰＯモノクローナル抗体を使用することにより、壊死性および／または半月形の糸球体腎炎と診断された患者の血清をスクリーニングできる。選択された抗−ＭＰＯモノクローナル抗体と反応する血清試料のほとんどは、エタノール固定の正常好中球の間接免疫蛍光アッセイにおいて、核または核周囲の染色パターンを生じるべきである（ファンデ　「フード（Ｖａｎ　ｃＪｅ　％〜’ｏｕｄｃ）ら、１ｊｉｆｄｊ）　Ｏ所望の反応性を有するハ・イブリドーマはサブクローン仕でき、そ［、て抗−ＭＰＯモノクローナル抗体はプロティン−Ａセファ０−スクロマトグラフィーを用いる標準的技術によりｍｓできる。別法として、市販されでいる（ダコ（Ｄａｋｏ）社、ザンタバーバラ、ＣＡ）モ、ツクローナル抗−ミエロパーオキシダーゼ抗体が使用できる。。

免疫不足ＮＣＧＮ自己抗体に関する間接同相イムノア！セイこのアノセ１′においては、モノクローナル抗−ｐ２９および抗−ＭＰＯυ〔体を使用して好中球酸抽出物から蛋白質を人手する　洗浄後、入手した１白質を試験血清に暴露する７、停留した自己抗体はマーカーと結合し７た抗−ヒトＩｇ抗体を用いて検出される。

マイクロタイターウェルはｍＡｂ　ＩＦ５または精製された抗−！ｖＩＰｏ　ｍＡｂの硫酸アンモニウムカットを予めコートし、好中球酸抽出物（上記のとおりに調製さ第１た）に暴露し、そして４時間インキ、べ−）・する。ウェルをＰＢＳで洗浄し、そして総量３５μｌ中で１１００に希釈して試験試料に暴露する。

室温で６０分後、ウェルをＩ）　Ｂ　Ｓで洗浄し、そして＋２５１．−標識ヒツノ抗−ヒｌ−１ｇ抗体（ＩｇＧに予め中和された）で発色させる。ウェルを切り出し、乾燥し、モしてガンマカウンターで計数する。＋２５Ｉ−標識ヒツノ抗− ヒｔ・Ｉ　ｇ抗体は、酵素と結合した抗−ヒｌ−１ｇ抗体または他の放射様マーカーまたは非放射様マーカーに置き換えてもよい。

このアッセイは幾つかのマイクロタイターウェルに結合したｍＡｂ　ＩＦ５（または同様の基質）、他のマイクロタイターウェルに結合した抗−ＭＰＯｍＡｂ（または同様の基質）、陽性対照試料（例えば、免疫不足と診断された患者からの血清）、およびアッセイを実施するのに必要な他の試薬を含むキットとして提供される３、別法としては両ｍＡｂを一つのウェルに、（れることもできる。そのようなキットは、免疫不足ＮＣＧＮに関連した、自己抗体存在症状の検出を行うことを可能にする。

免疫不足ＮＣＧＮ自己抗体に関する［ｎ接固相イムノアッセイこのアッセイにおいては、精製１）２９および精ＶＭＰＯを使用しで、試験血清から自己抗体を入手する。そして人手された自己抗体はマーカーを結合した抗−ヒ１−１ｇ抗体を用いて検出される。

ｐ２９は上記のとおり好中球−酸抽出物から親和性により精製され、そして−組のマイクロタイターウェルにコー）・される。第二のマイクロタイターウェルは精製ＭＰＯでコートされる。患者からの血清（１：１００希釈の３５ｕｌ）をマイクロタイターウェルに添加し、そして６０分間イ：２・キュベー１−シた。マイクロタイターウェルをＰ　Ｂ　Ｓて洗浄［７、そして放射標識、酵素の結合、または他の標識による抗−１ｇ抗体で発色した。

このア、・セイはマイクロタイターウェルに結合したｐ２９（または他の適切な基質）、陽性対照試料（例えば、免疫不足ＮＣＧＮと診断された。電音からの血清）、およびアッセイを実施するのに必要な他の試薬を含むギ・ソｉ・とじて提供される。、別法としては両ｍＡｂを一つのウェルに入れることもできる。

このキｙｈは抗−系球体基底膜（抗−ＧＢＭ）抗体の検出のための物質を含んでもよい。例えば、糸球体基底膜のコラーゲン分解物をマイクロタイター・ウェルに結合することができる（ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）ら、Ｋｉｄｎ＋δｙ　Ｉｎｔ　６・１１４．Ａ、１９７４）。

免疫７ｚ足ＮＣＧＮ自己抗体の７′：めの直接固相イム７１アツセイの実施例直接固相イムノア７セイを使用して、４グル・−ブ個々の血清を試験した。グループＡは免疫不足ＮＣＧＮの４２人の患者、グループＢは２００人の血液銀行の供血者、グループＣは抗−ＧＢＭ抗体に陽性の］８人の寄者、グループＤはＲＰＧＭと診断されたが、免疫不足ＮＣＧＮまたは抗−０８Ｍ腎炎であると証明されていない６２人の患者である。１ｐ２９およびＭＰＯのう、ｊオイム２ノアソセイ１）２９は上記にルズ（Ｎｉｌｅｓ）ら、Ｂｌｏｏｄ　７４：］、８８．１９８９）のモノクローナル抗体アフィニティークロマトグラブイーにより単離された顆粒球の粗酸抽出物から精製された。精製されｆＭＰＯはカルビオケム社（サンディエゴ、ＣＡ）から購入した。ｐ２９およびＭＰＯはポウ酸緩衛塩ｐＨ８，１（ＢＢＳ）中、それぞれミリリンドルあたり１０マ・１′クログラムおよび５０７フイクログラムに希釈した。

３５μｌ／′ウエルのｐ２９およびＭＰＯをポリビニルマイクロタイタープレート（コスターザイエンテ１）づツク（Ｃｏｓｔａｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社、ケンブリノ／、ＭＡ）中で１時間３７℃においてインキュベ−ｈした。非特異的結合を査定するために、対照として幾つかのウェルをＢＢＳのみでインキュベートした１、未結合部位は、ＢＢＳ中の１％脱脂乾燥ミルクをウェルに１時間３７℃において添加することによりブロックした。次に、ウェルをさまざまな希釈の血ｆ４３５μｌと共に３つにわけて２時間（または−晩）室温においてインキュベートシた。ＢＢＳで洗、浄後、ウェルを３５ｍｌの１２５１−標識ヒラ／抗 −ヒトイムノグロブｒツノ（１５００ＣＰＭ／ｎｇの１．Ｔｕｇ、−′ｍりと共にインキ、べ−トシた。最後の洗、４＋後、ウェルを乾燥し、そしてカンマ活性を計数した。２つの標準陽性対照ｍ１１１試料、即ち一方は抗−］）２９活性を有し、他方は抗−ＭＰＯ活性を有する試料を１１６から１　：　２０４８の８連続希釈にして各アッセイにおいて反応させた。各試験血清は１−１６希釈においてアッセイした。３つのカウントの平均をとり、そして対照ウェルのみて得られた各試料の平均カウント数をｐ　２９およびｐ、ｊ　））○で得られた平均カウントから差し引いた。

標準曲線は陽性対照の８つの値から作成された。２つの標準陽性未希釈血清試料は１２８ユニットの活性を不定に有し、各連続１−：２希釈は多くのユニットの１゜５倍を有した。次に、各試験血清のカウント（非特異的カウントを差し引いた）を標準曲線から読み取ることにより、抗−ｐ２９または抗−ＭＰＯ活性のユニット数を決定した。レノ−バーが操作する特徴的な曲線は、免疫不足ＮＣＧＮおよび正常対照の抗−ｐ２９および抗−ＭＰＯ抗体の力価のログの平均および標準偏差に由来する（ソックス（Ｓ　ｏ　ｘ）ら、Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｄｅｃｉｓｉｏｎ　Ｍａｋｉｎｇ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ、１９８８）ｏ抗−ｐ２９および抗−ＭＰＯ抗体アッセイの９９％の組合わされた特異性を保持している間、カットオフ（Ｃｕｔｏｆｆ）値は、最も可能性のある、組合わされた感受性を与えるように選択抗−ｐ２９および抗−ＭＰＯ抗体は、上記のとおり、１ユニツト未満から１２８ユニット以上の範囲の活性スケールで計算された。グループＡ（免疫不足ＮＣＧＮ）およびグループＢ（血液銀行供血者）の抗体力価は、それぞれ図２および図３にプロットされた。方法において記述したとおり、これら２つのグループを使用し、そして抗−ｐ２９および抗−ＭＰＯ抗体アッセイの９９％の組合わされた特異性を保持しながら、我々は免疫不足Ｎ　ＣＧ　Ｎの９５％と、抗 −１）　２９の、１５ユニットおよび抗−ＭＰＯの２５ユニツトとを組合わせて感受性を評価した３、グループ４八（免疫不足ＮＣＧＮ）の２人以外のすべてのノ＼は抗−ｐ２９抗体または抗−ＭＰＯ抗体のいずれかに陽性を示１．た。２）＼の陰性の人の内の１人は、３力月後に集められた繰り退しの血清においてｐ　２９に対する抗体を有することが分かった。ウニノナ−肉芽腫と診断された唯一の串者のｒｆｎ清は抗−ｐ２９抗体に陽性でなかった。この患者の血清は抗−ＭＰＯ抗体に陽性てあった。血液銀行の供血者からのすべての試料は両方の抗体に対して陰性であった。

上記のように決定されたカットオフ値を使用することにまり、２つの他のグループＣおよびＤの試験結果を分析した。グループＣは試験において抗−ＧＢＭ抗体に陽性である１８人の帝者からなった。こわらの患者の免疫蛍光の結果は抗−ＧＢＭの好中球に特？：１．グｊであ−７た。グループＤはＲＰ　Ｃ：：と診断されたが免疫不足ＮＣＧＮまたは抗−ＧＢＭの好中球の訂明が見いだされていない６２人の患者からなった。

グループＣの１８人の内、２人は抗−ｐ２９抗体を有し、そして６人は抗−ＭＰＯ抗体を有することが見いだされた（図４）。グループＤにおいては、６２人のうちの２人の両方が抗−ｐ２９抗体に陽性であると計算された（図５）。利用できる臨床的データおよび実験的データを再吟味して、これら２人の患者はＮＣＧＮを有すると結論された。

全体では、臨床的ＲＰＧＮ症候群のを者の間では、抗−ｐ２９または抗−ＭＰＯに陽性なものに、抗−ＧＢＭ抗体Ｊこ陰性なものを組み合わせることにより、腎臓検体がな（でも、免疫不足ＮＣＧＮの診断において高い信頼性のある指標が提供された。

使用法Ｄ２９蛋白質および／またはｐ２９に対する抗体を使用することにより、ウニシナ−肉芽腫の診断に役立つ自己抗体の存在を試験することができる。ミエロパーオキシダーゼおよび／またはミエロパーオキシダーゼに対する抗体の組み合わせにおいて、ｐ２９および／またはｐ２９に対する抗体を使用することにより、免疫不足ＮＣＧＮの診断に役立つ自己抗体の存在を試験することができる。ｐ２９蛋白質を他の抗原と共に使用することにより、糸球体腎炎に関連した抗体の存在を試験することができる。

他の態様池の態様は以下の請求の範囲内にある。例えば、ｐ２９またはｐ２９に対する抗体をキットの一部として、直接または間接イムノアッセイを用いて使用することにより、糸球体腎炎に関連した症状のあらゆる血液スペクトルに関連した抗体を検出できる。この抗原は次のものを含みつる。ミエロパーオキシダーゼ、補体Ｃ３（ロビング（Ｒｏｂｂｉｎｓ）Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｂａ５ｉｓ　。

ｆ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ、５ａｎｄｅｒｓ、ｐ、１０２９）、連鎖状球菌抗原（カラザ−（Ｃａｕｓｅｒ）、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊ、Ｋｉｄｎｅｙ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　１１：４４９．１９８８）、　タイプＩＶコラーゲンのα３鎖のＮＣＩドメイン（バ・イスラング−ＣＷｅ　：　Ｓ　ｌａ　ｎ　、：ＩＣｒ＞ら、ｐ　７０　Ｃ，ｐ：　ａｔ：、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ　８１　：１５４４．１９８４）、ＤＮ、Ａ　（コンデミ　（Ｃｏｎｄｅｍｉ）ら、ＪＡＭＡ　２５９：２９２０）、および上記自己抗体の検出のための指導。

２．５ユニット抗−ＭＰＯ抗−ＭＰＯ抗体力価（ユニツト）２．５ユニット抗−ＭＰＯ抗−ＭＰＯ抗体力価（ユニット）ＦＩＧ、４２．５コ、二・ント抗−ＭＰＯ抗−ＭＰＯ抗体力価（ユニット）ＦＩＧ、５２．５ユニット抗−ＭＰＯ抗−ＭＰＯ抗体力価（コニット）手続捕正斉平成　４年９月に日

Claims

【特許請求の範囲】

１．（ａ）好中球から単離することができ；（ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約２９ｋＤの分子量であると決定され；（ｃ）ジイソプロピルフルオロリン酸塩に結合することができ；（ｄ）約９．２から約９．４の等電点を有し；（ｅ）ウエジナー肉芽腫に悩まされている人の血清に存在する自己抗体に結合することができ、そして（ｆ）Ｎ末端のアミノアシル配列が【配列があります】（配列番号：１）の特徴を有する、実質的に純粋な蛋白質。
２．請求項１記載の蛋白質と免疫複合体を形成することができるモノクローナル抗体。
３．ウエジナー肉芽腫の診断に役立つ、生物学的液体試料中の自己抗体の検出方法であって：（ａ）前記生物学的液体試料を請求項１記載の蛋白質に接触させ、そして（ｂ）段階（ａ）で形成された免疫複合体を検出することからなり、該免疫複合体の形成が自己抗体の存在の指標となる、前記方法。
４．ウエジナ−肉芽腫の診断に役立つ、生物学的液体試料中の自己抗体の検出方法であって：（ａ）請求項２に記載のモノクローナル抗体と、該モノクローナル抗体に反応性のある抗原との免疫複合体を提供し；（ｂ）上記免疫複合体を生物学的液体試料に接触させ：そして（ｃ）上記免疫複合体に対する自己抗体の結合を検出することからなり、該免疫複合体の形成が生物学的液体試料中の自己抗体の存在の指標となる、前記方法。
５．ｐ２９蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含むベクター。
６．免疫不足壊死および半弓形の糸球体腎炎の診断に役立つ、生物学的液体試料中の自己抗体の検出方法であって：（ａ）前記試料を請求項１記載の蛋白質に接触させ：（ｂ）前記試料をミエロパーオキシダーゼに接触させ；そして（ｃ）段階（ａ）または（ｂ）で形成された免疫複合体を検出することからなり、該免疫複合体の形成が生物学的液体試料中の自己抗体の存在の指標となる、前記方法。
７．免疫不足壊死および／または半月形の糸球体腎炎の診断に役立つ、生物学的液体試料中の自己抗体の検出方法であって；（ａ）請求項２記載のモノクローナル抗体と上記モノクローナル抗体と反応性のある抗原との免疫複合体を提供し：（ｂ）ミエロパーオキシダーゼと、ミエロパーオキシダーゼに対するモノクローナル抗体との免疫複合体を提供し：（ｃ）段階（ａ）の免疫複合体と下記試料を接触させ：（ｄ）段階（ｂ）の免疫複合体と下記試料を接触させ：そして（ｅ）段階（ａ）または（ｂ）の免疫複合体に対する自己抗体の結合を検出することからなり、該免疫複合体の形成が生物学的液体試料中の自己抗体の存在の指標となる、前記方法。
８．請求項１に記載の蛋白質、およびミエロパーオキシダーゼを含み、生物学的液体試料中に存在する、免疫不足壊死および／または半月形の糸球体腎炎の診断に役立つ自己抗体を検出するための診断用キット。
９．請求項１に記載の蛋白質、請求項２に記載のモノクローナル抗体、ミエロパーオキシダーゼ、およびミエロパーオキシダーゼに対するモノクローナル抗体を含み、生物学的液体試料中に存在する、免疫不足壊死および／または半月形の糸球体腎炎の診断に役立つ自己抗体を検出するための診断用キット。
１０．請求項１に記載の蛋白質、ミエロパーオキシダーゼ、補体Ｃ３、連鎖状球菌抗原、タイプＩＶコラーゲンのα３鎖のＮＣ１ドメイン、およびＤＮＡを含み、生物学的液体試料中に存在する、糸球体腎炎の診断に役立つ抗体を検出するための診断用キット。