JP2537539B2 - モノクロ―ナル抗体 - Google Patents

モノクロ―ナル抗体

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JP2537539B2 JP63177250A JP17725088A JP2537539B2 JP 2537539 B2 JP2537539 B2 JP 2537539B2 JP 63177250 A JP63177250 A JP 63177250A JP 17725088 A JP17725088 A JP 17725088A JP 2537539 B2 JP2537539 B2 JP 2537539B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、細胞外サイトケラチン上に存在するエピト
ープに対して特異的なハイブリドマ細胞生産性モノクロ
ーナル抗体に関する。腫瘍マーカーの同定を介して癌を
検出しそして診断するための能力は、広範な興味ある領
域である。腫瘍マーカーは、物質、典型的にはタンパク
質、糖タンパク質、多糖、及び同様のものであり、これ
らは腫瘍細胞によって生成されそしてそれらに特徴的で
ある。しばしば、腫瘍マーカーは、正常細胞及び腫瘍細
胞によって生成される。しかしながら、腫瘍細胞におい
ては、その生産量は幾分異常である。たとえば、腫瘍マ
ーカーの生産量は、癌細胞においてひじょうに増加する
ことができる。一方、正常細胞内又は表面上に通常存在
するタンパク質及び他の物質は、その細胞が悪性になる
時、循環内に放出又は与えられるかも知れない。従って
血清中におけるそのような分泌される物質の検出が、悪
性の症候であることができる。
癌診断において遭遇するもう一つの問題は、第１次及
び転移性腫瘍の両者の細胞起源を同定することに関す
る。両タイプの腫瘍に関しては、異なる細胞起源の腫
瘍、たとえば上皮起源の腫瘍（癌）、非上皮の結合組織
に由来する腫瘍（肉腫）、及びリンパ腫瘍（リンパ腫）
の間で形態的に区別することは時々困難である。さら
に、乳房上皮癌に関しては、管上皮組織、分泌上皮組
織、及び筋上皮組織に由来する腫瘍間で区別すること
は、しばしば困難である。
従がって、これまでに認識されていない腫瘍マーカ
ー、特に、循環中に分泌されそして血清検定によって同
定することができる腫瘍マーカーを同定することが望ま
しい。また、特定の腫瘍の細胞起源の決定を可能にする
方法及び組成物を開発することが望ましい。
〔従来の技術の記載〕
エストラジオール刺激に応じてある乳房細胞系によっ
て放出される52,000ドルトンのタンパク質が同定されて
いる。Westley及びRochefort、セル（Cell）（1980）2
0:353〜3362、及びVeithなど。キャンサーリサーチ（Ca
ncer Research）（1983）43:1861〜1868を参照のこと。
MCF−７ヒト乳癌細胞系に対して生じるモノクローナル
抗体は、24キロドルトンのサイトゾルタンパク質を同定
することが示されている。Cioccaなど。キャンサーリサ
ーチ（Cancer Research）（1982）42:4256〜4258。組織
ポリペプチド抗原（TPA）と称されるタンパク質は、上
皮細胞の細胞質中間線維に関係している。TPAは、血清
中において及び細胞表面マーカーとして両方ともの腫瘍
マーカーであると報告されている。Altmannsbergerな
ど。Virchows Arch.〔セルパソロジイ（Cell Patholog
y）〕（1981）37:277〜284（この場合、乳癌細胞がプリ
ケラチンに対する抗体と反応し）:Wagnerなど。オース
トラリアン アンド ニュージーランド ジャーナル
オブ サージェリイ（Australian and New Zealand Jou
rnal of Surgery）（1982）52:41〜43（この場合、TPA
の高められた血清レベルが胃及び腸癌に苦しむいくらか
の患者に検出され）:Mrossなど。Klin.Wochenschr（198
3）61:461〜468（この場合、TPAの高められた血清レベ
ルが乳癌に苦しむいくらかの患者に見つけられ）そして
Luning及びNilson。アクタ ケミカ スカンジナビカ
（Acta Chemica Scandinavica）（1983）37:731〜753
（この場合、表皮ケラチンを含む、TPA及びある線維性
タンパク質間の一部相同の配列が報告された）を参照の
こと。スウェーデンのブロマにあるSangtec Medical
は、商標Prolifigren RIAキットのもとで血清及び血
漿中のTPAの検出のためのキットを販売している。Marir
esseなど。ジャーナル オブ ステロイド バイオケミ
ストリイ（Journal of Steroid Biochemistry）（198
1）15:375〜381は、MCF−７細胞の培養培地での約50kd
の低転換速度のタンパク質の存在を報告している。ケラ
チンの血清学的検出が、癌患者において報告されてい
る。Madriなど。ラボラトリイインベスティゲーション
（Laboratory Investigation）（1983）48:98〜107。
〔発明の要約〕 この発明は、第１次及び転移性上皮腫瘍、特に上皮乳
房腫瘍を検出しそしてモニターするために有用な組成物
を提供する。細胞外サイトケラチンは、約40〜46キロド
ルトンの分子量を有しそして腫瘍性上皮細胞の細胞表面
上に見出される約42〜48kdのタンパク質に関係してい
る。細胞外サイトケラチン及び細胞表面タンパク質の両
者は、今度は、細胞内サイトケラチンに関係している
が、しかし細胞外サイトケラチンは、ブロックされてい
るＮ−末端を有しそして水性溶液に溶解する点におい
て、細胞内サイトキシン及び細胞表面サイトケラチンの
両者と異なる。細胞外サイトキシンの検出は、ハイブリ
ドーマ細胞系、UCD/AB6.11,UCD/PR10.11に由来するモノ
クローナル抗体又は特定の複合体の形成を決定する類似
の特異性を有する他の抗体との反応によって便利に達成
することができる。
この発明の組成物は、また種々の上皮腫瘍の細胞起源
を同定するために有用である。上皮サイトケラチン、特
にUCD/PR10.11と反応できるモノクローナル抗体は、非
上皮腫瘍、たとえば肉腫及びリンパ腫と上皮腫瘍（癌）
を区別するのに利用することができる。その上、抗体の
グループ又はパネルを管上皮、分泌上皮、及び筋上皮起
源の第１次及び転移性乳房腫瘍の間の区別をするために
利用することができる。
〔特定の態様の記載〕
組成物は、上皮腫瘍、特に乳房上皮腫瘍の検出、同
定、及びモニターリングのために提供される。正常及び
腫瘍性上皮細胞の両者は、細胞表面上の約42〜48キロド
ルトン（kd）のタンパク質（これは、細胞内サイトケラ
チンに免疫学的に及び組成的に関係している）によって
特徴づけられることが見つけられた。また、サイトケラ
チン関連タンパク質の低分子形（約40〜46kd）が正常及
び腫瘍性細胞の両者によって放出されるがしかし腫瘍性
細胞からの放出速度は相当に高いということが見出さら
れた。従って血清中のそのような細胞外サイトケラチン
の存在について検定することによって、患者集団を、上
皮新生物についてスクリーンすることができる。この検
定は特に上皮新生物のために治療を受けている患者の経
過をモニターするために適切である。
中間線維は、多くの細胞型における細胞体質の主成分
である。乳腺のような組織の上皮細胞は、ケラチンから
成る不溶性中間線維を含む。サイトケラチンと称するこ
れらのタンパク質は、正常及び腫瘍性乳房細胞の両者中
に見つけられそしてタイプ１から19〔Mollなど。セル
（Cell）（1982）31:11〕と称する少なくとも19の異な
るタンパク質のグループを含んで成る。これまで、その
ようなサイトケラチンは、細胞内サイトケラチンタンパ
ク質であると信じられていた。しかしながら後の実験部
分に報告されている研究は、そのような細胞内サイトケ
ラチンに免疫学的に及び組成的に関連しているタンパク
質を、細胞表面上でも見出すことができ、そして細胞か
ら分泌され得るということを証明している。
この発明によって同定された細胞表面サイトケラチン
及び細胞外サイトケラチンは、構造的に及び免疫学的に
既知の細胞内サイトケラチンに関連しているがしかし同
一ではない。構造的に関連があるということは細胞外／
細胞表面のサイトケラチン及び細胞内サイトケラチンの
間で少なくとも60％の相同性普通75％又はそれより大き
な相同性が存在するということを意味する。免疫学的に
関連があるということは、サイトケラチン内で共通な少
なくとも１つのエピトープ部位、普通多数のエピトープ
部位しかし、すべてのエピトープ部位よりも少ない部位
が存在するであろうことを意味する。乳房上皮細胞の典
型的な場合においては、タイプ8,18及び19の細胞内サイ
トケラチンと免疫学的に交叉反応をする少なくとも３つ
のエピトープが細胞表面サイトケラチン上に存在すると
いうことが見出される。乳房上皮細胞から放出される細
胞外サイトケラチンは、タイプ８及びタイプ18の細胞内
サイトケラチンと最っとも強く交叉反応し、そして水性
溶液中で可溶性である。細胞外サイトケラチンは、ブロ
ックされているＮ−末端を有するということも、さらに
見出される。
生物学的液体、たとえば血清中での細胞外サイトケラ
チンの検出は、上皮癌の状態に関係があり得る。腫瘍性
上皮細胞は、正常な上皮細胞と比較して増大された速度
でサイトケラチンを放出し、そして血清中のサイトケラ
チンレベルを疾患状態と関係することをできることが観
察される。たとえば、腫瘍が外科的に取り除かれ又は他
の形の治療によってその後退が誘発された後、血清中の
サイトケラチンレベルが、減少することが予想され得
る。従って患者の血清レベルをモニターすることによっ
て増大した腫瘍負荷（第１次又は転移性いづれか）の特
徴である細胞外サイトケラチンの増加レベルを検出する
ことができる。
この発明は、また腫瘍細胞の細胞起源を決定するため
に腫瘍細胞をスクリーニングするのに有用である。腫瘍
細胞におけるサイトケラチンの存在は、その細胞の上皮
起源のを診断するものである。従って、細胞サイトケラ
チンに対して特異な抗体との反応によって非上皮腫瘍と
上皮腫瘍を区別することができる。さらに、サイトケラ
チンと反応することができる抗体は、管上皮、分泌上皮
及び筋上皮の乳房細胞間を識別することができるという
ことが見出された。従って、乳房上皮細胞のおのおのの
型と反応するが、しかし乳房上皮細胞の他の２つの型と
は実質的に反応性が低い、典型的にはキットとしてパッ
ケージされる抗体のグループ又はパネルを使用すること
によって、乳房腫瘍の細胞起源を、組織化学的染色技法
により便利に決定することができる。通常の技法により
抗体との反応性を基礎にして、陽性及び陰性のサンプル
を評価することが可能であろうことが、“実質的に反応
性が低い”ということによって意味される。腫瘍の細胞
起源の知識は、治療の適切な態様を選択する場合に有用
である。
細胞サイトケラチン及び細胞外サイトケラチンの存在
は、タンパク質と反応する抗体を用いる通常のイムノア
ッセイ又は組織化学的染色技法を免疫学的に使用して便
利に決定することができる。免疫源として、細胞サイト
ケラチンもしくは細胞外サイトケラチン、又はそれらの
抗原性フラグメントのいづれかを通常に使用して（下に
記載されているように）そのような抗体を生産すること
ができる。乳房腫瘍細胞系からの完全な又は溶解した細
胞を、免疫原として便利に使用することができる。一
方、サイトケラチンに特異な抗体を利用して、血清、第
１次腫瘍細胞、又は腫瘍細胞系からサイトケラチンを単
離し、免疫原として使用するための精製されたる抗原を
得ることができる。
通常の技法に従って広範囲の種類の脊椎動物中に所望
の免疫原を注入することによって抗体を得ることができ
る。適当な脊椎動物は、マウス、ラット、羊及びヤギ、
を含み、特にマウスが適切である。普通、改良された力
価及び特異性を有する、逐次的な放血により定期的に動
物から採血する。抗原は、筋肉内に、腹腔内に、皮下に
又はこれらと同様にして注入することができる。普通、
完全又は不完全フロインドアジュバンドのような賦形剤
が使用される。所望によりモノクローナル抗体を製造す
ることができる。
モノクローナル抗体を得るために、免疫化されたる脊
椎動物からの脾臓細胞が不滅にされる。不滅化の方法は
臨界ではない。現在、最っとも通常な方法は、骨髄腫融
合パートナーによる融合である。他の技法は、EBV形質
転換、裸のDNA、たとえば、腫瘍遺伝子、レトロビール
ス、等による形質転換、又は細胞系の安定維持及びモノ
クローナル抗体の生成をもたらすいづれか他の方法を含
む。ヒトモノクローナル抗体は、適切なヒト融合パート
ナー、たとえばWI−L2と脾臓細胞の融合によって得るこ
とができる（ヨーロッパ出願番号82.301103.6に記載さ
れ、これと関連する部分を、引用によりこの明細書に組
み入れる）。マウス×マウスモノクローナル抗体を生成
するための詳しい技法は、Oi及Herzenbergの“細胞免疫
学における選択法（Selected Methods in Cellular Imm
unology）,"Mishell及びShiigi（出版）、W.H,Freeman
及びCo.,サンフランシスコ（1980）ページ351〜372によ
って教示されている。この発明の抗体は、いづれかの免
疫グロブリンクラス、すなわちIgG1,IgG2a、及びIgG2b
を含むIgG,IgA,IgD,IgE,並びにIgM、普通IgG又はIgMで
あることができる。
特に有用なモノクローナル抗体がこの発明において使
用のために製造されている。抗体UCD/AB6.11、上皮サイ
トケラチンの細胞内、細胞表面、及び細胞外形と、特に
分泌上皮細胞に特徴的であるタイプ18サイトケラチンと
反応的である。抗体UCD/PR10.11は、サイトケラチンの
細胞内及び細胞外形と、特に管上皮細胞に特徴的である
タイプ８サイトケラチンと反応的である。UCD/PR7.01
は、筋上皮細胞に特徴的である抗原の細胞内及び細胞外
形と反応的である。これらの３つの抗体は、特に、それ
らが管起源、分泌起源、又は筋上皮起源であるかどうか
を決定するために腫瘍性上皮細胞をスクリーニングする
のに適切である。
抗体UCD/PR10.11は、また、それらが上皮起源のもの
であるかどうかを決定するために腫瘍細胞をスクリーニ
ングするのに特に適切である。UCD/PR10.11抗体は、上
皮細胞のために高い親和性を有しそしてひじょうに低い
バックグラウンドレベルを伴って高度に特異的な染色を
提供することが見出される。
いったん適切な特異性を有する抗体が製造されたな
ら、広範囲の種類の免疫学的検定法が特定の抗体−抗原
複合体の形成を決定するために利用可能である。多くの
コンピティティブ及び非コンピティティブタンパク質結
合検定は、科学及び特許文献に記載され、そしてそのよ
うな検定のひじょうに多くが商業的に使用可能である。
血清抗原を検出するために適切である典型的なイムノア
ッセイは、アメリカ合衆国特許番号、3,791,932;3,817,
837;3,839,153;3,850,752;3,850,578;3,853,987;3,867,
517;3,879,262;3,901,654;3,935,074;3,984,533;3,996,
345;4,034,074;及び4,098,876に記載されている方法を
含む。
イムノアッセイを実施するより前に、ある種の方法に
より生物学的サンプルをあらかじめ処理することが普通
必要であろう。サンプルの調製法は、生物学的サンプル
源に依存して異なるであろう。固形腫瘍及び他の組織サ
ンプルは、細胞を溶解することによって調製されるであ
ろう。血清サンプルは、典型的に、良く知られている方
法に従って、全血液を凝固しそして上清液を単離するこ
とによって調製されるであろう。他の生物学的液体、た
とえば精液、痰、及び尿は、また細胞外サイトケラチン
の存在について検定することができる。
通常の免疫組織化学的染色技法も、また組織サンプル
中のサイトケラチンを検出するために用いることができ
る。たとえば、組織サンプルを、ホルマリン、Ｂ−５又
は他の標準組織学的保存薬中に固定し、脱水しそしてど
の病院の病理実験室においても日常の仕事であるような
パラフィン中に封入することができる。切片をパラフィ
ンから切り離しそしてガラススライド上に置くことがで
きる。次に細胞抗原が、検出されそしてラベルされてい
る抗体及びラベルされている第２抗体に暴露することに
よっておのおの位置決定され得る。一方、細胞学的調製
法を用いることができる。たとえば、組織サンプルから
の細胞は、典型的には、生理学的pHで緩衝液中、ホルマ
リンに暴露し、次にアセトン中に懸濁しそして遠心分離
によりゼラチン−被覆のスライド上にペレット化するこ
とによって、スライド上に固定することができる。次に
ラベルされている抗体に暴露するか、又はラベルされて
いない抗体及びラベルされている第２抗体に暴露するか
いづれかによって、細胞表面受容体を位置決定すること
ができる。サンプル中の細胞表面タンパク質の量は、結
合しているラベルの量に直接的に比例する。
放射性同位体のラベルを使用するホールボディイメー
ジング技法は、上皮腫瘍、特に転移した乳癌の位置を見
つけるために利用され得る。この発明の抗体、又はそれ
らのフラグメントは、適切な放射性同位体、典型的には
テクネチウム−99,123I，125I、もしくは131I、又はそ
れらの組合せに結合され、そして非経腸的に投与され
た。ラベルの生体分布状態は、シンチグラフィによって
モニターされ、そしてラベルの蓄積を、エストロゲン感
受性の腫瘍性乳房上皮細胞の存在に関係することができ
る。ホールボディイメージング技法は、アメリカ特許第
4,036,945及び4,311,688に記載され、この開示を引用に
よりこの明細書中に組み入れる。
次の実験は、制限的でなく、例示的に提供されてい
る。
実験 次の略語が用いられる： BSA−ウシ血清アルブミン DCC−デキストラン被覆木炭 ER−エストロジン受容体 HMFGM−ヒト乳脂肪乳球膜 IEF−等電点電気泳動 MCA−モノクローナル抗体 PBS−リン酸緩衝化食塩溶液（0.01Mのリン酸ナトリウ
ム、pH7.3、0.15Mの塩化ナトリウムを含む） RIA−ラジオイムノアッセイ SDS−PAGE−ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動 材料及び方法 細胞系 1.MCF−７細胞。MCF−７ヒト乳房腫瘍細胞系を用いて、
抗体生産のために免疫化及びスクリーンの両方を行なっ
た。これは、転移性乳癌を有する患者の胸膜の滲出液に
由来する十分に特徴づけられている細胞系である〔ソウ
ルなど。ジャーナル オブ ナショナル キャンサー
リサーチ（Journal of National Cancer Research）（1
973）51:1409〜1416〕。エストロゲン及びプロエステロ
ジン受容体の両者を含んでいるということが示されてい
る。
2.HBL−100。HBL−100は、授乳中の乳房乳汁サンプルか
ら開発された非腫瘍性ヒト乳房上皮細胞系である〔ポラ
ノウスキイなどイン ビトロ（In Vitro）（1976）12:3
28〜336〕。それはエストロゲン受容体を含まない。
3.186−NWT。186−NWTは、転移性乳癌を有する患者から
の腹水から開発されたヒト上皮細胞系である。それはい
かなる乳房細胞マーカも示さずそしてそれはER陰性であ
る。
4.P3×63Ag8.653。これは、MCA生産のためにハイブリド
マ融合パートナーとして用いられるマウス骨髄腫細胞系
である。それは、免疫グロブリン又はいかなる免疫グロ
ブリン サブユニットも生産しない〔ケアーニイなど。
ジャーナル オブ イムノロジィ（Journal of Immunol
ogy）（1979）123:1548〜1555〕。
増殖培地 ハイブリドマ細胞系は、ローズウェル パーク メモ
リアル インスティテュート カルチャー メディアム
1640（Gibcoラボラトリィズ，グランド アイランド，
ニューヨーク）（加熱により不活性化されている10％子
牛血清、1mMピルビン酸ナトリウム、0.1mM非必須アミノ
酸、2mM L−グルタミン、及び25μg/mlゲンタマイシン
が補充されている）において増殖された。ヒト乳房細胞
系は、５％子牛又は馬血清のいづれか、１μg/mlインシ
ュリン、25μg/mlゲンタマイシン及び100nM17β−エス
トラジオール（シグマ ケミカル カンパニオ，セント
ルイス，ミズウリィ）を含むダルベッコ改変のイーグル
最少必須培地中に維持された。
5.細胞系AE1は、Tsengなど。セル（Cell）（1982）30:3
61〜372によって記載されているハイブリドマ細胞系で
あり、これは、サイトケラチンによる免疫化によって製
造された。この細胞系によって生産される抗体は、すべ
ての酸性サイトケラチンに対してそして特にMCF−７タ
イプ19に対して特異的である。
6.細胞系βH11は、Gown及びVogel。ジャーナル オブ
セル バイオロジィ（Journal of Cell Biology）（198
2）95:414〜424により記載されているハイブリドマ細胞
系であり、これはサイトケラチンによる免疫化によって
製造された。この細胞系によって生産される抗体は、MC
F−７細胞におけるサイトケラチンタイプ8,18及び19に
対して特異的である。
組織検体 正常な及び腫瘍性ヒト乳房組織のパラフィンブロック
は、カリフォールニア、サクラメントのカリフォールニ
ア大学医学センターの医学部病理学科から得られた。
ヒト乳脂肪乳球膜 破損されたHMFGMは、クロロホルム及びエーテルによ
りヒト乳汁のクリーム画分を抽出することによって製造
された〔Cerianiなど。プロスィーディング オブ ザ
ナショナル アカデミィ オブ サイエンス アメリ
カ合衆国（Proceedings of the National Academy of S
cience U.S.A）（1977）74:582〜586〕。
モノクローナル抗体製造 標準的ポリエチレングリコール融合、すなわちOi及び
Herzenberg。細胞免疫学における選択された方法（Sele
cted Methods in Cellular Immunology）（1980）、Mis
hell及びShiigi出版、W.H.Freeman及びカンパニイ，サ
ンフランシスコ，カリフォールニア，ページ351〜372に
よって記載されているようなヒポキサンチン−アミノプ
テリン−チミジン選択方法によって行なわれる。抗体生
産性クローンは、Tsu及びHerzenberg。前記（1980）ペ
ージ373〜397によって記載されているように固相RIA及
びオートラジオグラフィによって、放射性ヨード化され
ているウサギ抗−マウスIgGにより同定された。
生きている無傷のMCF−７細胞（２×106細胞）により
BALB/cマウスを週１度、４週間にわたって腹腔内高度免
疫した。３週間後、融合の前の３日間、２×106細胞に
より４度腹腔内にそのマウスを免疫した。次に、マウス
脾臓細胞をP3×63Ag8.653マウス骨髄腫細胞と共にハイ
ブリド形成した。
第１及び第２レベルのスクリーニングのために完全に
生きているMCF−７及びHBL−100細胞も、また固相RIAに
おいて用いた〔ブラウンなど。ジャーナル オブ イム
ノロジカル メソド（Journal of Immunological Metho
ds）（1979）31:201〜209〕。生きている細胞を用い
て、固定人工物についての選択を避けた。MCF−７を陽
性スクリーンとして、ER陽極細胞上の抗原に対する抗体
を同定した。HBL−100を陰性スクリーンとして用いて、
ER陰極抗体を同定した。また正常なヒト乳汁から単離さ
れるHMFGMを用いて、標準固相RIAにより正常な乳房上皮
の表面成分に対して選択した〔Tsu及びHerzenberg前記
（1980）〕。
最終スクリーニン判定基準は、抗原の検出のためのイ
ムノパーオキシダーゼ技法を用いて、パラフィンスライ
ド中の抗原の分布状態を直接的に映像化することに基づ
いた。
第２世代のモノクロール抗体を上記のようにして生産
したが、しかしMCF−７組織培養培地（融合系列10抗
体）又は186−NWTからの膜抽出物（融合系列７抗体）の
いづれかから単離される抗原により、マウスを免疫化し
た。下に記載しているようにして、UCD/AB6.11抗体によ
り調製されたイムノアフィニティ カラムを用いてその
抗原を単離した。第２世代の抗体についてのスクリーニ
ング方法は、次の通りであった。第２世代の抗体の選択
は、固相RIA、Western Blots及びイムノパーオキシダー
ゼにおける反応性に基づいた。
免疫拡散法 Ouchterlong及びNilsson。ハンドブック オブ イク
スペリメンタル イムノロジィ（Handbook of Experime
ntal Immunology）（1973）、Weir出版、ブラックウエ
ル，ロンドン，（チャプター19）の二重拡散法を用い
て、MCAをアイソタイプ分けした。おのおののクローン
からの上清液及びPBS（0.9％塩化ナトリウム、10mMリン
酸ナトリウム、pH7.5）中1:100に希釈した腹水をおのお
のの免疫グロブリンクラス:IgM,IgG1,IgG2a,IgG3、及び
IgAに対して特異な抗血清に対して反応せしめた。クラ
スに特異的抗血清は、インディアナのエルクハートのマ
イル ラボラトリィズから購入された。
生細胞固相RIA トリプシン処理によって、75cm2の組織培養フラスコ
から細胞を収得し、１つのウエルにつき50,000細胞で96
ウエル組織培養プレートを平板培養し、そして18〜24時
間培養した。すべての培養は、５％CO2中、37℃であっ
た。増殖培地を、吸引除去し、0.08％ナトリウムアジド
を含む増殖培地150μmlを添加しそして細胞を、30分間
インキュベートした。５％子牛血清及び0.08％ナトリウ
ムアジドを含むハンクス液（洗浄緩衝液）により細胞を
すすいだ。次に、洗浄緩衝液を添加しそして細胞を、30
分間インキュベートした。この細胞を、再び洗浄緩衝液
によりすすぎ、そしてハイブリドマ培養からの組織培養
液又は希釈された腹水50μｌを添加しそして１時間イン
キュベートした。次にその細胞を、洗浄緩衝液により２
度すすぎ、そして125I−ウサギ抗−マウスIgG50μｌ
（２×104cpm）を添加しそして１時間インキュベートし
た。その細胞を、洗浄緩衝液により２度洗浄しそして陽
性ウエルを、オートラジオグラフィーによって可視化し
た。
タンパク質分析 Laemmli.ネーチャー（Nature）（1970）227:680〜685
によって記載されている通りに、10％分解ゲルを含む４
％アクリルアミド積み重ねゲル（両者は、0.2％SDSを含
む）を用いて、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミドスラブゲル電気泳動（SDS−PAGE）によりタンパ
ク質を分析した。50μｌのサンプル緩衝液（63mM TRI
S、pH6.8、10％グリセロール、５％２−メルカプトエタ
ノール、2.3％SDS）中に、サンプルを加え、そして20mA
の一定電流により４時間電気泳動せしめた。既知の標準
タンパク質の分子量と比較してそれらの移動度によって
タンパク質の分子量を見積った。
Ｏ′Farrell.ジャーナル オブ バイオロジカル ケ
ミストリィ（Journal of Biological Chemistry）（197
5）250:4007〜4021によって記載されている通りに２次
元電気泳動を実施したが、しかし第２次元におけるSDS
−PAGEは、上に記載されている通りであった。イムノア
フィニティ精製した組織培養液40μｌ（蒸発乾燥せし
め、そして溶菌緩衝液に再溶解されている）又は40μｌ
の溶菌緩衝液に溶解された細胞タンパク質（溶菌緩衝液
2ml中に溶解されている１コンフルエント100mmペトリデ
ィッシュ）のいづれかを、分析した。
タンパク質濃度を、色素結合分析（Bio−Radラボラト
リイズ，リッチモンド，カリフォールニア）を用いて決
定した。
ウエスターン ブロット法（Western Blots） 抗体によって同定される抗原を特徴づけるために、To
wbin,など。プロスィーディング オブ ザ ナショナ
ル アカデミィ オブ サイエンス アメリカ合衆国
（Proceeding of the National Academy of Science U.
S.A）（1979）76:4350〜4354によって記載されているよ
うなウエスターン法の変法を用い、この場合タンパク質
は、SDS−PAGEゲルからニトロセルロースフィルターに
移されそしてMCAによって同定される。ニトロセルロー
スフィルターに移した後、過剰のタンパク質結合性部位
を、３％BSAを含むPBS中にそのフィルターを浸すことに
よってブロックした。１％BSA及び１〜２×107cpmのヨ
ード化された抗体を含むPBS30ml中にそのシートを１時
間、インキュベートすることによって、抗原の位置を決
定した。次にそのフィルターをすすぎ、乾燥せしめそし
てオートラジオグラフ化せしめた。100pgほどの少量の
タンパク質を、この方法により検出することができる。
ラベルされているタンパク質の分析 ステロイドホルモンを除くためにDCCにより処理され
た５％子牛血清中に10日間細胞を増殖せしめた。試験の
前２日間、細胞を、トリプトシ処理しそして100mmペト
リディッシュにつき４×106細胞で平板培養した。24時
間後、エストラジオールを、この培地に添加し、0,1,1
0、及び100nMのエストラジオール濃度を得た。この培地
を、24時間後交換した。ホルモン処理の48時間後、細胞
をハンクス液により２度洗浄した。正常なメチオニン濃
度の10％のほかに35S−メチオニン200μCi/mlを含む、
上記のようにホルモンが補充されている血清不含培地を
添加した。細胞及び培地を、６〜12時間の培養の後、収
得した。
イムノパーオキシダーゼ染色 用いられるイムノパーオキシダーゼ染色法は、Horan
−Handなど。キャンサー リサーチ（Cancer Researc
h）（1983）43:728〜735によって記載されているよう
に、Hsuなど。ジャーナル オブ ヒストケミストリィ
アンド サイトケミストリィ（Journal of Histochem
istry and Cytochemistry）（1981）29:577〜580のアビ
ジン−ビオチンイムノパーオキシダーゼ技法の変法であ
った。
イムノアフィニティ クロマトグラフィ セファロース 4B（Pharmacia Fine Chemicals、ピス
キャットウエイ，ニュージャジィ）を、Marchなど。ア
ナライティカル バイオケミストリィ（Analyical Bioc
hemistry）（1974）60:149〜152によって記載されてい
るように臭化シアンにより活性化した。４℃で一晩、40
％硫酸アンモニウム中での沈殿によって腹水から抗体を
精製した。この沈殿物を溶解しそして0.2Mリン酸ナトリ
ウム、pH7.3に対して透析した。活性化されたセファロ
ース （濾過され、コンパクトケーキにされた）の１容
積を抗体溶液（2mgタンパク質/ml）の1.5容積に添加し
た。抗体を、４℃で16時間、穏かに混合することにより
カップリングせしめた。セファロース を、再び濾過
し、コンパクトケーキにし、３容積の水により洗浄しそ
してpH9の1Mエタノールアミンの1.5容積に添加すること
により未反応部位をブロックした。この反応は、27℃で
２時間進行せしめられた。次に、順にリン酸緩衝液（0.
1Mリン酸ナトリウム、pH7.3、1.0M塩化ナトリウム）、
0.1M酢酸、及び再びホスフェート緩衝液のおのおのにつ
き10容積により順次セファロース を洗浄した。0.1％
ナトリウムアジドを含むリン酸緩衝液中に４℃でこの樹
脂を貯蔵した。
アフィニティー樹脂を0.2〜1.0mlのカラム中に注ぎ、５
カラム容積の6Mグウアニジン−HClpH1.5によりストリッ
ピングし、そして使用の前に、少なくとも10容積のPBS
によりすすいだ。組織培養液を集めそして2mM EDTA及び
フェニル−メチル−スルフォニルフルオリドを添加し、
タンパク質分解を抑制した。20分間、5000Xgで遠心分離
により、次にグラスウール及び0.22ミクロンのフィルタ
ーを通しての濾過によって破片を取り除いた。サンプル
を、４℃で20〜30ml/時でアフィニティーカラムを通す
前に、セファロース 4Bの1mlカラムを通した。非特異
的に結合したタンパク質を、PBS中0.5M尿素10〜20mlに
より溶出した。４カラム容積の6Mグウアニジン−HClpH
1.5のにより抗原を溶出し、この溶離剤を中和し、そし
て透析した。
抗体のヨード化 クロラミンＴ法〔McConahegなど。メソッド オブ
エンザイモロジイ（Methods og Enzymology）（1980）7
0:210〜213〕により抗体を約２μCi/μｇの比活性にヨ
ード化した。１％BSAを含むPBS中、セファロース Ｇ−
25（1cm×30cmのカラム）上で分離し、そして使用する
まで−70℃で貯蔵した。
結果 1.モノクローナル抗体の製造及び特徴付け 生細胞RIAにおけるオートラジオグラフィー結合パタ
ーンはMCAの最初の選択の基礎であった。最初の融合か
らの288ウエルのうち87が、MCF−細胞系に対する抗体を
生成するハイブリドコロニイを含んだ。これらのコロニ
イの22を、拡大しそしてさらに特徴付けるために選ん
だ。９コロニイを限界希釈によってクローン化した。こ
れらから、UCD/AB6.01及びUCD/AB6.11と命名された２つ
の抗体を、さらに特徴付けるために選択した。
MCF−７に対するUCD/AB6.11の特異性を、ウエスター
ン法によって証明した。UCD/AB6.11は、MCF−７抽出物
中の２つのSDS−PAGEバンドに結合したが、しかしHBL−
100、NWT−186HWT抽出物又はHMFGMにはなんら結合性を
も示さなかった。比較すると、UCD/AB6.13と命名された
もう一つのクローンは、HMFGMを除く３つのすべての細
胞系に結合性を示した。
アビジン−ピオチン イムノパーオキシダーゼ技法を
用いてのパラフィン切片における細胞抗原の検出を実施
例し、MCAがヒト乳房抗原に結合しそしてMCF−７の組織
培養人工物とは結合しないということを確かめた。
正常の、形成異常の及び悪性の乳房組織において、UC
D/AB6.11によって同定される抗原の分布状態を、ホルマ
リン及びＢ−５で固定された組織を用いて決定した。Ｂ
−５固定化は、いっそうすぐれた細胞学的な詳細を提供
した。
アビジン−ピオチン イムノパーオキシダーゼ染色を
用いて、UCD/AB6.11は、正常な筋上皮、支質、又は管腔
分泌生成物とではなく、正常な前泌乳性上皮細胞に結合
することが見出された。UCD/AB6.11によって検出される
抗原は、まず第１に核上顆粒に位置決定されたこの抗原
は、乳球間に斑点状分布を有し、その結果陽性的に染色
する乳球が、しばしば陰性的に染色する乳球に隣接して
いるのを見出された。多くの場合、個々の乳球内の隣接
する細胞は、選択的に陽性及び陰性であった。
イムノパーオキシダーゼにより染色された乳癌細胞の
パラフィン切片90％（18/20）は、UCD/AB6.11のために
陽性であった。特定の組織切片における悪性細胞のほと
んどは染色した。顆粒及び表面染色も観察されたけれど
も、この染色パターは、一般的に拡散的であり且つ細胞
質的であった。染色は、隣接する正常細胞においてより
も腫瘍細胞においてひじょうに濃かった。染色は、また
第１次乳房腫瘍癌においてよりも転移性腫瘍細胞におい
てより濃かった。これらの結果は、転移性乳癌細胞にお
いて、抗原の生成が増大しているということを示す。
いくらかの、しかしすべてではない乳房形成異常（線
維襄胞疾患）がUCD/AB6.11により染色された。MCF−７
組織培養培地からの6.11抗体によるイムノクロマトグラ
フィによって単離された抗原による免疫化から得られる
第２世代のモノクローナル抗体を、シリーズ10と命名し
た。さらに特徴付けそして試験するために選択された特
定の抗体は、UCD/PR10.02、UCD/PR10.11、及びUCD/PR1
0.12であった。UCD/PRは、タイプ18サイトケラチンと反
応するが、しかしUCD/AB6.11（6.11抗原）によって認識
される抗原へのUCD/AB6.11又はUCD/PR10.11の結合を抑
制しないネズミIgMである。UCD/PR10.11は、6.11抗原及
びタイプ８サイトケラチン並びにより低い程度では、タ
イプ８サイトケラチンと反応するネズミIgGである。UCD
/PR10.12は、6.11抗原と反応するネズミIgMである。
186−NWT細胞からの（6.11抗体によるイムノクロマト
グラフィによって単離された）抗原による免疫化から得
られる第２世代のモノクローナル抗体を、シリーズ７と
命名する。UCD/PR7.01と命名された１つの特定の抗体
は、筋上皮細胞に対して特異的であるということが見出
された。
2.細胞表面抗原 免疫沈殿法及びこれに続くラクトパーオキシダーゼに
よる生細胞の細胞表面タンパク質のヨード化を用いて、
UCD/AB6.11によって同定される抗原の細胞表面位置をさ
らに特徴づけた。このデータは、細胞がエストラジオー
ルにより又はエストラジンによらないで増殖される時、
抗原が細胞表面上に位置するということを示した。
3.異なるケラチン−関連タンパク質との抗原の反応性 細胞内ケラチン−関連タンパク質の３つの型（タイプ
8,18及び19に関する）が、MCF−７乳癌細胞系中に同定
された。これらのタンパク質は、約52,46、及び46kdの
分子量及びそれぞれ6.1〜6.0、5.8〜5.3、及び5.2〜5.0
の範囲内に等電点を有することが推定された。観察され
る多重等電点形は、多種のケラチンの種々のリン酸化に
少なくとも部分的に基くと信じられている。抗−ケラチ
ンモオクローナル抗体を用いるイムノプロットは、おの
おののタンパク質型に対するおのおのの抗体の異なる結
合パターンをもたらす。たとえば、35βH11抗体は、す
べての３つのMCF−７細胞ケラチン−関係のタンパク質
を認識し、一方AE1、UCD/AB6.01、UCD/AB6.11及びUCD/P
R10.11のおのおのは、種々のタンパク質型を区別した。
第１表を参照のこと。
4.6.11及び10.11によって認識されるエピトープの組織
分布 モノクローナル抗体UCD/AB6.11及びUCD/PR10.11によ
って認識されるエピトープの組織分布を決定し、そして
免疫診断におけるこれらの抗体の実用性を評価するため
に、多数のホルマリン又はB5−固定のパラフィン組織切
片を、アビジン−ピオチン イムノパーオキシダーゼ法
によってスクリーニングした。結果は、下の第２表に示
されている。組織学的に正常な組織において、両抗体
は、乳腺、肝腺及び唾液腺、胃及び腸粘膜、及び腎臓の
遠位尿細管を含む単純上皮を染色した。両抗体は、神経
及び血液要素との反応には機能しないが、しかしUCD/AB
6.11（しかしUCD/PR10.11ではない）は、しばしば平滑
筋の成分と弱く反応した。
5.生細胞上のエピトープ分布状態 生きている、無傷のMCF−７細胞に間接的イミノフル
オレセンスを実施することによって細胞表面エピトープ
に結合する細胞表面を可視化した。UCD/AB6.01及びUCD/
AB6.11が、細胞と細胞の接解の濃縮領域に伴って、全細
胞表面に分散された斑文状の抗原を同定した。細胞表面
エピトープは軽いトリプシン処理によって容易に取り除
かれ、パッチ形成又はキャップ形成の形跡を示さず、そ
して細胞が血清−含有又は血清−不含培地のいづれかで
増殖する場合、存在した。しかしながら、UCD/PR10.11,
35βH11及びAE1によって認識されたエピトープは、類似
の間接的イムノフルオレセンス実験では検出され得なか
った。
6.分泌された6.11抗原の特徴付け ケラチンに関係する抗原は、また腫瘍性乳房組織培養
培地において可溶性タンパク質として見出され得る。MC
F−7,T47D、及びSK−BR3ヒト乳房細胞系からの培養液
は、それぞれケラチンのような免疫活性を含んでいるこ
とが見出されている。試験された５つのモノクローナル
抗体のうち４つが、MCF−７培養上清液からの抗原に結
合し（第３表）、そしてこの抗原は40〜46キロドルトン
の分子量範囲及び5.0〜5.2の等電点を有する。追加実験
は、NCF−７組織培養抗原が3.6Sの沈降係数及び1.25g/c
m3の浮力密度を持つということを示した。
第３表 抗体 MCF−７抗原6.11による反応性 UCD/AB6.01 − UCD/AB6.11 ＋ UCD/PR10.11 ＋ AE1 ＋ 35βH11 ＋ 従って、このMCF−７細胞外抗原は、細胞内サイトケ
ラチンに関係しているようである。まず、非乳房ケラチ
ン（たとえば35βH11及びAE1）に対して生じた抗体は、
その抗原を認識する。第２に、ハイブリドーブが免疫ア
フィニティにより精製されたMCF−７組織液抗原により
免疫化されたマウスから生産される場合、この得られる
抗体（たとえば、UCD/PR10.11）は、非乳房ケラチンと
広く反応する。第３に、精製されたMCF−７抗原のアミ
ノ酸組成物は、他のケラチンに見つけられるアミノ酸組
成物、特にグリシン及びグルタミン酸−グルタミン残基
がタンパク質の総アミノ酸の25％〜30％を含んで成ると
いうことは密接に近い。第４表を参照のこと。
7.細胞外サイトケラチンのための血清検定 UCD/AB6.11をラジオイムノアッセイに使用し、正常な
血清及び乳癌に羅患している患者からの血清の両者中細
胞外サイトケラチンの存在を検定した。この検定は、マ
イルなど。（1973）〔医学におけるラジオイムノアッセ
イ及びそれに関する方法（“Radioimmunoassays and Re
lated Procedures in Medicine"）、インターナショナ
ル アトミック エナージイ エジェンスィ，ビエナ，
オーストリア，ページ149〜164、第１巻〕によって記載
されている２−部位イムノラジオメトリックアッセイ
（IRMA）の変法であった。精製されたモノクローナル抗
体UCD/AB6.11を、プラスチック マイクロタイター プ
レート ウエル上に吸着せしめた。吸着の後、サンプル
血清を、おのおののウエル中に置いた。細胞外サイトケ
ラチンが、血清サンプル中に存在する場合、固相に結合
したUCD/AB6.11は、サイトケラチンを捕捉するために反
応した。次に、サイトケラチン上の異なるエピトープの
ために特異な過剰に精製したウサギIgG抗体を、ミイク
ロタイターウエル〔ここで、結合しているサイトケラチ
ン（もしあるなら）と反応する〕に導入した。次に125I
によりラジオラベルしたタンパク質の過剰の量を、ウエ
ル〔ここで、ウサギIgGと反応する〕に導入した。未結
合のラベルされたタンパク質Ａを除くために洗浄した
後、おのおののウエルの放射能の量を決定した。従っ
て、細胞外サイトケラチンの量は、結合している放射能
の量に直接的に比例した。サイトケラチンの絶対量を、
あらかじめ用意した標準曲線から決定した。
正常な血清を、細胞外サイトケラチンの存在について
検定する場合、得られた値は、140〜3260CPMに対応して
0.02μg/ml〜0.82μg/mlに分布した。乳癌患者について
のこの値は、340〜10,800CPMに対応して0.05μg/ml〜3.
34μg/mlであった。任意のカット−オフとして1000CPM
を選択する場合、14の正常な血清サンプルのうち２つ
（14％）が、陽性であった。乳癌患者については、83の
サンプルのうち30（36％）が陽性であった。従って、血
清中の細胞外サイトケラチンの存在は、上皮腫瘍、たと
えば乳癌に羅患している患者中には有意に高められる。
この発明に従えば、正確且つ敏感な検定が、生物学的
サンプルにおける特定の42〜48kdの細胞タンパク質及び
関連する40〜46kdの血清タンパク質の存在を検出するた
めに提供される。この方法は特に、エストロゲン療法に
敏感であるこれらの乳房腫瘍を同定することのために有
用である。この方法は、また、乳房から転移したエスト
ロゲンー感受性の乳房腫瘍を同定することのために、そ
してそのような腫瘍についての患者の血清をスクリーニ
ングすることのために有用である。
前述の発明は、明確に理解するために、例示的及び例
的な方法によって、いくらか詳細に記載しているけれど
も、ある変更及び修飾を、付属の請求の範囲内で実施す
ることができる。
この発明は、デパートメント オブ ヘルス アンド
ヒューマン サービス（Department of Health and H
uman Services）によって与えられた許可番号No.1 CP0
1008下で、政府支援により行なわれた。政府は、この発
明に確かな権利を持つ。
ハイブリドマ細胞系UCD/AB6.11は、1983年12月８日に
アメリカン タイプ カルチャー コレクション（Amer
ican Type Culture Collection）に寄託されそして受入
番号HB8458を付与された。ハイブリドマ細胞系UCD/AB6.
01及びUCD/PR10.11は、1985年１月３日にアメリカン
タイプ カルチャー コレクションに寄託されそして受
入番号HB8693及びHB8694をそれぞれ付与された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (72)発明者 アラン シー．ブラボン アメリカ合衆国，メリーランド 20331, アンドリュース エア フォース ベイ ス，マルコルム グロウ ユーエスエー エフ メディル センター（番地なし) (56)参考文献 Ｔｈｅ ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ，１ 〔12〕（1982）Ｐ．1641−1647

Claims (1)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ヒト乳房上皮細胞によって放される、5.0
    〜5.2の等電点を有する約40〜46kdの血清可溶性細胞外
    サイトケラチン上に存在する、アメリカンタイプカルチ
    ャーコレクション取得番号HB8458として寄託されたハイ
    ブリドマ細胞系から生成されたUCD/AB6.11抗体及びアメ
    リカンタイプカルチャーコレクション取得番号HB8694と
    して寄託されたハイブリドマ細胞系から生成されたUCD/
    PR10.11抗体によって認識されるエピトープに対する、
    ハイブリドマ細胞生産性モノクローナル抗体。
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