JPS6284100A - 扁平上皮癌関連抗原に対する抗体及びその免疫学的利用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は扁平上皮癌関連抗原に関するものである。さら
に詳しくは新規扁平上皮癌関連抗ＳＣＣＡｇ１、ＳＣＣ
Ａｇ２、ＳＣＣＡｇ５、ＳＣＣＡｇ４、ＳＣＣＡｇ３．
５ＣＣＡ１２６、ＳＣＣＡｇ７、ＳＣＣＡｇ５、ＳＣＣ
Ａｇ９、ＳＣＣＳＣＣＡｇ１０、ＳＣＣＡｇ１１、ＳＣ
ＣＡｇ１２、ＳＣＣＡｇ１３およびｓｃｃＡｇ１４（以
下ＳＣＣＡｇ類と記す）、これら扁平上皮癌関連抗原の
分離精製法及びこれらＳｅｃ　Ａｇ類に対する特異抗体
を用いて生体試料中のＳＣＣＡｇ類を免疫学的に定性、
定箪する方法に関する。

子宮に発生する悪性腫瘍のほとんどは子宮′９１１癌で
あり、組織学的に分類すると子宮頚癌の大部分が扁平上
皮癌であり、腺癌、類腺癌は５チ程度しか認められない
と言われている。子宮頚癌は早期においては大多数が自
覚的に無症状であり、早期の子宮頚癌は癌検診の際に偶
然発見される程度である。現在、子宮頚癌検診にはスメ
ア細胞を用いた細胞診が利用されているが羞恥心による
受診のためらいや鏡検枚数に限界があるなどの問題力Ｓ
あり、その早期での発見には問題が残っている。さらに
子宮ｍ癌はその病変が骨盤腔の奥深くで進行するため病
状の正確な把握は臨床的に困難な場合が多い。従って簡
便な方法で多数検体を処理できるような子宮頚癌の診断
方法の開発、また治癒率の向上のためにも病状の変化を
正確に反映するパラメーターの開発が望まれていた。

一方、悪性腫瘍の診断、管理に＃！瘍ママ−カー利用す
る試みが盛んに行われており、癌胎児性蛋白（ｃａｒＣ
ｉｎＯｅｍ−ｂｒｙｏｎｉｃ　　ａｎｔｉｇｅｎ　：　
ＣＥＡ　）やａ−フェトプロティン（Ｑ　−Ｆｅｔｏｐ
ｒｏｔｅｉｎ　：　ＡＦＰ　）などが臨床的に広く用い
られている。

本発明は子宮頚部癌、肺癌、食道癌の扁平上皮癌組織あ
るいはそれらの転移巣よシ抽出、精製された新規な腫瘍
関連抗原ＳＣＣＡｇｌ、ＳＣＣＡｇ２、ＳＣＣＡｇ５、
ＳＣＣＡｇ４、ＳＣＣＡｇ５、ＳＣＣＡｇ６、ＳＣＣＡ
ｇ７、ＳＣＣＡｇ５、ＳＣＣＡｇ９、ＳＣＣＳＣＣＡｇ
１０、ＳＣＣＡｇ１１、ＳＣＣＡｇ１２、ＳＣＣＡｇ１
３及びＳＣＣＡｇ１４に関するものである。これらのＳ
ＣＣＡｇ類は扁平上皮癌組織並びに血中に存在する扁平
上皮癌関連抗原であり、共通の抗原活性（以下ＳＣＣＡ
ｇ１抗原活性と記す）を有する。さらにＳＣＣＡｇ類は
５ＤＳ−ポリアミドゲル電気泳動法による分子量が約４
５，０００の蛋白質であり、それぞれ等電点が異なって
いる。表１にＳＣＣＡｇ類のそれぞれの等電点を示した
。

ＳＣＣＡｇ　１　　　　　　ｐＩ＝約６．６２ＳＣＣＡ
ｇ　２　　　　　　　約６．５５ＳＣＣＡｇ　３　　　
　　　　約６４５ＳＣＣＡｇ　４　　　　　　　約６．
３５ＳＣＣＡｇ　５　　　　　　　約６．２３ＳＣＣＡ
ｇ　５　　　　　　　約６．１５ＳＣＣＡｇ　７　　　
　　　　約５．９０ＳＣＣＡｇ　８　　　　　　　約５
．８２ＳＣＣＡｇ　９　　　　　　ｐＩ＝約５．７０Ｓ
ＣＣＡｇ　１０　　　　　　約５．６４ＳＣＣＡｇ　１
１　　　　　　　約５．５８ＳＣＣｈｇ　１２　　　　
　　約５．５５ＳＣＣＡｇ１３　　　　　約５．５０ 本発明者らはすでに扁平上皮癌関連抗原としてＴＡ−４
を見出しているがこれは混合物であると同時に夾雑物を
含むものである。さらに、物質が精製されていないため
、重量単位を用いることができず、ユニツ）（Ｕｎｉｔ
）単位を用いており、アッセイ系としても未完成の状態
である。その測定系は感度が不充分であり、扁平上皮癌
患者におけるその出現率が低く、臨床的に利用するには
不充分であった。

本発明はＳＣＣＡｇ類として１４種類の単一物質を分離
・精製することに成功し、これらＴＡ−４の欠点を克服
したものである。

扁平上皮癌関連抗原を開示した従来例の一つとして特開
昭５９−２１２４３６号公報があるが、そこに記載され
ている蛋白質は１６５，０００〜２４０．０００の分子
量を有する成分二種類、１２０．０００〜１５０．００
０の分子量を有する成分一種類、７０，０００〜ｇｏ、
ｏｏｏの分子量を有する成分一種類の合計四種類の成分
を抗原物質として含んでいる混合物であるのに対し、本
発明の扁平上皮癌関連抗原は約４５，０００の分子量を
有する単一物質であり、分子量が異なるのみならず両者
の間で交叉反応性は見られず免疫学的にも新規な物質で
ある。

本発明の−の目的は子宮頚部癌、肺癌、食道癌の扁平上
皮癌組織あるいはそれらの転移巣よｆｉｓｃｃＡｇｌを
抽出・精製することに６る。上記目的は次の如くして達
成される。すなわち、子宮頚部癌、肺癌、食道癌の扁平
上皮癌組織あるいはそれらの転移巣組織をホモゲナイズ
して得た蛋白抽出液を硫安塩析した後、セファデックス
Ｇ−１００によりゲル濾過し、次いでＤＥＡＥ−セフア
ロースイオン交換クロマトグラフィーによる塩濃度勾配
溶出にかけ続いてＣＭ−セフアロースイオン交換クロマ
トグラフィーにかけ塩濃度勾配溶出し、余分な蛋白を除
去した後、さらにセファデックスＧ−１００によりゲル
濾過し、ＳＣＣＡｇ１を得る。

本発明の他の目的はＳＣＣＡｇ１と共通の抗原活性を有
する扁平上皮癌関連抗原を抽出・精製することにある。

この目的は次のμ口＜シて達成される。すなわち、子宮
頚部癌、肺癌、食道癌の扁平上皮癌組織あるいはそれら
の転移巣組織をホモゲナイズして得た蛋白抽出液を硫安
塩析した後、セファデックスＧ−１００によりゲル濾過
し次いでセファロース４Ｂに抗ＳＣＣＡｇ１抗体を結合
させたアフィニティークロマトグラフィーにかけ、未反
応成分を洗浄・除去した後、グリシン−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ＝３〜４）にて抗ＳＣＣＡｇ１抗体と特異的に結合し
たＳＣＣＡｇ１抗原活性を有する蛋白質を解離・回収す
る。回収した蛋白質をさらにＤＥＡＥ−セフアロースイ
オン交換クロマトグラフィーによる塩濃度勾配溶出する
と１４のピークに分けることができ、このピークがそれ
ぞれＳＣＣＡｇ１、ＳＣＣＡｇ２、ＳＣＣＡｇ５、ＳＣ
ＣＡｇ４、ＳＣＣＡｇ５、ＳＣＣＡｇ６、ＳＣＣＡｇ７
、ＳＣＣＡｇ５、ＳＣＣＡｇ９、ＳＣＣＳＣＣＡｇ１０
、ＳＣＣＡｇ１１、ＳＣＣＡｇ１２、ＳＣＣＡｇ１３お
よびＳＣＣＡｇ１４である。

これらＳＣＣＡｇ類は扁平上皮癌組織中に高濃度に存在
するが同じ子宮頚部由来でも腺癌や未分化癌組織中には
ほとんど検出されない。他方、子宮頚部の扁平上皮癌に
限らず他の臓器由来の扁平上皮癌においてもＳＣＣＡｇ
類の存在が確認されている。さらにまた、ＳＣＣＡｇ類
は扁平上皮癌の患者血中に高濃度に出現するので従来の
形態学的検査に替わり免疫学的方法による扁平上皮癌の
診断、予後推定、病状管理などに利用することが可能で
ある。すなわち、本発明の他の目的は扁平上皮癌の診断
、予後推定、病状管理を目的として放射性同位元素、酵
素あるいは螢光物質等の標識剤で標識したＡＣＣＡｇ類
またはＳＣＣＡｇ類に対する抗体を用い、生体試料中の
ＳＣＣＡｇ類を免疫学的に定性、定量する方法および定
性・定量に用いる試薬を提供することにある。

以下、ＳＣＣＡｇ１を例に取り、本発明をさらに詳しく
説明する。ＳＣＣＡｇ１は等電点が約６．６２．５ＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量（精
度：±約１０％）が約４５，０００の蛋白質で、扁平上
皮癌組織並びに血中に存在する扁平上皮癌関連抗原であ
る。そのアミノ酸組成（精度：士約１０％）は表２に示
すとおりである。

表２ＳＣＣＡｇｌのアミノ酸組成（精度：±１０チ）ア
ミノ酸　　　　　アミノ酸組成ｃモル／１００モル）ア
スパラギ匈竣）　　　　　　　１０．８％スレオニン　
　　　　　　　　　６．９セリン　　　　　　　　　　
　６．９ グルタミ潮）　　　　　　　　　　１２．８％スレオニ
ン　　　　　　　　　　　６．６アラニン　　　　　　
　　　　　　６．３／＜リン　　　　　　　　　　　　
　　　　　６．０１／２システイン　　　　　　　　　
０．６メチオニン　　　　　　　　　　２．フィンロイ
シン　　　　　　　　　４，２ロイシン　　　　　　　
　　　　　９・０チロシン　　　　　　　　　　　３．
０フェニルアラニン　　　　　　　　６．６％リジン　
　　　　　　　　　　　　９．０ヒスチジン　　　　　
　　　　　　２．４アルギニン　　　　　　　　　　３
．０プロリン　　　　　　　　　　　　　２・７トリプ
トファン　　　　　　　　　　　１．２本発明に用いる
抗ＳＣＣＡｇ１抗体は既知の方法により作製することが
できる。すなわちＳＣＣＡｇ１でウサギ、マウス、ヤギ
、ニワトリ、ウマなどヒト以外の動物を免疫し、免疫化
された動物よりＳＣＣＡｇ１に対する抗血清を得ること
ができる。また、ＳＣＣＡｇ１で免疫されたマウスある
いはラットの牌細胞とマウスミエローマ細胞するいはラ
ットミエローマ細胞との融合により得られる抗ＳＣＣＡ
ｇ１抗体産生細胞（ハイブリドーマ）よ］ＳＣＣＡｇ１
に対するモノクローナル抗体を得ることもできる。

本発明に用いる標識ＳＣＣＡｇ１及び標識抗ＳＣＣＡｇ
１抗体を作製するだめの標識剤によるＳＣＣＡｇ１及び
抗ＳＣＣＡｇ１抗体の標識は当該分野において通常用い
られている方法により行うことができる。

本発明による生体試料中のＳＣＣＡｇ１の定性、定量は
次の種々の方法によシ達成することができる。

α）体液検体中のＳＣＣＡｇ１と標識ＳＣＣＡｇ１とを
一定量の抗ＳＣＣＡｇ１抗体に対して競合反応させた後
、抗ＳＣＣＡｇ１抗体と結合した標識ＳＣＣＡ　ｇ　１
　、（Ｂ）と結合していない標識ＳＣＣＡ　ｇ　１　（
Ｆ）とを適当な方法！分離（Ｂ−Ｆ分離）し、それらの
分画の一力または両方の標識剤の活性を測定し、予め既
知量のＳＣＣＡｇ１において同様にして得られた標準曲
線より体液検体中のＳＣＣＡｇ１量を求める方法（競合
法）。

Ｂ−Ｆ分離はＰＥＧ法、二抗体法、固相法など既知の方
法により行うことができる。

■　体液検体中のＳＣＣＡｇ１を抗ＳＣＣＡｇ１抗体を
固相に結合させた不溶化抗ＳＣＣＡｇ１抗体に抗原抗体
反応によ多結合させ、次いで標識抗ＳＣＣＡｇ１抗体を
結合させることによシ、［不溶化抗ＳＣＣＡｇ１抗体］
−（ＳＣＣＡｇｌ）−（標識抗ＳＣＣＡｇ１抗体〕複合
物を形成させ、不溶化抗ＳＣＣＡｇ１抗体にＳＣＣＡｇ
１を介して結合した標識抗ＳＣＣＡｇ１抗体の標識剤の
活性を測定し、予め既知量のＳＣＣＡｇ１において同様
にして得られた標準曲線より体液検体中のＳＣＣＡｇ１
の量を求める方法（サンドインチ法）。

（３）さらにＳＣＣＡｇ１と抗ＳＣＣＡｇ１抗体との抗
原抗体反応によシ免疫複合体となった場合に標識ＳＣＣ
Ａｇｌ上の標識剤の活性が減衰あるいは増強することを
利用し九Ｂ−Ｆ分離を必要としない方法（均一イムノア
ッセイ）。

（４）また、組織中またはスメア細胞中のＳＣＣＡｇ１
を測定する方法として組織標本またはスメア細胞標本に
標識抗ＳＣＣＡｇ１抗体を反応させ、結合した標識抗Ｓ
ＣＣＡｇ１抗体の標識剤の活性を観察、測定する方法（
直接法）。

（５）組織標本またはスメア細胞標本に抗ＳＣＣＡｇ１
抗体を反応させ、さらに抗ＳＣＣＡｇ１抗体に対する抗
体を標識剤で標識した標識抗ＩｇＧ抗体を反応させ、抗
ＳＣＣＡｇ１抗体を介して組織中またはスメア細胞中の
ＳＣＣＡｇ１と結合した標識抗ＩｇＧ抗体の標識剤の活
性を観察・測定する方法（間接法）。

（６）組織標本またはスメア細胞標本に抗ＳＣＣＡｇ１
抗体を反応させ、次いで抗ＳＣＣＡｇ１抗体に対する抗
体（抗ＩｇＧ抗体）を反応させ、さらに酵素及び該酵素
に対する抗体（免疫動物が抗ＳＣＣＡｇ１抗体と同種の
もの）との結合物を反応させて得られた複合物中の酵素
活性を測定する方法（ＰＡＰ法）。

（′ｉ）組織標本またはスメア細胞標本に抗ＳＣＣＡｇ
１抗体を反応させ、次いでビオチン標識した抗ＳＣＣＡ
ｇ１抗体に対する抗体（抗ＩｇＧ抗体）を反応させる。

さらにビオチン化酵素とアビジンの結合物とを反応させ
て得られた複合物中の酵素活性を測定する方法（ＡＢＣ
法）。

標識剤としては放射性同位元素、酵素あるいは螢光物質
などを用いることができる。

生体試料としては血清、血漿、尿あるいは組織、スメア
細胞などをあげることができる。

本発明の方法により血中のＳＣＣＡｇ１を測定した結果
、子宮頂部扁平上皮癌患者の血中ＳＣＣＡｇ１は高値を
示した。他の嘘器由来の扁平上皮癌においても高値を示
すものが認められた。一方、子宮頚部腺癌をはじめ婦人
科良性疾患患者および正常婦人における血中ＳＣＣＡｇ
１は低値を示した。従って本発明による生体試料中のＳ
ＣＣＡｇ１の測定は、子宮頚部扁平上皮癌の診断を簡便
に行うことを可能にするとともに子宮頚部扁平上皮癌の
経過観察、治療効果の判定に極めて有用である。さらに
肺癌、食道癌の扁平上皮癌の診断、経過観察、治療効果
の判定にも有用である。

他０８ＣＣＡｇ類、すなわち、ＳＣＣＡｇ２、ＳＣＣＡ
ｇ５、ＳＣＣＡｇ４、ＳＣＣＡｇ５、ＳＣＣＡｇ６、Ｓ
ＣＣＡｇ７、ＳＣＣＡｇ５、ＳＣＣＡｇ９、ＳＣＣＡｇ
１０、ＳＣＣＡｇ１ｌ、ＳＣＣＡｇ１２、ＳＣＣＡｇ１
３及びＳＣＣＡｇ１４についても同様の結果を得ること
ができる。

次に本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本
発明は以下の実施例によって限定されるものではない。

実施例１．ＳＣＣＡｇ１の精製 子宮頚部扁平上皮癌肝転移組織４５０ｔを細切、ホモゲ
ナイズして得た抽出液に硫安を加え５０％飽和とし、塩
析する。遠心分離して回収した上清にさらに硫安を加え
９％胞和として塩析し遠心分離により沈渣を回収する。

この沈渣をリン酸緩衝液に対して透析し、遠心分離して
得た上清を濾過しこの分画を硫安分画として得た。

硫安分画をセファデックスＧ−１００によりゲル濾過し
溶出した第２番目のピーク（図１）を採取し、５０ｍＭ
）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，３）にて透析した後、ＤＥ
ＡＥ−セフアロースイオン交換クロマトグラフィーにか
けＯ〜０．２Ｍ塩化ナトリウムの塩濃度勾配溶出しなだ
らかな第５番目のピーク（図２）を５ＱｒｎＭ酢曖ナト
リウム緩衝液（ｐＨ５，５）にて透析した後、ＣＭ−セ
ファロースカラムにかけ、０〜１．０Ｍ塩化ナトリウム
の塩濃度勾配溶出して得た最初の大きなピーク（図３）
を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１４０ｍＭ塩化ナ
トリウム（ｐＨ８，０）で平衡化したセファデックスＧ
−１００を用いてゲル濾過し、第２番目のピークＣ図４
）を回収して純化されたＳＣＣＡｇ１を得た。

実施例２．ＳＣＣＡｇ１ないしＳＣＣＡｇ１４の精製子
宮頚部扁平上皮癌肝転移組織３２０２を細切、ホモゲナ
イズして得た抽出液に硫安を加え５０％飽和とし塩析す
る。遠心分離して回収した上清にさらに硫安を加え９０
％飽和として塩析し遠心分離により沈渣を回収する。こ
の沈渣をリン酸緩衝液に対して透析し、遠心分離して得
た上清を濾過し、この分画を硫安分画として得た。

硫安分画をセファデックスＧ−１００によりゲル濾過し
溶出した第２番目のピークを採取し、該分画をセファロ
ース４Ｂに抗ｓｃｃ　Ａｇ１抗体を結合させたアフィニ
ティークロマトグラフィーにかけリン酸緩衝食塩水（Ｐ
ＢＳ液）で洗浄した後、グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３
，０）を流し抗ＳＣＣＡｇ１抗体ど特異的に結合した成
分を解離させ回収した。５０ｍＭ）ＩＪス塩酸緩衝液（
ｐＨ８，３）にて透析した後、ＤＥＡＥ−セフアロース
イオン交換クロマトグラフィーにかけＯ〜０．２Ｍ塩化
ナトリウムの塩濃度勾配溶出し、ＳＣＣＡｇ１ないしＳ
ＣＣＡｇ１４まで分離し、純化された各ＳＣＣＡｇ類を
得た。

実施例３．抗血清の作製 精製ＳＣＣＡｇ１溶液０４−に生理食塩水１９．６ｍを
加えた後、フロイントコンプリートアジュバント２０−
と共にエマルジョンを作製した。このエマルジョン４ｍ
ｌをウサギに皮内注射した。５回免疫後１０日目に全採
血した。

実施例４．モノクローナル抗体の作製 精ｆｆ５ｃｃ　Ａ　ｇ　１ｍ’ｌ’ｌｊ、０．２ｍｌ　
（５０ｐ？金含有に７０インドコンプリードアシユバン
ド０．２　ｍｌを加工、エマルジョンをＡ製した。この
エマルジョン０．４ｍｌをＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔に
投与した。１ケ月後ＳＣＣＡｇ１溶液０．２　ｍｌ（５
０μ２含Ｍ）を尾静脈よシ静注した。３日後層殺し牌摘
出を行い、牌細胞１×１０ケとマウスミエローマ細胞（
Ｐ３Ｕ１株）　２　Ｘ　１０ケをＰＥＧ５０％存在下で
細胞融合を行なわせた。９５ｗｅ１１プレー）１０枚に
各０．１５ｍＡを播き、ＨＡＴ培地で２週間培養した後
、培養上清中の抗体検定を行った。抗体陽性ｗｅｌｌよ
り限界希釈法によりクローニングを行ない、抗体産生株
を選別した。得られたモノクローナル抗体産生株１×１
０ケを予めプリスタンを投与したＢＡＬＢ／Ｃマウスの
腹腔に接種し、２週後に腹水を採取した。

実施例５．抗−家兎γ−グロブリン抗体（第２抗体）の
作製 家兎γ−グロブリン１ηを生理食塩水２ｍ７！に溶かし
フロイントコンプリートアジュバント２−を加えエマル
ジョンとした。このエマルジョンを２週間間隔でヤギに
５回注射した。最後の注射の２週間後に全採血し抗血清
を得た。

実施例６．ＳＣＣＡｇ１の　　Ｉ標識 Ｎａ　　　Ｉ　　２０ｐｔ、０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，４）２５μｔに精製ＳＣＣＡｇ１溶液２０μｔ（
０，５μ２／ｄ）を加え、さらにクロラミンＴ　（１’
９７ｍ１　）　２５μｔを加えた。約１５秒攪拌の後、
約１０秒間静置し、メタ車亜硫酸ナトリウム（１■／ｄ
　）　１００μｔを加えて反応を停止した。これにヨウ
化カリウム（５０ｑ／ｍｌ　）　２５μｔ１ブルーデキ
ストラン（５０■／ｍｌ　）　２５μｔ、０．５％ウシ
血清アルブミンｉ５０μｔを加えセファデックスＧ−２
５によるゲル濾過で遊離の　　Ｉを除去し、　　■標識
ＳＣＣＡｇ１を得た。

実施例７．８ＣＣＡｇｌのラジオイムノアッセイ（２抗
体法） ＳＣＣＡｇｌ標準液１００μを又は血清・恢体１００μ
ｔを試験管に入れる。試験管に　　Ｉ標＊ｓｃｃ　Ａｇ
１液２００μｔを加える。さらにＳＣＣＡｇ１抗体液１
００μｔを加え混和し１０〜３０℃で２０〜３０時間イ
ンキュベートする。インキュベーション終了後、試験管
に第２抗体液０．５　ｍｌを加え、サンプルミキサーで
５〜１０秒間攪拌し反応液を十分に混和する。１０〜３
０℃で１０分間インキュベートした後３０００　ｒｐｎ
　２０分間遠心分離する。遠心分離後上清をデカンテー
ションにて除去し、沈殿物の放射能量を測定する。

標準ＳＣＣＡｇ１の測定により得られた１直よυ作成さ
れた標準曲線（図６）より検体中のＳＣＣＡｇ１量を読
み取る。

実施例８．抗ＳＣＣＡｇ１抗体のＨＲＰ標識ホースラデ
ィツシュパーオキシダーゼ（ｎＲｐ）５＋＋ｖを０．３
Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，１）　１ｍ１ｌＣ
ｉ解した後、１％１−フルオロ−２，４−ジニトロベン
ゼン（ＦＤＮＰ）エタノール清液０．１　ｍｌを加え、
室温で１時間反応させた。さらに０．０６Ｍ過ヨウ素酸
ナトリウム１ｍを加え室温で３０分間反応させた後、０
．１６Ｍエチレングリコール１ｍｌを加え室温で１時間
反応させた。次に０．０１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ９，５）に対し４℃で一夜透析した後、抗ＳＣＣＡｇ
１抗体５■を加え、室温で２時間反応させた。

さらに水素化硼素す）　ＩＪウム５ｒｎ！ｉを加え４℃
で一夜放置し、０、ＯＩＭＩＪン＃塩緩衝塩化ナトリウ
ム敵に対し４℃で一夜透析した後、セファデックスＧ−
２００でゲル濾過し■２標識抗ＳＣＣＡｇ１抗体を得た
。

実施例９．ＳＣＣＡｇ１のエンザイムイムノアッセイ（
サンドインチ法） ＳＣＣＡｇｌ標準液１００μを又は血清検体１００μを
及び０．１Ｍホウ酸緩価液（０，５チＢＳＡを含む）１
００μｔを試験管に入れる。この試験管に抗ＳＣＣＡｇ
１抗体結合ビーズ１個を入れ室温にて３時間インキュベ
ート後反応液を除去する。ビーズを生理食塩水にて洗浄
後、ＨＲＰ標識抗ＳＣＣＡｇｌ抗体液２００μｔを加え
室温にて３時間インキュベートする１、反応液を除去し
、ビーズを生理食塩水にて洗浄後、オルトクエニレンジ
アミンニ塩酸塩液３００μｔを加え、室温にて１０分間
インキュベートする。

インキュベート後ＩＮ＋ｉ酸１−を加え酵素反応を停止
させ蒸留水をブランクとし波長４９２ｎｍで吸光度を測
定する。

標準ＳＣＣＡｇ１の測定により得られた値より作成され
た標準曲線（図７）より検体中のＳＣＣＡｇ１ｉｔを読
み取る。

実施例１０．抗ＳＣＣＡｇ１抗体の　工標識シリコン処
理した試、験管に１ｍ（：ｉのＮａ　１２Ｊ　２０ｐｔ
、０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）　２５μｔを加
える。抗ＳＣＣＡｇ１抗体液５０μｔを加え、さらにク
ロラミンＴ（３１Ｎｉ／ｍｌ　）　２５μｔを加える。

２０〜３０秒間よく振って反応させた後、メタ重亜硫酸
ナトリウム（３〜／コ）１００μｔを加えて反応を停止
する。これにヨウ化カリウム（５０ｑ／ｍ）２５μｔ、
ウシ血清アルブミン液（５％）１００μｔを加え、七フ
ァデックスＧ−２５によるゲル濾過で遊離の１２５Ｉを
除去し１２５工標識抗ＳＣＣＡｇｌ抗体を得た。

実施例１１．ＳＣＣＡｇｌのラジオイムノアッセイｃサ
ンドイッチ法）ＳＣＣＡｇｌ標準液１００μを又は血清
検体１００μを及び０．１Ｍホウ酸緩衝液（０，５％Ｂ
ＳＡを含む）１００μｔを試験管に入れる。この試、験
管に抗ＳＣＣＡｇ１抗体結合ビーズ１個を入れ、室温に
て３時間インキュベート後、反応液を除去する。ビーズ
を生理食塩水にて３回洗浄後、１２５Ｉ標識抗ＳＣＣＡ
ｇ１抗体液２００μｔを加え、室温にて３時間インキュ
ベツトする。反応液を除去し、ビーズを生理食塩水にて
３回洗浄しビーズをカウント用試験管に移して放射能を
測定する。

標準ＳＣＣＡｇ１の測定により得られた値より作成され
た標準曲線（図８）より検体中のＳＣＣＡｇ１量を読み
取る。

実施例１２１組織中のＳＣＣＡｇ１の測定（直接法）ス
ライドガラス上に固定された標本にＨＲＰ標識抗ＳＣＣ
Ａｇ１家兎抗体液を１滴Ｃ約２０μｔ）滴下し、ガラス
キャピラリーを使って十分に攪拌した。室温にて２０分
間反応させた後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ液）で洗浄
し、さらに５分間づつ液を換えて３回ＰＢＳ液中に浸し
、未反応のＨＲＰ標識抗ＳＣＣＡｇ１抗体を除去した。

対照試験としてＨＲＰ標識抗ＳＣＣＡｇ１抗体のかわり
にＨＲＰ標識正常家兎血清を用いて同様の操作を行い非
特異的な反応の有無を確認した。

抗原抗体反応を終えたスライドガラスを３．３′−ジア
ミノベンチジン・過酸化水素発色液（ＤＡＢ−ＨｚＯｚ
浴液）中に浸し、室温にて１０分間反応させた後、４℃
に冷却したＰＢＳ液中に移して反応を停止させＰＢＳｉ
で数回洗浄した。

洗浄したスライドガラスをエタノール系列（７０チ〜１
００％）で脱水し、キジロールにて透徹した後封入剤（
カナダバルサム）にて封入し光学顕微鏡にて検鏡した。

実施例１３　組織中のＳＣＣＡｇ１の測定Ｃ間接法）ス
ライドガラス上に固定された標本に抗ＳＣＣＡｇｌ家兎
抗体液１滴（約２０μｔ）滴下し、ガラスキャピラリー
を使って十分に情拌した。室温にて２０分間反応させた
後、ＰＢＳ液で洗浄し、さらに５分間づつ３回、液を換
えてＰＢＳ液に浸し未反応の抗ＳＣＣＡｇ１家兎抗体を
除去した。余分なＰＢＳ液を拭い取りＨＲＰ標識抗家兎
ＩｇＧＩＬ）羊抗体液をｌｆｔ！ＩＩ（約２０μｔ）滴
下し、ガラスキャピラリーを使って十分に攪拌し、室温
にて２０分間反応させた後ＰＢＳ液で洗浄しさらに５分
間づつ３回液を換えてＰＢＳ液中に浸し未反応のＨＲＰ
標識抗家兎ＩｇＧ山羊抗体を除去した。対照試験として
抗ＳＣＣＡｇ１家兎抗体液のかわシに正常家兎血清を用
いて同様の操作を行い非特異的な反応の有無を確認した
。

洗浄したスライドガラスをエタノール系列（７０％〜１
００％）で脱水し、キジロールにて透徹した後、封入剤
（カナダバルサム）にて封入し光学顕微鏡にて検鏡した
。

健常人及び種々の疾患患者における血中のＳＣＣＡｇＩ
を測定した結果を図９に示した。図９からも明らかなよ
うに子宮頚部の扁平上皮癌においてはほとんどの検体が
高値を示したのに対し、良性・悪性を問わず他の疾患ヌ
び健常人においては血清ＳＣＣＡｇ１は低値を示した。

【図面の簡単な説明】

図１はＳＣＣＡｇ類の精製における硫安分画のセファデ
ックスＧ−１００によるゲルヂ過のチャートを示すもの
であり、第２番目のピーク中にｓｅｃ　Ａｇｄが含有さ
れている。 図２はＳＣＣＡｇ１の精製におけるＤＥＡＥセファロー
スイオン交換クロマトグラフィーのチャートを示すもの
であｐｓｃｃＡｇｌはなだらかな第５番目のピーク中に
含有されている。 図３はＳＣＣＡｇ１の精製におけるＣＭ−セフアロース
イオン交換クロマトグラフィーのチャートを示すもので
ある。 図４はＳＣＣＡｇ１の精製の最終段階におけるセファデ
ックスＧ−ｉｏｏによるゲルＦＪのチャートを示すもの
である。 図５はセファロース４Ｂに抗ＳＣＣＡｇ１抗体を結合さ
せたアフィニティークロマトグラフィーのチャートを示
すものでおる。 図６はラジオイムノアッセイ（２抗体法）によるＳＣＣ
Ａｇ１の測定に用いた標準曲線である。 図７はエンザイムイムノアツセイ（サンドイツチ法）Ｋ
よるＳＣＣＡｇ１の測定に用いた標準曲線である。 図８はラジオイムノアッセイ（サンドイツチ法）による
ＳＣＣＡｇ１の測定に用いた標準曲線である。 図９はラジオイムノアッセイ（２抗体法）によシ測定し
た種々の疾患における血清ＳＣＣＡｇ１値を示している
。 第１図 ｕ　　　　　　　　　　　　　　　ｊｌ）　　　　　　
　　　　　　　　ｍ（Ｊ　　（ｆ、ｎ、）第５図 パシング　　　　デイソシエイショノ 手続補正書 昭和６１年９月１７日 特許庁長官　黒　１）明　雄　殿 １、事件の表示。 昭和６０年特許願第２２２７３０号 ２、発明の名称 扁平上皮癌関連抗原及びその免疫学的利用方法５、補正
をする者 事件との関係　　特許出願人 名称　ダイナボット株式会社 ４、代理人 氏名　弁理士　（７１７５）　　斉　藤　武　彦　　−
き。 ５、補正により増加する発明の数　　　な　し６、補正
の対象 明細書の特許請求の範囲、発明の詳細な説明の欄特許請
求の範囲 ７補正の内容 （１）特許請求の範囲を別紙のとおり補正する。 （２）明細書（以下同じ）７頁１２行の「関連抗」を「
関連抗原」と補正する。 （３）２３頁２行の「９％」を「９０％」と補正する。 （４）　　３０　頁７　行の「オルトフェニレン」を「
オルトフェニレン」と補正スル。 （５）３２頁２行の「インキュベツト」を「インキュベ
ート」と補正する。 びにＳＣＣＡｇｌと共通の抗原性を示し、約４５゜１　
約４５．　ＱＯＱの分子量と約６，６２０等電点を有し
、かつ、下記のアミノ酸組成（精度：±１０％）アミノ
酸　　　　アミノ酸組成（モル／１００モル）アスパラ
ギン（酸）　　　　　　１０．８％スレオニン　　　　
　　　　　６９ セリン　　　　　　　　　　６・９ グルタミン（酸）　　　　　　１２８ ％スレオニン　　　　　　　　　　 ６６アラニン　　　　　　　　　　６ ．３バリン　　　　　　　　　　 ６０棒システィン　　　　　　　　 ０６メチオニン　　　　　　　　　 ２フイソ四イシン　　　　　　　　４ ．２ロイシン　　　　　　　　　　 ９０チロシン　　　　　　　　　　３ ．０フェニルアラニン　　　　　　 ６６リジン　　　　　　　　　　　 ９０ヒスチジン　　　　　　　　　２ ．４アルギニン　　　　　　　　　３ ．０プロリン　　　　　　　　　　　　２７トリプトフ
ァン　　　　　　　１ ．２を有することを特徴とし、免疫学的にも新規な物質
である扁平上皮癌関連抗原ＳＣＣＡｇｌ並００００分子
量を有し、且つ、下記の等電点ｉ旦且−−−　　　　等
電点 ＳＣＣＡｇ２　　　　　約６゜５５ ＳＣＣＡｇ３　　　　　約６．４５ ＳＣＣＡｇ４　　　　　約６．３５ ＳＣＣＡｇ５　　　　　約６２３ ＳＣＣＡｇ６　　　　　約６１５ ＳＣＣＡｇ７　　　　　約５９０ ＳＣＣＡｇ８　　　　　約５８２ ＳＣＣＡｇ９　　　　　約５．７０ ＳＣＣＡｇ１Ｏ約５．６４ ＳＣＣＡｇ１ｌ　　　　約５．５８ ＳＣＣＡｇ１２　　　　約５５５ ＳＣＣＡｇ１３　　　　約５５０ ＳＣＣＡｇ１４　　　　約５４４ を有する扁平上皮癌関連抗原ＳＣＣＡｇ２．ＳＣＣＡｇ
３．ＳＣＣＡｇ４．ＳＣＣＡｇ５゜ＳＣＣＡｇ６．Ｓｅ
ｃ　　Ａｇ７．ＳＣＣＡｇ８゜ＳＣＣ，Ａｇ９．ＳＣＣ
Ａｇ１Ｏ，ＳＣＣＡｇ１１、ＳＣＣＡｇ１２．ＳＣＣＡ
ｇ１３及びＳＣＣＡｇ１４　。 ２　扁平上皮癌関連抗原ＳＣＣＡｇｌ、ＳＣＣＡｇ２．
ＳＣＣＡｇ３．ＳＣＣＡｇ４．ＳＣＣＡｇ５．ＳＣＣＡ
ｇ６．ＳＣＣＡｇ７．ＳＣＣＡｇ８．ＳＣＣＡｇ９．Ｓ
ＣＣＡｇ１Ｏ。 ＳＣＣＡｇ１ｌ、ＳＣＣＡｇ１２．ＳＣＣＡｇ１３又は
ＳＣＣＡｇ１４をヒト以外の動物に免疫して上記いずれ
かの抗原に対する抗血清あるいはモノクロナール鳳跡を
採取することを特徴とする上記扁平上皮癌関連抗原に対
する抗血清あるいはモノクロナールλ跡の製造法。 ３　扁平上皮癌関連抗原ＳＣＣＡｇｌ、ＳＣＣＡｇ２．
ＳＣＣＡｇ３．ＳＣＣＡｇ４．ＳＣＣＡｇ５．ＳＣＣＡ
ｇ’６．ＳＣＣＡｇｅ、ＳＣＣＡｇ８．ＳＣＣＡｇ９．
ＳＣＣＡｇ１Ｏ。 ＳＣＣＡｇ１ｌ、ＳＣＣＡｇ１２．ＳＣＣＡｇ１３又は
ＳＣＣＡｇ１４あるいはこれらのいずれかに対する抗体
を標識剤で標識した標識物からなる免疫学的測定用試薬
。 ４、　標識剤が放射性同位元素、酵素又は螢光物質であ
る特許請求の範囲第３項に記載の試薬。 ５、　子宮頚部癌、肺癌、食道癌の扁平上皮癌組織ある
いはそれらの転移巣の抽出物あるいはそれらから得られ
る組織蛋白を含有する溶液を下記の諸段階、すなわち （ａｌ　　硫安塩析し得られる硫安分画を（ｂ）　　セ
ファデックスＧ−１００によりゲル濾過し、次いで １ｃｌＤＥＡＥ−セフアロースイオン交換クロマトグラ
フィーによる塩濃度勾配溶出し、続いて （ｄｌｃＭ−セフアロースイオン交換クロマトグラフィ
ーにかけ、塩濃度勾配溶出し、さらに＋６）　　セファ
デックスＧ−１００によりゲル濾過する ことを特徴とする扁平上皮癌関連抗原ＳＣＣＡｇ１の分
離精製法。 ６、　子宮頚部癌、肺癌、食道癌の扁平上皮癌組織ある
いはそれらの一転移巣の抽出物あるいはそれらから得ら
れろ組織蛋白を含有する溶液を下記の諸段階、すなわち ｔａ＋　　硫安塩析し得られる硫安分画を（ｂｌ　　セ
ファデックスＧ−１００によりゲル濾過し、次いで （ｅｌ　　セファｏ　−ス４　Ｂに抗ＳＣＣＡｇｌ抗体
を結合させたアフィニティークロマトグラフィーにかけ
未反応成分を洗浄、除去した後、グリシン−塩酸緩衝液
（ｐＨ＝３〜４）を流し、抗ＳＣＣＡｇｌ抗体と特異的
に結合した成分を解離させて回収し、 （ｄｌ　　回収した分画をＤＥＡＥ−セフアロースイオ
ン交換クロマトグラフィーにより塩濃度勾配溶出し、抗
ＳＣＣＡｇｌ抗体と免疫学的に結合したＳＣＣＡｇｌ抗
原活性を示すピークの各々を回収することを特徴とする
扁平上皮癌関連抗原ＳＣＣＡｇｌ、ＳＣＣＡｇ２．ＳＣ
ＣＡｇ３．ＳＣＣＡｇ４．ＳＣＣＡｇ５．ＳＣＣＡｇ６
．ＳＣＣＡｇ７．ＳＣＣＡｇ８．ＳＣＣＡｇ９．ＳＣＣ
Ａｇ１Ｏ，ＳＣＣＡｇ１ｌ。 ＳＣＣＡｇ１２．ＳＣＣＡｇ１３及びＳＣＣＡｇ１４の
分離精製法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　約４５，０００の分子量と約６．６２の等電点を有
   し、かつ、下記のアミノ酸組成（精度：±１０％） ￥アミノ酸￥　　　　　　￥アミノ酸組成（モル／１０
   ０モル）￥ アスパラギン（酸）　　　　　　　　１０．８％ スレオニン　　　　　　　　　　　　　６・９ セリン　　　　　　　　　　　　　　　６．９ グルタミン（酸）　　　　　　　　　１２．３ グリシン　　　　　　　　　　　　　　６．６ アラニン　　　　　　　　　　　　　　６．３ バリン　　　　　　　　　　　　　　　６．０ １／２システイン　　　　　　　　　　０・６ メチオニン　　　　　　　　　　　　　２．７％ イソロイシン　　　　　　　　　　　　４．２ ロイシン　　　　　　　　　　　　　　９・０ チロシン　　　　　　　　　　　　　　３・０ フェニルアラニン　　　　　　　　　　６．６ リジン　　　　　　　　　　　　　　　９．０ ヒスチジン　　　　　　　　　　　　　２．４ アルギニン　　　　　　　　　　　　　３．０ プロリン　　　　　　　　　　　　　　２．７ トリプトファン　　　　　　　　　　　１．２ を有することを特徴とし、免疫学的にも新規な物質であ
   る扁平上皮癌関連抗原ＳＣＣ　Ａｇ１並びにＳＣＣ　Ａ
   ｇ１と共通の抗原性を示し、約４５，０００の分子量を
   有し、且つ、下記の等電点 ￥蛋白質￥　　　　　　　　　￥等電点￥ ＳＣＣ　Ａｇ２　　　　　　　約６．５５ ＳＣＣ　Ａｇ３　　　　　　　約６．４５ ＳＣＣ　Ａｇ４　　　　　　　約６．３５ ＳＣＣ　Ａｇ５　　　　　　　約６．２３ ＳＣＣ　Ａｇ６　　　　　　　約６．１５ ＳＣＣ　Ａｇ７　　　　　　　約５．９０ ＳＣＣ　Ａｇ８　　　　　　　約５．８２ ＳＣＣ　Ａｇ９　　　　　　　約５．７０ ＳＣＣ　Ａｇ１０　　　　　　約５．６４ ＳＣＣ　Ａｇ１１　　　　　　約５．５８ ＳＣＣ　Ａｇ１２　　　　　　約５．５５ ＳＣＣ　Ａｇ１３　　　　　　約５．５０ ＳＣＣ　Ａｇ１４　　　　　　約５．４４ を有する扁平上皮癌関連抗原ＳＣＣ　Ａｇ２、ＳＣＣ　
   Ａｇ３、ＳＣＣ　Ａｇ４、ＳＣＣ　Ａｇ５、ＳＣＣ　Ａ
   ｇ６、ＳＣＣ　Ａｇ７、ＳＣＣ　Ａｇ８、ＳＣＣ　Ａｇ
   ９、ＳＣＣ　Ａｇ１０、ＳＣＣ　Ａｇ１１、ＳＣＣ　Ａ
   ｇ１２、ＳＣＣ　Ａｇ１３及びＳＣＣ　Ａｇ１４。 ２　扁平上皮癌関連抗原ＳＣＣ　Ａｇ１、ＳＣＣ　Ａｇ
   ２、ＳＣＣ　Ａｇ３、ＳＣＣ　Ａｇ４、ＳＣＣ　Ａｇ５
   、ＳＣＣ　Ａｇ６、ＳＣＣ　Ａｇ７、ＳＣＣ　Ａｇ８、
   ＳＣＣ　Ａｇ９、ＳＣＣＡｇ１０、ＳＣＣ　Ａｇ１１、
   ＳＣＣ　Ａｇ１２、ＳＣＣ　Ａｇ１３又はＳＣＣ　Ａｇ
   １４をヒト以外の動物に免疫して上記いづれかの抗原に
   対する抗血清あるいはモノクロナールを採取することを
   特徴とする上記扁平上皮癌関連抗原に対する抗血清ある
   いはモノクロナールの製造法。 ３　扁平上皮癌関連抗原ＳＣＣ　Ａｇ１、ＳＣＣ　Ａｇ
   ２、ＳＣＣ　Ａｇ３、ＳＣＣ　Ａｇ４、ＳＣＣ　Ａｇ５
   、ＳＣＣ　Ａｇ６、ＳＣＣ　Ａｇ７、ＳＣＣ　Ａｇ８、
   ＳＣＣ　Ａｇ９、ＳＣＣＡｇ１０、ＳＣＣ　Ａｇ１１、
   ＳＣＣ　Ａｇ１２、ＳＣＣ　Ａｇ１３又はＳＣＣ　Ａｇ
   １４あるいはこれらのいづれかに対する抗体を標識剤で
   標識した標識物からなる免疫学的測定用試薬。 ４　標識剤が放射性同位元素、酵素又は螢光物質である
   特許請求の範囲第３項に記載の試薬。 ５　子宮頚部癌、肺癌、食道癌の扁平上皮癌組織あるい
   はそれらの転移巣の抽出物あるいはそれらから得られる
   組織蛋白を含有する溶液を下記の諸段階、すなわち（ａ
   ）硫安塩析し得られる硫安分画を （ｂ）セフアデツクスＧ−１００によりゲルろ過し、次
   いで （ｃ）ＤＥＡＥ−セフアロースイオン交換クロマトグラ
   フイーによる塩濃度勾配溶出し、続いて （ｄ）ＣＭ−セフアロースイオン交換クロマトグラフイ
   ーにかけ、塩濃度勾配溶出し、さらに （ｅ）セフアデツクスＧ−１００によりゲルろ過するこ
   とを特徴とする扁平上皮癌関連抗原ＳＣＣ　Ａｇ１の分
   離精製法。 ６　子宮頚部癌、肺癌、食道癌の扁平上皮癌組織あるい
   はそれらの転移巣の抽出物あるいはそれらから得られる
   組織蛋白を含有する溶液を下記の諸段階、すなわち（ａ
   ）硫安塩析し得られた硫安分画を （ｂ）セフアデツクスＧ−１００によりゲルろ過し、次
   いで （ｃ）セフアロース４Ｂに抗ＳＣＣ　Ａｇ１抗体を結合
   させたアフイニテイークロマトグラフイーにかけ未反応
   成分を洗浄、除去した後、グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ
   ＝３〜４）を流し、抗ＳＣＣ　Ａｇ１抗体と特異的に結
   合した成分を解離させて回収し、 （ｄ）回収した分画をＤＥＡＥ−セフアロースイオン交
   換クロマトグラフイーにより塩濃度勾配溶出し、抗ＳＣ
   ＣＡｇ１抗体と免疫学的に結合したＳＣＣ　Ａｇ１抗原
   活性を示すピークの各々を回収することを特徴とする扁
   平上皮癌関連抗原ＳＣＣ　Ａｇ１、ＳＣＣ　Ａｇ２、Ｓ
   ＣＣ　Ａｇ３、ＳＣＣ　Ａｇ４、ＳＣＣ　Ａｇ５、ＳＣ
   Ｃ　Ａｇ６、ＳＣＣ　Ａｇ７、ＳＣＣ　Ａｇ８、ＳＣＣ
   　Ａｇ９、ＳＣＣ　Ａｇ１０、ＳＣＣＡｇ１１、ＳＣＣ
   　Ａｇ１２、ＳＣＣ　Ａｇ１３及びＳＣＣＡｇ１４の分
   離精製法。